LUẬN VĂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG NUÔI CẤY MÔ SẸO CÂY KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb.)

Đặt vấn đềỨng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ramột bước tiến xa trong khoa học thực vật.. Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu 1

1.2.1 Mục đích 1

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên 3

2.1.1 Khái niệm 3

2.1.2 Phân loại 3

2.2 Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC) 15

2.2.1 Tổng quát về TLC 15

2.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp 25

2.3.1 Khái niệm 25

2.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật 26

2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học 29 2.4 Giới thiệu chung về Kim ngân hoa 37

2.4.1 Mô tả cây 37

2.4.2 Phân bố, thu hái và chế biến 37

2.4.3 Thành phần hóa học 38

2.4.4 Tác dụng dược lý 39

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 41

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 41

3.2 Vật liệu 41

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 41

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ 41

3.2.3 Các loại hóa chất sử dụng 41

3.3 Phương pháp thí nghiệm 42

3.3.1 Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo 42

3.3.1.1.Khử trùng mẫu lá 42

3.3.1.2.Cảm ứng tạo mô sẹo 42

3.3.2 Chuẩn bị mẫu 43

3.3.3 Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid trong cây Kim ngân bằng phương pháp thử nghiệm sinh hóa 43

3.3.4 Thí nghiệm 3: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 44

3.3.5 Thí nghiệm 4: khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 45 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

4.1 Thí nghiệm 1: cảm ứng mô sẹo 49

4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và sapoin triterpenoid bằng phương pháp trắc nghiệm sinh hóa 51

4.2.1 Khảo sát sự hiện diện của flavonoid 51

4.2.2 Khảo sát sự hiện diện của triterpenoid saponin 57

4.3 Thí nghiệm 2: khảo sát thành phần flavonoid và saponin triterpenoid bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 59

4.3.1 Khảo sát sự hiện diện flavonoid 59

4.3.2 Khảo sát sự hiện diện triterpenoid 62

4.4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân 65

4.4.1 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết Kim ngân bằng phương pháp khuếch tán qua vòng giấy lọc 65

4.4.2 Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 67

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

5.1 Kết luận 71

5.2 Kiến nghị 72

CHƯƠNG 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đề

Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ramột bước tiến xa trong khoa học thực vật Việc phát triển và sử dụng các công cụ ditruyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và cácphương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất là cơ sở cho việc sản xuấtchúng ở quy mô thương mại

Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y dược ngày càng tăngnhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triểnkhông ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn Tuy nhiên, các con đườngsinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôicấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào vàphân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuấtcông nghiệp Nhiều nghiên cứu được đã thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giảithích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ

các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro Các kết quả này cũng cho thấy các hệ thống

nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chấttrao đổi thứ cấp

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục đích

Bước đầu khảo sát một vài hợp chất có hoạt tính sinh học có trong mẫu môsẹo, hoa, cành lá của Kim ngân hoa và thử hoạt tính của chúng lên hai chủng vi

khuẩn E.coli và Samonella Từ đó tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết và

phân lập các chất có giá trị dược lý trong mô sẹo, hoa, cành lá Kim ngân làm nguyênliệu phục vụ cho nghành công nghiệp dược

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học được biết nhiều trongKim ngân hoa là saponin triterpenoid và flavonoid bằng hai phương pháp: trắcnghiệm sinh hóa và sắc ký lớp mỏng (TLC)

Thử hoạt tính dịch chiết của mô sẹo, hoa đối với hai chủng vi khuẩn E.coli và

Samonella.

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên

2.1.1 Khái niệm

Hợp chất tự nhiên, là chất biến dưỡng thứ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ,được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật Chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiếthoặc nhiều khi không cần thiết cho sự sống của sinh vật, điều này khác với nhữnghợp chất đại phân tử như protein, acid nucleic, polysacchride là những hợp chất cănbản cần thiết đối với sự sống của mỗi sinh vật (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007,Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh)

2.1.2 Phân loại

Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất và được sắp xếpthành những nhóm khác nhau Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thườngkhông phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thườngkhông rõ ràng

2.1.2.1 Alkaloid

Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ.Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R(mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito

Các alkaloid chia thành ba loại:

 Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base,thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật vàhiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ

 Protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin

và N, N–dimetyltryptamin Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từcác amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn

 Giả alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid, baogồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid

2.1.2.2 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật Hơn một nữarau quả thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trongdược liệu có nguồn gốc từ thực vật Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xácđịnh cấu trúc Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là -OH và / hoặc-OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38.627 chất Phần lớn các chất flavonoid có màuvàng (flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số có màu xanh,tím, đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid Trong thực vậtcũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàngnhư carotenoid, anthranoid, xanthon.

