Đồ án tốt nghiệp xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinnis)

Mục đích nghiên cứu - Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi nhân

Trang 1

MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO

CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS Nguyễn Hoàng Quân Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Hằng

Ho Chi Minh City University of Technology

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan nô ̣i dung trong đồ án tốt nghiê ̣p là công trình nghiên cứu thực sự của tôi dưới sự hướng dẫn của ThS Nguyễn Hoàng Quân – cán bộ kỹ thuật tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp HCM Đề tài được tiến hành nghiên cứu thực nghiệm ta ̣i phòng Thực nghiê ̣m Cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh Ho ̣c Tp HCM Các số liê ̣u và kết quả có trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực.Tôi xin hoàn toàn chi ̣u trách nhiê ̣m về lời cam đoan này

Tp HCM, nga ̀ y 20 tháng 07 năm 2017

Sinh viên thực hiê ̣n Nguyễn Thị Thanh Hằng

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ trang thiết bị giúp em hoàn thành đề tài

Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như dạy bảo và truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích giúp em hoàn thành khóa học cùa mình

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS Hà Thị Loan – Phó Giám đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM và ThS Nguyễn Hoàng Quân đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo kiến thức cho em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp

Em xin cảm ơn toàn thể anh chị đang làm việc tại Trung tâm và các bạn sinh viên cùng làm đề tài tại Trung tâm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài

Con xin cám ơn ba mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng con khôn lớn Cám ơn anh chị em và người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn ở bên cạnh giúp

đỡ và luôn cổ vũ tinh thần cho em

Em xin chân thành cảm ơn

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2017

Sinh viện thực hiện Nguyễn Thị Thanh Hằng

Trang 4

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH i

DANH MỤC BẢNG ii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Ý nghĩa của đề tài 1

3 Đối tượng và pha ̣m vi nghiên cứu 2

4 Mục đích nghiên cứu 2

5 Nội dung nghiên cứu 2

6 Phương pháp nghiên cứu 3

7 Kết quả đạt được 3

8 Bố cục đồ án 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật 4

1.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 4

1.1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 5

1.1.3 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro 8

1.1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 9

1.2 Giới thiệu về chi Stachys 17

1.3 Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis) 19

1.3.1 Phân loại 19

Trang 5

1.3.2 Đặc điểm sinh học và công dụng 19

1.3.4 Thành phần hóa học 21

1.3.5 Giá trị dinh dưỡng 22

1.4 Một số nghiên cứu về chi Stachys 23

1.4.1 Kháng viêm và giảm đau 24

1.4.2 Chống oxy hóa 24

1.4.3 Chống lo âu 25

1.4.4 Kháng khuẩn 26

1.5 Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys 27

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

2.2 Vật liệu và phương pháp 29

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất 29

2.2.3 Môi trường nghiên cứu 30

2.2.4 Điều kiện phòng nuôi cấy 30

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 30

2.3 Nội dung nghiên cứu 30

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

2.4.1 Pha môi trường nuôi cấy 31

2.4.2 Các thao tác trong phòng cấy 32

2.4.3 Bố trí thí nghiệm 32

Trang 6

2.4.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng

nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo 32

2.4.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo 33

2.4.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của gía thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ngoài vườn ươm 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo 37

3.2 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo 42

3.3 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm 47

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

4.1 Kết luận 52

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

1 Tài liệu Tiếng Việt 53

2 Tài liệu Tiếng Anh 53

PHỤ LỤC 1

Phụ lu ̣c A: Thành phần môi trường MS 1

Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis) 2

Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4 3

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây sùng thảo 19 Hình 1.2 Củ sùng thảo 20 Hình 3.1 Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 39Hình 3.2 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 46Hình 3.3 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 51

Trang 8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng 10Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi 33Bảng 2.2 Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ 34Bảng 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm 35Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 43 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 48

Trang 9

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau 4 tuần nuôi cấy 39 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 39Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy 44Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 48 Biểu đồ 3.5 Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn ươm sau 4 tuần trồng 49

Trang 11

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam có một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu, trong số hơn 12.000 loài thực vật tại Việt Nam thì có gần 4.000 loài có công dụng làm thuốc với vùng phân

bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý hiếm trên thế giới như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng, Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú,… Theo kết quả điều tra và đánh giá tại một số vùng, trồng cây dược liệu đem lại giá trị kinh tế to lớn hơn bất

kỳ loại cây lương thực, thực phẩm nào (có thể thu nhập trên 100 triệu đồng/ha)

Tuy nhiên theo báo cáo tháng 9/2016 của Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền (Bộ Y tế) cho biết hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các loại, nhưng Việt Nam mới chỉ tự cung cấp được khoảng 20% nguyên liệu để phục vụ việc sản xuất thuốc trong nước, còn khoảng 80 - 85% vẫn phải nhập khẩu từ nước ngoài (chủ yếu nhập từ Trung Quốc) và mới chỉ có 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn gốc rõ ràng, rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay

Cây sùng thảo là một loại cây đã được trồng làm thực phẩm ở nhiều nơi trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp… Củ sùng thảo giàu dinh dưỡng và chứa nhiều hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe Các bộ phận của cây và các chiết xuất từ cây sùng thảo đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh, bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi ở Trung Quốc Các nghiên cứu về các loài cùng chi và

nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Stachys affinnis đã chứng minh chúng chứa

nhiều hoạt chất thứ cấp có nhiều công dụng như kháng viêm, chống oxy hóa, ngừa loãng xương, điều trị ung thư, bệnh tiểu đường,…

Nắm bắt những cơ sở khoa học thực tiễn và nhu cầu của thị trường, nhóm nghiên

cứu đã tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo

(Stachys affinnis)

2 Ý nghĩa của đề tài

Trang 12

• Ý nghĩa khoa học

- Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học

- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung thông

tin về cây sùng thảo, kỹ thuật nhân giống in vitro cây sùng thảo

- Kết quả nghiên cứu có thể là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo của cùng đối tượng hoặc một số giống cây có giá trị khác

- Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học

• Ý nghĩa thực tiễn

- Xây dựng quy trình nhân giống cây sùng thảo, tạo ra cây giống có chất lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM

3 Đối tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu được sử du ̣ng trong đề tài này là cây sùng thảo vitro

được cung cấp từ phòng nuôi cấy mô ta ̣i phòng Thực nghiê ̣m cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM

Phạm vi nghiên cứu trong đề tài này là tâ ̣p trung khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA lên quá trình nhân chồi, tạo rễ của cây sùng thảo

và khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể: mụn xơ dừa, tro trấu,… đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo

4 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi

và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi

nhân giống in vitro

- Đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở giai đoạn vườn ươm

5 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo

Trang 13

- Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo

- Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai

đoạn vườn ươm

6 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiê ̣m được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, đơn yếu tố Mỗi thí nghiê ̣m gồm 3 – 5 nghiê ̣m thức, các nghiê ̣m thức thí nghiê ̣m được lă ̣p la ̣i ba lần

Các số liê ̣u thu thâ ̣p được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4 và chương trình MicroSoft Excel 2016®

7 Kết quả đạt được

- Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho quá trình nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo

- Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ cây sùng thảo

- Xác định được loại giá thể thích hợp để trồng cây sùng thảo khi trồng cây

con in vitro ngoài vườn ươm

8 Bố cục đồ án

Kết cấu của đồ án gồm 4 chương:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Trang 14

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

1.1.1 Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Nuôi cấy mô và tế bào đã trả qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau:

Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa

ra khái niệm tế bào

Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào

Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục

Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công

Năm 1904, Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài

họ Cải Crucifers

Năm 1922, Knudson và Bot Gaz Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro

Năm 1924, Blumenthal và cộng sự tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy hình thành callus tử rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic

Năm 1925, Knudson L, Bot Gaz làm hạt phong lan nảy mầm in vitro

Năm 1929, Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà

hợp khi lai ở Linum spp

Năm 1934, Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một phytohormone thực vật đầu tiên thuộc có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào

Năm 1936, LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá

Trang 15

Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non

ở cà rốt

Năm 1942, Gautheret lần đầu theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô sẹo thực vật

Năm 1944, Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy

mô thuốc lá in vitro

Năm 1950, Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa

Năm 1951, Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và phát sinh cơ quan

Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công

Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở

mô nuôi cấy

Năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi)

Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật – môi trường MS

Năm 1964 – 1998, hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gen để lai tạo giống mới, thương mại hóa sản phẩm nuôi cây mô (Dương Tấn Nhựt, 2011)

1.1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Dương Công Kiên (2003), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật như:

1.1.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh bên)

Trang 16

Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường khác

1.1.2.2 Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình thành Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu trắng Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp hình thành chồi

Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo

1.1.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt tên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất

hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống như hệ thống nuôi cấy vi sinh Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid,…)

Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được tách

ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế bào mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường

có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột biến bằng tia phóng xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng

Trang 17

1.1.2.4 Nuôi cấy tế bào trần

Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu và enzyme) trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền) Khi mất thành tế bào, hai tế bào trần

có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây trồng quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hoặc khác loài (khoai tây, cà chua)

Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc, tế bào trần dễ dàng hấp thu các AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất và chất lượng cây trồng Hiện nay kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào trần đang được nghiên cứu và hoàn thiện

1.1.2.5 Nuôi cấy hạt phấn

Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro Bao phấn chứa các bào tử hoặc

hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích tạo cây đơn bội Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội Nuôi cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng, giống thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới Nuôi cấy bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như: lúa mì, lúa nước, thuốc lá, ngô,…

1.1.2.6 Nuôi cấy protoplast

Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast tách

từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào trong môi trường lỏng Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra nhiều triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống cây mới

ở thực vật bậc cao nói chung Phương pháp này được ứng dụng thành công trên nhiều đối tượng khác nhau Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây thuốc lá đơn bội từ tế bào trần đơn bội

Trang 18

Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng cũng như trong công tác giống cây trồng

1.1.3 Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro

Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng

cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài) Giáo sư Murashige (1974) đã chia quy trình

nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và một giai đoạn tiếp sau in vitro:

1.1.3.1 Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro

Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy Các mẫu đã được khử trùng

và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới Giảm tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này Theo Yildiz (2012), mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng thành Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần

1.1.3.2 Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro

Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất

Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin)

1.1.3.3 Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con

Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ Trong

giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ

Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định

1.1.3.4 Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên

Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống

hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên (Hazarika, 2003) Sự biến

Trang 19

động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong

việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên

Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in vitro vào

thực tiễn Tuy nhiên, đối với cây hoa chuông do toàn thân được phủ một lớp lông tơ dày, thân lá chứa nhiều nước nên giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu gặp nhiều khó khăn (số lượng mẫu nhiễm và chết rất cao) Vì vậy, để tăng hiệu quả của giai đoạn này cần lựa chọn được hóa chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan sinh dưỡng đưa vào nuôi cấy

1.1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật

1.1.4.1 Sự lựa chọn mẫu cấy

Theo Mantell và cộng sự (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô phải

có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng Mô non như đỉnh chồi nách, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của cùng một cây (Nguyễn Quang Thạch, 2001) Thời vụ và giai đoạn sinh trưởng của cây mẹ có ảnh hưởng hoàn toàn khác nhau tới khả năng tái sinh, phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Mamaril và Lopez, 1997)

1.1.4.2 Khử trùng mô thực vật

Các mô cấy hầu hết là các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, lá,

rễ, thân, củ,… tùy theo sự tiếp xúc của môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa

ít hay nhiều vi khuẩn và nấm Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào

môi trường nuôi cấy in vitro, các mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để

loại bỏ hết các nguồn tạp nhiễm (Bhojwani và Razdan, 1996)

Khử trùng mẫu cấy là một việc làm khó vì mẫu sống không thể khử trùng bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng dung dịch khử trùng Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, oxy già,… Các mẫu cấy sau khi chọn phải rửa phải ngâm rửa mẫu bằng xà phòng dưới dòng chảy rồi mới cho vào ngâm trong dung dịch khử trùng Hiệu quả xử lý các chất phụ thuộc vào thời gian, nồng độ

Trang 20

và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề mặt các mô cấy Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử trùng trước tiên người ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70o trong 30 giây, sau

đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn

Việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử

lý trong nuôi cấy vô trùng Các nguồn gây nhiễm phần lớn là bụi tóc, tay, quần áo vì vậy trong khi cấy phải rửa tay bằng xà phòng, lau cồn 70o tới khuỷa tay,…

Bảng 1.1 Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng Chất khử trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả

1.1.4.3 Carbon và nguồn năng lượng

Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng, vì vậy cần phải bổ sung nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy để cung cấp năng lượng (Nguyễn Quang Thạch, 2001) Hai loại đường thường được sử dụng là sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn Nồng độ sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Laneri; Franconi; Altavista, 1990)

Trang 21

1.1.4.4 Các khoáng đa lượng

Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, S, Ca và Mg được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp chất khoáng để cấu tạo tế bào, mô thực vật được sử dung với nồng độ trên 30 ppm (Torres, 1989)

