phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm azosporillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh đăk nông

55 3.7.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến sinh trưởng của cây ngô .... 65 3.7.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược t

NGUYỄN TIẾN DŨNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum

TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA

ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

NGUYỄN TIẾN DŨNG

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum

TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA

ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ: Sinh học

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Người cam ñoan

Nguyễn Tiến Dũng

PGS TS Nguyễn Anh Dũng, người quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận

PGS TS Nguyễn Hữu Hiệp thuộc viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ ñã có những trao ñổi quý báu và tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bộ môn Sinh học thực vật, Bộ môn SHTN, Bộ môn khoa học ñất, Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm và Phòng thí nghiệm CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, giáo viên trường THCS Tô Hiệu, huyện Krông Ana, tỉnh Đăklăk ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K03 ñã cùng tôi san sẻ những buồn vui, cùng tôi học tập và trao ñổi kiến thức trong suốt khóa học Tôi xin gửi lời cảm ơn tới em Nguyễn Xuân Tài lớp Khoa học cây trồng K2007, em Lê Thị Hương lớp Cử nhân Sinh K2007 ñã cùng tôi tham gia nghiên cứu ñề tài

Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới những người thân trong gia ñình ñã luôn quan tâm, tin tưởng, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn

Buôn Ma Thuột, tháng 09 năm 2011

Nguyễn Tiến Dũng

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của ñề tài 1

2 Mục tiêu của ñề tài 2

3 Ý nghĩa của ñề tài 2

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây ngô 3

1.1.1 Phân loại thực vật 3

1.1.2 Đặc ñiểm hình thái cây ngô 3

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô 4

1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt ñộ 4

1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng 4

1.1.3.3 Yêu cầu về nước 5

1.1.3.4 Yêu cầu về ñất 5

1.1.3.5 Yêu cầu chế ñộ không khí trong ñất 5

1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô 6

1.1.4.1 Vai trò của ñạm 6

1.1.4.2 Vai trò của lân 6

1.1.4.3 Vai trò của kali 6

1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng 7

1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ (N) 7

1.2.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do 7

1.2.1.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do hiếu khí 7

1.2.1.2 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do kỵ khí Clostridium 9

1.2.2 Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh 9

1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu 9

1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu 10

1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc 13

1.4 Nghiên cứu trong nước 15

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 17

2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 17

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu 18

2.2.3 Thời gian nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 18

2.3.2 Phương pháp phân lập 18

2.3.3 Phương pháp mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các chủng Azospirillum 20

2.3.4 Phương pháp xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum 20

2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô 21

2.3.6 Phương pháp ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng kỹ thuật PCR 23

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn 23

2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 23

2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 25

2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 25

2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 25

2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối

của các chủng Azospirillum 25

2.3.8 Phương pháp ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn

Azospirillum ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng 26

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 28

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số ñịa

ñiểm của tỉnh Đăk Nông 29

3.2 Mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các chủng Azospirillum 30 3.3 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum

34

3.4 Kết quả tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm bằng

nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô 37

3.4.1 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến sinh trưởng của cây ngô trong

bầu ñất 37

3.4.2 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng ñạm trong lá ngô 41 3.4.3 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng diệp lục trong lá 43 3.5 Kết quả ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng kỹ thuật

PCR 45

3.6 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum

ñược tuyển chọn 463.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các

3.6.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường nuôi cấy ñến sinh

khối của các chủng Azospirillum 53

3.7 Kết quả ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng 55

3.7.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến sinh trưởng của cây ngô 55

3.7.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến chiều cao cây ngô 55

3.7.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến số lá của cây ngô 58

3.7.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến chiều dài lá cây ngô 61

3.7.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến ñường kính gốc 63

3.7.1.5 Kết quả xác ñịnh hàm lượng diệp lục trong lá 65

3.7.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến năng suất của cây ngô 66

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

4.1 Kết luận 72

4.2 Kiến nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BNF Biological nitrogen fixation

IAA Indole - 3 - acetic acid

IBA Indole - 3 - butyric acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Đặc ñiểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azospirillum 30

Bảng 3.2 Kết quả nhuộm gram của các chủng Azospirillum 33

Bảng 3.3 Giá trị OD530nm ño ñược ở các nồng ñộ IAA pha loãng khác nhau 34

Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của các chủng Azospirillum (mg/l) 35

Bảng 3.5 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trồng trong bầu ñất 37

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến sinh khối tươi và khô của cây ngô 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng N tổng số trong lá ngô 41

Bảng 3.8 Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) 43

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) 46

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) 48

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) 50

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) 52

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 109 tế bào/ml) 54

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến chiều cao cây (cm) 56

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến số lá của cây ngô (lá/cây) 59

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến chiều dài lá của cây ngô (cm) 61

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến ñường kính gốc cây ngô (mm) 64

Bảng 3.18 Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) 65

Bảng 3.19 Các chỉ tiêu năng suất của cây ngô trồng ngoài ñồng 67 Bảng 3.20 Khối lượng khô 100 hạt và năng suất lý thuyết 70

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang Biểu ñồ 3.1 Phương trình ñường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa chỉ

số OD530nm và nồng ñộ IAA (mg/l) 35Biểu ñồ 3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng

chủng Azospirillum 53

Biểu ñồ 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 55Biểu ñồ 3.7 Hàm lượng diệp lục trong lá (mg/g) 66

Biểu ñồ 3.8 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến số

hạt/hàng của bắp ngô 68

Biểu ñồ 3.9 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến chiều

dài của bắp ngô 69

Biểu ñồ 3.10 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến năng

suất lý thuyết 71

DANH MỤC CÁC HÌNH

TrangHình 3.1 Phân lập vi khuẩn từ môi trường bán ñặc Nfb 29

Hình 3.2 Kết quả ñiện di DNA của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn 45

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của ñề tài

Phân vi sinh có nhiều ưu ñiểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa ñáp ứng ñủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn ñịnh Do ñó, nghiên cứu

