Đồ án tốt nghiệp đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ “sargassum

Nó tồn tại dưới dạng sợi, hạt hay bột màu trắng đế vàng nâu, được dùng làm chất tạo đông, chất ổn định, chất tạo gel, chất nhủ hóa, không tan trong nước và dung môi hữu cơ, tan chậm tron

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

TP Hồ Chí Minh, 2014

Tài liệu HUTECH

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan:

- Những kết quả nghiên cứu trong đề tài này chưa được bất kì ai công bố trước đây

- Những nội dung thí nghiệm trong đề tài này là do em thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của cô Trần Thị Ngọc Mai

- Mọi tham khảo dùng trong đề tài đều được trích dẫn rõ ràng, đầy đủ, chĩnh xác về tác giả, tên công trình, thời gian công bố

Nếu xảy ra bất kỳ trường hợp nào liên quan đến bản quyền, em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2014

Nguyễn Thị Thuý

Tài liệu HUTECH

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn Nhà Trường đã cho chúng em có một môi trường học tập thật tốt, sắp xếp những môn học hợp lý phù hợp với năng lực của

mình Cảm ơn cô Trần Thị Ngọc Mai đã rất tận tình hướng dẫn, giúp đỡ để em

hoàn thành tốt đồ án này Cô là người đã truyền thụ cho em nhiều kiến thức và kinh nghiệm bổ ích trong quá trình thực hiện đồ án, và đây cũng là hành trang để chúng

em có thể vững vàng bước vào đời theo ngành mình đã chọn sau khi rời trường Thứ hai, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quí thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường Trường Đại Học Công Nghệ Tp HCM đã giảng dạy, truyền đạt nguồn tri thức quí báu giúp em có thể hoàn thành tốt đồ án của mình

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên cùng khoá và các anh chị sinh viên khóa trước đã đóng góp ý kiến giúp em hoàn thành đồ án

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn thầy cùng quí thầy cô và gửi lời chúc sức khỏe đến quí thầy cô!

Tài liệu HUTECH

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Giới hạn đề tài 2

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về rong Nâu 3

1.1.1 Phân loại khoa học [1,2,6] 3

1.1.2 Sự phân bố của rong nâu 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật [1,2,7] 4

1.1.3 Thành phần hóa học của rong nâu 5

1.1.5 Nguồn lợi – tình hình khai thác và sử dụng rong nâu 9

1.2 Tổng quan về polyphenol trong rong nâu 11

1.2.1 Đặc điểm 11

1.2.2 Cơ chế kháng nấm của polyphenol 12

1.3 Tổng quan về quá trình trích ly 13

1.3.1 Định nghĩa 13

1.3.2 Cơ sở khoa học 13

1.3.3 Phương pháp trích ly 13

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly 14

1.3.5 Tìm hiểu dung môi trích ly trong đề tài 16

1.4 Tổng quan về phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm 17

1.4.1 Giới thiệu về nấm Aspergillus niger 17

1.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm 18

CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hoá chất và dụng cụ - thiết bị 20

Tài liệu HUTECH

2.1.2.1 Hoá chất 20

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 20

2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23

2.3.1 Đối với dung môi trích ly là nước 23

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian trích ly 24

2.3.2 Đối với dung môi trích ly là ethanol 25

2.4 Cách tính toán các chỉ tiêu xác định 28

2.4.1.1 Cách tính tỉ lệ thu hồi 28

2.4.1.2 Cách tính hàm lượng polyphenol 28

2.5 Thí nghiệm khảo sát tính kháng nấm 29

2.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết bằng nước 29

2.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ethanol 29

2.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi 30

2.6 Sơ đồ và thuyết minh quy trình trích ly thu nhận polyphenol 31

2.6.1 Sơ đồ quy trình 31

2.6.2 Thuyết minh quy trình 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả 34

3.1.1 Đối với dung môi là nước 34

3.1.2 Đối với dung môi là EtOH 42

3.4 Kết quả kháng nấm của dịch chiết thu được 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

Tài liệu HUTECH

Tài liệu HUTECH

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi

đến hiệu quả trích ly 23

Hình 2 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly 24

Hình 2 3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của dung nhiệt độ đến hiệu quả trích ly 25

Hình 2 4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly 26

Hình 2 5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả trích ly 27

Hình 2 6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ EtOH đến hiệu quả trích ly 28

Hình 2 7 Sơ đồ quy trình trích ly thu nhận polyphenol 31

Tài liệu HUTECH

DANH MỤC BẢNG

Tài liệu HUTECH

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong nâu là một trong các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất Rong nâu chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao Đó là các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose,…); 17 acid amin; các acid béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự

do nguy hiểm; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu ; alginat là chất giải độc thiên nhiên; polyuronan có hoạt tính kháng u não; laminaran có tác dụng rất tích cực trong việc hỗ trợ điều trị bệnh có liên quan đến mạch máu tim, chất kháng ung thư,chất bảo vệ phóng xạ, kháng đông lạnh, chất kích thích hạt giống nảy mầm, tăng trưởng cây trồng và fucoidan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viên nhiễm, ngăn ngừa ung thư Trong rong nâu, hàm lượng polysaccharide chiếm khoảng từ 40 - 80% khối lượng rong khô, là những chất có giá trị nhất và có ứng dụng hết sức rộng rãi nhờ các đặc điểm cấu trúc và tính chất đặc thù của chúng Theo các nhà khoa học Nga, polysaccharide tồn tại trong rong nâu được chia làm 2 nhóm chính: nhóm tan trong kiềm là acid alginic, đã được nghiên cứu từ những năm