- Nguồn Nitơ (N): mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các dạng nitơ khoáng như amon và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như amino acid Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoặc NH4NO3 Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc

NH4NO3 Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea Tổng nồng độ của NO3+ và NH4+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy

và mục đích nghiên cứu

- Nguồn Phospho (P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, nucleic acid

và tham gia cấu trúc màng Hai dạng P thường được dùng nhất là Na2H2PO4.7H2O và

KH2PO4 (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2011)

-Nguồn Kali (K): K giú p tăng khả năng thẩm thấu qua màng tế bào, điều chỉnh

pH và lượng nước ở khí khổng, hoa ̣t hoá enzyme, có liên quan đến quang hợp và tổng

hợp hydrate carbon, giúp vâ ̣n chuyển hydrate carbon, tổng hợp protein, cải thiê ̣n khả năng sử du ̣ng ánh sáng khi gă ̣p điều kiê ̣n bất lợi.K thường được cung cấp cho môi trường nuôi cấy ở dạng kali nitrat (KNO3), kali clorua (KCl2), kali phosphat(

KH2PO4) (Dương Công Kiên, 2003)

- Nguồn Canxi (Ca): Canxi có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau do

đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở phiến giữa của thành tế bào (Trần Văn Minh, 1997) Sự hoạt động của nhiều enzyme của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca2+ vì canxi là đồng yếu tố với những enzyme phân giải ATP Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là auxin và cytokinin

Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào Số lượng lớn Ca2+

Trang 22

gắn trên thành tế bào đóng vai trò chủ yếu trong củng cố độ vững chắc cho thành tế bào và điều hoà cấu trúc màng tế bào.Canxi được cung cấp dưới dạng muối canxi nitrat Ca(NO3)2 4H2O, canxi clorua CaCl2 6H2O (Dương Tấn Nhựt, 2009)

- Nguồn Magie (Mg): Magie là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp lục tố và nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme vận chuyển phosphate Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuyếch tán vào trong tế bào như K+ vì vậy có vai trò như một cation trung hòa các cation và các acid hữu cơ Magie được cung cấp dưới dạng magie sulphat MgSO4.7H2O (Dương Tấn Nhựt, 2011)

1.1.4.5 Các khoáng vi lượng

Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh trưởng của mô và tế bào thực vật còn được gọi là các nguyên tố vi lượng Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp là: Fe,Zn, B, Mn, Cu, I, Mo, Ni,… (Torres, 1989)

1.1.4.6 Vitamin

Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng (White, 1943)

Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol Thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào Thiamin thường được sử dụng với nồng độ biến thiên từ 0,1 – 10 mg/l Acid nicotinic thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,1 – 5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng độ 0,1 – 10 mg/l Myo-inositol có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp tế bào, thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ cao

50 - 100 mg/l (Dương Công Kiên, 2003)

1.1.4.7 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống tốt cho mô và các tổ chức (Torres, 1989) Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này

Trang 23

thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm chính sau đây

a Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường gặp trong tự nhiên,

có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ do Went và Thimann (1937) phát hiện ra Auxin vận chuyển hướng cực: từ đỉnh chồi ngọn tới cơ quan khác

Auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và giãn nở của tế bào đặc biệt theo chiều ngang làm tế bào phình ra Bên cạnh đó auxin còn kích thích sự phân chia

và kéo dài tế bào Tuy nhiên các ảnh hưởng đến sự giãn nở và phân chia tế bào trong tác động hỗ trợ với các phytohoocmon khác (Skoog và Miller, 1957)

Auxin cũng gây ra tính hướng động của cây (hướng sáng và hướng đất), gây

ra hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt Ngoài ra auxin còn kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả; ảnh hưởng đến sự vận động của chất nguyên sinh; ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất

Những auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: IBA (3-indolebutiric acid), IAA (3-indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic acid), 2,4-D (2,4-D-dichlorophenoxyaxetic acid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic acid) Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin

sử dụng cho môi trường ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối với môi trường tạo và phát triển callus (Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, 1993)

b Cytokinin

Cytokinin là nhóm phytohormone có mặt ở tất các các loại cây trồng, hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ Cytokinin vận chuyển không hướng cực, có thể hướng ngọn hoặc hướng gốc

Cytokinin có ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi Trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ auxin/cytokinin

có ý nghĩa quyết định trong sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo rễ, tạo

Trang 24

chồi hay tạo phôi vô tính Cytokinin cũng có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất như quá trình sinh tổng hợp nucleic acid, protein, chlorophyll và ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây Có ba loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy

mô là BA, kinetin và zeatin (Trần Văn Minh, 1997)

Kinetin được Skoog (1957) phát hiê ̣n ngẫu nhiên trong khi chiết xuất acid nucleic, kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi Zeatin thực chất là một dẫn xuất của adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng BA tuy là cytokinin tổng hợp nhân ta ̣o nhưng có hoa ̣t tính ma ̣nh hơn kinetin và bền nhiệt với độ cao hơn zeatin

c Gibberellin (GA)

Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930 Lịch sử phát hiện nhóm hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von Năm 1926, xác

định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra Đến những năm 30,

mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin Mãi sau chiến tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này của người Nhật Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellic acid Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là GA3

Hiệu quả sinh lý rỏ rệt nhất của gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng kéo dài của thân bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế bào Gebberellin cũng kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, do đó nó có tác dụng đặc trưng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng Trong nhiều trường hợp gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt Ảnh hưởng đặc trưng của gibberellin lên sự ra hoa là kích thích sự sinh trường kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa Đối với sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt thì gibberellin có vai trò gần giống với auxin,

nó làm tăng kích thước quả và tạo nên quả không hạt (Hoàng Minh Tấn; Nguyễn Quang Thạch, 1993)

Trang 25

Trong nuôi cấy mô thực vật, tác dụng của gibberellin chưa thực sự rõ ràng Nhiều tác giả đã sử dụng và coi đó là thành phần không thể thiếu của một số loại môi trường chuyên dụng

d Abscisic acid (ABA)

Abscisic acid thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng tự nhiên gây ra sự ngủ nghỉ của chồi; làm chậm sự ra hoa và sự nảy mầm của hạt; tham gia vào sự rụng lá, hoa, quả ở hầu hết các cây trồng và gây ra sự nứt quả; ức chế sự kéo dài thân và gây

ra hiện tượng đóng khí khổng Abscisic acid còn được xem là một hoocmon của

“stress” vì nó được hình thành mạnh để phản ứng với các stress hoặc điều kiện bất thuận cảu môi trường và làm cho cây biến đổi để thích ứng với điều kiện môi trường (Hoàng Minh Tấn; Nguyễn Quang Thạch, 1993)