 Cấu trúc hóa học

Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung theo kiểu C6–

C3–C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhauqua một mạch 3 carbon

Hình 2.1: khung cơ bản của flavonoid

Người ta xem cấu trúc này gồm hai phần (được theo dõi bằng chất đồng vị):

+ C6 – C3 (tức là vòng B + 3C) phần này xuất phát từ acid shikimic dẫnđến các dẫn chất phenylpropanoid

Hình 2.2: sơ đồ hình thành phenylpropanoid

+ C6 hay là (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetat dẫn đến acid triacetic.Sau đó 2 phần được ghép lại tạo thành chalcone

Hình 2.3: cấu tạo cơ bản của chalcone

Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhântrên Đánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxy rồi tiếp đến vòng A, vòng Bđánh số phụ Trường hợp không có vòng C (nghĩa là mạch 3C hở) ví dụ trường hợpchalcon thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ

Hình 2.4: cấu tạo cơ bản của flavan

 Phân loại flavonoid

Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độoxy hóa của mạch 3C Người ta chia ra: Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở

vị trí C – 2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C – 3, neoflavonoid có gốc ary ở vị trí C– 4 Người ta còn phân biệt biflavanoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấutạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có mộtphần cấu trúc ligan

 Euflavonoid: bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3–ol flavan 4–

ol, 3,4–diol, flavanon, 3–hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon,chalcon, auron

 Isoflavonoid: bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3–ene,isoflavan – 4 –ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3–arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon,

homoisoflavon Isoflavonoid thường gặp trong họ Đậu – Fabaceac.

 Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật, bao gồm: 4–arylchrroman, 4–arylcoumarin, dalbergion

 Biflavonoid và triflavonoid: những flavonoid dimer và trimer Những hợpchất này được gọi là proanthocyanidin Ở đây những biflavonoid tạo thành từflavon, flavanon, dihydroflavonol–chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon

 Sự phân bố flavnoid trong thực vật

Trong thực vật bậc thấp flavonoid ít được gặp Trong ngành rêu chỉ phát hiệnđược rất ít chất Trong dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng đều có mặt các nhómanthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon.

Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavnoid cũng khôngnhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon,flavonol, isoflavon Nét đặc trưng của nghành hạt trần có khác thực vật bậc thấp vàngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid

Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm Có rất nhiều

họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưngcho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rấtnhiều dẫn xuất thuộc các nhóm khác nhau Tuy nhiên, một số chi có nét đặc trưng

riêng của nó, ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp các dẫn chất chalcon và auron Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất

flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm) Họ Fabaceae thìhay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid Họ Rutaceae thường gặp các flavon vàflavonol có nhiều nhóm methoxy Họ Theaceae hay gặp các flavan–3–ol HọRanunculaceae và Paeoniaceae hay gặp dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid Họ

Rosaceae chi Rubrus và Prunus ở trong quả hay gặp anthocyanin có mạch đường phân nhánh Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavonol

sulfat

Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy

có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae,Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Oridaceae, Poaceae

Hàm lượng và cả thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc Câymọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng

Hình 2.5: sơ đồ sinh tổng hợp flavonoid

 Tính chất

Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không có màu (trường hợpcác nhóm OH đã methyl hóa), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàngđậm, đến đỏ cam Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol,leuco–anthocyanidin, flavan–3–ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B vớinhóm carbonyl nên không màu

Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường Tuynhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợpvới các sắc tố khác

Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat lànhững hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan đượctrong nước tốt nhất là cồn Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu

cơ, không tan trong nước Các dẫn chất flavnoid có nhóm 7–hydroxy thường đễ tantrong dung dịch kiềm loãng

 Tác dụng sinh học của flavonoid

Các dẫn chất flavonoid có khả năng loại bỏ các gốc tự do như -HO, -ROO.Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì

sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư,tăng nhanh sự lão hóa Thí nghiệm cho thấy khả năng ức chế của một số flavonoidtheo thứ tự: myriceum > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin > naringenin >apigenis > catechin > 5,7 dihydroxy–3’, 4’, 5’ trimethoxy flavon > robinin >kaempferol > flavon

Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này

là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa Các flavonoid có 3, 5, 3’, 4’ hydroxyl có khảnăng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonxyl hoặc3’, 4’ orthodioxyphenol

Thành phần của màng tế bào có các hoạt chất lipid dễ bị peroxyde hóa, tạo ranhững sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng như đến sự hủy hoải tế bào Đuacác chất chống oxy hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có ngăn ngừacác nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ,thoái hóa gan…

Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động củaenzyme oxy hóa – khử Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase Enzymenày làm tăng tính thấm của mao mạch Khi enzyme này thừa thì gây hiện tượng xuấthuyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P Các chế phẩm chứa flavonoidchiết từ các loài Citrus như “Cemaflavone”, “Circularine”,… flavonoid từ lá bạc hà(diosmin) như “Daflon”, “Diosmil”, flavonoid từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dượckhác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính “dòn” và tínhthấm của mao mạch Tác dụng này được hợp lực cùng với acid ascorbic Flavonoidđược dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu,giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoanhư sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hòa võng mạc Các dẫn chất anthocyanosid cótác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vàoban đêm

Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ

(CCl4, benzene, ethanol, CHCl3, quinine, novarsenol, ) Dưới tác dụng của flavonoidngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng Sự tích lũyglycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan.

Việc sử dụng một số dược liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào

gan rất hiệu quả như: cây actiso, có biệt dược là Chophytol Cây Silibummarianum

Gaertn có biệt dược “Legalon”; cây bụt dấm – Hibiscus sabdariffa.