30 của thế kỷ trước và được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm; nhóm tan trong nước bao gồm fucoidan, laminaran và polyuronan là những chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá mới được nghiên cứu sử dụng trong khoảng vài thập kỷ trở lại đây Đặc biệt fucoidan được tìm thấy trong vách tế bào rong nâu là chất có nhiều hoạt tính sinh học quí giá: hoạt tính chống đông máu và chống đông tụ (Anticoagulant và Antithrombotic), hoạt tính kháng u, tăng cường miễn dịch, hoạt tính kháng virus, trị bệnh dạ dày, bệnh về da Ngoài ra fucoidan còn được sử dụng để điều trị các bệnh dị ứng, lão hóa, viêm khớp, suyễn, đái tháo đường, tăng nhãn áp, huyết áp cao, cholesterol cao, bệnh tim, viêm gan C, HIV, bệnh gan, loét dạ dày, đột quỵ, tuyến giáp, thiên đầu thống Việt Nam có hệ động vật, thực vật vô cùng phong phú, có nhiều gen quý hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Một trong những điều kiện tạo nên

sự phong phú và giàu có ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài hơn 3200

Tài liệu HUTECH

km bao bọc hết phía đông và nam đất nước Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị mà vùng biển ban tặng cho chúng ta là rong biển

Nhằm đáp ứng nhu cầu của xã hội hiện đại, đồng thời tận dụng được nguồn nguyên liệu dồi dào, các nhà khoa học của nước ta đã và đang tăng cường nghiên cứu, chuyển nguồn rong biển và phế thải từ rong biển thành các sản phẩm có giá trị, bằng cách sản xuất ra các loại thực phẩm khác nhau, tách chiết ra các thành phần khác nhau có hoạt tính sinh học hoặc hỗn hợp các thành phần có hoạt tính sinh học

để gia tăng giá trị rong biển Việt Nam

Đi chung với xu hướng đó nhóm thực hiện đề tài tiến hành nghiên cứu :

“Đánh giá khả năng kháng nấm của cao chiết từ phân đoạn phân cực rong mơ

Tài liệu HUTECH

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về rong Nâu

1.1.1 Phân loại khoa học [1,2,6]

Loài: Sargassum virgatum (rong mơ chổi), Sargassum feldmannii

P.Hoang (rong mơ Việt Nam), Sargassum mcclurei setchell (rong mơ

McClurei), Sargassum graminifolium (rong mơ cỏ), Sargassum carpophyllum (rong mơ chụm), Sargassum horneri (rong mơ Horner), v.v …

1.1.2 Sự phân bố của rong nâu

Rong nâu phân bố dọc theo bờ biển nước ta, ở miền Trung và miền Nam rong tập trung chủ yếu ở các tỉnh: Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hoà, Ninh Thuận, Bình Thuận, Vũng Tàu, Kiên Giang và các đảo: Lý Sơn, Phú Quý, Phú Quốc, quần đảo Trường Sa Ở các tỉnh phía Bắc, rong nâu có ở các tỉnh: Quảng Ninh, Hải Phòng, và một số đảo như Cô Tô, Cát Bà…

Diện tích rong nâu ở vùng biển Quảng Nam Đà Nẵng khoảng 190.000 m2, trữ lượng khoảng 800 tấn rong tươi Diện tích rong nâu ở tỉnh Bình Định khoảng hơn 40.000 m2, trữ lượng rong khoảng hơn 100 tấn/năm Vùng biển

Khánh Hoà là vùng biển có diện tích rong nâu mọc cao nhất khoảng 2.000.000 m2, trữ lượng có thể khai thác được hàng năm khoảng 11.000 tấn rong tươi Sản lượng rong nâu trung bình của các tỉnh duyên hải miền trung là 18,00 tấn rong tươi/vụ

Tài liệu HUTECH

1.1.2 Đặc điểm thực vật [1,2,7]

Rong dài ngắn tùy loài và tùy thuộc

vào điều kiện môi trường, thường gặp

rong dài từ vài chục centimet đến vài ba

mét hay hơn Chúng bám vào vật bám

nhờ đĩa bám hay hệ thống rễ bò phân

nhánh Đĩa bám thường chắc hơn rễ và

sóng biển thường đánh đứt rong hơn là

nhổ được đĩa bám

Thân rong gồm một trục chính rất

ngắn, đa số thường dài trên dưới 1cm,

hình trụ, sần sùi Đỉnh của trục chính sẽ phân ra làm 2 đến 5 nhánh chính, hai bên nhánh chính sẽ mọc ra nhiều nhánh bên Nhánh chính và nhánh bên sẽ tạo ra chiều dài của rong Chiều dài này khác nhau tuỳ vào các chi, loài và trong cùng một loài kích thước này cũng thay đổi tuỳ vào điều kiện sống, nơi phân bố

Trên các nhánh có các cơ quan dinh dưỡng gần giống như lá và các túi chứa đầy không khí được gọi là phao Khi rong trưởng thành trên các nhánh bên mọc ra các nhánh phụ, ngắn (thường từ tháng 3 đến tháng 6) có mang nhiều cơ quan sinh sản đực và cái gọi là đế Nhờ có hệ thống phao rong luôn giữ vị trí thẳng đứng trong môi trường biển Nếu nước cạn rong khá dài thì phần trên của rong nằm trên mặt nước

Hình 1 2

Hình 1 1 Hình thái rong nâu

Tài liệu HUTECH

1.1.3 Thành phần hóa học của rong nâu

Bảng 1 1 Thành phần hoá học chính của rong nâu

dễ tan trong nước, có vị ngọt Hàm lượng từ 14% ÷ 25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý nơi sinh sống

➢ Polysaccharide

• Alginic

Công thức cấu tạo của acid alginic là (C6H6O6)n Là một acid hữu cơ có trong tảo nâu, có trọng lượng phân tử từ 32.000 - 200.000, do D - Mannuroic acid và L - Guluronic acid liên kết với nhau bởi liên kết glucozit Nó tồn tại dưới dạng sợi, hạt hay bột màu trắng đế vàng nâu, được dùng làm chất tạo đông, chất ổn định, chất tạo gel, chất nhủ hóa, không tan trong nước và dung môi hữu cơ, tan chậm trong dung

Tài liệu HUTECH

Hình 1 2 Cấu trúc của acid alginic

khác nhau như: Ca, Cu, Zn Fuccoidin có tính chất gần giống với alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn alginic

Fuccoidin hay fucoidan là một polysaccharide sulfate hóa dị hợp, trong đó fucose chiếm từ 18,6% ÷ 60% [18], sulfate chiếm từ 17,7% ÷ 39,2%, ngoài ra còn

có mặt các thành phần đường khác như: galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose, và acid uronic Hàm lượng fucoidan trong các loại rong nâu khoảng 2