Trong nuôi cấy mô và tế bào, abscisic acid có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy abscisic acid được đưa vào môi trường nuôi cấy và mang lại hiệu quả nhất định

e Ethylene

Ethylen thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng thực vật được tổng hợp trong các mô đang xảy ra sự lão hóa hay sắp chín như ở trái Ethylene gia tăng sự rụng lá

và trái, sự lão hóa; phá vỡ sự ngủ của chồi và hạt của một số loài; kích thích trổ hoa

ở một số loài thực vật không xác định (Lê Văn Hoàng, 2008)

1.1.4.8 Các chất hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro

a Nước dừa

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbreek và cộng sự (Van Ovebreek và cộng sự, 1941) Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận.Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất kích thích sinh trưởng (George, 1993)

Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây với nồng độ 5 – 20 % thể tích môi trường

b Dịch chiết khoai tây

Trang 26

Dịch chiết khoai tây có chứa cacbohydrat, acid amin, các vitamin B, C và các khoáng vi lượng cần thiết như kaili, sắt, magie,… rất tốt cho sự sinh trưởng và phát triển của mô, tế bào Chiết xuất khoai tây được bổ sung vào môi trường nuôi cấy lan, bao phấn lúa và một số cây ngũ cốc khác Nồng độ khoai tây thường sử dụng là 20 mg/l (Horst, 1990)

c Dịch chiết nấm men

Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô

tế bào động vật với nồng độ thích hợp, có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển của mô và tế bào, lượng thường dùng là 1 g/l (Horst, 1990)

Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch thủy phân casein hydrolylase (0,1 – 1 %) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100 g/l (chuối xanh) nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy

1.1.4.9 Độ pH môi trường và agar

Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong nuôi cấy Trong khi chuẩn bị môi trường, pH có thể được điều chỉnh đến giá trị cần thiết của thí nghiệm bằng NaOH hoặc HCl

pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động

từ 5,5 - 6,0 Nếu pH cao hơn thì sẽ làm môi trường rất rắn trong khi pH thấp hơn lại giảm khả năng đông đặc của agar (Dương Tấn Nhựt, 2009)

Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để làm rắn hóa môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 – 1 %, đây là loại tinh bột đặc chế

từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môi trường hoặc bị chết vì thiếu oxi nếu môi tường lỏng và tĩnh Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuyếch tán cũng như hấp thu dinh dưỡng của mô, tế bào (Collin, 1998; Bhojwani & Razan, 1983) Nếu như agar không được tinh sạch có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên Agar có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những tác động sinh lý trên mô thực vật (Griffis và cộng sự, 1991; Debergh, 1983; Halquist

và cộng sự, 1983)

Trang 27

1.1.4.10 Than hoạt tính

Khi bổ sung than hoạt tính vào môi trường sẽ kích thích sự tăng trưởng của

mô thực vật do than hoạt tính kết hợp với các hoạt chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường với nồng

độ 0,5 – 3 %

1.1.4.11 Điều kiện nuôi cấy

Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Các yếu tố ảnh hưởng như: cường độ chiếu sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng

Kết quả nghiên cứu của Vince-Pure (1994), Teresa và cộng sự (2007) đã chỉ ra nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và chất lượng cây giống Để mô cấy phát triển tốt thì phòng nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25 – 28oC (Nguyễn Đức Thành, 2000)

1.2 Giới thiệu về chi Stachys

Chi Stachys là một trong những chi lớn nhất trong họ Lamiaceae, bao gồm

khoảng 300 loài xuất hiện ở vùng ôn đới và nhiệt đới Chi này phân bố khắp thế giới nhưng phổ biến nhất ở châu Âu và Đông Á Sự đa dạng loài lớn nhất ở Đông Nam Á

(khoảng 154 loài) Chiết xuất từ các loài Stachys đã được sử dụng trong y học truyền

thống ở châu Âu để tiêu đờm, giảm ho, giảm các triệu chứng hen suyễn và đau tai

Tại Liên bang Nga, có 37 loài Stachys sinh trưởng, trong đó có 12 loài được sử dụng

trong y học dân gian, một số loài được trồng làm cây cảnh Phần thân trên của một số loài được sử dụng để điều trị các vấn đề như rối loạn da, đau dạ dày, ung nhọt, hen suyễn, viêm thấp khớp và ung thư (Gören, 2014)

Các loài Stachys cũng được sử dụng trong y học dân gian Bulgaria, Đức, Afghanistan, và Trung Quốc Loài S recta đã được đưa vào sản xuất dược phẩm tại

Pháp và Mêhicô và được sử dụng trong liệu pháp vi lượng đồng căn Nhiều loài thuộc

chi Stachys còn được sử dụng như một loại trà gọi là “trà núi”, có tác dụng an thần,

chống co thắt, lợi tiểu và tuần hoàn (Gören, 2014) Ngoài ra, các chế phẩm của

Trang 28

Stachys còn được sử dụng làm thuốc chống viêm, làm lành vết thương, thuốc an thần,

kích thích sự co tử cung trong khi sinh và được sử dụng như một loại thuốc cầm máu

Tác dụng an thần của các chế phẩm thuốc thu được từ Stachys mạnh hơn so với các chế phẩm thu được từ Leonurus cardiaca

Thành phần hóa học của chi Stachys bao gồm các loại tinh dầu, alkaloid,

flavonoid, tannin, iridoid, glycosides, choline, betaine, allantoin, turicine, các loại đường (bao gồm tetrasaccharide stachyose có hoạt tính giống insulin) và nhiều thành phần khác Chúng có mặt trong tất cả các bộ phận của cây, bao gồm lá, thân, rễ và

củ Các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã chứng minh rằng nuôi cấy tế bào S sieboldii có

thể tạo ra glycosid verbascoside có đặc tính chống miễn dịch

Hạt của các loài S balansae, S lanata, S sylvatica, S annua, S palustris, S

betoniciflora chứa 24 – 44 % chất béo Các loại axit béo trong hạt của các loài thuộc

chi Stachys chứa triacylglycerols có nguồn gốc từ acid panmitic, stearic, oleic,

linoleic và linolenic Triaeylglycerols của axit linoleic chiếm 60 – 70 % (trong tổng số) - và của axit oleic chiếm 20 – 30 %, chiếm ưu thế trong chất béo của các loài

Stachys nghiên cứu, trong khi đó lượng triacylglycerols chủ yếu chứa axit béo no

chiếm từ 5 đến 10 %

Đã có nhiều nghiên cứu về các loài thuộc chi Stachys cho thấy chúng có khả

năng điều trị các loại bệnh như tiểu đường, kháng viêm, an thần, chống oxi hóa, gây độc với các tế bào ung thư,

