tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp đắng (momordica charantia l.) trong nuôi cấy in vitro

Mục tiêu của ñề tài - Tìm ñược môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành mô sẹo và phát sinh hình thái của mướp ñắng trong nuôi cấy in vitro... Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu sự

TRẦN THỊ PHƯƠNG HẠNH

TÌM HIỂU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ PHÁT

SINH HÌNH THÁI CÂY MƯỚP

ĐẮNG(momordica charantia L.)TRONG

NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

TRẦN THỊ PHƯƠNG HẠNH

TÌM HIỂU SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ PHÁT

SINH HÌNH THÁI CÂY MƯỚP

ĐẮNG(momordica charantia l.)TRONG

NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số : 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Du Sanh

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Người cam ñoan

Trần Thị Phương Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn tất luận văn này, em xin chân thành cảm ơn

Thầy TS Nguyễn Du Sanh, người thầy ñã dìu dắt em từ những buổi ñầu khi

em mới tốt nghiệp ñại học, ñã tận tình hướng dẫn, ñộng viên trong lúc khó khăn, truyền ñạt những kiến thức, những kinh nghiệm quí báu trong quá trình làm ñề tài và học tập cũng như trong cuộc sống Suốt thời gian qua, thầy ñã giảng dạy cho em rất nhiều kiến thức, em ngày càng hiểu thêm và có niềm tin vào bản thân mình hơn trong quá trình lên lớp

Thầy TS Lê Thương, Cô TS Võ Thị Phương Khanh, Cô Ths Nguyễn Thị Thu, Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, các thầy cô trong Bộ môn SHCS, SHTN, SHTV ñã

giảng dạy, tận tình giúp ñỡ và tạo ñiều kiện thuận lợi cho em trong học tập và công tác

Thầy TS Phan Văn Tân, ñã giảng dạy, bồi dưỡng những kiến thức sinh lý

thực vật, giúp em tập làm quen với nghiên cứu khoa học và truyền ñạt kinh nghiệm sống thật bổ ích

Các thầy, cô trong Hội ñồng ñã ñọc, nhận xét và ñưa ra những ý kiến quí báu

về luận văn

Thầy PGS TS Bùi Trang Việt, ñã tạo ñiều kiện thuận lợi trong thời gian em

học tập và làm luận văn tại trường Đại học KHTNTPHCM

Thầy Hoang, cô Hương, cô Tú, cô Xuân, thầy Kiệt, chị Hiền, anh Kiệt, Chị Hương và các bạn lớp cao học K18, trường Đại học KHTNTPHCM ñã giúp ñỡ trong

suốt thời gian làm luận văn

Chị Tuyến, anh Sỹ, chị Thanh, Bốn, Định, Vũ Duyên, anh Huệ, Duyên và các anh chị lớp cao học SHTN K2 ñã ñộng viên, giúp ñỡ trong quá trình học tập và làm

ñề tài tốt nghiệp

Các thầy cô ở phòng Đào tạo sau Đại học ñã tạo ñiều kiện thuận lợi trong

thời gian học tập

Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ñến ba Tường, mẹ Tham, mẹ Đông ñã luôn yêu thương, chăm sóc con Cảm ơn gia ñình chị Lan, gia ñình chị Hằng Cảm

ơn anh Thảo, người bạn ñời luôn ở bên chia sẻ, ñộng viên, giúp ñỡ em Cảm ơn con,

Anh Tuấn là niềm tin, thương yêu cho mẹ phấn ñấu

Trần Thị Phương Hạnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết 1

2 Mục tiêu của ñề tài 1

3 Ý nghĩa khoa học 2

4 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây mướp ñắng 3

1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.2 Đặc tính sinh học 3

1.1.2.1 Mô tả hình thái 3

1.1.2.2 Điều kiện sống và phân bố 3

1.1.2.3 Sâu bệnh 4

1.1.3 Thành phần và tác dụng các hợp chất tự nhiên của cây mướp ñắng 4

1.2 Sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái 6

1.2.1 Sự tạo mô sẹo 6

1.2.2 Sự phát sinh hình thái 7

1.2.3 Vai trò của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật 9

1.2.3.1 Auxin 9

1.2.3.2 Cytokinin 10

1.2.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh cơ quan 11

1.2.2.4 Giberelin 12

1.2.2.5 Acid abcisic (ABA) 12

1.2.2.6 Ethylen 12

1.2.3 Một số yếu tố khác ảnh hưởng ñến sự phát sinh hình thái thực vật 13

1.2.3.1 Tuổi của mô cấy 13

1.2.3.2 Ánh sáng 13

1.2.3.3 Nhiệt ñộ 13

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước 13

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊM CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.2 Vật liệu nghiên cứu 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Thí nghiệm khử trùng mẫu cấy 18

2.3.2 Thí nghiệm tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu của cây mướp ñắng 18

2.3.3 Thí nghiệm tạo chồi từ mô sẹo và tạo rễ từ những chồi thu nhận 24

2.3.4 Thí nghiệm khả năng thích ứng của cây con ngoài vườn ươm 26

2.3.5 Đo cường ñộ hô hấp 26

2.3.6 Xử lý số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ 3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ các chất khử trùng và thời gian khử trùng lên mẫu hột mướp ñắng 27