÷ 9% so với rong khô Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường mà rong sinh sống

Fucoidan là môt hợp chất chống oxy hóa được chiết xuất từ thành phần chất

nhờn “sliminess” của tảo nâu Mozuku (Cladosiphon okamuranus) và Mekabu (phần

cuốn nằm gần gốc của Wakame) Cấu trúc hóa học của fucoidan là một chuỗi dài polysaccharide giàu sulfate fucose Giáo sư Kylin.H.Z của đại học Uppsala Thụy Điển, vào năm 1913 đã điều chế thành công fucoidan từ tinh chất nhờn của loài rong

Konbu và đặt tên là fucoidin Sau đó, hiệp hội thế giới đồng ý đổi tên fucoidin thành

fucoidan

Fucoidan được chiết xuất từ tảo nâu Okinawa Mozuku và Mekabu Nhiều

nghiên cứu đã chứng minh fucoidan tăng cường hoạt động của các Natual Killer Cell (tạm dịch là tế bào tiêu diệt tự nhiên) cũng như thúc đẩy sự hoạt động của Macrophage (đại thức bào), Helper T - cells và B - cells làm cho các tế bào có hại trong cơ thể giảm đi đáng kể và thậm chí tự tiêu biến đi Đó là kết quả chứng tỏ

Tài liệu HUTECH

fucoidan đã tăng cường miễn dịch cho cơ thể và để tấn công trực tiếp loại bỏ các tế bào có hại (hiện tượng này được gọi là Apoptosis)

Fucoidan là thành phần chứa nhóm các phân tử đường (polysaccharide) chỉ có trong các loại tảo biển, có tác dụng đặc biệt khiến cho tế bào ung thư vốn liên tục tự tăng lên có thể tự tiêu diệt (apoptosis)

Fucoidan chính là thành phần “nhớt” đặc biệt có trong các loại tảo biển màu nâu, một loại sợi thuộc nhóm hợp chất đa đường phân tử cao do đường fucoza kết hợp với axit sulfuric tạo thành đường fucoza chứa lưu huỳnh hóa trị cao, cùng với các loại đường như galactoze, mannoza liên kết với nhau

Có 3 loại Fucoidan là F - FUCOIDAN, U - FUCOIDAN, G - FUCOIDAN Trong 3 loại này, U - FUCOIDAN là loại được quan tâm nhiều nhất Đó là do các nghiên cứu đã chứng minh trong U - FUCOIDAN có chất làm cho tế bào ung thư trong cơ thể con người tự hủy diệt U - FUCOIDAN có nhiều trong các loại tảo biển

như Konbu, Mozuku, Hijiki, trong đó các phân tử đường đơn như glucuronic acid,

mannoza, fucoza đứng cạnh nhau

CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA U - FUCOIDAN

Tế bào con nguời sau khi hoàn thành nhiệm vụ của mình thì sẽ tự chết đi (hiện tượng apoptosis), đây là cơ chế mang tính di truyền Tuy nhiên, riêng đối với tế bào ung thư, khác với tế bào thường, cơ chế này không xảy ra và tế bào ung thư cứ được nhân lên mãi

Tuy nhiên, một loại U - FUCOIDAN bao gồm các sợi đa đường vốn có nhiều

trong các loại tảo biển Konbu, Wakame, Mozuku…có tác dụng làm các tế bào ung thư

dạng bột không màu, không mùi và có hai loại: loại hòa tan và loại không hòa tan

Tài liệu HUTECH

trong nước Laminarin có hàm lượng từ 10% ÷ 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong nâu

trong rong nâu nhiều hơn rong đỏ

1.1.3.3 Protein

Protein của rong nâu thường ở dạng kết hợp với iod tạo iod hữu cơ như: monoiodinzodizin, diiodinzodizin Hàm lượng protein rong nâu vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05% ÷ 21,11% so với trọng lượng rong khô

1.1.3.4 Hỗn hợp Phenolic

Theo Ragan và Glombitza, hợp chất rất phổ biến trong rong nâu thuộc nhóm hợp chất polyphenolic là phlorotannin Phlorotannin là chất chuyển hóa thứ cấp, xuất hiện chủ yếu ở các mô, tại đó nồng độ có thể tới 20% so với khối lượng tịnh của rong biển Schoenwaelder (2002) chỉ ra một số chức năng của chúng như tăng tính liên kết và độ chắc cho thành tế bào Phlorotannin hấp thụ bước sóng UV, chủ yếu là UVC và một phần UVB, với cực đại tại 195 nm và 265 nm [9]

Polyphenol là một nhóm các hợp chất mà trong công thức cấu tạo có chứa vòng benzen và ít nhất 2 nhóm - OH trở lên Lượng polyphenol có trong hầu hết các loại rau, củ, quả , tùy theo loại nguyên liệu mà hàm lượng polyphenol sẽ khác nhau, cùng tồn tại trong nguyên liệu đó là enzym polyphenoloxidase Khi tiếp xúc với oxi không khí sẽ kích hoạt enzym polyphenoloxidase hoạt động và xúc tác cho phản ứng oxi hóa các hợp chất polyphenol thành những hợp chất mới gây sẫm màu

và tạo vị đắng cho rau quả.Ví dụ: Trong khoai tây là pirocatechol và dẫn xuất tạo từ tyrozyl bị oxi hóa thành dopaquinon gây sẫm màu khoai tây

Hợp chất phenol rất dễ bị oxy hóa trong các điều kiện khác nhau: chúng có thể

bị oxi hóa bình thường trong môi trường không khí ẩm, phản ứng được tăng cường trong môi trường kiềm

1.1.3.5 Chất khoáng

Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong nâu thường lớn hơn trong nước biển Hàm lượng c h ấ t khoáng trong các loài rong nâu ở Nha Trang dao động

từ 15,51 ÷ 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ, thời kỳ sinh trưởng

Tài liệu HUTECH

1.1.5 Nguồn lợi – tình hình khai thác và sử dụng rong nâu

1.1.5.1 Nguồn lợi

Nguồn lợi rong nâu chủ yếu tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ

Canada tập trung hơn 75% khối lượng rong nguyên liệu sản xuất alginate , trong

khi đó khối lượng rong nâu Châu Á chỉ khoảng 5% [1]

Trên thế giới alginate được sản xuất từ rong nâu có sản lượng lớn hơn agar,

carrageenan, furcellanan được sản xuất từ rong đỏ Về sản lượng rong nâu thì khu

vực Bắc Mỹ có sản lượng lớn nhất, tiếp đến là Châu Âu, Mỹ La Tinh và Châu Á

Đối với rong đỏ thì sản lượng chủ yếu tập trung lớn tại Châu Á, đến Châu Mỹ La

Tinh, rồi đến Châu Âu

Việt Nam có nguồn lợi rong biển rất đa dạng và phong phú Theo các kết quả

nghiên cứu gần đây, ở nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng

biển miền Bắc 310 loài (các nghiên cứu từ Quảng Bình trở ra), miền Nam có 484

loài (các nghiên cứu từ Đà Nẵng trở vào), 156 loài được tìm thấy ở cả 2 miền

(Nguyễn Hữu Dinh, 1998) Trong đó có các đối tượng quan trọng là: rong câu

(Gracilaria), rong nâu (Sargassum)……

Sản lượng và nguồn lợi rong biển trên thế giới được thể hiện trên bảng sau:

Bang 1.2 Nguồn lợi, sản lượng thu hoạch và tiềm năng sản xuất rong biển [1]

Nguồn lợi Sản lượng

thu hoạch

Nguồn lợi

Tây bắc Đại Tây dương 35 100 6 500

Đông bắc Đại Tây dương 72 150 223 2,00

0 Trung tâm tây Đại Tây dương - 10 1 1,00

0 Trung tâm đông Đại Tây

dương

Địa Trung Hải và biển đen 50 1,000 1 50

Tây nam Đại Tây dương 23 100 75 2,00

0 Đông nam Đại Tây dương 7 100 13 100

Tài liệu HUTECH

Tây Ấn Độ dương 4 120 5 150

Tây bắc Thái Bình dương 545 650 822 1,50

0 Đông bắc Thái Bình dương - 10 - 1,50

0 Trung tâm tây Thái Bình

0

Tổng cộng 807 2,660 1,315 14,6

00

1.1.5.2 Tình hình khai thác và sử dụng rong nâu

Tại Nhật Bản, rong nâu đã được sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V, cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm đã xem xét và cấp phép cho các sản phẩm thực phẩm chức năng của Nhật được bổ sung thêm thành phần fucoidan để tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ máu… và trở thành thực phẩm hỗ trợ điều trị bệnh nan y ngay cả ung thư

Các polysaccharide từ rong nâu được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, công nghệ sinh học và y học Ngoài ra trong công nghiệp chế biến phức hợp rong biển ta cũng có thể thu nhận các thành phần có các giá trị khác nhau như: fucoidan, laminaran và những chất chuyển hoá phân tử thấp như mannitol, các acid amin tự do, polyphenol, các hợp chất chứa iod, các vitamin và acid béo

Tài liệu HUTECH

Hình 1 3 Biểu đồ biểu diễn sản lượng khai thác rong nâu toàn cầu (thống kê

Tài liệu HUTECH

Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid Gallic

Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid Cafeic

Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6: Catechin, Flavonoid

Hình 1 5 . Hợp chất polyphenolTính chất: Các polyphenol có chứa gốc pyrocatechic hoặc pyrogalic nên chúng có thể tham gia phản ứng oxy hoá – khử, phản ứng cộng và ngưng tụ

Phản ứng oxy hoá – khử: Dưới tác dụng của enzyme polyphenol oxydase, các polyphenol bị oxy hoá tạo thành các quinon

Phản ứng cộng: Khi có mặt các acid amin thì các quinon này sẽ tiến hành phản ứng cộng với acid amin để tạo thành các octoquinon tương ứng

Phản ứng ngưng tụ: Các octoquinon này dễ dàng ngưng tụ với nhau

để tạo thành các sản phẩm có màu gọi chung là flobafen

1.2.2 Cơ chế kháng nấm của polyphenol

Các hợp chất polyphenol phát huy tác dụng bằng cách thay đổi màng tế bào nấm Tương tác với 14 - alpha demethylase, một enzym cytochrom P - 450 cần để chuyển lanosterol thành ergosterol, ức chế tổng hợp ergosterol Kết quả là làm tǎng tính thấm tế bào, gây rò rỉ chất chứa trong tế bào Những tác dụng chống nấm khác của các hợp chất polyphenol đã được đề xuất bao gồm: ức chế hô hấp nội sinh, tương tác với các phospholipid màng, và ức chế sự chuyển dạng nấm men thành dạng sợi

Tài liệu HUTECH

1.3 Tổng quan về quá trình trích ly

1.3.1 Định nghĩa

Bản chất của quá trình trích ly (quá trình chiết) là sự rút chất hòa tan trong chất lỏng hay chất rắn bằng một chất hòa tan khác (gọi là dung môi) nhờ quá trình khuếch tán giữa các chất có nồng độ khác nhau Trích ly chất hòa tan trong chất lỏng được gọi là trích ly lỏng, còn trích ly chất hòa tan trong chất rắn là trích ly chất rắn

Phương pháp trích ly là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ trích ly và cách trích ly Một phương pháp trích ly thích hợp chỉ có thể được hoạch định khi biết rõ thành phần của các chất cần trích ly trong nguyên liệu ra Mỗi loại hợp chất

có độ hoà tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy không thể có phương pháp trích ly chung áp dụng cho tất cả nguyên liệu

Phương pháp thực hiện quá trình trích ly:

Các công đoạn chủ yếu của quá trình trích ly là: Cho hỗn hợp cần trích ly tiếp xúc với dung môi rồi tách các pha, sau đó tách và thu hồi dung môi và tiến hành phân tách riêng

➢ Phương pháp ngâm: Nguyên liệu được ngâm với dung môi trong bồn trích ly ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng đảo trộn Thời gian ngâm tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu

➢ Có thể thực hiện quá trình trích ly gián đoạn hoặc liên tục; trích ly một hoặc nhiều bậc, dung môi có thể chuyển động cùng chiều hoặc ngược chiều

Tài liệu HUTECH

➢ Có thể trích ly ở nhiệt độ thường hoặc trích ly nóng Hai cách trích

ly ở nhiệt độ thường là ngấm kiệt và ngâm phân đoạn Phương pháp ngấm kiệt cho kết quả tốt hơn vì trích ly được nhiều hoạt chất và ít tốn dung môi, nhất là khi

áp dụng cách trích ly ngấm kiệt ngược dòng Khi trích ly nóng, nếu dung môi là các chất bay hơi thì áp dụng cách chiết liên tục hoặc chiết hồi lưu Nếu dung môi là nước thì sắc hoặc hãm phân đoạn

➢ Phương pháp ngấm kiệt và phương pháp ngược dòng: được thực hiện trong bồn chiết có van điều chỉnh để dịch chiết chảy xuống theo mong muốn sau khi ngâm nguyên liệu với dung môi trong một thời gian nhất định Dịch rút ra

từ bồn thứ nhất dùng để ngâm nguyên liệu ở bồn thứ hai, tiếp tục thực hiện cho đến bồn chiết sau cùng Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong sản xuất

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình trích ly

Thực chất quá trình trích ly là quá trình khuếch tán Vì vậy sự chênh lệch nồng độ giữa hai pha (gradient nồng độ) chính là động lực của quá trình Khi chênh lệch nồng độ lớn, lượng chất trích ly tăng; thời gian trích ly giảm ta thực hiện bằng cách tăng tỷ lệ của dung môi so với nguyên liệu Quá trình trích ly polyphenol (phlorotannin) hiện nay được thực hiện bằng nhiều loại dung môi Nguyên tắc của trích ly bằng dung môi dựa trên sự thẩm thấu dung môi vào tế bào, chất cần trích ly hòa tan vào dung môi và khuếch tán ra ngoài tế bào Quá trình trích ly bằng dung môi có ưu điểm là thiết bị đơn giản, có thể xử lý một lượng lớn nguyên liệu và có thể sử dụng ở quy trình liên tục

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bằng dung môi:

➢ Lựa chọn dung môi trích ly: Dung môi trích ly là dung môi hòa tan được hợp chất cần trích ly Các polyphenol (phlorotannin) là các hợp chất phân cực nên chủ yếu sử dụng các dung môi phân cực như: nước, ethanol, acetone, ethyl acetate…

➢ Diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi Cần tăng diện tích này để làm tăng hiệu quả của quá trình Với các nguyên liệu rắn cần tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi Điều này thực hiện bằng cách nghiền nhỏ, thái nhỏ, băm nhỏ vật liệu Nó còn làm phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để giữa dung môi và vật liệu Tuy nhiên kích thước và hình dạng của vật

Tài liệu HUTECH

liệu khi làm nhỏ cũng có giới hạn vì nếu chúng quá mịn sẽ bị lắng đọng lên lớp nguyên liệu, làm tắc các ống mao dẫn hoặc bị dòng dung môi cuốn vào mixen (hỗn hợp) làm cho dung dịch có nhiều cặn gây phức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo

➢ Khuấy trộn: Khuấy trộn giúp tăng cường hiệu quả trích ly, do tăng cường quá trình truyền khối

➢ pH: Polyphenol (phlorotannin) rất bền ở pH acid và kém bền ở pH bazo Khi thực hiện trích ly ở pH thấp sẽ tránh được hiện tượng oxy hóa polyphenol

và tăng hiệu quả quá trình trích ly Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu cho rằng ảnh hưởng của pH không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả trích ly, chỉ cần đảm bảo

pH trung tính hoặc thấp hơn

➢ Tính chất của vật liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly Vật liệu là hỗn hợp lỏng - lỏng hoặc hỗn hợp rắn – lỏng cộng với một dung môi hoặc tập hợp một số loại dung môi Chúng có độ hòa tan khác nhau, nồng độ các chất khác nhau và có tác dụng tương hỗ, khuếch tán vào nhau Như khi trích ly đầu nếu

độ ẩm nguyên liệu giảm, tốc độ trích tăng lên, vì độ ẩm tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán

➢ Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phần tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phần tử dung môi Tuy nhiên nhiệt độ là một yếu tố có giới hạn Vì khi nhiệt độ quá cao có thể xảy ra các phản ứng khác không cần thiết (làm oxi hóa polyphenol cần trích ly), gây khó khăn cho quá trình công nghệ Do đó trong toàn bộ quá trình nhiệt độ không nên vượt quá

800C

➢ Sử dụng chất kháng oxy hóa hỗ trợ: Việc sử dụng các chất kháng oxy hóa bổ sung như acid ascorbic, acid citric, …được xác nhận làm tăng hiệu quả trích

ly cũng như làm giảm sự oxy hóa polyphenol

➢ Yếu tố thời gian cũng ảnh hưởng đến quá trình trích ly Khi thời gian tăng lên, lượng chất khuếch tán tăng, nhưng thời gian phải có giới hạn Vì khi đã đạt được mức độ trích ly cao nhất, nếu kéo dài thời gian sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế

Tài liệu HUTECH

1.3.5 Tìm hiểu dung môi trích ly trong đề tài

1.3.5.1 Nước

Phân tử nước được cấu tạo từ một phân tử oxy và hai phân tử hydro, mà hai electron trong môi trường liên kết này bị kéo lệch về phía oxy nên phân tử nước có tính phân cực, do đó nước dễ liên kết với các nguyên tử, phân tử và các chất khác Mặt khác, các phân tử nước liên kết với nhau bằng các liên kết hydro (liên kết kém bền) nên các phân tử, nguyên tử hoặc các chất khác dễ bẻ gãy liên kết đó để tạo nên chất mới

1.3.5.2 Ethanol

Ethanol là một ancol mạch thẳng, công thức hóa học của nó là C2H6O hay

C2H5OH Một công thức thay thế khác là CH3 - CH2 - OH thể hiện carbon ở nhóm metyl (CH3 – ) liên kết với carbon ở nhóm metylen ( – CH2 – ), nhóm này lại liên kết với oxy của nhóm hydroxyl ( – OH) Nó là đồng phân hoá học của dimetyl ete Ethanol thường được viết tắt là EtOH, sử dụng cách ký hiệu hoá học thường dùng đại diện cho nhóm etyl (C2H5) là Et