Trang 29

1.3 Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis)

1.3.1 Phân loại

Giới (regnum): Plantae

(không phân hạng): Angiospermae

(không phân hạng) : Eudicots

Bộ (ordo): Lamiales

Họ (familia): Lamiaceae

Chi (genus): Stachys

Loài (species): Stachys affinis Hình 1.1 Cây sùng thảo

1.3.2 Đặc điểm sinh học và công dụng

Cây sùng thảo – Stachys affinis (Stachys sieboldii, Stachys tuberifera) còn

được gọi với tên khác là atisô Trung Quốc, là một loại cây thân thảo lâu năm có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản, nơi chúng được trồng rộng rãi và lấy củ làm thực phẩm

Cây có chiều cao từ 30 đến 50 cm, lá có lông mọc đối xứng nhau và mép lá có răng cưa, hoa nhỏ màu trắng hoặc màu hồng tím nở vào mùa hè Vào cuối mùa thu, dưới mặt đất hình thành các củ nhỏ giống như một chuỗi hạt ngọc trai màu trắng

Củ sùng thảo có hình dạng giống sâu bướm, dài từ 2,5 đến 5,5 cm hoặc dài hơn, dày 1,3 đến 2,5 cm Khi ăn củ có vị man mát giống như atiso đỏ và thường được chế biến bằng cách ngâm, xào, nấu súp hoặc ăn sống Tại Trung Quốc và Nhật Bản,

củ sùng thảo còn được ngâm rượu làm thuốc chữa bệnh có tác dụng thanh nhiệt, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm và tăng cường hệ tiêu hóa

Atisô Trung Quốc đã được sử dụng như một loại rau củ ở Trung Quốc từ thế

kỷ thứ tư Kể từ thế kỷ XIX, cây sùng thảo được trồng ở châu Âu (Łuczaj và cộng sự, 2011), ở Pháp cây sùng thảo được gọi là “Crosnes”, chỉ thành phố Crosne, thuộc tỉnh Essonne, nơi nó được trồng lần đầu tiên vào năm 1882

Trang 30

Hình 1.2 Củ sùng thảo

Ở Trung Quốc, S affinis được sử dụng như một phương thuốc truyền cổ truyền

điều trị nhiễm trùng, cảm lạnh, bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi (Yamahara, Kitani, Kobayashi & Kawahara, 1990; Feng và cộng sự, năm 2015)

Có một số nghiên cứu chỉ ra rằng dịch chiết xuất từ củ sùng thảo giúp giảm bớt sự rối loạn trí nhớ liên quan đến chứng mất trí và bệnh Alzheimer ở chuột thông qua cơ chế chống oxy hóa (Harada, Tsujita, Ono, Miyagi, Mori & Tokuyama, 2015)

Chiết xuất methanolic từ S affinis cũng đã được chứng minh có tác dụng bảo vệ chuột

khỏi tác động gây tử vong của kali cyanide (Yamahara và cộng sự, 1990) và ức chế hoạt động của enzyme hyaluronidase (Takeda, Fujita, Satoh & Kakegawa, 1985)

Trong một nghiên cứu khác, một đoạn polysaccharide chiết xuất từ củ của S

affinis có khả năng thu hồi cao các anion superoxide, hydroxyl và các gốc tự do (Feng

và cộng sự, 2015) Theo những nghiên cứu của chúng tôi, các glycosides phenylethanoid như acteoside và stachysoside C là những hoạt chất thứ cấp chính đặc

trưng trong củ của S.affinis (Yamahara và cộng sự, 1990) Đặc biệt, acteoside được

xem là một ức chế di căn ung thư hiệu quả (Hayashi, Nagamatsu, Ito, Yagita &

Suzuki, 1996) Củ của S affinis còn có một nguồn stachyose phong phú (Łuczaj và

cộng sự, 2011), người ta đã chứng minh rằng stachyose có tác dụng hạ đường huyết đáng chú ý ở chuột nhắt (Zhang và cộng sự, 2004)

Trang 31

1.3.4 Thành phần hóa học

Phân tích các hóa chất thực vật từ chiết xuất ethanol của atisô Trung Quốc thông qua sử dụng sắc ký cột (tách các hợp chất) cùng với dữ liệu NMR và MS (xác định và mô tả cấu trúc) cho phép xác định 9 hợp chất, cụ thể là verbascoside (1),

leucosceptoside A (2), martynoside (3), harpagide (4), 8-O- acetyl-harpagide (5), melittoside (6), 5- O-allosyloxy-aucubin (7), acid succinic (8), và stachyose (9)

Các hợp chất này thuộc bốn loại chất chuyển hóa tự nhiên khác nhau, cụ thể

là các phenylethanoid glycosides (PhG) (các hợp chất 1-3), iridoids (các hợp chất 7), axit dicarboxylic (hợp chất 8) và oligosaccharides (hợp chất 9) Sự hiện diện của PhG và các iridoid glycoside trong chiết xuất ethanol của atisô Trung Quốc hoàn toàn phù hợp với sự phân loại thực vật hiện tại của loài

4-Verbascoside (1) là một PhG phổ biến đã được tìm thấy ở S affinis (Hayashi

và cộng sự, 1994) cũng như các thành viên khác của chi như: S anisochila, S

beckeana, S plumosa, S Alpina subsp Dinarica, S germanica subsp Salviifolia và

S tymphaea (Venditti và cộng sự, 2014) Từ khía cạnh sức khoẻ, verbascoside có một

số đặc điểm dược lý đáng chú ý, trong đó quan trọng nhất là kháng viêm, giảm đau, chống oxy hóa và chống ung thư (Funes và cộng sự, 2009; Speranza và cộng sự, 2010)

Leucosceptoside A (2) và martynoside (3) cũng là PhGs, trước đây nó được

tìm thấy trong lá của S.affinis và các thành viên khác trong họ Lamiaceae (Nishimura

và cộng sự, 1991) Các hợp chất này có tính chất tương tự estrogen và khả năng chống oxy hoá quan trọng (Papoutsi và cộng sự, 2006; Wang và cộng sự, 1996)

Harpagide (4), 8-O-acetyl-harpagide (5), melittoside (6) và

5-O-allosyloxy-aucubin (7) đại diện cho tất cả các hợp chất mới của loài, trong khi chúng đã được

tìm thấy ở một số thành viên của chi Stachys trước đây và các chi liên quan của họ

Lamiaceae (Venditti và cộng sự, 2013a, 2013b) Cần lưu ý rằng harpagide (4) và O-acetyl-harpagide (5) được xem là các dấu hiệu hóa học của họ Lamiaceae, cũng