3.2 Sự tạo mô sẹo 28

3 2.1 Sự hình thành và tăng trưởng mô sẹo từ các nguồn mẫu 28

3.2.1.1 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lá 28

3.2.1.2 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 31

3.2.1.3 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp 34

3.2.1.4 Sự hình thành và tăng trưởng của mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp 37

3.2.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo mô sẹo 41

3.2.3 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ các nguồn mẫu 41

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình

thành từ lá 42

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng ñốt tử diệp 43

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng tử diệp 44

3.2.3.1 Sự thay ñổi cường ñộ hô hấp (CĐHH) theo thời gian của mô sẹo ñược hình thành từ lớp mỏng trụ hạ diệp 45

3.2.3 Sự gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của mô sẹo ñược hình thành từ

các nguồn mẫu 47

3.3 Sự phát sinh chồi 48

3.3.1 Sự hình thành và tăng trưởng của cụm chồi từ mô sẹo 48

3.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh chồi 52

3.4 Sự phát sinh rễ 54

3.4.1 Sự hình thành và tăng trưởng rễ 54

3.2.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ 56

3.5 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm 57

Chương 4 BIỆN LUẬN 4.1 Sự hình thành mô sẹo 58

4.1.1 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình tạo sẹo 58

4.2 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình hình thành mô sẹo 58

4.2 Sự phát sinh chồi từ mô sẹo của cây mướp ñắng 59

4.2.1 Sự thay ñổi hình thái trong sự phát sinh chồi 59

4.3.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh chồi 60

4.3 Sự phát sinh rễ từ chồi mướp ñắng 61

4.3.1 Ảnh hưởng của AIA trong sự phát sinh rễ 61

4.3.2 Sự thay ñổi hình thái trong quá trình phát sinh rễ 61

4.3.3 Các biến ñổi sinh lý trong quá trình phát sinh rễ 62

4.4 Sự thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm 62

KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1a Bố trí thí nghiệm 19

Bảng 2.1b Bố trí thí nghiệm 19

Bảng 2.2a Bố trí thí nghiệm 20

Bảng 2.2b Bố trí thí nghiệm 20

Bảng 2.3a Bố trí thí nghiệm 21

Bảng 2.3b Bố trí thí nghiệm 21

Bảng 2.4a Bố trí thí nghiệm 22

Bảng 2.4b Bố trí thí nghiệm 22

Bảng 2.4c Bố trí thí nghiệm 23

Bảng 2.4d Bố trí thí nghiệm 23

Bảng 2.6a Bố trí thí nghiệm 24

Bảng 2.6b Bố trí thí nghiệm 25

Bảng 2.7 Bố trí thí nghiệm 25

Bảng 3.1a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D) 28

Bảng 3.1b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lá sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA) 29

Bảng 3.2a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D) 31

Bảng 3.2b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ĐTD sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA) 32

Bảng 3.3a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử

diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D) 34

Bảng 3.3b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp

sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và

cytokinin (BA) 35

Bảng 3.4a Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

diêp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin 2,4-D 37

Bảng 3.4b Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

diệp cắt dọc sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có bổ sung auxin (2,4-D

hay AIA) và cytokinin (BA) 38

Bảng 3.4c Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ

hạ diệp cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường chỉ bổ sung auxin (2,4-D) 38

Bảng 3.4d Sự thay ñổi trọng lượng tươi của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ

diệp cắt ngang và cắt ngang sau 2, 3, 4, và 5 tuần nuôi cấy trên môi trường có và không bổ sung auxin (2,4-D hay AIA) và cytokinin (BA) 39

Bảng 3.5a: Ảnh hưởng của BA lên sự hình thành chồi từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi

cấy 48

Bảng 3.5b Ảnh hưởng của BA và AIA lên sự hình thành và tăng trưởng chồi từ mô

sẹo sau 4 tuần nuôi cấy 49

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của AIA lên sự hình thành và tăng trưởng rễ từ chồi sau 4 tuần

nuôi cấy 54

Bảng 3.7 Khả năng thích ứng của cây con in vitro ngoài vườn ươm 57

DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Tỷ lệ mẫu sạch và sống sau khi khử trùng bởi dung dịch chất khử trùng

với nồng ñộ và thời gian khác nhau 27

Hình 3.2 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lá theo thời gian 42 Hình 3.3 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng ñốt tử diệp theo

thời gian 43

Hình 3.4 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng tử diệp theo thời

gian 44

Hình 3.5 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt

dọc theo thời gian 45

Hình 3.6 Sự thay ñổi CĐHH của mô sẹo có nguồn gốc từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt

ngang theo thời gian 46

Hình 3.7 Sự gia tăng trọng lượng tươi và gia tăng trọng lượng khô giữa các nghiệm

thức cho mô sẹo tốt nhất ở các nguồn mẫu 47

Hình 3.8 Sự hình thành và tăng trưởng rễ sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có

và không bổ sung AIA 54

DANH MỤC ẢNH

Ảnh 1.1: Cây mướp ñắng 3

Ảnh 2.1: Cây khổ qua 10 ngày tuổi (A), lá (B), tử diệp (C), ñốt tử diệp (D), trụ hạ diệp cắt dọc (1mm) (E), trụ hạ diệp cắt ngang (1mm) (F) 17

Ảnh 3.1 Mô sẹo từ lá 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ 30

Ảnh 3.2 Mô sẹo từ lá 5 tuần tuổi 31

Ảnh 3.3 Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ 33

Ảnh 3.4 Mô sẹo từ lớp mỏng ñốt tử diệp 5 tuần tuổi 34

Ảnh 3.5Mô sẹo từ lớp mỏng tử diệp 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ 36

Ảnh 3.6 Mô sẹo từ lá lớp mỏng tử diệp 5 tuần tuổi 37

Ảnh 3.7Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 3 tuần tuổi, mũi tên trắng chỉ rễ 40