Các tính chất của ethanol chủ yếu do sự hoạt động của nhóm hydroxyl (OH) và

do mạch cacbon ngắn Vì có nhóm OH nên có thể tham gia vào các liên kết với phân

tử hydro, làm cho nó có độ nhớt và ít bay hơi so với các hợp chất hữu cơ cùng trọng lượng phân tử

Nhóm phân cực của hydroxyl làm ethanol có thể hòa tan các hợp chất ion đặc biệt như natri và kali hydroxit, magiesium chloride, clorua calci….Vì các phân tử ethanol có cấu trúc không phân cực nên sẽ hòa tan các chất không phân cực, bao gồm các loại tinh dầu, nhiều hương liệu, màu sắc

Tài liệu HUTECH

1.4 Tổng quan về phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm

1.4.1 Giới thiệu về nấm Aspergillus niger

Hình 1 6 Chủng nấm Aspergillus niger

Nấm Aspergillus niger thuộc nhóm Aspergillus flavus, là nấm đa bào, có hình

thức sinh sản vô tính Sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu 6 - 80C, tối đa 45 -

470C, tối ưu 25 - 280C, độ ẩm tối thiểu 23% Chúng sinh trưởng và phát triển khi có mặt O2, pH tối ưu 4 - 6,5 Tuy nhiên, theo Patt (1981) cũng có những chủng

Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH = 2 Aspergillus niger có khuẩn ty phân

nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở 2 đầu tạo bọng hình cầu 5 - 6 x 20 – 30 mm, đôi khi 6 - 10 x 60 –

70 mm Thể bình gồm 2 lớp, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ 2 hình chai; bào tử đính xòe ra, hình cầu xù xì, có gai nhọn, màu nâu đen đến đen than, đường kính 4 - 5 mm

- Khả năng lên men đường: Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các

loại đường đơn và đường đôi như: glucose, fructose, maltose, xylose, manose, saccharose Aspergillus niger đồng hóa được galactose, sorbose và lactose ở mức độ kém hơn

- Khả năng tổng hợp enzyme:

+ a-amylase: Aspergillus niger có khả năng tổng hợp a-amylase ngoại bào để

thủy phân nhanh tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose

Tài liệu HUTECH

+ Protease: Aspergillus niger có khả năng tạo 2 loại protease Protease thứ

nhất phân giải protein thành polypeptid, pepton; protease thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin

+ Cellulase: Aspergillus niger có khả năng tạo cellulase, chủ yếu là cellulase

Cl, cellulase Cx và b-glucosidase hay cellobiase

+ Pectinase, Xylanase: Aspergillus niger có khả năng tạo pectinase, xylanase ở

nhiệt độ tối thích 25 độ C, pH = 5,6

Ngoài ra, Aspergillus niger còn có khả năng tổng hợp hàng loạt enzym khác

như: lipase, mananase

1.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng nấm

Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch:

Tài liệu HUTECH

Tài liệu HUTECH

CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là loài rong nâu khô (Sargassum), mọc tự nhiên ở vùng

biển Ninh Thuận

2.1.2 Hoá chất và dụng cụ - thiết bị

2.1.2.1 Hoá chất

Các loại hoá chất sử dụng cho toàn bộ quá trình thực hiện các thí nghiệm đều

là hoá chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích: ethanol 96%, folin, acid gallic, agar

Môi trường PDA: MT Potato - Dextrose - Agar (nuôi nấm mốc)

Các thiết bị sử dụng là: máy li tâm, máy cô quay, tủ sấy, máy so màu, bếp điện, bình hút ẩm, tủ lạnh, máy xay…

2.2 Các phương pháp nghiên cứu

❖ Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy

a) Nguyên lý:

Dùng nhiệt độ cao để làm bay hơi hết nước trong mẫu thử, sau đó dựa vào hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô, từ đó tính được hàm lượng nước trong thực phẩm (%)

b) Dụng cụ và hóa chất:

 Tủ sấy điều chỉnh được nhiệt độ

 Cân phân tích, độ chính xác 10-4 g

 Cốc sấy bằng thủy tinh

 Đũa thủy tinh

Tài liệu HUTECH

và cân đến khi nào giữa hai lần liên tiếp sai khác khối lượng không quá 5.10-4 g

là được (sấy đến khối lượng không đổi) Cân chính xác một lượng rong đã cắt nhỏ (khoảng 10 g) vào cốc đã sấy khô đến khối lượng không đổi Dùng đũa thủy tinh đánh tơi mẫu rồi dàn đều mẫu trên đáy cốc Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở 60 ÷ 800C trong 2 giờ Sau đó nâng nhiệt độ lên 100 ÷ 1050C, sấy liên tục trong 3 giờ Chú ý, trong quá trình sấy cứ sau một giờ đảo mẫu một lần

Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm, sau đó mang cân trên cân phân tích rồi sấy tiếp ở nhiệt độ 100 ÷ 1050

C đến khối lượng không đổi như trên

d) Tính kết quả:

Độ ẩm của rong được tính theo công thức:

Trong đó:

X : Độ ẩm (hàm lượng nước) của rong (%)

G1: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử trước khi sấy (g)

G2: Khối lượng cốc sấy và mẫu thử sau sấy (g)

G : Khối lượng cốc sấy (g)

❖ Xác định hàm lượng P.p trong dịch chiết

Bố trí thí nghiệm xây dựng đường chuẩn acid gallic

VFolin

Ủ trong bóng tối trong 15 phút ở 500C, đo λ=750nm

Hàm lượng polyphenol trong dịch trích ly được xác định bằng phương pháp

so màu, dùng phép thử Folin-Ciocalteu ở bước sóng 750 nm

a.) Nguyên lý:

Oxy hoá toàn bộ lượng polyphenol trong dịch trích ly bằng dung dịch Folin - Ciocalteu (hỗn hợp acid phosphotungstic và acid phosphomolyblic) Các acid này sẽ bị khử thành Vonfram (W8O23) và oxit molipden (Mo8O23) có màu xanh Màu xanh được hấp thụ nhiều nhất ở bước sóng