8-như các iridoids diglycosidic melittoside (6) và 5-O-allosyloxy-aucubin (7), đã được phát hiện ở một số chi của họ Lamiaceae với mức độ gần gũi và phân loại chặt chẽ

Trang 32

(Venditti và cộng sự, 2013a, 2013b) Từ quan điểm dược lý, tất cả những iridoid này đều có những đặc tính sinh học quan trọng Harpagide (4) có thể sử dụng để ngừa loãng xương (Chung và cộng sự, 2016), và dẫn xuất acetyl của nó cũng cho thấy tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống ung thư, kháng virus và giảm đau (Xie, Tần

& Fang, 2005)

Melittoside (6) và 5-O-allosyloxy-aucubin (7) có khả năng chống oxy hoá ở

mức trung bình nhưng chúng có tác dụng kháng viêm (Samuelsen, 2000)

Axit succinic (8) là một hợp chất chuyển hóa thứ cấp đóng một vai trò như một chất trung gian trong chu trình tế bào của axit citric ở cả thực vật và động vật Axit succinic có vai trò quan trọng trong y học và làm thực phẩm chức năng vì nó có tác dụng chống co giật trong trường hợp oxy cao áp (Sanders, Currie & Woodhall, 1969), nó cũng có tác dụng giảm đau và an thần (Chen, Xin, Kong, Min & Li, 2003) Axit hữu cơ này còn có tác dụng làm giảm lượng đường và cholesterol trong máu, nó

đã được chứng minh có ích trong điều trị bệnh đái tháo đường và các rối loạn chuyển hóa khác (Vengerovskii, Khazanov, Eskina & Vasilyev, 2007)

Stachyose (9) là hợp chất dấu hiệu để nhận biết atisô Trung Quốc (Łuczaj và cộng sự, 2011) Nó là một oligosaccharide được tìm thấy trong một số loại rau, đặc biệt là ở trong hạt đậu, thường được sử dụng làm chất tạo ngọt thay thế cho sucrose trong đồ uống (Nakakuki, 2002), cần lưu ý rằng đường này không tiêu hoá hoàn toàn bằng enzyme trong cơ thể người, và có thể gây đầy bụng nghiêm trọng ở những người nhạy cảm (Hu, 2005) Tuy nhiên, những nhược điểm nhỏ này không đáng kể so với lợi ích của nó Stachyose có tiềm năng cao trở thành chất tiền sinh học trong thực phẩm chức năng (Yildiz, 2010), và nó có khả năng hạn chế sự gia tăng một số vi khuẩn có hại (Smith, Roche, Trombe, Briles & Håkansson, 2002) cũng như làm giảm nồng độ glucose huyết tương (Zhang và cộng sự, 2004)

1.3.5 Giá trị dinh dưỡng

S affinis giàu protein, carbohydrate và vitamin Có thể ăn sống, nấu, ngâm

rượu, làm salad, chế biến súp, làm gia vị (Mercier & Perennes, 1982), hoặc mài thành

bột và sử dụng để chế biến bánh quy Củ của S affinis rất giàu Fe2+, do đó củ sùng

Trang 33

thảo là thực phẩm lý tưởng cho các bệnh nhân thiếu máu (Instituto Botanico Occidentali Academiae Sinicae, 1983)

Boreali-Phân tích giá trị năng lượng của củ sùng thảo cho thấy cứ 100 g củ cung cấp

195 kcal Carbohydrate (36,94 %) là chất dinh dưỡng đa lượng phổ biến nhất, trong

đó đường chiếm một phần quan trọng (14,07 %) Stachyose là thành phần chiếm tỷ

lệ lớn nhất trong phần đường

Củ có 10,64 % protein, 0,53 % chất béo Đáng chú ý là trong củ có một nguồn chất xơ dồi dào (35 %), đây thành phần thực phẩm có tác dụng tốt với sức khoẻ Hàm lượng tro cao (8.44 %) do sự hiện diện của nhiều yếu tố đa lượng và vi lượng Về mặt này, atisô Trung Quốc cho thấy nồng độ K (2,36 %), P (0,41 %), Ca (0,38 %) và Mg (0,22 %) và nồng độ Na thấp (0,008 %) (Stanley & Stephen, 2008)

Như đã biết khẩu phần ăn có chứa hàm lượng kali cao có thể bảo vệ khỏi nguy

cơ mắc bệnh tim mạch (Khaw & Barrett-Connor, 1987) Trên cơ sở này, việc sử dụng atisô Trung Quốc không chỉ có lợi cho bệnh nhân bị tiểu đường (vì hàm lượng stachyose cao) mà còn ở những người có vấn đề về tim Hàm lượng kali cao phát hiện trong củ có thể giải thích về truyền thống sử dụng củ sùng thảo ở Trung Quốc để điều trị các bệnh về tim (Phong và cộng sự, 2015)

1.4 Một số nghiên cứu về chi Stachys

Các loài thực vật thuộc chi Stachys đã được sử dụng trong y học cổ truyền ở

một số quốc gia để làm thuốc khử trùng, chống co thắt, tiêu đờm, giảm ho, làm dịu các triệu chứng hen suyễn và đau tai, ức chế sự phát triển của khối u sinh dục và ung thư lở loét Các loại thảo mộc được sử dụng bên ngoài để điều trị vết thương và sắc thuốc uống điều trị đau bụng dưới, chuột rút, chóng mặt, sốt, bệnh gout và rối loạn kinh nguyệt Các nghiên cứu dược phẩm đã chứng minh rằng các chiết xuất hoặc các

thành phần của cây thuộc chi Stachys có hoạt động kháng khuẩn và kháng nấm, các

hoạt tính chống oxy hoá, giảm lo âu, kháng viêm, hạ huyết áp, hyaluronidase và chống viêm thận

Trang 34

1.4.1 Kháng viêm và giảm đau

Hoạt tính kháng viêm của dung dịch chiết xuất thu được từ các bộ phận trên

mặt đất của mười loài Stachys Hungary đã được nghiên cứu thử nghiệm ở cơ thể

chuột bị gây phù nề bằng carrageenan sau khi tiêm vào ổ bụng và cho chuột uống (Háznagy-Radnai và cộng sự, 2012)

Chiết xuất acetone và methanol của S byzantina đã được chứng minh có vai

trò quan trọng trong việc ức chế cơn đau và quá trình viêm trong thí nghiệm sử dụng hai mô hình viêm nhiễm: thử nghiệm formalin và thử nghiệm chứng phù nề do carrageenan (Khanavi và cộng sự, 2005) Cả ba liều của acetone và methanol chiết

xuất từ S byzantina (50, 100 và 200 mg/kg) đã ức chế đáng kể cơn đau trong giai

đoạn thứ hai của thử nghiệm formalin và tác dụng của liều thấp cao hơn Cả hai chiết

xuất của S byzanthina đều giảm phản ứng đau đớn hiệu quả hơn indomethacin - một

thuốc chống viêm không steroid (NSAID)