Ảnh 3.8Mô sẹo từ lớp mỏng trụ hạ diệp cắt dọc và ngang 5 tuần tuổi 40

Ảnh 3.9 Sự phân chia của tế bào ở gân lá (A), các tế bào mô sẹo phía ngoài sau 2 tuần (B), các tế bào mô sẹo phía ngoài sau 5 tuần (C) 41

Ảnh 3.10 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 1 tuần nuôi cấy, mũi tên xanh chỉ nốt tròn, mũi tên trắng chỉ chồi 50

Ảnh 3.11 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy 51

Ảnh 3.12 Chồi ñược hình thành và phát triển từ mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy 52

Ảnh 3.13 Phẫu thức cắt ngang mô sẹo qua các nốt xanh (A), chồi ñược hình thành từ các nốt trên mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy (B), 15 ngày (C), mũi tên xanh chỉ nối xanh, ,mũi tên ñỏ chỉ bó mạch, mũi tên vàng chỉ phát thể lá, mũi tên trẵn chỉ ñỉnh sinh trưởng

53

Ảnh 3.14 Rễ ñược hình thành sau 4 tuần tuổi nuôi cấy 55

Ảnh 3.15 Phẫu thức cắt ngang gốc thân cây mướp ñắng in vitro 0 ngày (A), 5 ngày

(B), sơ khởi rễ kéo dài (C), rễ (D), nuôi cấy trên môi trường bổ AIA 0,5 mg/l, mũi

tên trắng chỉ tượng tầng libe-mộc, mũi tên mũi xanh chỉ tế bào phân chia, tên mũi ñỏ chỉ sơ khởi rễ, mũi tên tên vàng chỉ rễ kéo dài 56

Ảnh 3.16 Cây mướp ñắng ngoài vườn ươm 57

Cho ñến nay, ñã có rất nhiều công trình nghiên cứu về mặt dược liệu của

cây mướp ñắng (Momordica charantia L.), chủ yếu tập trung vào việc ly trích,

phân tích các thành phần hoá học của các hợp chất thứ cấp có trong cây [1],[9] Trong khi những nghiên cứu về sinh lý cơ bản còn rất ít Ngoài ra, việc nhân giống cây chủ yếu bằng phương pháp gieo hạt, cây con rất dễ bị bệnh tấn công làm cho năng suất, hàm lượng và chất lượng các hợp chất tự nhiên trong cây giảm sút

Vì vậy, việc nhân giống cây dược liệu ñang ñược các nhà nuôi cấy mô quan tâm Nuôi cấy mô tế bào thực vật ñã không ngừng phát triển và ñem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng Do ñó, ñể có giống cây mướp ñắng ñồng nhất, sạch bệnh và số lượng lớn, nuôi cấy mô cây mướp ñắng ñang trở thành việc làm cần thiết

Đề tài: “Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp ñắng

(Momordica charantia L.) trong nuôi cấy in vitro” ñược thực hiện nhằm hiểu

biết thêm về khoa học nuôi cấy mô, vi nhân giống trên ñối tượng mướp ñắng Đây cũng là nghiên cứu cơ bản ñể ứng dụng cho các ñối tượng khác thuộc họ bầu bí

2 Mục tiêu của ñề tài

- Tìm ñược môi trường thích hợp nhất cho sự hình thành mô sẹo và phát

sinh hình thái của mướp ñắng trong nuôi cấy in vitro

- Xác ñịnh khả năng hình thành mô sẹo trên những nguồn mẫu khác nhau

(tử diệp, trụ hạ diệp, lá non,…) và ảnh hưởng của chất ñiều hoà sinh trưởng lên sự

phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro

3 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp ñắng

trong nuôi cấy in vitro sẽ tìm ra mối liên hệ giữa mô, tế bào, các giai ñoạn phát

sinh hình thái và giải thích vai trò của các chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật trong

sự phát sinh cơ quan ở cây mướp ñắng

4 Ý nghĩa thực tiễn

Tìm hiểu sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái cây mướp ñắng trong nuôi

cấy in vitro ñể biết ñược phương pháp, kỹ năng nuôi cấy mô trên ñối tượng mướp

ñắng, góp phần xây dựng thành một qui trình vi nhân giống, nghiên cứu những sản

phẩm nuôi cấy in vitro, …

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 4 BÀN LUẬN

Chương 3 KẾT QUẢ

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

MỞ ĐẦU

1.1 Giới thiệu chung về cây mướp ñắng

Chi (Genus): Momordica

Loài (species): Momordica charantia L

Ảnh 1.1: Cây mướp ñắng 1.1.2 Đặc tính sinh học

1.1.2.1 Mô tả hình thái

Mướp ñắng là loại cây dây leo có tua cuốn, thân có góc cạnh, ở ngọn hơi

có lông tơ Lá mọc so le, dài 5 - 10cm, rộng 4 - 8cm, phiến lá chia 5 - 7 thùy hình tim tròn, mép có răng cưa ñều, mặt dưới lá mầu nhạt hơn mặt trên, trên gân

lá có lông ngắn Hoa mọc ñơn ñộc ở kẽ lá, ñực cái cùng gốc, có cuống dài, cánh hoa màu vàng nhạt, ñường kính của hoa chừng 2cm

Trái hình thoi dài 8 - 15cm, trên mặt có nhiều u nổi lên, trái chưa chín có màu xanh hoặc vàng xanh, khi chín có màu vàng hồng, trong trái có hột dẹt dài

13 - 15mm, rộng 7 - 8mm, gần giống hột bí ngô, quanh hột có màng màu ñỏ như màng gấc [28]