- Cho 1 ml mẫu vào 2ml Na2CO3 10%, để yên 2 phút

- Thêm 1 ml thuốc thử Folin - Ciocalteu 10%, ủ khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối

- Sau khoảng thời gian trên quan sát thấy có màu xanh đen xuất hiện và tiến hành so màu bằng máy quang phổ UV - Vis ở bước sóng λ = 750 nm

- Ghi độ hấp phụ và tính toán xác định hàm lượng polyphenol

y = 0.9256x + 0.0386 R² = 0.9976

y = 0.9256x + 0.0386 R² = 0.9976

0 0.1

- Chú ý: Trước khi tiến hành thí nghiệm phải pha loãng mẫu nếu cần thiết

❖ Xác định màu bằng máy đo quang phổ hấp thu

❖ Phương pháp kháng nấm trực tiếp

❖ Phương pháp trích ly

❖ Phương pháp xử lý số liệu: sử dụng phần mềm Statgraphics

2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.3.1 Đối với dung môi trích ly là nước

2.3.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu: dung môi

Việc lựa chọn tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (rong khô : nước cất) có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly Nếu lựa chọn dung môi quá ít, quá trình trích ly sẽ không triệt để, lượng chất hòa tan bên trong nguyên liệu còn nhiều (do chênh lệch nồng độ chất tan nhỏ)

• Chuẩn bị 4 mẫu theo tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi như sau: 1:20;1:30; 1:40; 1:50 trong các bình tam giác có đựng sẵn 120 ml dung môi Thí nghiệm lặp lại 3 lần

• Sơ đồ thí nghiệm:

Hình 2 1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên

liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly

• Cố định các thông số sau:

- Dung môi: nước

- Thời gian trích ly: 24 h

Tài liệu HUTECH

- Nhiệt độ trích ly: 350C

• Chỉ tiêu xác định:

- Tỉ lệ thu hồi

- Hàm lượng polyphenol

2.3.1.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian trích ly

Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định thời gian chiết tối ưu để thu được hàm lượng polyphenol cao nhất Thời gian chiết phải hợp lý, nếu kéo dài thời gian chiết lượng chất hòa tan dung môi đã hết, đồng thời sẽ ảnh hưởng đến thời gian thực hiện và chi phí cho toàn bộ quá trình

• Chuẩn bị 3 mẫu thí nghiệm trong các bình tam giác dung tích 120 ml theo các thời gian như sau: 24 h; 48 h; 72 h, sau đó tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần

2.3.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát nhiệt độ trích ly

Nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả năng hoà tan các chất có trong rong nguyên liệu vào môi trường trích ly Khi nhiệt độ tăng, các phân tử khuếch tán càng mạnh,

độ nhớt giảm, lượng chất tan vào môi trường trích ly càng nhiều Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao có thể làm biến tính một số hợp chất có hoạt tính sinh học hoặc hao hụt một lượng chất tan dễ bay hơi khác

• Chuẩn bị 4 mẫu thí nghiệm trong các bình tam giác dung tích 120 ml theo các thí nghiệm có các nhiệt độ như sau: 300C; 400C; 500C; 600C Thí nghiệm lặp lại 3 lần

• Cố định các thông số sau:

- Dung môi: nước

- Thời gian trích ly: 24 h

2.3.2 Đối với dung môi trích ly là ethanol

Tài liệu HUTECH

Sau khi chiết trong dung môi nước, ta thu lại bã rong, sấy khô đến khối lượng không đổi để tính hiệu suất thu hồi Sau đó lấy rong đã sấy khô đó mang đi chiết lại bằng ethanol

• Chuẩn bị 4 mẫu theo tỷ lệ khối lượng nguyên liệu: dung môi (rong khô: ethanol) như sau: 1:20;1:30; 1:40; 1:50 ( là các mẫu đã chiết bằng nước ở thí nghiệm

1 được thu lại bã sau đó mang đi sấy khô đến khối lượng không đổi ) trong các bình tam giác có đựng sẵn 120 ml dung môi Thí nghiệm lặp lại 3 lần

• Sơ đồ thí nghiệm:

Hình 2 4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng nguyên

liệu: dung môi đến hiệu quả trích ly

• Cố định các thông số sau:

- Dung môi: ethanol 600

- Thời gian trích ly: 24 h

2.3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian tới hiệu quả trích ly

• Chuẩn bị 3 mẫu thí nghiệm ( là các mẫu đã chiết bằng nước ở thí nghiệm 2 được thu lại bã sau đó mang đi sấy khô đến khối lượng không đổi ) trong các bình tam giác dung tích 120 ml theo các thời gian như sau: 24h; 48h; 72h, sau đó tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần

2.3.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ tới hiệu quả trích ly

• Chuẩn bị 4 mẫu ( là các mẫu đã chiết bằng nước ở thí nghiệm 3 được thu lại bã sau đó mang đi sấy khô đến khối lượng không đổi ) có nồng độ EtOH lần lượt là: 60%;

70%; 80%; 90% trong các bình tam giác có dung tích 120 ml Thí nghiệm lặp lại 3 lần

• Cố định các thông số sau:

- Tỷ lệ NL: DM là: 1:20

Tài liệu HUTECH

- Thời gian trích ly: 24 h

Tỉ lệ thu hồi =[ (mban đầu – msau trích ly) : mban đầu]* 100%

mban đầu: khối lượng rong khô ban đầu, g

msau trích ly: khối lượng rong khô còn lại sau khi trích ly, g

Khối lượng rong khô trước và sau trích ly đều được đưa về cùng một độ ẩm (sấy đến khối lượng không đổi)