1.4.2 Chống oxy hóa

Có nhiều nghiên cứu cho thấy các loài thực vật thuộc chi Stachys là một nguồn

chất chống oxy hoá tự nhiên dồi dào

Hoạt tính chống oxy hoá ở điều kiện in vitro của chiết xuất methanol thu được

từ các bộ phận trên mặt đất của S spruneri đã được nghiên cứu cùng với 20 loài thực

vật khác thuộc họ Lamiaceae và cho thấy có tác dụng tương tự vitamin E (Couladis

và cộng sự, 2003)

Dung dịch chiết xuất từ S iberica có hoạt tính chống oxy hoá trong điều kiện

in vitro khác nhau (Tepe và cộng sự, 2011) S iberica có thành phần chất chống oxy

hoá tốt với khả năng ức chế acid linoleic là 88,14 % ở nồng độ 2 mg/ml, nhưng hoạt tính loại bỏ tạp chất và hiệu ứng tạo phức chelate ở mức vừa phải (lần lượt là 46,63%

ở 1,0 mg/ml và 33,14 % ở 2 mg/ml)

Chiết xuất methanol từ các bộ phận trên mặt đất của bốn loài Stachys như S

alpina, S anisochila, S beckeana và S plumosa đã được nghiên cứu về tác dụng

chống oxy hoá của chúng (Kukic và cộng sự, 2006) Các chiết xuất được nghiên cứu

về khả năng chống oxy hoá tổng hợp (TAC), cùng với khả năng thu hồi gốc tự do và

Trang 35

OH, và oxy hóa lipid Sự tương quan cao giữa hàm lượng phenol tổng, TAC và thu gốc tự do chỉ ra rằng polyphenol là chất chống oxy hoá chính Tất cả các chiết xuất

Stachys, ngoại trừ S plumosa, đều có hoạt tính chống gốc tự do với giá trị IC50 <50 lg/ml Trong nồng độ từ 6,25 đến 50 lg/ml tất cả các chiết xuất thu được gốc OH có

tỷ lệ trên 40 %, với sự ức chế tối đa của chiết xuất S beckeana là 64,97 % Chiết xuất

S plumosa đạt hoạt độ tối đa là 60,67 % ở 100 mg/ml Các nghiên cứu trước đây đã

chứng minh sự hiện diện của phenylethanoid glycosides như acteoside, martinoside

và forsithoside B là thành phần chính của S plumosa (Bankova và cộng sự, 1999)

Các hợp chất này được chứng minh là các chất chống oxy hoá mạnh (Aligianis và cộng sự, 2003)

Sáu loài Stachys là S cretica, S germanica, S hydrophila, Stachys nivea, S

palustris, và S spinosa đều có khả năng thu gốc DPPH (Conforti và cộng sự, 2009)

S palustris cho thấy hiệu quả chống gốc tự do cao nhất với giá trị IC50 là 0,482 mg/ml Các hợp chất carbonylic (25,4 %), axit béo và este (24,2 %), sesquiterpenes đã bị oxy hoá (10,6 %) là ba nhóm thành phần cấu thành dầu tinh dầu này Các hợp chất có nhiều nhất là caryophyllene oxide, hexahydrofarnesyl acetone, hexadecanoic acid,

(Z)-phytol, thymol và p-methoxyacetophenone Những hợp chất này hoạt động như

chất chống oxy hoá (Ruberto và Baratta, 2000)

1.4.3 Chống lo âu

Trong một nghiên cứu gần đây đã chứng minh tác dụng an thần của tinh dầu

Stachys tibetica khi tiến hành thí nghiệm mô hình chữ thập nâng cao, thí nghiệm lỗ

hổng và thí nghiệm khu vực sáng/tối ở chuột (Kumar và cộng sự, 2012) Ở chuột

cống, tinh dầu của S tibetica (liều 25 và 50 mg/kg) làm tăng cả thời gian và số lần ra

vùng cánh tay mở, giảm tỷ lệ quay lại vùng cánh tay đóng, điều đó cho thấy tác dụng chống lo âu đáng kể

Chiết xuất của S alpina, S anisochila, S beckeana và S plumosa được tiêm

dưới da những con chuột Wistar đực trưởng thành với liều lượng 100 - 400 mg/kg và đem thí nghiệm trong thí nghiệm mô hình chữ thập nâng cao (EPM - Elevated Plus Maze), thử nghiệm Grip và các hoạt động vận động tự nhiên, mục đích chính là để

Trang 36

dự tính khả năng giảm lo lắng, giảm đau và giảm giãn cơ (Savic' và cộng sự, 2010)

S beckeana ở liều 400 mg/kg gây ra hiệu ứng giống như bị ngộ độc ở bệnh nhân cao

áp (EPM), trong khi các thông số hoạt động có liên quan ở cùng một thử nghiệm cho

thấy hoạt tính an thần của S alpina subsp dinarica và S plumosa

Sự có mặt của chrysoeriol và các glycosides apigenin trong S plumosa thể hiện hoạt tính đặc trưng Chrysoeriol 4’-O-α-D-glucopyranoside và chrysoeriol 7-O- α-D glucopyranoside cho thấy hoạt tính bảo vệ thần kinh trong điều kiện in vitro (Ma

và cộng sự, 2005) Apigenin được mô tả là chất có hiệu quả giảm lo lắng rõ ràng ở chuột, không gây dị ứng hoặc làm giãn cơ, phù hợp để trở thành một chất đối kháng với benzodiazepine (Dekermendjian và cộng sự, 1999; Viola và cộng sự, 1995) Axit chlorogenic, được tìm thấy trong cả bốn chất chiết xuất cũng cho thấy hiệu quả chống

lo âu trong các mô hình thí nghiệm lo lắng ở chuột, bao gồm thử nghiệm khu vực sáng/tối, mô hình chữ thập nâng cao và thử nghiệm khám phá tự do (Bouayed và cộng

sự, 2007)

Linalool có mặt trong chiết xuất từ các loài Stachys được tiêm vào ổ bụng

chuột cũng cho thấy tác dụng an thần rõ rệt (bao gồm thôi miên, hạ nhiệt và chống co giật) đã được chứng minh có hiệu quả an thần ở người (Linck và cộng sự, 2010)

1.4.4 Kháng khuẩn

Koutsaviti và cộng sự (2011) đã đánh giá khả năng ức chế sự tăng trưởng vi

khuẩn của tinh dầu S spruneri đối với vi khuẩn Gram dương như: B subtilis,

Enterococcus faecalis, Micrococcus luteus, S aureus, Staphylococcus epidermidis;

các vi khuẩn Gram âm như E coli , Klebsiella pneumoniae, P aeruginosa và hai chủng nấm Candida albicans phát hiện thấy tinh dầu có tác dụng ức chế đáng kể với

tất cả các vi sinh vật được thử nghiệm

Tinh dầu thu được từ các bộ phận trên mặt đất của S officinalis ở Serbia đã được tiến hành thử nghiệm chống lại các vi khuẩn Gram dương như Bacillus subtilis

và Staphylococcus aureus, các vi khuẩn Gram âm như Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhimurium, tạo ra các giá trị MIC (nồng

độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi sinh vật) trong khoảng 0,31 - 20,00 mg/ml

Trang 37

(Lazarevìc và cộng sự, 2013) Tác dụng của chúng với vi khuẩn Gram dương cao hơn

các chủng Gram âm Trong một nghiên cứu trước, tinh dầu của S officinalis cho thấy giá trị MIC là 1,0 mg/ml đối với S aureus (Grujic-Jovanovic và cộng sự, 2004)

Các dung dịch chiết xuất, methanolic và dichloromethane của S nivea thể hiện

tác dụng kháng Leishmania ở hình dạng ký sinh trùng nội bào không có roi (Di Giorgio và cộng sự, 2008)

Hoạt tính kháng khuẩn của chiết xuất methanol từ hoa khô của S byzantina,

S inflata, S lavandulifolia và S laxa được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán

trên đĩa thạch và xác định các giá trị ức chế tối thiểu (MIC) đối với S aureus ,

Streptococcus sanguis, E coli, P aeroginosa, K pneumoniae, A niger và C albicans

(Saeedi và cộng sự, 2008) Các chiết xuất cá tác dụng hiệu quả hơn với vi khuẩn Gram dương và không có hoạt tính kháng nấm Hoạt tính có thể liên quan đến sự có mặt của flavonoids như là thành phần chính Nhiều nghiên cứu đã xác định flavonoid có khả năng chống nấm, kháng vi trùng và kháng khuẩn (Cushnie and Lamb, 2005)

1.5 Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys

Nhân giống bằng nuôi cấy mô và tế bào là biện pháp nhân giống hiện đại và ngày càng phổ biến, cho phép nhân nhanh nhiều loại cây trồng với quy mô lớn Một

số loài thuộc chi Stachys đã được nghiên cứu và xác định các điều kiện môi trường nhân giống in vitro thích hợp, có thể kể đến một số loài như Stachys thracica, Stachys

pubescens, …

Khử trùng 100 hạt giống Stachys thracica bằng cồn 70 %, sau đó rửa với cồn

96% Hạt sau khi khử trùng được chia đều cấy vào môi tường ½ MS và môi trường lỏng chứa 0,07% agar Sau 14 ngày, 10 % trong số 50 hạt cấy vào môi trường lỏng chứa 0,07% agar nảy mầm, trong khi ở môi trường ½ MS không cáo dấu hiệu nảy mầm Cây con được cấy truyền sang môi trường MS cơ bản bổ sung 3 % sucrose và 0,7 % agar và được trồng trong điều kiện môi trường được kiểm soát (ánh sáng và nhiệt độ) Các cây tái sinh có chỉ số tăng trưởng cao, hệ thống rễ phát triển và số lượng lá nhiều (Desislava Mantovska và cộng sự, 2016)

Trang 38

Môi trường tạo mô sẹo tốt nhất của Stachys pubescens là môi trường MS bồ

sung 100 mg/l myo inositol, 2 mg/l glycine, 0,5 mg/l nicotinic, 0,5 mg/l pyridoxine, 0,1 mg/l thymine, 30 g/l sucrose, 15 % nước dừa, 0,8 % agar, 1 mg/l IAA, 1 mg/l 2,4-

D và 0,2 mg/l kinetin Độ pH của môi trường được điều chỉnh về 5,8 Môi trường đã cấy mẫu được để ở nhiệt độ 250C trong bóng tối (Masoume Sabokbari và cộng sự, 2013)

Trang 39

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Dự kiến thực hiện đề tài từ tháng 1/2017 đến tháng 7/2017

- Địa điểm: Phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, số 2374, Quốc lộ 1, khu phố 2, phường Trung Mỹ Tây, quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh

2.2 Vật liệu và phương pháp

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu được sử dụng trong đề tài là cây sùng thảo in vitro được

cung cấp từ phòng Thực nghiệm cây trồng thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP HCM

2.2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất

- Dao cấy, kẹp cấy

- Ống đong 100 ml, ống đong 100 ml, pipet 10 ml

- Chai thủy tinh 500 ml

- Đèn cồn, đĩa cấy, bông thấm

- Máy đo pH, cân điện tử

Trang 40

- Môi trường MS cơ bản

- Saccharose

- Agar

- Các chất kích thích sinh trưởng: NAA, BA, IBA

2.2.3 Môi trường nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy sử du ̣ng là môi trường khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962) gồ m: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin

Môi trường được bổ sung thêm 30 g/l đường sucrose, 8,5 g/l agar Sau khi bổ sung đầy đủ các chất cần thiết thì cần điều chỉnh pH = 5,7 – 5,8

Môi trường nuôi cấy được đong vào chai thuỷ tinh với thể tích mỗi chai là 60

ml rồi tiến hành hấp khử trùng ở điều kiê ̣n áp suất 1atm, nhiê ̣t đô ̣ 121oC trong 20 phú t

2.2.4 Điều kiện phòng nuôi cấy

Để đảm bảo điều kiê ̣n vô trùng, các thí nghiê ̣m được thực hiê ̣n trong mô ̣t phòng nuôi cấy riêng biê ̣t với các điều kiê ̣n sau:

- Cường độ chiếu sáng ánh sáng 2000 ± 500 lux

- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, số liệu thu thập được

xử lý bằng phần mềm SARS 9.4 và Microsoft Excel 2016

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo

- Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo

Tiêu đề	Xây Dựng Quy Trình Nhân Giống In Vitro Cây Sùng Thảo (Stachys Affinnis)
Tác giả	Nguyễn Thị Thanh Hằng
Người hướng dẫn	ThS. Nguyễn Hoàng Quân
Trường học	Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh
Chuyên ngành	Công Nghệ Sinh Học
Thể loại	Đồ án tốt nghiệp
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Thành phố Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	2,51 MB