1.1.2.2 Điều kiện sống và phân bố

Mướp ñắng dễ trồng, không kén ñất Là cây ưa ẩm, ưa sáng, sợ úng Vì trái mướp ñắng có hình dạng ngộ nghĩnh, ñẹp nên còn ñược trồng làm cảnh, lấy bóng mát kết hợp ăn trái, làm thuốc trong gia ñình

Trên thế giới, mướp ñắng ñược trồng nhiều ở các nước châu Á, Mỹ Latinh Ở nước ta, mướp ñắng ñược trồng ở khắp mọi miền Mùa quả ở miền Bắc

là các tháng 5-6-7 Riêng ở các tỉnh miền Nam, mướp ñắng có quanh năm [28]

1.1.2.3 Sâu bệnh

Sâu hại chính thường có

- Giòi ñục trái (Zeugodacus caudatus): phải chú ý phòng trừ sớm khi ruồi mới

ñẻ trứng, thường vào giai ñoạn quả mới ñậu hoặc còn non

- Sâu xanh (Hilecoverpa armigera): sâu hại hoa và trái ở tất cả các thời kỳ

- Giòi ñục lá (Liriomyza spp.) làm trắng lá, ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng của

cây

- Khi mật ñộ các loài sâu hại cao có thể sử dụng các biện pháp sau :

+ Thuốc trừ sâu sinh học: các lọai BT, Aztrol, Dipel, Xenteri, thời gian cách

ly 3 ngày khi cây có hoa và trái non

+ Thuốc trừ sâu hóa học: Sherpa 25 EC, Match 50 ND, Success 25 SC, Vertimec 1.8 EC,… theo hướng dẫn ghi trên bao bì, thời gian cách ly từ 7 -10 ngày

+ Sau thời kỳ ra hoa và ñậu trái non chỉ ñược dùng thuốc sinh học, chủ yếu các loại thuốc BT

- Bệnh hại: bệnh phấn trắng (Erysiphe sp.) hại chủ yếu trên lá, cần phòng trừ

sớm bằng các thuốc: Ridomin MZ 72WP nồng ñộ từ 30-50g/10lít nước Thời gian cách ly 7-10ngày; Validacin 3SL nồng ñộ 0.1-0.2% Thời gian cách ly tối thiểu 10 ngày Khi sử dụng thuốc ñều phải tuân theo hướng dẫn trên nhãn bao bì của từng loại thuốc [28]

1.1.3 Thành phần và tác dụng các hợp chất tự nhiên của cây mướp ñắng

Năm 1990, Liên Hiệp Quốc phát hành bộ tem dược thảo, mỗi con tem là một cây thuốc ñược Liên Hiệp Quốc cho là có giá trị chữa bệnh trên thế giới, mướp ñắng ñược chọn làm một trong 6 cây tiêu biểu [23]

Mướp ñắng có thành phần dinh dưỡng cao Trong 100g trái mướp ñắng chứa: chất béo 0,10g; chất ñạm 0,90g; chất bột ñường 4,70g; các khoáng chất như K 250mg, Ca 22mg, Mg 16mg, Fe 0,9mg, Zn 0,1g Các vitamin: A 4mg, C 50g, B1 0,05mg, B2 0,03mg, PP 0,40mg…

Trong lá và trái mướp ñắng có chứa polyphenol và flavonoid (mùa ñông cao hơn mùa hè một chút), hàm lượng polyphenol và flavonoid trong trái cao hơn trong lá: polyphenol: 3,85% trong trái; 3,09% trong lá già flavonoid: 1,34% trong trái; 1,12% trong lá già Các chất quan trọng là glycosid: charantin và momordicin Charantin và polypeptid – P có tác dụng làm hạ ñường huyết Momordicin có tác dụng diệt vi khuẩn, siêu vi và hỗ trợ cho cơ thể chống lại các tế bào ung thư ñang phát triển, alkaloid trong mướp ñắng có công hiệu lợi tiểu, máu lưu thông, chống viêm, hạ sốt, mát gan, sáng mắt, phòng chống ung thư [24]

Năm 1984, nhiều nhà sinh hóa và dược lý của các nước vùng Caribê ñã công bố: chất momordicosid trong trái mướp ñắng là một hợp chất có tác dụng sinh học

quan trọng làm giảm glucose trong máu… Đặc biệt, polypeptid-P (P- insulin;

plantinsulin) ñược cô lập từ trái, hột và các mô trong thân, lá… có tác dụng sinh học gần giống insulin, giúp cơ thể tăng tiết insulin, làm hạ glucose trong máu có tác dụng cải thiện rõ sự dung nạp glucose ở người tiểu ñường týp II trong giai ñoạn

chưa có biến chứng ñã ñược công bố ở nhiều nước trên thế giới [25]

Theo Nguyễn Minh Đức và cộng sự (2002), từ hột mướp ñắng ñã chiết xuất và phân lập ñược 4 hợp chất Mc1, Mc2, Mc3, Mc4 Trong ñó Mc1 ñược xác ñịnh là

momordicosid A có tác dụng sinh học (diệt khuẩn) dựa vào mô hình thử tác dụng

ñộc trên ấu trùng tôm biển (Artemia salina) [1]

1.2 Sự tạo mô sẹo và phát sinh hình thái

1.2.1 Sự tạo mô sẹo

Trong nuôi cấy in vitro, mô sẹo là ñám tế bào không phân hoá, có ñặc tính

phân chia mạnh, thường ñược tạo ra từ những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan Do ñó, các phần non của cơ thể thực vật (mô phân sinh ngọn, thân, rễ…)

dễ cho mô sẹo trong ñiều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác ñộng của một auxin

mạnh ñược áp dụng riêng rẽ hay kết hợp với cytokinin Ngược lại, những mảnh

cơ quan trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo [10],[11]