2.4.1.2 Cách tính hàm lượng polyphenol

Xây dựng đường chuẩn acid gallic, xác định phương trình đường chuẩn bằng phần mềm exel (phương trình dạng y = ax + b) sau đó tiến hành đo mật độ quang (OD) của dịch chiết ở bước sóng 750 nm OD đo được chính là y, thay

y vào phương trình đường chuẩn để tìm x (x là hàm lượng polyphenol) rồi lấy

x nhân với hệ số pha loãng để xác định hàm lượng polyphenol trong một đơn

vị thể tích của mẫu

Tài liệu HUTECH

2.5 Thí nghiệm khảo sát tính kháng nấm

2.5.1 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết bằng nước

Thí nghiệm được bố trí gồm 5 nghiệm thức:

- Nghiệm thức 1 (đối chứng): dung dịch nước

- Nghiệm thức 2: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/20 (3,505µg/ml)

- Nghiệm thức 3: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/30 (4,693 µg/ml)

- Nghiệm thức 4: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/40 (5,125 µg/ml)

- Nghiệm thức 5: dịch chiết bằng nước ở tỉ lệ 1/50 (6,551 µg/ml)

Dịch chiết được lấy ở tỉ lệ 1/20 (3,505µg/ml); 1/30 (4,693 µg/ml); 1/40 (5,125 µg/ml); 1/50 (6,551 µg/ml), chiết trong 24h, nhiệt độ chiết 350C

Thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình của 3 lần

Nấm được nuôi trên các đĩa petri chứa môi trửờng PDA (đĩa giống) Cấy tơ nấm ở giữa đĩa thạch, để ở nhiệt độ phòng (370C) cho tơ nấm lan tỏa trên bề mặt thạch Dịch chiết bằng nước vô trùng bằng cách lọc qua phin lọc với đường kính lỗ lọc 0,45 µm Dung dịch nước dùng làm nghiệm thức đối chứng cũng được lọc qua phin lọc để vô trùng

Môi trường PDA sau khi hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút được rót vào đĩa petri với thể tích khoảng 15 - 20 ml/đĩa

Khi nhiệt độ môi trường trong đĩa petri hạ xuống khoảng hơn 40oC (lưu ý không để môi trường đặc lại) thì bổ sung vào mỗi đĩa 0,2 ml dịch đã được lọc vô trùng Đối với nghiệm thức đối chứng thì thay thế dịch chiết bằng 0,2 ml dung dịch nước

Đục lỗ giữa các tơ nấm trên môi trường PDA đĩa giống gốc với đường kính

lỗ đục 8 mm, đặt miếng thạch có tơ nấm giống trên vào đĩa thạch PDA được bổ sung dịch chiết nước đã được đục lỗ có đường kính 8 mm

Các đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ phòng (370C) trong 3 ngày

2.5.2 Khảo sát hoạt tính kháng nấm của dịch chiết ethanol

Thí nghiệm được bố trí gồm 8 nghiệm thức:

- Nghiệm thức 1 (đối chứng): dung dịch ethanol 60%

- Nghiệm thức 2: dịch chiết bằng ethanol 60 % (0,393 µg/ml)

- Nghiệm thức 3 (đối chứng): dung dịch ethanol 70%

Tài liệu HUTECH

- Nghiệm thức 4: dịch chiết bằng ethanol 70 % (0,297 µg/ml)

- Nghiệm thức 5 (đối chứng): dung dịch ethanol 80%

- Nghiệm thức 6: dịch chiết bằng ethanol 80 % (0,231 µg/ml)

- Nghiệm thức 7 (đối chứng): dung dịch ethanol 90%

- Nghiệm thức 8: dịch chiết bằng ethanol 90 % (0,188 µg/ml)

Thí nghiệm lặp lại 3 lần với từng nghiệm thức và lấy kết quả trung bình của 3 lần lặp lại

Nấm được nuôi trên các đĩa petri chứa môi trửờng PDA (đĩa giống) Cấy tơ nấm ở giữa đĩa thạch, để ở nhiệt độ phòng (370C) cho tơ nấm lan tỏa trên bề mặt thạch Dịch chiết bằng nước vô trùng bằng cách lọc qua phin lọc với đường kính lỗ lọc 0,45 µm Dung dịch ethnol dùng làm nghiệm thức đối chứng cũng được lọc qua phin lọc để vô trùng

Môi trường PDA sau khi hấp khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút được rót vào đĩa petri với thể tích khoảng 15 - 20 ml/đĩa

Khi nhiệt độ môi trường trong đĩa petri hạ xuống khoảng hơn 40oC (lưu ý không để môi trường đặc lại) thì bổ sung vào mỗi đĩa 0,2 ml dịch đã được lọc vô trùng Đối với nghiệm thức đối chứng thì thay thế dịch chiết bằng 0,2 ml dung dịch ethanol

Đục lỗ giữa các tơ nấm trên môi trường PDA đĩa giống gốc với đường kính

lỗ đục 8 mm, đặt miếng thạch có tơ nấm giống trên vào đĩa thạch PDA được bổ sung dịch chiết nước đã được đục lỗ có đường kính 8 mm

Các đĩa thạch được ủ ở nhiệt độ phòng (370C) trong 3 ngày

2.5.3 Các chỉ tiêu theo dõi

Đo đường kính tản nấm dạng tỏa tròn (mm) sau 3 ngày cấy Đường kính

tản nấm trên đĩa môi trường có bổ sung dịch chiết càng nhỏ so với trên đĩa đối chứng cho biết dịch chiết có tính kháng nấm càng cao

Công thức tính đường kính trung bình của tản nấm:

Dtb =(d1+d2)/2 Trong đó: Dtb: đường kính trung bình của tản nấm, mm

d1 : đường chéo thứ nhất của tản nấm, mm

d2 : đường chéo thứ hai của tản nấm, mm

Hiệu quả kháng nấm của dịch chiết:

Tài liệu HUTECH

Công thức tính hiệu quả kháng nấm:

HQ % = (D1 – D2)/ D1*100 Trong đó: D1: đường kính tản nấm trên môi trường không chứa dịch chiết, mm

D2: đường kính tản nấm trên môi trường chứa dịch chiết, mm

Thang đánh giá hiệu quả kháng nấm:

- HQ ≤10%, dịch chiết không hạn chế được nấm (ký hiệu [-])

- 10% < HQ < 60%, dịch chiết hạn chế nấm ở mức trung bình (ký hiệu [+])

Lọc

Cô quay

Bã Rong

Tài liệu HUTECH