Tác dụng kích thích tiết mật thể hiện ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon,flavonol, và flavan–3–ol

Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật,ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác) Ví dụ apigemin có tác dụng làmgiảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, acetylcholine, serotonin

Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavonon, flavonol

thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt Scoparosid trong Sarothammus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capiata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoid của cây

râu mèo đều có tác dụng thông tiểu

Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycoside của rễ cam thảo đãđược ứng dụng để chữa đau dạ dày Một số dẫn chất khác như catechin, 3–O– methylcatechin, naringennin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét

Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavonon,dihydroflavonol, anthocyanin, flavan–3–ol , chalcon, isoflavon, biflavon, 4–arylcoumarin, 4–aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chấtflavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp prostaglandin

Người ta đã sử dụng rutin, citrin, leucodephinidin, quercetin, catechin để điều trị ban

đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị

Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan–3– ol,anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelarrgonin, hỗn hợp catechin của trà cótác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích của tim, thí nghiệm làm hồi phụctim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, methanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp

Cao chiết từ lá cây bạch quả (Ginko biloba) chứa các dẫn xuất 3–rutinosid của

kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin vàisoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược ví dụ

“Ginkogink”, “Tanakan” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnhmạch và mao mạch Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trínhớ, khả năng làm việc trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt.

Trên hệ thần kinh, một số C– lavon glycoside của hạt táo – Ziziphus vulgaris var spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng

an thần rõ rệt

Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chấtnhư leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV củamột số dẫn xuất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7–O–β–D–galactopyranosid

Các dẫn xuất thuộc nhóm isoflavonoid có tác dụng tương tự estrogen ví dụnhư genistein daizein Tác dụng này được giải thích do sự gần nhau về cấu trúc vớidiethylstiboestrol

Một số flavonoid khác thuộc nhóm rotenoid như chất rotenon có trong dây

mật – Deris ellptica Benth thì tác dụng diệt côn trùng đã được biết và đã được ứng

Saponin có một số tính chất đặc biệt:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũhóa và tẩy sạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làmmất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềmnhư giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu caogây nôn mửa, đi lỏng

Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin Ví dụ:sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol.Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc,

abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.

Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người

ta dùng ba dung môi này để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate,barihydroxyd, ammoni sulfate Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chấtnày để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất Phần genin tức là sapogenin vàdẫn xuất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin

Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì cóloại trung tính và loại kiềm Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hóa học có thể chiara: saponin triterpenoid và saponin steroid

- Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho Saponin là hoạt chất chính trong cácdược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn,…

- Một số dược liệu chưa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải,thiên môn, mạch môn,…

- Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một sốcây thuộc họ nhân sâm khác

- Saponin làm tăng sự thấm của tế bào: sự có mặt của saponin sẽ làm cho cáchoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu

- Một số saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn,kháng nấm, ức chế virus

Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả

bồ kết, bồ hòn; rễ cam thảo, viễn chí, cát cánh; lá như dứa Mỹ

+ Phần aglycon của glycosid: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loạihợp chất tự nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid,iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol,

2.1.2.5 Hợp chất phenol

Các hợp chất phenol dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc cóvòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy – OH Trong thiên nhiên, cáchợp chất phenol là: flavonoid, xanthon, courmarin, quinon, các phenol đơn vòng, cácpolyphenol (ligin, tanin, )

Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ởdạng glycosid Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể đựa vào đặcđiểm này để theo dõi chúng trong quá trình chiết tách, cô lập chúng ra khỏi cây cỏ.Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzmye phenolase vốn luôn

có trong cây vì thế nên sử dụng alcol nóng để chiết tách do alcol giúp hạn chế tácdụng của enzyme này

Sinh tổng hợp các hợp chất đã được biết từ rất sớm, đi từ ba amino acid làphenylamin, tyrosin, tryptophan Quá trình này xảy ra ngang một chuỗi các phản ứngphức tạp để cho phenylalanin, tyrosin, tryptophan và từ đó dẫn đến những hợp chấtphenol

2.2 Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC)

2.2.1 Tổng quát về TLC

Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng từ nhiều thế kỷ trước để tách các phẩmnhuộm từ cây cỏ Đến thập kỷ 1930 – 1940, phương pháp này được phát triển nhanhchóng với nhiều kỹ thuật khác nhau Có các loại sắc ký: sắc ký giấy (kỹ thuật sớmnhất, hiện nay ít được sử dụng vì hiệu quả tách kém thua kỹ thuật sắc ký lớp mỏng),sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký lỏng hiệunăng cao, điện di

Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thutrong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngangqua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấmkiến, tấm nhôm hoặc tấm plastic Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng

 Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắpđậy.

 Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ nhưsilica gel, alumin,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nềnphẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá

đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ

 Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọctheo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển đi lêncao nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển vớivận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùythuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất

ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫuchất trong dung môi

Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ dichuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm

2.2.1.1 So sánh TLC với kỹ thuật sắc ký khác

Nắp đậy bình sắc ký

Pha động (dung môi)

Tấm lớp mỏng bằng plastic hoặc nhôm

Pha tĩnh (chất hấp

thu)

Mẫu cần phân tích

Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích(vi lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biếtngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau.