ñể hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết Trong ñó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu ñầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [5]

Hướng ñến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái bền vững, trong vài chục năm gần ñây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích khu trú trong rễ cây trồng không thuộc cây họ ñậu, ñặc biệt ở cây ngũ cốc Theo

Doebereiner, vi khuẩn Azospirillum ở trong rễ cây không gặp phải sự cạnh tranh

nguồn Carbon như vi khuẩn khu trú trên bề mặt rễ và có thể cung cấp ñạm cho cây trồng mà không phải nhờ ñến khi tế bào chết [35]

Nhóm Azospirillum là vi khuẩn sống trong rễ các loại cây ngũ cốc như

lúa, ngô Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố ñịnh N, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA3… góp phần nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất, kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [35]

Ở Việt Nam ñã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn thuộc

chi Azospirillum trong rễ lúa Bên cạnh ñó, ngô là một ñối tượng có vòng ñời

sinh trưởng và phát triển tương ñối ngắn, ít ñầu tư, hiệu quả kinh tế cao, ñược trồng phổ biến Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố ñịnh ñạm

Azospirillum trong rễ cây ngô còn rất ít Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên

cứu nào về thành phần loài của chi Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số ñịa

phương của tỉnh Đăk Nông

Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập,

tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố ñịnh ñạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số ñịa ñiểm của tỉnh Đăk Nông”

2 Mục tiêu của ñề tài

- Phân lập và tuyển chọn ñược một số chủng Azospirillum cố ñịnh ñạm

trong rễ cây ngô

- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủng Azospirillum có hoạt

tính cố ñịnh ñạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô

3 Ý nghĩa của ñề tài

Ý nghĩa khoa học

Xác ñịnh ñược một số chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm, sống

nội sinh trong rễ cây ngô

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của ñề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azospirillum sống

nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố ñịnh ñạm ñể sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về cây ngô

1.1.1 Phân loại thực vật

Ngô có tên khoa học là Zea mays L (Zea: Từ Hi Lạp ñể chỉ cây ngũ cốc và

từ Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản ñịa da ñỏ [7] Cũng có thể Mays là từ “Maya” tên một bộ tộc da ñỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây ngô) [18]

Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta

Lớp : Liliopsida

Bộ : Poales Chi : Zea Loài : Mays

1.1.2 Đặc ñiểm hình thái cây ngô [7],[15],[16]

Rễ ngô: trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ Đó là:

rễ mầm, rễ ñốt và rễ chân kiềng

Thân ngô: thân ñặc, ñường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào

giống, mùa vụ và trình ñộ thâm canh, thân có nhiều lóng Trong ñiều kiện bình thường ngô cao từ 1,8 – 2m, từ khi mọc ñến khi cây có 6 – 7 lá thân phát triển chậm, từ lúc 8 – 9 lá ñến nhú cờ, nở hoa cây phát triển nhanh và ñến khi hoa ñực phơi màu, bắp phun râu cây vẫn tiếp tục lớn Sau khi thụ phấn thì thân ngừng phát triển

Lá ngô: gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ Lá ñược chia thành các

bộ phận như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn sóng, có nhiều lông tơ Gân lá song song Lá mang bắp có chiều dài dài nhất

Hoa ngô: gồm hoa ñực (bông cờ) và hoa cái Bông cờ có nhiều nhánh,

mỗi nhánh có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa có

3 nhị ñực, mỗi nhị ñực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa từ

1000 – 2500 hạt phấn Hoa cái sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều ñốt

ngắn có lá bao bi, mỗi hoa cái có một râu Hoa cái mọc từng ñôi trên hoa tự Mỗi chùm hoa có hai hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một hoa hình thành hạt, một ñôi chùm hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên bắp luôn luôn chẵn

Hạt ngô: thuộc loại quả dĩnh, gồm các bộ phận chính là vỏ hạt, lớp

alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần dính liền hạt với lõi ngô Hạt ngô ñược hình thành gồm các giai ñoạn: từ thụ phấn ñến chín sữa là 10 – 15 ngày, từ chín sữa ñến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp ñến chín hoàn toàn là 10 – 15 ngày

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô [18],[22]

1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt ñộ

Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt ñộ thích hợp vào khoảng 200C - 28

0C Nhiệt ñộ có thể ảnh hưởng ñến thời gian sinh trưởng của cây ngô Trong cả chu kỳ sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần một lượng tích nhiệt nhất ñịnh Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển bình thường Tùy vào từng giống khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau

Giống càng chín muộn thì cần lượng tích nhiệt càng cao

1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng

Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt ñới thuộc nhóm cây ngày ngắn Ánh sáng

là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo ñiều kiện thuận lợi cho quá trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng ñến ñộ dài của

quá trình sinh trưởng Trung bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày

Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với ñộ dài ngày cho thấy cây ngô hình thành các kiểu hình thái khác nhau D.Azit ñã chỉ ra rằng: Các giống ngô ở châu

Âu do kết quả chọn lọc ñã hoàn thành ñược chu kỳ ánh sáng trong ñiều kiện ngày dài, loại trừ ñược yêu cầu ngày ngắn Cuperman và Razumov cho rằng rút ngắn thời gian chiếu sáng ban ngày ñến 12 giời sẽ thúc ñẩy sự trổ cờ và hình thành bắp

Ánh sáng ảnh hưởng ñến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng Những tia sáng dài ñã kìm hãm sự sinh

trưởng của cây ngô, các tia sáng ngắn lại thúc ñẩy sự phát triển Nghiên cứu của Cuperman ñã xác ñịnh thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng ñã gây ảnh hưởng rất lớn ñến sự phát triển của bắp và bông cờ của cây ngô Trong ñiều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng trắng và xanh lam thì sự phát triển của cây diễn ra nhanh nhất Trong diều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng ñỏ thì sự phát triển của bông cờ hầu như không bị ảnh hưởng nhưng sự hình thành của bắp chậm lại

Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng và phát dục của bắp

1.1.3.3 Yêu cầu về nước

Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và sử dụng tiết kiệm nước Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn Do vậy cây cần một lượng nước rất lớn Trung bình cây ngô trong một chu kỳ sống cần khoảng 200 lít nước ñể sinh trưởng và phát triển Ở các thời kì sinh trưởng khác nhau cây ngô yêu cầu lượng mưa và lượng nước tưới khác nhau Cây ngô không chịu ñược úng, ñộ ẩm của ñất quá cao, lớn hơn 80% có ảnh hưởng xấu ñến sinh trưởng phát triển của cây ngô, ñặc biệt là từ lúc cây mọc ñến khi cây ñược 8 lá Vào giai ñoạn này chỉ cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô cũng có thể bị chết úng

Ẩm ñộ thích hợp khoảng 70%

1.1.3.4 Yêu cầu về ñất

Đất rất quan trọng trong sản xuất ngô, ñất trồng ngô phải tơi xốp, nhiều mùn, hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, pH từ 6 – 7, thuận lợi cho việc tưới nước vào mùa khô và tiêu nước vào mùa mưa Hầu hết, ngô ñược trồng ở trên ñất cạn, không ngập nước, ñất có thành phần cơ giới nhẹ, ñất cát pha, trên các loại ñất vụ trước trồng các cây họ ñậu, hoặc các cây phân

xanh cải tạo ñất

1.1.3.5 Yêu cầu chế ñộ không khí trong ñất

Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng còn phải chú ý ñến chế ñộ không khí ở trong ñất Chế ñộ không khí ảnh hưởng gián tiếp thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến ñổi hóa học trong ñất Cây ngô ñặc biệt là rễ ngô phát triển tốt trong ñiều kiện háo

khí, nếu ñất chặt bí thiếu tơi xốp thì rễ ngô phát triển kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng khoáng và nước kém Dẫn ñến tình trạng cây

ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát triển kém

1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô [16],[18],[22]

Triệu chứng thiếu ñạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già có

vệt xém ñỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp

1.1.4.2 Vai trò của lân

Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai ñoạn cây non lại rất yếu Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không ñược nhiều lân, ñó

là thời kỳ khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai ñoạn này sẽ làm giảm năng suất nghiêm trọng Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng

lượng lân yêu cầu) ở thời kỳ 6 – 12 lá sau ñó giảm ñi ở các thời kỳ sau

Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá và gốc cây, trái cong queo Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết Hiện tượng này xảy ra ở lá già trước, sau ñó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ ñông trong ñiều kiện thời tiết khắc nghiệt

1.1.4.3 Vai trò của kali

Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của ngô Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt ít hơn Cây ngô hút kali mạnh ngay từ giai ñoạn sinh trưởng ban ñầu Từ khi cây mọc

tới trổ cờ ngô ñã hút khoảng 70% lượng kali cây cần

Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển chất hữu cơ Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu kém phát

triển, do ñó cây dễ ñổ Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như chuyển nâu và khô dọc theo mép và chóp lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở ñầu bắp (bắp ñuôi chuột)

và năng suất thấp

1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng

Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypñen Thiếu kẽm lá có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải màu vàng sáng, các lóng ngắn lại Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên ñất kiềm, nghèo mùn, ñất giàu lân dễ tiêu hay bón quá nhiều lân Thiếu molypñen lá chuyển xanh nhạt, lá non teo lại và héo, nặng hơn lá ngọn không bung ra ñược,

có nhiều vết xém vàng

1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ (N )

Vi sinh vật cố ñịnh N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn

N2 và cung cấp một lượng N ñáng kể cho cây trồng Theo tính toán của các nhà khoa học, các nhóm vi sinh vật cố ñịnh N BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240 x 106 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản xuất bằng con ñường hóa học

Vi sinh vật cố ñịnh N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí

N2 dồi dào trong không khí (79%) thành dạng NH4+ cung cấp cho cây Vi khuẩn

cố ñịnh N gồm có hai nhóm lớn:[5]

- Vi khuẩn cố ñịnh N tự do gồm:

+ Vi khuẩn cố ñịnh N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp + Vi khuẩn cố ñịnh N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium

- Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ ñậu

Rhizobium, cộng sinh với rễ lúa Azoarcus,

1.2.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do

1.2.1.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do hiếu khí

Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp.[5]

- Beijerinskia sp

Được phân lập bởi Starkey (1939), là loại có ñặc ñiểm giống với Azotobacter

sp Tế bào có hình dạng thay ñổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử Có khả năng sống tốt trong

môi trường axit ( pH=3) Vi khuẩn có khả năng cố ñịnh ñược 16 - 20 mg N khi ñồng hóa hết 1g dinh dưỡng Carbon Ngoài khả năng cố ñịnh N chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng

- Azotobacter sp

Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố ñịnh N tự do Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu ñược bao bọc bởi một lớp nhầy

Khuẩn lạc của Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo

Các nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố ñịnh 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố ñịnh tới 30mg/1g dinh dưỡng Carbon

Trong ñất, Azotobacter tập trung ở vùng ñất xung quanh rễ cây Ngoài khả

năng cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm,

kích thích sinh trưởng Trong ñất, Azotobacter thường phổ biến các nòi sau: + Azotobacter chrococum: kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả

năng di ñộng khi còn non Khi già hình thành nang xác Khuẩn lạc có màu nâu hoặc ñen khi về già, không khuếch tán ra môi trường

+ Azotobacter beijerinckii: có kích thước 2,4 x 4,6 micromet Không có

khả năng di ñộng và hình thành nang xác Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy

+ Azotobacter vinelandii: tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả

năng di ñộng và hình thành nang xác Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường

+ Azotobacter agilis: tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả

năng di ñộng, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang,

sắc tố khuếch tán vào môi trường [5]

1.2.1.2 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do kỵ khí Clostridium