Sự tạo mô sẹo, nhờ auxin, thuộc một trong ba quá trình:

- Sự phản phân hoá của các tế bào nhu mô (ít nhiều ở sâu bên trong cơ quan)

- Sự phân chia của các tế bào tượng tầng

- Sự xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi (chồi hay rễ) Trong quá trình này ñược ưu tiên áp dụng ở cây một lá mầm, vì các cây này không

có các tượng tầng ñiển hình, và các tế bào nhu mô khó phản phân hoá (so với cây hai lá mầm)

Để tạo mô sẹo, cần chú ý ñến tình trạng sinh lý của mô cấy, sự dùng auxin riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin, bản chất và nồng ñộ auxin [11]

1.2.2 Sự phát sinh hình thái

Phát sinh hình thái là sự phát triển của cơ thể thực vật: tế bào, mô, cơ quan theo thời gian, từ lúc khởi ñầu cho ñến lúc trưởng thành, ñể hoàn tất chu trình phát triển Bao gồm quá trình:

- Phát sinh mô (histogenesis)

- Phát sinh cơ quan (organogenesis)

- Phát sinh phôi (embryogenesis)

Trong chu trình phát triển, mỗi thực vật ñều ở trạng thái cử ñộng phát sinh hình thái Các cơ quan thực vật tác ñộng lẫn nhau trong sự phát triển của riêng mình, sự tiến hoá của những cơ quan phụ thuộc vào sự tiến hoá của những

cơ quan khác, cấu trúc toàn vẹn của cơ thể thực vật là do toàn bộ các tương tác giữa các cấu trúc hợp thành

Ở môi trường nhân tạo, mô cấy thoát khỏi sự tương quan mà nó phải chịu trong cơ thể thực vật nguyên vẹn ñể thiết lập một tương quan mới Tuy nhiên, dù

trong các ñiều kiện in vitro, sự phát triển của thực vật là một chuỗi lần lượt các

quá trình liên tiếp nhau theo một trật tự không thể ñảo ngược

• Sự phát sinh cơ quan

Phát sinh cơ quan là quá trình các tế bào và mô tạo ra cấu trúc một cực, cực chồi hoặc cực rễ Đây là một quá trình liên quan ñến sự tăng sinh và sự phân hóa tế bào, phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng của các chất ñiều hoà tăng trưởng thực vật khác nhau [11], [29]

Trong thiên nhiên, sự phát sinh cơ quan có nguồn gốc từ các mô phân sinh ngọn Mô phân sinh ngọn chồi ở cây hạt kín thường có ñường kính 100 - 200µm, với các tế bào ñang phân chia, chưa biệt hoá cao về mặt hình thái, nhưng có khả năng phát sinh hình thái

Mô phân sinh ngọn có vai trò quan trọng trong sự hình thành cơ quan và duy trì chính nó Việc duy trì tính toàn vẹn của mô phân sinh ngọn ñòi hỏi sự chính xác trong phân chia, tăng rộng và biệt hoá của tế bào Các tế bào ở vùng vỏ phân chia theo hướng thẳng góc với bề mặt mô phân sinh cho ra các lớp biểu bì

và dưới biểu bì của thân và lá Một số ít tế bào từ phân chia trong vỏ và có thể cho sự khởi lá, thân, nụ nách và các bộ phận của hoa (nếu là nụ hoa) Các tế bào của vùng thể phân chia vừa theo hướng thẳng góc vừa theo hướng song song với

bề mặt của mô phân sinh làm gia tăng thể tích tế bào [11],[29]

Trong nuôi cấy in vitro, sự phát sinh cơ quan (chồi hay rễ) có thể ñược

thực hiện từ chồi hiện diện sẵn hay từ sự tạo mới

- Sự phát triển chồi

Các chồi tận cùng và các chồi nách hiện diện sẵn, ở trạng thái hoạt ñộng

hay nghỉ, có thể phát triển in vitro (không phải sự tạo mới cơ quan) Một mô cấy

chứa một chồi duy nhất có thể phát triển thành một chồi duy nhất hay cụm chồi, tùy thuộc vào loài, trạng thái sinh lý của mô cấy và môi trường nuôi cấy

Kích thích sự phát triển của chồi hiện diện sẵn là phương pháp vi nhân giống chậm nhất, nhưng là cách thông dụng, dễ áp dụng nhất trong hầu hết các loài thực vật, ñặc biệt ñối với các cây gỗ (vì sự sinh phôi thế hệ và tăng trưởng chồi/rễ bất ñịnh khó thực hiện hơn)

- Sự tạo mới chồi

Mọi cơ quan thực vật ñều có khả năng tái sinh các mô phân sinh ngọn chồi bởi sự sinh cơ quan trực tiếp hay gián tiếp Ở cây hột kín, nguồn gốc của mô phân sinh ngọn chồi có thể là tế bào biểu bì, mô hàng rào (mô dậu), mô khuyết hay mô bao quanh mạch của mẫu cấy

Trước sự phân hoá ñể tạo tầng phát sinh của chồi ñược tạo mới, tiền mô phân sinh hay tế bào phân hoá ñều phải qua sự tái hoạt ñộng Sự tái hoạt ñộng này có thể ñược cảm ứng trên cây nguyên bằng sự ñàn áp các hiệu ứng cản tương

quan (thí dụ: cắt bỏ vùng ngọn ñể gỡ ưu tính ngọn) hay trên mô cấy nhờ các môi trường thích hợp Sự tái hoạt ñộng gồm hai giai ñoạn: khử phân hoá và tái phân hóa