So với phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc ký cột cổ điển cho kếtquả kém hơn do phải sử dụng một lượng lớn chất hấp thu, chất mẫu và dung môi nênquá trình thực hiện phải kéo dài, dẫn theo kết quả không tốt Tiếp theo, kỹ thuật sắc

ký lớp mỏng mới là sắc ký cột chớp nhoáng (flash column chromatography) do có sửdụng thêm áp suất nên rút ngắn được thời gian thao tác và khả năng tách riêng cácchất ra khỏi hỗn hợp ban đầu, đã cho kết quả gần đạt được so với sắc ký lớp mỏng,tuy vật vẫn mất thời gian Những năm gần đây kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp cho kếtquả nhanh, tốt, cả về mặt định tính lẫn định lượng nhưng máy rất đắt tiền, không phảiphòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị

Bảng 2.1: so sánh các đặc trưng của các kỹ thuật sắc ký

Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký cột

cổ điển

Sắc ký cột chớp nhoáng

Hấp thu Hấp thu Phân chia Phân chia

Dung dịchmẫu có tínhkém bayhơn

Dung dịchmẫu có tínhkém bay hơi

Khí hoặchơi của cáchợp chất cótính bay hơi

Mẫu cótính bayhơi nhiềuhay ít đềuphù hợpKhả năng

Nhiều giờ Vài mươi

Rất tốt Rất tốt

Rất tốt

2.2.1.2 Ưu điểm của TLC

Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điềukiện phân tích

Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc kýlớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc

ký đồ ở dạng một mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn

2.2.2 Các bước chuẩn bị trước khi TLC

2.2.2.1 Chấm mẫu lên tấm bản mỏng

 Chuẩn bị tấm bản mỏng: từ tấm bản mỏng thương mại 20 x 20 cm,dùng kéo cắt các bản với kích thước cần thiết Lưu ý sao cho tấm bảnmỏng phải lọt được vào bình giải ly

Dùng bút chì để vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức kết thúc

 Chuẩn bị dung dịch mẫu: Với mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếpmẫu lên bản mỏng; trường hợp đây là dung dịch quá sệt, có thể phaloãng mẫu Với mẫu là chất rắn, phải hòa tan hoàn toàn mẫu trongdung môi hữu cơ phù hợp, với nồng độ 2 – 5%; dung môi hòa tan mẫukhông nhất thiết phải là dung môi giải ly

Nhờ một vi quản, đặt dung dịch mẫu lên bề mặt của tấm sắc ký lớp mỏng mộtcách thận trọng, tránh không làm lũng bề mặt của lớp mỏng Thao tác: cầm vi quản(hoặc một ống nhỏ có khắc độ bằng thủy tinh để rút dung dịch) nhúng vào dung dịchmẫu, lực mao dẫn sẽ tự hút dung dịch lên vi quản, rồi đặt đầu vi quản chạm nhẹ lên

bề mặt của tấm lớp mỏng, dung dịch trong ống sẽ chảy ra và thấm lên tấm lớp mỏng.Phải nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm lớp mỏng, để vết chấm chỉ lan rộng rathành vết tròn có đường kính từ 2 – 5 mm

TLC (sắc ký lớp mỏng) là phương pháp định tính vì thế mỗi vết chấm trên bảnkhông nên chứa nhiều hơn 12 microgam (10 microgram là tối ưu) mẫu chất Với một

mẫu, có thể chấm nhiều lần, nhưng giữ cho vết chấm đừng lan rộng ra trên bản, vếtphải có đường kính từ 2 – 5 mm; muốn thế, sau mỗi lần chấm, dùng miệng thổi hơinhẹ hoặc dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi mới chấm tiếptheo vài lần nữa cho đến khi đủ lượng cần cho một vết chấm.

Sau khi chấm hoàn tất, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm,rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly; điều này đặc biệt cần thiết nếu dung dịch phamẫu là nước hoặc loại dung môi có độ bay hơi kém

Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị các dung dịch mẫunày, mỗi dung dịch mẫu chấm lên cùng một bản, vết này cách vết kia 1cm Hai vết ởngoài bìa phải các bờ cạnh 1.5 cm (đối với có kích thước 20 x 20cm)

Với bản sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch mẫu sẽ được chấm lên bảnthành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát Có thể áp dụng khoảng 10 mgcho một bản có kích thước 20 x 20 cm và chiều dầy bản 5mm Trên mức kết thúcdung môi (cách bờ cạnh trên 0.5 – 1 cm), nên dùng một đầu viết chì vót nhọt vạchmột đường hằn xuống lớp hấp thu Làm như thế, khi dung môi giải ly đi lên đến đầutrên sẽ bị buộc phải ngừng lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống như nhau

Khi dung môi lên đến đầu trên của bản, không nên để bản ở lâu trong bình,nên lấy bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuyếch tán và sự bay hơi dung môi có thể làmcác vết vừa tách được sẽ bị trải dài ra

Ngoài ra, các nhà xản xuất có bán sẵn các thiết bị tự động để chấm mẫu lênlớp mỏng Các loại thiết bị này giúp chấm dung dịch mẫu lên lớp mỏng với lượng thểtích xác định chính xác

2.2.2.2 Giải ly bản mỏng

Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bảnmỏng Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giátrị Rf của mẫu Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyển sẽnhỏ nhất

Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình Với sắc ký lớp mỏng địnhtính, chỉ cần một thể tích koảng 10 ml dung môi Quan sát chiều dầy của lớp dung

môi trong bình giải ly: không được cao quá 1 cm, bởi vì các vết chấm mẫu trên bảnmỏng cách bìa là 1cm.

Nếu sắc ký lớp mỏng với các tấm bản lớn, sử dụng bình lớn, phải tính toán thểtích dung môi trong bình không cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bản mỏng(vết chấm trên bản mỏng không được ngập vào trong dung môi khi vừa mới thả bảnvào bình)

Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần phải được bão hòa dung môi

để có một bầu khí quyển đồng nhất, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bìnhbằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc.Một hậu quả dễ thấy là nếu bình không được bão hòa dung môi, khi dung môi giải ly

là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm (hình lòng chảo) do dungmôi di ở hai bênh cạnh nhanh hơn đi ở giữa bản

Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung dịchgiải ly khoảng 0.5 – 1 cm Hệ dung môi phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ cho các vếtchính có Rf khoảng từ 0.3 đến 0.6

2.2.2.3 Hiện hình các vết sau giải ly

Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường,nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết,cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý

 Phương pháp vật lý

Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng phương pháp thông dụng nhất làphát hiện bằng tia tử ngoại (UV) Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sátbản mỏng bằng tia UV Dụng cụ đơn giản gồm một thùng rỗng, được bao phủ chungquanh bằng vật liệu màu đen để tạo phòng tối; trên nắp thùng có gắn hai bóng đèn

UV với hai loại bước sóng là μ = 254 nm và 366 nm Thùng có cửa mở ở bên hông.Muốn nhìn bản bằng đèn UV: mở cửa, đặt tấm bản mỏng vào bên trong, ở đáy thùng,đóng cửa lại, bật công tắc cho đèn sáng và quan sát tấm bản mỏng từ bên ngoài, từtrên cao nhìn xuống ngang qua một cửa sổ bằng kiếng

Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này để nhận ra các hợp chất có thể hấpthu tia UV Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm

Nếu sử dụng bản mỏng thương mại ví dụ silica gel 60 F254, bản mỏng này làsilica gel có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang (silicat kẽm có Mn hoạt hóa)hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, như vậy dưới ánh sáng 254 nm, tấm bản sẽ cómàu xanh lục chói Nếu trên tấm bản có một vết của hợp chất mà hợp chất này cũnghấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, vết này sẽ che mất huỳnh quang, xuất hiện làmột vệt tối trên nền sáng.

Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chấtphát huỳnh quang Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu

 Một số điểm cần lưu ý:

Có thể thay thế dụng cụ nêu trên bằng máy kiểm tra tiền, nhưng khi sử dụngcẩn thận vì máy này không có thùng che chắn tia UV giống như dụng cụ nói trên,nhưng biết rằng tia UV có thể gây đột biến gen

Bản mỏng với chất hấp thu có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang có thểgây nên sự thay đổi vị trí của các vết trên bản: vết ở đúng vị trí này nhưng lại nhìnthấy vết ở ví trí khác, điều này gây nên nhưng nhầm lẫn tai hại

 Phương pháp hóa học

Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòathuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt dung dịch thuốc thử này lên bảnmỏng Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu Cácthuốc thử được xếp thành 2 loại: đặc trưng và không đặc trưng

Thuốc thử không đặc trưng khi nó tạo vết có màu hầu hết với các loại hợpchất hữu cơ, thí dụ như: iod, acid sulfuric, rhodamin B, chất chỉ thị phát huỳnhquang

Thuốc thử đặc trưng khi nó chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa nhữngnhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng Thí dụ: thuốc thửdinitrophenylhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonyl để tạomàu đỏ đậm

 Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng

Muốn khảo sát các hợp chất trên bản mỏng bằng các thuốc thử đặc trưng, phảithấm bản mỏng với dung dịch thuốc thử, có thể thực hiện theo hai cách

+ Phun xịt bản mỏng bằng bình phun xịt: Thuốc thử pha theo quy định và chovào bình, thể tích thuốc thử chỉ được chiếm tối đa hai phần ba thể tích chứacủa bình Sử dụng khí nén hoặc dùng một bóp cao su để tạo sức nén, giúpdung dịch đi ra khỏi bình ở dạng giọt sương mịn Phải bóp vài cái trước để tạo

ra các giọt sương đều, rồi mới hướng đầu ra của bình vào tấm bản mỏng, saocho hơi sương phủ đều lên bề mặt bản mỏng Phương pháp có ưu điểm làdung dịch thuốc thử được sử dụng với lượng vừa đủ để tạo phản ứng màu vớihợp chất trên bản mỏng, nhược điểm là cần có thao tác khéo léo chuyênnghiệp nếu không dung dịch thuốc thử được phủ lên bản không đều, chỗ nhiềugây loang lỗ, chỗ ít không đủ để làm xuất hiện vết

+ Nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử Ưu điểm củaphương pháp này là dung dịch thuốc thử có thể phủ đều lên mặt bản: nhượcđiểm là các chất mẫu nằm trên bản khi gặp một lượng lớn thuốc thử sẽ hòatan luôn thuốc thử, có thể biến mất khỏi bản Sau mỗi lần nhúng bản vào dungdịch, một lượng nhỏ chất hấp thu silica gel sẽ rơi vào dung dịch, sau một thờigian, đáy bình chứa đầy silica gel, do đó phải thay dung dịch mới

Thường sau khi phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản vào dung dịch thuốcthử, cần phải xúc tiến phản ứng bằng cách sấy nóng bản mỏng cho đến khi các vếtxuất hiện

2.2.2.4 Lưu giữ vết để làm tài liệu

Sau khi giải ly bản, cần ghi lại những thông tin cần thiết Các chi tiết có thểghi lên mặt trước của bản bằng bút chì, hoặc ghi lên mặt sau bằng bút benzen Cácchi tiết như: dung môi giải ly, giá trị Rf của mẫu chất, hình dạng, màu sắc của vết,thuốc thử dùng để hiện hình các vết

Tờ bản mỏng cần được lưu giữ bằng cách bảo quản trong một bao plastic.Nhưng nếu để lâu, bản cũng sẽ bị phai màu hoặc hư hỏng Tốt nhất là đối với các bảnquan trọng cần phải lưu tài liệu, có thể làm các cách như sau:

+ Đặt tấm bản mỏng dưới một tờ giấy trong, dùng bút chì tô lại các vết đậm,nhạt, vị trí vết.

+ Photocopy lại tấm bản mỏng

+ Tốt nhất là chụp hình màu để lưu lại hình ảnh nguyên tấm bản với đầy đủ màusắc của các vết

2.2.2.5 Ứng dụng của TLC

 Để công bố các đặc điểm của một hợp chất

Một hợp chất tinh khiết có một vết với sắc ký lớp mỏng, với giá trị Rf khôngđổi, trong một hệ dung môi giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhấtđịnh

Muốn đo Rf sử dụng thước để đo khoảng đường di chuyển của hợp chất vàcủa dung môi Rf là tỉ số giữa đoạn đường di chuyển của hợp chất và đoạn đường dichuyển của dung môi, là con số không có đơn vị, luôn luôn nhỏ hơn một (Rf< 1).Quy ước viết Rf với hai con số lẻ sau dấu phẩy

b

a Tiền tuyến dung môi

Hình 2.12 hình minh họa bản sắc ký

Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là một vết tròn, nhỏ, đo khoảng cách từ mứcxuất phát đến tâm của vết đo Nếu vết mẫu quá to, phải thực hiện sắc ký bản mỏnglại, giảm lượng mẫu chấm, sao cho vết hiện nhỏ, gọn

Giá trị Rf của hợp chất thay đổi tùy theo nhiều yếu tố:

+ Loại bản mỏng silica gel hoặc alumina của hãng Merk hay Prolabo (bản mỏngtráng sẵn dù của cùng một hãn sản xuất cũng khác nhau tùy theo lô sản xuất).+ Hoạt độ của bản lúc sử dụng khác nhau tùy theo thời gian tồn trữ lâu, mau.+ Độ dầy của bản

+ Thành phần của dung môi giải ly, chỉ cần thay đổi một ít cũng làm ảnh hưởngkết quả Độ bão hòa dung môi trong bình giải ly của hai lần giải ly khác nhaucũng khác nhau

+ Kỹ thuật giải ly: dung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết quả khác nhau.Lượng mẫu chấm lên bản nhiều hay ít cũng làm vị trí của vết trên bản thay đổi

 Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát

Biết được số các hợp chất có trong hỗn hợp mẫu ban đầu: Chuẩn bị nhiều bản,chấm mẫu chất lên mỗi bản; mỗi bản giải ly với một hệ dung môi giải ly khác nhau,cần phải dò tìm mới có thể chọn ra được một hệ dung môi phù hợp làm rải các hợpchất ra trên cùng một bản mỏng

Nhìn số lượng các vết hiện trên bản để đoán biết mẫu ban đầu có chứa baonhiêu hợp chất Lưu ý: do bản mỏng có độ phân giải thấp cho nên nhìn thấy một vếttrên bản mỏng không có nghĩa đó là một chất, mà đó có thể là hai hoặc ba chất tụ lạivới nhau

Để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất: phân tích cộng hưởng từ hạt nhân(NMR) để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất, mẫu này phải đạt độ tinh khiết ≥95% Kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất hiệu quả nhất là HPLC, máy sẽ chobiết luôn hàm lượng phần trăm của mẫu chất Tuy nhiên, thực hiện như thế sẽ khá

tốn kém vì HPLC cần có các loại dung môi tinh khiết tiêu chuẩn của HPLC Có thể

tự mình kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị ba bản giống nhau, có vết mẫu Thực hiện sự giải ly, mỗi bản vớimột hệ dung môi giải ly khác hẳn nhau Ba hệ dung môi phải lựa chọn như thế nào

để có: một hệ dung môi đẩy các vết di chuyển gần với mức xuất phát; một hệ dungmôi đẩy vết di chuyển đến khoảng giữa bản và một hệ dung môi đẩy vết di chuyển

Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợpchất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái Nhiều hợp chất thứ cấp đượcsản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các

mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái và sựtrưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynhhướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, các tế bào không phânhóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào

ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sựphân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối tế bào để tạo thành các chấtthứ cấp (Lee, 2001)

Nuôi cấy huyền phù tế bào thường khởi đầu bằng cách đặt các khối mô sẹo dễ

vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy) Trong quá trình nuôi

trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm

tế bào với kích thước khác nhau, mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bàochết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỉ lệ cao các tế bàođơn và tỉ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộcvào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thànhphần môi trường (Misawa, 1994)

Bên cạnh nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy mô sẹo (trên môi trường rắn)

có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm làthể tích nuôi cấy ít nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếpxúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ratrong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến việc sản xuất sinh khối tếbào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinhvật ngập chìm trong môi trường lỏng

2.3.2 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật

Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thựcvật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hợp chất quý hiếmmang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khảnăng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mônông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứcấp (Dicosmo và Misawa, 1995) Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuốinhững năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuấthợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệusuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sảnphẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau:

+ Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tốmôi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng

+ Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tựnhiên (vi sinh vật và côn trùng)

+ Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khácnhau;

+ Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng củatế bào và điều hòa quátrình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên Bên cạnh

đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù củathực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp(Fisher và cs, 1999)

Hình 2.13: sơ đồ tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong thực vật

Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng pháttriển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ởmức cao hơn Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sửdụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạtđộng sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao, 2000; Dixon, 1999) Tế bào nuôicấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như: + Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp

+ Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao

+ Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal

và Tsay, 2004)

 Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Các thông số hóa học và vật lý như thành

khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chấtthứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi, 1999; Lee vàShuler, 2000; Wang và cs, 1999) Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ởmức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiệntối ưu Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như

là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy

 Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao Các tế bào thực vật trong nuôi

cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập Chọn lọc tế bào dựa vào khảnăng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin

và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng

rộng rãi Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau

24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất

từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs, 1982) Yamada và Sato (1981) đã

chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng

gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L

 Cung cấp tiền chất (precursor feeding) Bổ sung các tiền chất của quá trình

sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sảnphẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinhtổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng.Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ Tăng cườngkích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệuquả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs, 2002; Moreno và cs, 1993)

Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia

officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong

nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla

frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004)

 Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation) Thực vật sản xuất các hợp chất

thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh.Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợpchất thứ cấp Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng

bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp cóhoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học vàphi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thíchhình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúprút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985).

2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học

Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mangtính toàn cầu Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trongđiều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu

tố lịch sử và văn hóa Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thểứng dụng trong y học Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mấtnhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác Nhưvậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấpdùng trong dược phẩm Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhàkhoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sựthay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này

Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới

có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus

brevifolia) Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa

Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng.Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồngtrứng và ung thư vú Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối

u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca, 1993 và1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ungthư (Cragg và cs, 1993) Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉtách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên Lớp vỏ mỏng nàychứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô Ở cây 100 năm tuổi trung bìnhchỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toànđợt điều trị ung thư Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh

trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993) Do đó, cần có những nguồn khác để thay thếmới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học

Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để

cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff,

1991) Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành

một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra cácgiá trị thương mại to lớn Fett-Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các

chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T.

cuspidata Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy

tế bào của T baccata Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy

tế bào huyền phù của cây T mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao

2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu được từ mô sẹo có nguồn gốcthân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môitrường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mgtaxol

Tsay và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào

huyền phù của cây Angelica dahurica var Formosana Đây là một loài cây bản địa

lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến.Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da

Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var formosana bằng phương pháp nhân giống

truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu Vì vậy,phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sửdụng Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sảnphẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày Benzylaminopurine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thíchhợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM

sẽ làm tăng lượng impertatorin Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose vàfructose về hiệu quả sản xuất imperatorin Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát,

bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyếtđịnh nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng

độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy Hoặc bổ

sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợpimperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10 Hàm lượng imperatorin sảnxuất bởi phương thức này đạt 460 μg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần.

Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica

và vỏ của cây Phellondendron amurense Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6

năm Yamada và Sato (1980) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberine

cao của loài (1981) C japonica Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải

thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệuxuất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1.66 g/l (Misawa 1994)

Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm

được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụngchữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể Trong rễ của nó chứanhiều loại saponin và sapogenin khác nhau Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính

an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô mô

sẹo P ginseng để phân lập saponins và sapogenins Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P ginseng trên quy mô công nghiệp Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất.

Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes Các rễ tơ này đã sản

xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) củacác hormone steroid Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượngkhô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %).Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosanđến khả năng sản xuất diosgenin Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vàomôi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng

Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền

phù của cây Dioscorea doryophora Phương pháp này được sử dụng như một cách

thay thế quá trình tổng hợp steroid Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằngcách đưa mô sẹo vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-

được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô Sản xuất diosgenin từ cây

D doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy

mô công nghiệp

Gentiana davidii var formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài

Loan Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyềnTrung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc(Zheng và cs 1997) Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở

trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993) Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G davidii var formosa để sản

xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng Tế bào huyền phùsinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút Sự tích lũy cao nhất 2 hợpchất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24ngày nuôi cấy

Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy

mô sẹo cây Salvia miltiorrhiza Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian.

Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy mô sẹo

S.miltiorrhiza đã được khảo sát Mô sẹo sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở

trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D Mô sẹo sau đó phát triển nhanhhơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA Kết quả phân tích HPLCcho thấy mô sẹo chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô).Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong

mô sẹo tăng lên Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong mô sẹo nuôicấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu

và cs, 2003)

Bảng 2.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực

vật (Mulbagal and Tsay 2004) Loài thực vật Hợp chất thứ cấp Dạng nuôi

cấy

Tham khảo

Agave amaniensis Saponins Mô sẹo Andrijany và

Anchusa officinalis Rosmarinic alkaloids Huyền phù De-Eknamkul

Canavalia ensiformis L-Canavanine Mô sẹo Ramirez và

Cryptolepis buchanani Cryptosin Mô sẹo Venkateswara

Isoplexis isabellina Anthraquinones Huyền phù Arrebola và

 Họ: Caprifoliacea

 Chi: Lonicera L

 Loài: Lonicera japonica Thunb

Hình 2.14: hoa Kim ngân 2.4.1 Mô tả cây

Kim ngân là một loại dây leo, thân có thể vươn dài tới 10m hay hơn Cành lúccòn non màu lục nhạt, có phủ lông mịn, khi cành già chuyển màu nâu đỏ nhạt, nhẵn

Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng ba lá một, hình trứng dài, đầu hơi tù, phía cuống tròn,cuống ngắn 2 – 3 mm, cả hai mặt đều phủ lông mịn Vào các tháng 5 – 8, hoa mọctừng đôi ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có 1 cuống mang 2 hoa, hai bên lá mọc đối mang 4 hoa, lábắc giống lá nhưng nhỏ hơn Hoa hình ống xẻ 2 môi, môi lớn lại xẻ thành 3 hay 4thùy nhỏ, phiến của tràng dài gần bằng ống tràng, lúc đầu màu trắng, sau khi nở mộtthời gian chuyển màu vàng, cùng một lúc trên cây có hoa mới nở màu vàng như bạc,lại có hoa nở đã lâu màu vàng như vàng cho nên có tên là Kim ngân (kim là vàng,ngân là bạc); cây Kim ngân xanh tốt vào mùa đông cho nên còn có tên là nhẫn đôngnghĩa là chịu đựng mùa đông, 4 nhị thòi dài cao hơn tràng; vòi nhụy lại thòi dài caohơn nhị, mùi thơm dễ chịu Quả hình trứng dài chừng 5mm

2.4.2 Phân bố, thu hái và chế biến

Kim ngân là một cây loại mọc hoang dại tại nhiều tỉnh vùng núi nước ta,nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, BắcGiang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ Một số nơi người ta bắt đầutrồng lấy hoa và cành lá làm thuốc Do cây Kim ngân có lá xanh tốt quanh năm, đếntháng 4 -5 lại cho hoa đẹp và thơm cho nên có thể trồng làm cảnh và lấy bóng mát

Kim ngân có thể trồng ở miền núi cũng như ở đồng bằng Đất đai và khí hậu

Hà Nội cũng rất thích hợp Ta có thể trồng bằng dâm cành: cắt những cành bánh tẻdài chừng 20–60 cm, khoanh thành khoanh, chôn xuống dưới đất, để chừa đoạn saucùng; vào thời kỳ đầu cần tưới đều Có thể trồng quanh năm nhưng tốt nhất vàotháng 9–10 hoặc tháng 2 -3 Sau một năm có thể bắt đầu thu hoạch; thu hoạch lâunăm, càng về những năm sau càng nhiều hoa Nếu hái hoa cần hái vào lúc hoa sắp nởhay khi hoa mới nở, màu còn trắng chưa chuyển vàng Có thể hái hoa riêng, cành láriêng nhưng có thể hái hoa kèm theo một ít cành lá, về nhà mới phân, chia cành lá

riêng, hoa riêng Hoa hay cành lá hái về phơi hay sấy khô là dùng được Không phảichế biến gì khác Việc bảo quản hoa lá cành lá Kim ngân tương đối dễ vì ít bị mốc,mọt.

2.4.3 Thành phần hóa học

Hoa và lá chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid(lonicerin=scolymosid)

Một số chất carotenoid: ξ-caroten, β-cryptoxanthin, auroxanthin

Acid chlorogenic và các đồng phân của nó

2.4.4 Tác dụng dược lý

Tác dụng kháng sinh – tác dụng kháng sinh được nhiều nhà nghiên cứu chú ý

và chứng minh trong thực nghiệm

Người ta thấy nước hoa Kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với tụ cầukhuẩn vi khuẩn thương hàn, trùng lỵ Shiga Nước sắc có tác ụng mạnh hơn các dạngbào chế khác

Năm 1950, Lưu Quốc Thanh (Trung Hoa tân y học báo) đã báo cáo dùngnước sắc cô đặc 100% của hoa Kim ngân thấy có tác dụng khánh sinh rất mạnh đốivới vi trùng thương hàn, tả, liên cầu khuẩn tiêu máu (vòng vô khuẩn tới 11–20 mm),

vi trùng lỵ, trực khuẩn E.coli, tụ cầu khuẩn, phế cầu khuẩn, đối với bạch hầu cũng có

Tụ cẩu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) 1/40

Bạch hầu (Corynebacterium diphtheriae) 1/80

Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) 1/60