Clostridium ñược phát hiện lần ñầu tiên bởi Vinogradxki (1893) Vi khuẩn Clostridium có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể ñứng riêng rẽ

hoặc kẹp ñôi thành chuỗi ngắn Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu ñược

nhiệt ñộ cao và khô hạn Clostridium có khả năng tích lũy ñược 10 - 15mg N phân tử khi ñồng hóa hết 1g ñường Carbon [5]

1.2.2 Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh

1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu

Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh với cây họ ñậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần Chúng hình thành các nốt sần với rễ cây họ ñậu như cây ñậu tương, lạc, ñiền thanh, muồng, cốt khí, trinh nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và

cố ñịnh N không khí ñể sử dụng và cung cấp một phần cho cây chủ

Gồm có: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium[9]

- Rhizobium

Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck ñã phân lập ñược loài vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ ñậu, ông ñã ñặt tên là

Basilusradicicola

Năm 1889, vi khuẩn này ñược xếp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989)

Trên môi trường ñặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả năng di ñộng nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất ñộng

Rhizobium thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5 -

7,5), nhiệt ñộ thích hợp 24 – 260C Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ ñậu thông qua lông hút, ñôi khi qua vết thương ở vỏ rễ Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ thành lông hút tạo ñiều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ Theo tính toán của các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này

có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha

- Bradyrhizobium

Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thường chứa chất dự trữ PHB Trên môi trường ñặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn, bóng, nhầy, không màu

Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển

ñược ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm Chúng phát triển thích hợp ở pH= 6,5 - 7,5 Nhiệt ñộ phát triển thích hợp là 24 –

260C, nhiệt ñộ 370C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt

- Azorhizobium

Azorhizobium là một giống mới ñược ñề nghị với một loài là Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của Sesbania rostrata

- Sinorhizobium

Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây ñậu nành ñược

phân lập từ Trung Quốc Giống Sinorhizobium gồm có 2 loài là Sinorhizobium

fredii và Sinorhizobium xinjiangensis

1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu

- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng ñạm hay

thanh tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho ñến các thực vật hạt kín [5]

- Azospirillum

Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, ñường kính 1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển ñộng trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao

dài ở ñầu ( polan flagellum), trong môi trường ñặc ở 300C nhiều tiêm mao bên (lateral flagellum) ngắn hơn cũng ñược thành lập

Trong những năm gần ñây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này sống ở trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ ñậu như lúa, bắp, mía, sorghum, và một số loại cỏ

Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở ñiều kiện nhà lưới

(Mirza và ctv, 2000; Malik và ctv, 2002) Nhưng ở ñiều kiện ngoài ñồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa ñược 10 - 30% [9]

Azospirillum tăng sinh ở cả trong ñiều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện

diện hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu khí Nhiệt ñộ tối hảo từ 35 - 370C Một số dòng Azospirillum là những vi sinh vật

tự dưỡng không bắt buộc Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của

những acid hữu cơ như malate, succinate, hay pyruvate Fructore và những ñường ñôi khác cũng có thể ñược vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon Một

số dòng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của chúng [5], [9]

Ngoài khả năng cố ñịnh nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại

vi khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm Theo Eckert (2001) chi Azospirillum

có 7 loài là: A brasilense; A lipoferum ; A amazonense; A irakense; A

halopraeferens; A largimobile và A doebereineae [35]

Một số báo cáo gần ñây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins Những kích thích tố ñó làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ Từ ñó, chúng làm tăng khả năng hấp thu khoáng chất và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng năng suất của cây Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu ñược ñiều kiện khô hạn

- Gluconacetobacter diazotrophicus [9]

Năm 1988, ñược Cavalcante V A và Dobereiner J phân lập lần ñầu tiên từ

rễ và thân cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil

G diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế

bào dạng que thẳng tròn ñầu ( 0,7 - 0,9µm ñến khoảng 1 - 2µm) tồn tại ở dạng ñơn, ñôi hoặc chuỗi mà không có nội bào tử; sử dụng ñường (glucose, fructose, sucrose…) ở nồng ñộ khác nhau làm nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ở nồng ñộ sucrose 10% và pH = 5,5

G diazotrophicus có khả năng cố ñịnh ñạm và sản xuất ra hormone thực

vật ( auxin, gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên G diazotrophicus

ñược xem là một loài vi khuẩn ñầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửa nitơ cố ñịnh ñược ở dạng hữu ích cho cây [9]

- Herbaspirillum [9]

Herbaspirillum là các vi khuẩn hình que, Gram âm, rộng khoảng 0,5 -

0,6µm Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp nitơ trong một khoảng pH biến thiên từ 5,3 - 8 Trong môi trường bán ñặc vi khuẩn

Herbaspirillum tạo thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn ( pellicle) Khi cấy

chuyển lên môi trường ñặc JNFb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường ñặc BMS thu ñược khuẩn lạc màu trắng sữa

Herbaspirillum có khả năng cố ñịnh ñạm cộng sinh trong mô của những

cây thân cỏ như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm Ngoài ra chúng còn tạo ra những sản phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho

sự tăng trưởng của cây

- Burkholderia [9]

Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que,

ñường kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở ñầu ( Jesús et al, 2004)

Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong ñiều kiện kỵ khí hoặc hiếu

khí, nhưng trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu trong môi trường nuôi cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001) Trong môi trường

nuôi cấy chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, ñường kính khoảng 2 - 4mm, tròn, phẳng hoặc dài (Jesús et al, 2004)

Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố ñịnh ñạm.Ví

dụ như khi các vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây luá sẽ cố ñịnh

ñạm khoảng 19% tổng lượng ñạm cần thiết cho nhu cầu của cây lúa Năng suất

của cây lúa có chủng loài Burkholderia vietnamiensis tương ñương với năng suất của cây lúa không chủng loài Burkholderia vietnamiensis nhưng có bón phân

ñạm 25 - 30kg/ha (Van et al, 2000)