Trong sự tạo mới chồi từ các tế bào lá ñã phân hóa, người ta cho rằng có

sự hiện diện của các nhóm tế bào ñặc biệt, gọi là mô ñích Các tế bào này là nơi nhận các thông tin hoá học, ñặc biệt là chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật: nếu auxin có tác dụng tạo rễ ñối với các mô quanh mạch (nguồn gốc nội sinh của rễ) thì citokinin có tác dụng tạo chồi ñối với các mô ngoại vi (nguồn gốc ngoại sinh của chồi) Tỷ lệ auxin/cytokinin xác ñịnh một chương trình phát sinh hình thái (rễ hay chồi) [8]

- Sự phát sinh rễ

Sự thành lập rễ bao gồm 2 giai ñoạn có thể thấy ñược dưới kính hiển vi: giai ñoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe - mộc hay chu luân

và giai ñoạn kéo dài sơ khởi rễ này

Trong phần lớn trường hợp, sự hiện diện của cytokinin giúp cho sự tạo chồi sẽ cản sự tạo rễ Do ñó môi trường cảm ứng sự tạo rễ phải là môi trường khác và ñôi khi phải qua nhiều lần cấy chuyền trên môi trường không có cytokinin

Một ñiều cần ñược lưu ý trong sự tái sinh cây từ mô sẹo là nguy cơ biến dị thể hệ Những biến ñổi về di truyền sẽ xảy ra khi cây ñược tái sinh từ mô sẹo ñược cấy chuyền qua nhiều lần và duy trì trong thời gian dài [15]

1.2.3 Vai trò của các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật

1.2.3.1 Auxin

Auxin rất cần thiết cho sự phân chia và tăng trưởng của tế bào nên nó có vai trò quan trọng trong sự phát sinh hình thái thực vật Auxin ñược tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non ( là các nơi có sự phân chia

tế bào nhanh) Sau ñó, auxin di chuyển hướng gốc tới rễ và tích tụ trong rễ [11]

Auxin ở nồng ñộ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi rễ này [7] Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamin (như thiamin mà rễ không tổng hợp ñược), acid amin (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho-diphenolic (như acid cafeic, acid chlorogenic) [11]

Auxin cảm ứng hoạt ñộng của mô phân sinh rễ, chất này di chuyển từ gốc ñến ngọn rễ và ñẩy mạnh sự phân chia tế bào tại ñây Điều này cho thấy tác ñộng của auxin chủ yếu trong giai ñoạn phân chia tế bào chứ không phải suốt quá trình

kéo dài rễ [15]

Trong số các loại auxin ñược sử dụng trong nuôi cấy in vitro, 2,4-D ñược

xem là một auxin mạnh, có tác ñộng hình thành mô sẹo Tuy nhiên nếu sử dụng nồng ñộ quá cao, auxin này sẽ gây ñộc cho tế bào, thậm chí gây biến ñổi di truyền Trong sự hình thành sơ khởi rễ bất ñịnh, sử dụng NAA, AIA hay IBA thường ñược hiệu quả cao hơn so với 2,4-D Tuy nhiên, tác ñộng của auxin ngoại sinh trong sự phát sinh hình thái cơ quan còn tùy thuộc vào trạng thái sinh lý cũng như hàm lượng chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh trong mô cấy Trong suốt quá trình tạo rễ bất ñịnh, hàm lượng AIA tích lũy tăng cao Điều này ñược giải thích là do auxin ngoại sinh ức chế hoạt ñộng của enzyme IAA oxidase và IBA có khả năng chuyển ñổi thành AIA Do ñó cũng làm tăng nhanh lượng IAA nội sinh, kích thích sự hình thành rễ bất ñịnh [15]

1.2.3.2 Cytokinin

Trong thực vật, cytokinin ñược tổng hợp chủ yếu từ mô phân sinh ngọn rễ

Từ ñó chúng ñược vận chuyển trong mạch mộc tới chồi Tuy nhiên, các chồi và phôi cũng là nơi tổng hợp cytokinin [11]

Ở rễ, cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích tăng rộng tế bào [7] Cytokinin ngăn cản sự lão hóa, thúc ñẩy sự trưởng thành của diệp lạp và là nhân tố chính ñiều khiển quá trình tái sinh mạch giúp cho sự tạo chồi [4] Trong sự hình thành chồi,

cytokinin có thể ñược sử lý riêng rẻ hay phối hợp ñể làm tăng khả năng hình thành và chất lượng của chồi

Ở nồng ñộ cytokinin cao giúp tạo thành cụm chồi Số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng ñộ cytokinin Cytokinin ở nồng ñộ thấp kích thích chồi nách phát triển Nồng ñộ cao hơn sẽ cảm ứng hình thành chồi bất ñịnh nhưng chồi rất khó ra rễ

Ở một số loài thực vật, mặc dù sự hình thành chồi ñược cảm ứng bởi cytokinin nhưng chồi không xuất hiện cho ñến khi mẫu ñược chuyển sang môi trường giảm hoặc không có cytokinin Cytokinin cần cho giai ñoạn cảm ứng tạo chồi nhưng kìm hãm sự kéo dài của chồi Những vấn ñề này có thể khắc phục bằng cách giảm nồng

ñộ chất ñiều hòa sau vài lần cấy chuyền ñể chồi ñược phát triển tốt [15]

1.2.3.3 Sự phối hợp auxin và cytokinin trong phát sinh cơ quan

Auxin phối hợp với cytokinin giúp tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng ñộ cao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay của chồi nách [11]

Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, nhất là khi phối hợp với auxin Cytokinin tác ñộng trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Dù hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng nhưng cũng có sự ñối kháng giữa cytokinin (giúp sự tạo chồi) auxin (giúp sự tạo rễ) Vì vậy, trong con ñường phát sinh hình thái thông qua mô sẹo, việc phối hợp cytokinin và auxin sẽ quyết ñịnh chiều hướng phát sinh hình thái Miller và Skoog (1965) ñã chứng minh mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay chồi tuỳ theo tỷ lệ auxin/cytokinin thấp giúp sự tạo chồi [11]

1.2.2.4 Giberelin

Giberelin kích thích sự kéo dài tế bào bởi cơ chế kiểm soát hướng ñặt của các

vi sợi Nó cũng có tác dụng kéo dài lóng do sự phối hợp hoạt tính kéo dài và phân chia tế bào thân Giberelin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu

bì Giberelin cũng có tác ñộng kích thích sự tăng trưởng chồi và gỡ sự ngủ của chồi

Tuy nhiên giberelin có những ảnh hưởng khác nhau trên sự hình thành chồi trong

nuôi cấy in vitro ở những loại thực vật khác nhau [11]

1.2.2.5 Acid abcisic (ABA)

ABA ñược xem là một nhân tố kìm hãm quá trình sinh lý, ñặt biệt là sự tăng trưởng của thực vật Tuy nhiên, cũng như những hormon khác, tác ñộng kích thích hay kìm hãm quá trình sinh lý của ABA còn tuỳ thuộc vào nồng ñộ xử lý, và sự tương tác của ABA với những hormon khác [11]

1.2.2.6 Ethylen

Ethylen là nhóm chất ức chế, gây sự lão suy tế bào Ethylen ñược hình thành

từ tiền chất là SAM (S-adenosiylmethionin, trước ñó là methionin), thông qua các enzyme ACC-synthase, và ACC oxydase ñể biến ñổi lần lược thành ACC (acid l – amino-cyclopropan-l-carboxylic) và etylen Hoạt tính của các chất trên dễ bị cản bởi

tác ñộng cản hoạt ñộng của etylen [11]

ACC ức chế sự hình thành rễ bằng cách trì hoãn sự xuất hiện rễ và gia tăng

sự hình thành mô sẹo ở gốc của chồi Ngược lại, cả hai chất ức chế hoạt ñộng của

sự hình thành mô sẹo ở gốc của chồi AgNO3 kích thích sự xuất hiện và sự tăng

và sự hình thành rễ Những ảnh hưởng này là do sự giảm nồng ñộ etylen hoặc ức chế hoạt ñộng của etylen [15]

1.2.3 Một số yếu tố khác ảnh hưởng ñến sự phát sinh hình thái thực vật

1.2.3.1 Tuổi của mô cấy

Hiệu quả tác ñộng của các chất ñiều hoà tăng trưởng thực vật trên sự phát sinh hình thái phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của mô cấy

Ở nhiều loài, ñặc biệt ở cây thân gỗ, chồi bất ñịnh ñược hình thành một cách

dễ dàng ở những mô trẻ từ các bộ phận của cây con mới nẩy mầm hơn những khúc cắt từ cây trưởng thành [4]

1.2.3.2 Ánh sáng

Ánh sáng có tác ñộng ñến sự tăng trưởng và khả năng phát sinh hình thái của

tế bào trong nuôi cấy in vitro Tuy nhiên mỗi loài thực vật khác nhau có những ñáp

ứng khác nhau với từng loại ánh sáng, cường ñộ và thời gian chiếu sáng khác nhau Thường sự hình thành rễ xảy ra trong tối [4]

1.2.3.3 Nhiệt ñộ

Trong nuôi cấy mô in vitro, mỗi loài thực vật khác nhau có những

ngưỡng nhiệt ñộ tối hảo khác nhau Đa số các loài hình thành chồi ở nhiệt ñộ

220C – 250C [4]

1.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Li Z (2004) thuộc Trường ñại học Xihua ở Chengdu, Trung Quốc, nghiên cứu ñiều kiện nuôi cấy tối ưu mô sẹo mướp ñắng ghi nhận, trong môi trường MS

có bổ sung casein 100mg, glucose 30g/l, BA 0,5mg/l, 2,4-D 0,2mg/l là ñiều kiện tối ưu cho sự hình thành mô sẹo [17]

Yang và cộng sự (2004) ghi nhận, khi nuôi cấy mô mướp ñắng cho ba loại

mô sẹo khác nhau: mô sẹo vàng trong, vàng xanh và xanh Những mô sẹo này tiếp tục nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 4,0mg/l và kinetin 2,0mg/l cho chồi bất ñịnh sau ba tuần nuôi cấy Tỷ lệ chồi bất ñịnh hình thành trên từng loại mô sẹo khác nhau 66,7% ñối với mô sẹo vàng xanh, rất thấp ở mô sẹo xanh (< 15,0%) thậm chí thấp hơn nữa, chồi bất ñịnh không hình thành trên mô sẹo vàng trong Môi trường MS bổ sung zeatin 5,0mg/l và kinetin 0,5mg/l thích hợp cho phát sinh chồi, hệ số phát sinh là 5 - 6 Môi trường ½ MS và kinetin