1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc

Hiệu quả của việc nhiễm chế phẩm Azotobacter sp cho ñất và hạt giống,

cây con ñã ñược chứng minh trên các thí nghiệm ñồng ruộng Theo nghiên cứu

của Puneet (1998) cho thấy việc nhiễm Azotobacter sp kích thích nẩy mầm của

hạt, kích thích ra rễ và sinh trưởng, năng suất lúa mì, ngô tăng 10-15% so với ñối chứng [32]

Tổng kết các kết quả nghiên cứu của Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn

Độ cho thấy sử dụng chế phẩm Azotobacter có thể cung cấp cho cây trồng từ

30-60 kg N/ha/năm và tổng lượng N do vi sinh vật tổng hợp trên hành tinh có thể

ñạt ñến 240 triệu tấn/năm Vi khuẩn cố ñịnh N tự do Azotobacter còn có khả

năng tổng hợp B1, giberellin, cytokinin kích thích tăng trưởng cây trồng [35]

Fulchieri (1993) nghiên cứu sử dụng 3 chủng Azospirillum ñể xử lý hạt

cho ngô Kết quả cho thấy ñã làm tăng chiều cao cây, tăng sinh khối và tăng năng suất ngô lên 59% so với ñối chứng, các chủng này có thể cung cấp khoảng

60 kg N/ha [35]

Nghiên cứu của Puneet (1998) cũng cho thấy nếu bón phối hợp

Azotobacter sp với các chủng phân giải P như Aspergillus niger sẽ làm tăng

năng suất lúa mì tăng 17,7%, trong khi Azotobacter chỉ tăng 9% Kapoor cũng cho kết quả tương tự khi phối hợp chủng Azotobacter sp với các chủng phân giải

phosphat như Bacillus sp, Pseudomonas sp Thí nghiệm làm tăng năng suất lúa,

bông vải lên 10-20% [32]

El-Komy (2005) nghiên cứu phối hợp hai chủng cố ñịnh N Azospirillum

và phân giải lân Bacillus megaterium xử lý cho lúa mì Kết quả cho thấy hàm

lượng N trong thân lúa mì của các thí nghiệm có xử lý hai chủng này tăng 53%; hàm lượng P trong thân tăng 48,6%; hàm lượng K tăng 10-14,3% so với ñối chứng không xử lý Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy xử lý phối hợp hai chủng có tác dụng cộng hưởng, tốt hơn xử lý ñơn chủng [35]

37-Zemrany (2006) nghiên cứu sử dụng chủng A lipoferum cho ngô Kết quả

cho thấy khi sử dụng chủng này ñã làm giảm 50% lượng N cho cây mà năng suất ngô vẫn ñảm bảo [35]

Abbas Akbari và cộng sự (2007) ñã phân lập và tuyển chọn ñược một số

chủng Azospirillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích sinh trưởng của cây lúa mì Kết quả là sự nhiễm các chủng Azospirillum ssp ñã làm tăng ñường

kính gốc lúa, chiều dài rễ, trọng lượng khô và số lượng lông rễ so với ñối chứng [29]

Elazar Fallik and Yaacov Okon ( 1996) nghiên cứu sử dụng Azospirillum

brasilense kết hợp với than bùn cho Setaria italica và ngô Kết quả cho thấy

chiều dài thân, trọng lượng khô, năng suất tăng ñáng kể Sinh khối vi khuẩn là

108 CFU/1g than bùn có hiệu quả gây nhiễm hạt giống cao nhất [26]

Fabricio Cassa´n và cộng sự ( 2009) ñã nghiên cứu phối hợp hai chủng

Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium japonicum E109 xử lí cho ngô

và ñậu tương Kết quả cho thấy xử lí phối hợp hai chủng cho hiệu quả cao hơn so với xử lí ñơn chủng Tỉ lệ nảy mầm, chiều cao cây, chiều dài rễ, trong lượng khô ñều tăng so với ñối chứng [27]

Cristiana Felici và cộng sự (2008) ñã nghiên cứu phối hợp hai chủng

Bacillus subtilis và Azospirillum brasilense xử lý cho cà chua Kết quả cho thấy

khi phối hợp hai chủng cho hiệu quả kém hơn so với xử lý ñơn chủng [24]

G Holguin, C L Patten, B R Glick (1999) ñã tổng hợp nghiên cứu về di

truyền và sinh học phân tử của vi khuẩn Azospirillum, cho thấy các gen nif H, nif

DK quy ñịnh tổng hợp nitrogennase cần cho quá trình cố ñịnh ñạm của vi khuẩn [28]

Martı´n Dı´az-Zorita và cộng sự (2009) ñã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi

khuẩn Azospirillum cho lúa mì, trong ñiều kiện trồng khô hạn Kết quả cho thấy

cây tăng trưởng tốt, tăng chiều cao, ñường kính gốc, hàm lượng tích lũy chất khô tăng, năng suất hạt khô tăng 260kg/ha, tương ñương sản lượng tăng 8% (so với ñối chứng [30]

Andres D Naiman và cộng sự ( 2009) ñã nghiên cứu xử lý gây nhiễm vi

khuẩn Azospirillum brasilense và Pseudomonas fluorescens cho lúa mì Kết quả

cho thấy chiều cao cây tăng 12%, ñường kính gốc thân tăng 40%, năng suất tăng 16% [23]

1.4 Nghiên cứu trong nước

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững và ứng dụng CNSH vào nông nghiệp, trong những năm gần ñây Việt Nam có khá nhiều

nghiên cứu về Azotobacter và Azospirillum làm phân sinh học

Phạm Bích Hiên và cộng sự ( 2003) ñã nghiên cứu 10 chủng Azotobacter

của Việt Nam và nhận thấy rằng ngoài khả năng cố ñịnh N chúng còn có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng IAA Nhiệt ñộ thích hợp của các chủng này là 25-300C, pH thích nghi rộng từ 5,5- 8,0 [8]

Phạm Ngọc Lan (1999) ñã phân lập ñược 37 chủng Azotobacter trên ñất

gò ñồi vùng Thừa Thiên - Huế Nhóm nghiên cứu cũng tuyển chọn ñược hai chủng có khả năng kháng kháng sinh, tồn tại ñược ở pH kiềm ( pH = 8) Kết quả thử nghiệm gây nhiễm cây giống keo tai tượng trong vườn ươm ñã làm tăng tỷ lệ sống, sinh khối, chiều cao cây và hàm lượng N trong lá cũng cao hơn so với ñối chứng [13]

Nguyễn Thị Phương Chi (1999) nghiên cứu bón thử nghiệm chủng cố

ñịnh N tự do Azotobacter và chủng phân giải phosphate Archomobacter,

Pseudomonas aeruginosa Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học làm tăng sinh

trưởng chiều cao mạ 7,47 - 16,93% và năng suất lúa tăng từ 13,39 – 55,85% [3]

Lâm Minh Tú, Trần Văn Tuân (2003) nghiên cứu sản xuất một số phân bón ñơn chủng, ña chủng cho cây trồng Các chủng sử dụng trong nghiên cứu là

Azotobacter bejerinski, Azotobacter vinelandii, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa Thử nghiệm trên khoai tây làm tăng năng suất từ 100 - 300% so với

ñối chứng [20]

Phạm Văn Toản (2003) sử dụng phân bón sinh học giảm ñược 20% phân bón vô cơ N, P, K nhưng năng suất khoai tây vẫn tăng so với ñối chứng 15-50%,

cà chua tăng 12-34%, lạc tăng 30% và giảm ñáng kể bệnh héo xanh [19]

Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh (1999) nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng cố ñịnh N trong rễ lúa ñến sinh trưởng của mầm lúa CR 203 Nhóm tác giả ñã phân lập ñược 78 chủng cộng sinh với rễ lúa Các chủng này có ñặc

ñiểm của chi Azospirillum Các chủng này kích thích sự nảy mầm và rễ của lúa

CR 203 [1]

Lăng Ngọc Dậu (2004) ñã nghiên cứu khả năng tạo IAA của vi khuẩn

Azospirillum lipoferum, tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn này trên môi trường

Nfb có bổ sung Tryptophan, theo dõi tại những thời ñiểm khác nhau Kết quả cho thấy tại thời ñiểm 10 ngày sau khi cấy ủ khả năng tao IAA cao nhất [4]

PHẦN II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Để ñạt ñược mục tiêu của ñề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau:

1 Phân lập và mô tả ñặc ñiểm sinh học một số chủng Azospirillum

2 Tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm bằng

nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô

3 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng

Azospirillum ñược tuyển chọn

2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

* Vật liệu:

- Các chủng vi khuẩn cố ñịnh ñạm Azospirillum ñược phân lập từ rễ cây

ngô trong giai ñoạn trổ cờ tại huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh Đăk Nông

- Giống ngô lai C919 cung cấp bởi Công ty Monsanto Việt Nam

- Vi khuẩn Azospirillum lipoferum AL10 do viện nghiên cứu và phát triển

Công Nghệ Sinh học - Đại học Cần Thơ cấp

- Cặp mồi chuyên biệt ñể nhận diện Azospirillum lipoferum ñược Viện

nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ thiết kế

dựa theo trình tự gen nif H của vi khuẩn Azospirillum lipoferum gồm:

+ Mồi xuôi: 5’-GTA AAT CCA CCA CCT CCC-3’ và

+ Mồi ngược: 5’ -TGT AGA TTT CCT GGG CCT-3’

* Hóa chất: Acid Malic, KH2PO4, Na2MoO4, CuSO4, ZnSO4, Saccarose, Agar, Biotin, Pyridoxine

* Thiết bị nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette, que cấy, box cấy vô trùng,

máy quang phổ spectrophotometer Plus 100 (Nhật Bản), máy ủ nhiệt, nồi hấp

khử trùng, PCR C1000 (Biorad, Mỹ); GelDoc (Biorad, Mỹ); Điện di Biorad

(Mỹ)

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu

- Địa ñiểm thu mẫu: ñược thực hiện tại các huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh Đăk Nông

- Địa ñiểm thí nghiệm: ñược thực hiện tại Bộ môn Sinh học thực vật, Khoa Nông Lâm nghiệp, Phòng thí nghiệm CNSH & MT, Trường Đại học Tây Nguyên

- Địa ñiểm thực nghiệm: tại Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm nghiệp,

trường Đại học Tây Nguyên

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 08/2010 tới tháng 08/2011

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu mẫu

Rễ cây ngô trong giai ñoạn trổ cờ thuộc các giống khác nhau ñược thu thập một cách ngẫu nhiên, mỗi ruộng lấy năm cây (4 cây ở 4 góc và 1 cây ở giữa ruộng) tại các huyện Krông Nô, Cư Jut, Đăk Mil thuộc tỉnh Đăk Nông Toàn bộ

bộ rễ ñược ñựng trong túi nilon ñã khử trùng Các mẫu sau khi lấy ñược ghi nhãn nơi lấy, ngày lấy và người thu mẫu Mẫu rễ cây ngô sau khi thu ñược ñem tới phòng thí nghiệm, rửa thật sạch ñất bám ở rễ dưới vòi nước chảy, ñể ráo tự nhiên, ñể riêng từng mẫu rồi tiến hành phân lập hoặc bọc riêng từng mẫu trong túi nilon ñã khử trùng buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (50C) nếu chưa phân lập ngay [5], [17]

2.3.2 Phương pháp phân lập

Cắt rễ thành những khúc nhỏ 2 - 3cm Các mẫu rễ ñược ñể riêng trong các bình tam giác tiến hành khử trùng bề mặt Rễ ñược khử trùng bằng dung dịch chloromine 1% trong 30 phút, tiếp tục khử trùng bằng cồn 700 5 phút, H2O2 3 phút rồi rửa thật sạch bằng nước cất vô trùng (6 lần) Sau ñó lấy khoảng 2g mẫu

cho vào cối giã nhuyễn rồi thêm 0,5 - 2ml nước cất vô trùng vào cối, ñể yên 10 phút và hút lấy phần trong cho vào eppendorf, ñể yên 10 phút cho dịch mẫu lắng xuống và lấy phần nước trong ñể tiến hành phân lập Lấy 0,5ml dịch nghiền rễ cho vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường NFb bán ñặc (không ñạm) Ủ ở nhiệt

ñộ 320C trong vòng 4 - 5 ngày, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Quan sát những ống nghiệm có vòng ñậm (vòng pellicle), cách bề mặt

môi trường 2 – 5 mm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn Azospirillum Chuyển

vi khuẩn từ môi trường bán ñặc sang môi trường ñặc tiến hành làm thuần giống [21]

Làm thuần giống: Cấy ria các khuẩn lạc ñược lựa chọn lên các ñĩa petri chứa môi trường NFb ñặc ñể thu khuẩn lạc ñơn Quá trình làm thuần ñược tiến hành 2 - 3 lần Chọn khuẩn lạc ñơn ñã ñược làm thuần cấy chuyền vào ống thạch nghiêng ñể giữ giống [5], [21]

* Môi trường Nfb không ñạm: [25], [34]

- 2ml dung dịch vi lượng (200mg Na2MoO4 .2H2O, 235mg MnSO4.H2O,

280 mg H3BO3, 8 mg CuSO4.5H2O, 24 mg ZnSO4.7H2O hòa tan trong

* Môi trường ñặc có chứa 15g/lít agar (Dobreigner, 1995)

2.3.3 Phương pháp mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các

chủng Azospirillum

Mô tả các ñặc ñiểm hình thái của các chủng dưới kính hiển vi, xác ñịnh ñặc ñiểm sinh học và ñịnh danh theo khoá phân loại của Bergey 1994

2.3.4 Phương pháp xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum

Đánh giá khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum dựa trên nồng ñộ

IAA có trong dich chiết từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Nồng ñộ IAA có trong dịch chiết càng cao chứng tỏ khả năng tạo IAA của chủng vi khuẩn càng mạnh Nồng

ñộ IAA ñược xác ñịnh bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530

Lấy 39ml A + 61ml B cho thêm nước cất vừa ñủ 200ml, ñiều chỉnh pH 7

- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

Lấy 553 ml H2SO4 (98%) cho vào nước cất ñủ 1 lít, ñể nguội sau 12 giờ ñược dung dịch H2SO4 ñậm ñặc 10,8M

Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8M ñã pha ở trên ñể ñược thuốc thử Salkowski

- Chuẩn bị ñường chuẩn IAA

Cân 1,6 mg IAA tổng hợp hòa tan với 10 ml dung dịch ñệm phosphat ñược nồng ñộ là 160mg/l Sau ñó tiến hành pha loãng ra các nồng ñộ 0, 5, 10, 16,

20, 40, 80 mg/l

Lấy 4 ml thuốc thử cho vào các ống nghiệm có nồng ñộ IAA khác nhau có thể tích 2 ml, mỗi nồng ñộ lặp lại 3 lần

Để 10 phút trong tối ở nhiệt ñộ phòng ñể phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau

ñó tiến hành ño OD ở bước sóng 530 nm

Từ kết quả trên, chúng tôi xác ñịnh ñược phương trình ñường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm Dựa vào phương trình ñường chuẩn ñể xác ñịnh nồng ñộ IAA ( mg/l) do các vi khuẩn tạo ra có trong môi trường nuôi cấy

Bảng nồng ñộ IAA thành lập ñồ thị ñường chuẩn

IAA 160 mg/l 0 0,0625 0,125 0,2 0,25 0,5 1 Dung dich ñệm

Thực hiện nuôi cấy các chủng Azospirillum phân lập ñược trên môi trường

chiết khoai tây (BMS) Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, mỗi bình chứa 50ml dịch môi trường, hấp khử trùng, ñể nguội Tiến hành cấy các

chủng Azospirillum vào các bình tam giác chứa môi trường ñã khử trùng Nuôi ở

nhiệt ñộ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau 72h thu dịch nuôi cấy và li tâm 8000 vòng/phút, li tâm 4 phút, lấy dịch trong ñể ño lượng IAA ñược vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh

ñạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô

Đánh giá hoạt tính cố ñịnh ñạm của các chủng Azospirillum dựa trên N

tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô N tổng số có trong lá

và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô của các lô thực nghiệm càng cao hơn so với lô ñối chứng, chứng tỏ hoạt tính cố ñịnh ñạm của chủng vi khuẩn càng mạnh

* Phương pháp thí nghiệm: Hạt ngô lai C919 ñược khử trùng bằng H2O23% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất Sau ñó, cho hạt vào ñĩa petri có bông

ñã ñược khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy

mầm Rửa sạch hạt bằng nước cất Vi khuẩn Azospirillum ñược nuôi trong ống

nghiệm sau 72h lấy dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút Sau

ñó ñem gieo 1 hạt/bầu ñất Loại ñất ñóng bầu là ñất ñỏ Bazan chỉ lấy lớp ñất mặt,

mỗi bầu ñóng khoảng 5 kg ñất Mỗi chủng Azospirillum có 1 nghiệm thức, mỗi

nghiệm thức có 15 bầu ñất, thí nghiệm ñược lặp lại 3 lần

Nghiệm thức 1: Đối chứng không bón phân, không nhiễm vi khuẩn

Azospirillum

Nghiệm thức 2: Không bón phân, nhiễm vi khuẩn Azospirillum

Các chỉ tiêu theo dõi cây ngô sau khi gieo 45 ngày: Chiều cao cây, số lá trên cây, chiều dài lá, ñường kính gốc, chiều dài rễ, khối lượng tươi, khô

Các chỉ tiêu phân tích: Hàm lượng ñạm tổng số, hàm lượng diệp lục trong

lá

* Phương pháp xác ñịnh hàm lượng ñạm tổng số: Theo phương pháp

Kjeldanl [2],[14]

* Phương pháp xác ñịnh hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục

(chlorophyll) và carotenoid ñược xác ñịnh bằng phương pháp so màu [36]

- Lấy 500mg lá, cắt nhỏ, ngâm trong 50ml aceton 80%, ñể trong tối

- Sau 3 ngày lấy toàn bộ dịch chiết ñịnh mức ñến 100ml Sau ñó lấy dịch chiết ño ở các bước sóng 663nm, 645nm và 440,5nm

Hàm lượng chlorophyll a (Ca), chlorophyll b (Cb) và carotenoid (Ccar) ñược tính theo công thức:

Ca = 0,0127 x OD663 - 0,00269 x OD645

Cb (mg x g-1) = 0,0299 x OD645 - 0,00468 x OD663

Ccar (mg x g-1) = 0,004695 x OD440,5 - 0,000268 x (Ca + Cb)

2.3.6 Phương pháp ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng

DNA ñược thực hiện trong thể tích 25 µl

Một phản ứng bao gồm: 1,0µL DNA vi khuẩn; 2,5µL 10X PCR buffer; 1,0µL mồi xuôi; 1,0µL mồi ngược; 1,0µL dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

0,5µL Taq polymerase; 18µL nước cất vô trùng

Chu kỳ phản ứng PCR gồm các bước thứ tự như sau:

Bước 1: Biến tính các mẫu ADN ở 950C trong 5 phút

Bước 2: Thực hiện tiếp ở 950C trong 1 phút

Bước 3: Hạ nhiệt ñộ ñến 550C trong 1 phút

Bước 4: Nâng nhiệt ñộ lên 720C trong 1 phút

Bước 2 ñến bước 4 lặp lại 30 chu kỳ

Bước 5: Giữ ở 720C trong 10 phút

Bảo quản sản phẩm PCR ở 40C

Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Các sản phẩm sau khi ñược khuếch ñại bằng phản ứng PCR, tiếp tục ñem ñiện di trên gel agarose 1,2% có bổ sung thêm ethidium bromide (EtBr)

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các

chủng Azospirillum ñược tuyển chọn

2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến

sinh khối của các chủng Azospirillum

Các chủng Azospirillum sẽ ñược nuôi trên 3 loại môi trường Nfb, Fallik,

môi trường nước chiết khoai tây (BMS), ở nhiệt ñộ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau 72 h tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào Mật ñộ tế bào ñược xác ñịnh tương quan OD660 = 1,0 tương ñương với mật ñộ

109 tế bào/ml [26] Chọn môi trường thuận lợi nhất cho sinh trưởng của vi khuẩn

Azospirillum ñể tiến hành những thí nghiệm tiếp theo

- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập

- Thêm nước cất cho ñủ 1000ml

* Môi trường nước chiết khoai tây (BMS) [12], [34]

- Nước chiết khoai tây: 500ml ( 200g/l )

- Acid Malic: 2,5g

- KOH: 2,0g

- Đường Sacarose: 2,5 g

- Thành phần khoáng vi lượng, vitamin như môi trường phân lập

- Thêm nước cất vừa ñủ 1 lít

- pH ñiều chỉnh ñến 6,8

2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh

khối của các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường thuận lợi nhất

chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt ñộ phòng, pH = 6,8 trên máy lắc 150 vòng/phút Sau 24h, 48 h, 72h, 96h tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6]

2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của

các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường thuận lợi nhất

(môi trường ở dạng lỏng) chọn ra từ thí nghiệm trên, nuôi cấy ở nhiệt ñộ phòng,

pH = 6,8 trên máy lắc xoay vòng ở các tốc ñộ 0, 100, 150, 200, 250 vòng/phút Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6]

2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

ñến sinh khối của các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum trên môi trường (môi trường ở

dạng lỏng), ở các pH 5,8; 6,3; 6,8; 7,3 và 7,8 Nuôi cấy ở nhiệt ñộ phòng, trên máy lắc xoay vòng 150 vòng/phút Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6]

2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh

khối của các chủng Azospirillum

Tiến hành nuôi cấy các chủng Azospirillum cố ñịnh ñạm trên môi trường,

pH thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên ở các nhiệt ñộ 270C, 320C,

370C, 420C Sau thời gian thuận lợi nhất chọn ra từ các thí nghiệm trên tiến hành

ño OD660 ñể xác ñịnh sinh khối tế bào [6]

2.3.8 Phương pháp ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn

Azospirillum ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng

Hạt ngô lai C919 ñược khử trùng bằng H2O2 3% trong 3 phút, rửa lại 4 lần với nước cất Sau ñó, cho hạt vào ñĩa petri có bông ñã ñược khử trùng, với một ít nước và ủ cho tới khi hạt nứt mộng chuẩn bị nảy mầm Rửa sạch hạt bằng nước

cất Các chủng vi khuẩn Azospirillum ñã ñược tuyển chon ñược nuôi trong ống

nghiệm sau 72 giờ lấy dịch sinh khối tế bào cho hạt ngô vào và ngâm 15 phút Với ñối chứng thì ngâm bằng nước cất Sau ñó ñem gieo, mỗi hốc gieo 2 hạt

- Nghiệm thức 9: bón 75% phân ñạm, nhiễm vi khuẩn Azospirillum chủng

Diện tích mỗi ô thí nghiệm: 2m2 (Chiều dài: 2m; Chiều rộng: 1m)

Tổng diện tích thí nghiệm: (11 ô x 2m2/ô) x 3 lần lặp lại = 66m2

+ Lượng phân bón cho 1 ha

Phân chuồng (hữu cơ): 8 tấn/ha

Phân vô cơ: 300kg Urea + 350kg Lân Văn Điển + 150kg KaliClorua (Theo qui trình của khuyến nông tỉnh Đak Lak)

+ Với nghiệm thức 8, 9, 10 thì bón lượng ñạm là 22,5%

+ Với nghiệm thức 11 thì bón lượng ñạm 30%