0,02mg/l hoặc môi trường ½ MS sau 3 tuần nuôi cấy cho thân và rễ Tỷ lệ sống sót khi ñem trồng là 70% [20]

Thiruvengadam và cộng sự (2006) nghiên cứu về sự tối ưu hoá hệ thống phát sinh phôi soma ở mướp ñắng cho thấy, sẹo bở mướp ñắng nuôi cấy trong môi trường MS lỏng bổ sung 2,4-D 1,5 mg/l cho phôi hình cầu (24,6%) Việc loại bỏ hoàn toàn 2,4-D ra khỏi môi trường kích thích hình thành nên phôi hình tim và hình cá ñuối Từ tế bào soma hình thành nên tế bào tiền phôi, từ ñó phát triển thành phôi hình tim, hình cá ñuối trong vòng hai tuần trên môi trường MS không bổ sung chất ñiều hoà sinh trưởng Nhưng nếu trong môi trường trên ñược

bổ sung thêm PVP (polyvinylpyrrolidone) 50 mg/l và glutamine 40 mg/l, phôi soma ñược hình thành nhiều hơn và thường xuyên hơn [29]

Agarwal và cộng sự (2006) nghiên cứu sự tổng hợp flavonoid của mô sẹo

và cây mướp ñắng trong nuôi cấy in vitro trên môi trường MS có bổ sung Auxin

và cytokinin với các nồng ñộ khác nhau ghi nhận có 3 loại flavonoid Hàm lượng tổng số flavonoid ở mô sẹo sau sáu tuần nuôi cấy là 2,90 mg/g, ở thân là 2,96 mg/g trọng lượng khô… [12]

Al Munsur1 và cộng sự (2009) nhân giống invitro mướp ñắng từ ñốt thân

và rễ cây non sau 10 ñến 12 ngày gieo hạt trên môi trường MS có bổ sung BA kết hợp với 2,4-D hoặc NAA ghi nhận, mẫu ñốt thân cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất (93,75%) khi nuôi cấy có bổ sung 2,4-D 1,0mg/l và BA 1,0mg/l Mẫu cấy rễ cho

tỷ lệ mô sẹo cao nhất (85,00%) với NAA 0,6 mg/l Ngoài ra, bổ sung 2,4-D 1,0 mg/l và BA 1,0 mg/l tỷ lệ tái sinh chồi là 75,00% từ ñốt thân, chồi tái sinh ñạt chiều cao nhất (5,15cm) khi kết hợp BA 2,5 mg/l và IAA 0,2 mg/l Không có sự tái sinh chồi từ mẫu cấy rễ ở bất kì sự kết hợp nào [13]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong nước có rất ít tài liệu nghiên cứu về cây mướp ñắng ñược công bố

Nguyễn Bá và cộng sự (1992), bước ñầu xây dựng ñược quy trình nhân nhanh in vitro cây mướp ñắng và ñã ñưa ra trồng thử nghiệm cây mướp ñắng ở quy mô nhỏ [26]

2.1 Nội dung nghiên cứu

1- Tìm hiểu thời gian và nồng ñộ chất khử trùng thích hợp

2- Môi trường & chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp (auxin, cytokinin) ñể tạo và tăng sinh mô sẹo

3- So sánh phản ứng tạo mô sẹo giữa các nguồn mẫu cấy khác nhau (tử diệp, trụ hạ diệp, lá non,…)

4- Khảo sát sự tạo chồi (cụm chồi, tăng trưởng chồi) từ mô sẹo

5- Khảo sát sự tạo rễ từ những chồi thu nhận

6- Khảo sát khả năng thích ứng của con in vitro ngoài vườn ươm

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Nguồn vật liệu: hột mướp ñắng do công ty GINO - Seed & Agriculture TP Hồ Chí Minh cung cấp Hột giống có ñộ sạch ≥ 98%, tỷ lệ nảy mầm ≥ 80%, ñộ ẩm < 12%

- Lớp mỏng tế bào ñược thu nhận từ các bộ phận khác nhau (Lá non, ñốt tử

diệp, tử diệp, trụ hạ diệp) của cây in vitro 6 – 7 ngày tuổi nảy mầm từ hột mướp

ñắng (ñược nuôi trong ñiều kiện nhiệt ñộ 22 ± 20C, ñộ ẩm 55% ± 10%, ánh sáng

2000 lux ± 300lux)

- Trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy ñược sử dụng là môi trường ña

lượng và vi lượng theo thành phần khoáng của môi trường MS (Murashige và Skoog,

Ảnh 2.1: Cây khổ qua 7 ngày tuổi (A), lá (B), tử diệp (C), ñốt tử diệp (D), trụ hạ diệp cắt dọc

(1mm) (E), trụ hạ diệp cắt ngang (1mm) (F)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật - ĐH Khoa học Tự nhiên TP HCM và phòng thí nghiệm SHTV – ĐH Tây Nguyên

Thời gian thực hiện: 11/2009 ñến 9/1010

- Dung dịch thuỷ ngân chlorite nồng ñộ 0,1% với thời gian khử trùng từ 5 -

15 phút

Ghi nhận % mẫu sạch, sống sau 6 ngày khử trùng và gieo hạt

2.3.2 Thí nghiệm tạo mô sẹo từ các nguồn mẫu của cây mướp ñắng

Các mẫu này ñược ñặt trên môi trường MS có bổ sung chất ñiều hoà sinh

trưởng thực vật: auxin (2,4-D hay AIA) có hoặc không có kết hợp với cytokinin (BA)

ở các nồng ñộ thay ñổi như sau: