Enzyme là chất xúc tác sinh học được phát hiện lần đầu tiên khoảng giữa thế kỉ XIX, đã và đang đóng vai trò quan trọng ở nhiều khía cạnh khác nhau trong khoa học thực phẩm với các cuộc điều tra, khám phá các nguyên tắc hóa học và sinh học, nghiên cứu phát triển đã được tiến hành cho đến giữa thế kỷ XX về bản chất, cấu trúc và chức năng xúc tác để tạo ra các phản ứng trong quá trình xử lý sinh học một cách tiết kiệm, an toàn và thân thiện với môi trường thay vì sử dụng các chất xúc tác hóa học và trao đổi chất tế bào. Những bước đệm này dẫn đến những tiến bộ trong một số công nghệ như xử lý sinh học bằng enzyme, kiểm soát một số phản ứng enzyme ngoài ý muốn và phân tích thực phẩm dựa trên enzyme cơ bản đã được thiết lập tốt. Một nhược điểm lớn làm hạn chế các ứng dụng công nghiệp của enzyme là bản chất protein của nó dẫn đến các cấu hình cấu trúc cụ thể để kích hoạt các chức năng xúc tác. Những phát triển gần đây trong kỹ thuật enzyme đã phần nào khắc phục được những hạn chế của enzyme truyền thống, bao gồm độ nhạy cảm với môi trường làm việc khắc nghiệt (pH, độ mặn, nhiệt độ, áp suất, dung môi,…v.v.), các quy trình sản xuất phức tạp và đắt tiền, cũng như năng suất thấp, khả năng thu hồi hoạt tính thấp và khả năng tái sử dụng. Như vậy, những tiến bộ trong enzyme học đã nâng cao độ chính xác hơn và sản xuất thực phẩm bền vững, chất lượng hiệu quả quản lý an toàn cho thế hệ mới khỏe mạnh hơn và các sản phẩm thực phẩm an toàn hơn. Người tiêu dùng ngày nay yêu cầu mức chất lượng cao hơn trong thực phẩm của họ về hương và vị tự nhiên không chỉ ở các nước Châu Âu mà còn ở các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam nơi mà việc tiêu thụ là sự di dời nguồn calo để tận hưởng niềm vui cuộc sống. Với xu hướng này làm nảy sinh nhu cầu phát triển các ứng dụng enzyme trong chế biến thực phẩm. Thị trường enzyme thực phẩm toàn cầu ước tính đạt khoảng 2,4 tỷ USD năm 2019. Đến năm 2023, thị trường thực phẩm toàn cầu, enzyme ước tính đạt 3,23 tỷ USD1 và dự kiến sẽ đạt 3,2 tỷ vào năm 20252. Cùng với sự phát triển và tiến bộ trong công cuộc khám phá enzyme mới thì ứng dụng trong số chúng vào thực phẩm cũng không ngừng phát triển. Có thể thấy nhu cầu về thực phẩm lành mạnh thúc đẩy sự tăng trưởng một cách tích cực trên toàn bộ thị trường enzyme thực phẩm. Với mong muốn trên, nhóm 1 thiết kế bài tiểu luận “Vai trò và ứng dụng của enzyme trong công nghiệp thực phẩm”. Bài tiểu luận này trình bày về đặc tính, cơ chế xúc tác, một số yếu tố tác động và ảnh hưởng đến enzyme như thế nào trong thực phẩm.
Tổng quan về enzyme
Sơ lược về lịch sử enzyme
Việc sử dụng enzyme phục vụ trong chế biến thực phẩm có thể bắt nguồn từ hàng nghìn năm trước khi
Dòng thời gian phát triển trong enzym học bắt đầu từ năm 7000 trước Công nguyên khi con người sản xuất thực phẩm lên men để tận dụng enzyme trong vi khuẩn Năm 1833, diastase, enzyme đầu tiên, được phát hiện, tiếp theo là pepsin và invertase Thuật ngữ "enzyme" được Wilhelm Kühne đặt ra vào năm 1877, trong khi Berzelius đã đưa ra khái niệm chất xúc tác vào năm 1836, cho rằng enzyme là chất xúc tác không thay đổi Nấm men, ban đầu được xem như chất xúc tác trong quá trình lên men etanolic, sau đó được phát hiện là sinh vật sống Pasteur đã chứng minh quá trình lên men xảy ra không cần oxygen, nhưng Liebig lại phản đối mối liên hệ giữa nấm men và quá trình này, cho rằng sự phân hủy của nấm men trong oxygen mới tạo ra rượu Cuối cùng, vào năm 1897, Eduard Büchner đã chứng minh rằng chiết xuất men chết có thể thực hiện quá trình lên men giống như men sống, mở đường cho ngành enzyme in vitro hiện đại.
Bản chất hóa học của enzyme vẫn đang là chủ đề tranh luận Năm 1926, James B Sumner đã thành công trong việc kết tinh enzyme đầu tiên, urease, và xác nhận rằng enzyme là một loại protein Ông chỉ ra rằng các nhà hóa học hữu cơ không thể tổng hợp đường mía, nhưng với sự hỗ trợ của enzyme, các nhà hóa học sinh học có khả năng tổng hợp không chỉ đường mía mà còn cả gum dextran, tinh bột và glycogen.
Sự cần thiết của enzyme
Enzyme đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng hóa sinh trong cơ thể, mang lại nhiều lợi ích như giảm thời gian xử lý, tiêu thụ năng lượng thấp và cường lực xúc tác mạnh Chúng có tính đặc hiệu cao, không độc hại và hoạt động hiệu quả trong điều kiện thông thường Enzyme tham gia vào hầu hết các quá trình sống như sao chép DNA, tổng hợp protein và trao đổi chất Trong thế kỷ XX, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra đặc tính của enzyme vi sinh vật, từ quy mô nhỏ đến lớn, với nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật Các enzyme phổ biến nhất được chiết xuất từ nấm, nấm men và vi khuẩn, như amylase và protease Protease đã được sử dụng để làm rõ bia từ năm 1911, trong khi pectinase được dùng để làm trong nước trái cây và rượu vang.
Phân loại, danh pháp
Trong giai đoạn đầu của ngành enzyme học, việc đặt tên enzyme thường diễn ra một cách tùy tiện, phụ thuộc vào từng tác giả, dẫn đến sự thiếu chính xác trong danh pháp Nhiều nhà khoa học cho rằng danh pháp không quan trọng vì họ quen thuộc với hệ thống enzyme của mình, nhưng điều này không mang lại lợi ích thực tiễn Một ví dụ điển hình là sự nhầm lẫn giữa hai họ enzyme monoamine oxidase (EC 1.4.3.4) và amine oxidase (EC 1.4.3.6), vốn có nhiều đặc tính và các chất đồng yếu tố khác nhau Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận rằng các tác giả có thể đã nghiên cứu EC 1.4.3.4 nhưng thực tế lại đang làm việc với EC 1.4.3.6, mà đã được gọi là monoamine oxidase trong một thời gian dài.
In an effort to create a more powerful and useful enzyme system, Dixon and Webb, along with Hoffmann-Ostenhof, successfully persuaded the International Union of Biochemistry (IUB), now known as the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB), to establish the current enzyme committee based on a series number reflecting the overall reactions catalyzed This initiative led to the publication of the Recommendations of the Nomenclature.
The International Union of Biochemistry and Molecular Biology's Commission on the Nomenclature and Classification of Enzymes has released updated recommendations regarding the naming and classification of enzymes based on the reactions they catalyze.
Các bản in của tài liệu đã được cập nhật vào các năm 1965, 1972, 1978, 1984, với ấn bản cuối cùng phát hành vào năm 1992 Số lượng enzyme được công nhận và phân loại đã tăng lên đáng kể kể từ lần xuất bản đầu tiên, như thể hiện trong Hình 1.2.
Hình 1.2 Sự tăng trưởng của các enzyme được phân loại.[19]
Từ năm 1961 đến 2021, số lượng enzyme mới được thêm vào danh sách enzyme IUBMB được hiển thị bằng cột màu xanh lá cây, trong khi số EC bị xóa, tức là những mục cần loại bỏ do có bằng chứng bổ sung, được thể hiện bằng cột màu đỏ Các enzyme đã được phân loại lại sẽ không được đề cập trong thống kê này.
Việc đặt tên cho enzyme thường gây khó khăn và thiếu rõ ràng, với nhiều tên gọi mơ hồ và ít ý nghĩa Nhiều enzyme có thể được đặt cùng một tên, trong khi một enzyme có thể có nhiều tên khác nhau, gây nhầm lẫn cho người sử dụng Ví dụ, các tên như pepsin, trypsin và chimotrypsin vẫn được sử dụng phổ biến nhưng không thể hiện rõ đặc điểm của enzyme.
Hậu tố “-ase” thường được thêm vào tên của cơ chất, ví dụ như urease (enzyme tác dụng vào ure), proteinase (enzyme tác dụng vào protein), lipase (enzyme tác dụng vào lipid) và amylase (enzyme tác dụng vào tinh bột) Năm 1956, Hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUBMB) đã thiết lập tiêu chuẩn về danh pháp enzyme, khuyến nghị tên enzyme phải phản ánh cả cơ chất tác động và loại phản ứng được xúc tác Đối với các enzyme cùng xúc tác một loại phản ứng, tên phản ứng sẽ được thêm hậu tố “-ase”; ví dụ, enzyme xúc tác sự oxy hóa được gọi là oxydase, enzyme khử hydrogen là dehydrogenase, và enzyme uricase được gọi là urate.
Phân loại enzyme nhằm làm rõ mối quan hệ và những điểm tương đồng giữa các loại enzyme Tuy nhiên, công việc này gặp khó khăn do số lượng enzyme có cơ chế xúc tác được hiểu biết đầy đủ còn hạn chế Hệ thống phân loại enzyme IUBMB, được trình bày trên trang web IUBMB ExplorerEnz, sử dụng số EC (The enzyme Commission) để tạo ra một phương pháp phân loại thống nhất dựa trên loại phản ứng và cơ chế phản ứng Theo hệ thống này, enzyme được chia thành sáu lớp chính, mỗi lớp được đánh số từ 1 đến 6, với các số thứ tự cố định cho từng lớp.
Lớp enzyme này bao gồm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa – khử, trong đó chất nền bị oxy hóa được xem là chất cho hydrogen Các enzyme điển hình như dehydrogenase (tách H+), oxygenase (tác động oxy hóa), reductase (tác động khử), cytochromreductase và peroxydase (tác động với H2O2 để loại bỏ độc tính của H2O2) Những enzyme này tham gia vào quá trình vận chuyển hydrogen, chuyển electron, và thực hiện oxy hóa bởi oxy phân tử, hydrogen peroxide hoặc các chất oxy hóa khác.
Trong đó, AH 2 là cơ chất; B là chất nhận H nào đó, có thể là O 2
Các enzyme transferase xúc tác cho phản ứng chuyển vị, tham gia vào nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau nhờ vào việc vận chuyển các gốc như nhóm methyl hoặc nhóm glycosyl từ chất cho sang chất nhận.
Trong đó, x là nhóm được vận chuyển
Các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết như C-O, C-N, C-C và một số liên kết khác, bao gồm cả liên kết anhydrit photphoric Trong nhóm enzyme này, có các enzyme phân giải este, chẳng hạn như lipid, glucozid, amid, peptide và protein.
Các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, bao gồm hydratase, aldolase, decarboxylase và một số desaminase Những enzyme này có khả năng tách liên kết C – C và tạo ra các sản phẩm mới bằng cách kết hợp hoặc loại bỏ phân tử nước.
C – O, C – N và các liên kết khác bằng các phương pháp khác ngoài quá trình thủy phân hoặc oxy hóa [25],[26]
Các enzyme này đóng vai trò xúc tác cho sự thay đổi hình học hoặc cấu trúc của phân tử Tùy thuộc vào loại đồng phân mà chúng tác động, các enzyme này có thể được phân loại thành racemase, epimerase, cis-trans isomerase, isomerase, tautomerase, mutase hoặc cycloisomerase.
Các enzyme đóng vai trò xúc tác trong việc liên kết hai phân tử, đồng thời thực hiện quá trình thủy phân liên kết adiphosphate trong ATP hoặc các triphosphate tương tự Chúng cũng xúc tác cho các phản ứng tổng hợp sử dụng ATP, nguồn năng lượng giàu có cho các quá trình sinh hóa.
Ban đầu, có sáu nhóm enzyme được công nhận: Oxidoreductases (EC 1), Transferases (EC 2), Hydrolase (EC 3), Lyase (EC 4), Isomerase (EC 5) và Ligases (EC 6) Trong số đó, lyase gây ra khó khăn trong việc nhận biết và phân loại do định nghĩa của chúng là “các enzyme tách C-C, C-O, C-N và các liên kết khác mà không thông qua thủy phân hoặc oxy hóa.” Gần đây, lớp enzyme Translocases (EC 7) đã được bổ sung, liên quan đến việc chuyển động của các ion hoặc phân tử qua màng Ngoài ra, một phân lớp mới cho các đồng phân cũng đã được đưa vào, dành cho các enzyme thay đổi cấu hình của protein và acid nucleic Các enzyme mới được xác nhận thường xuyên được thêm vào danh sách, và khi có thông tin mới, các số EC mới sẽ được tạo ra mà không tái sử dụng các số EC cũ Lớp EC này mới được thành lập vào năm 2018, liên quan đến việc xúc tác cho sự chuyển vị của các ion hydrogen, cation và anion vô cơ, amino acid, carbohydrates và các hợp chất khác.
Hình 1.3 Sáu lớp enzyme được công nhận ban đầu theo IUB
Bảng 1.1 Phân loại enzyme theo loại phản ứng được xúc tác
Lớp Transloscase EC 7 được thêm vào năm 2018 [19] a Trong đó nicotinamide – adenine dinucleotide là chất nhận, NAD+ và NADH + H+ được sử dụng theo quy ước b NTP = nucleoside triphosphate
Sơ lược về cấu trúc enzyme
Cùng với sự tiến bộ trong việc hiểu biết về cấu trúc enzyme, các kỹ thuật vật lý và hóa học đã được phát triển và áp dụng để làm rõ các cơ chế như động học chi tiết, ghi nhãn đồng vị, hiệu ứng đồng vị và kỹ thuật quang phổ.
Enzyme là sản phẩm của quá trình sinh học được sinh ra trong tế bào, chịu sự kiểm soát chặt chẽ của tế bào Theo Britannica, enzyme xúc tác các phản ứng có thể xảy ra trong cơ thể sống hoặc ngoài cơ thể Tất cả các quá trình sinh học trong sinh vật đều là phản ứng hóa học, hầu hết được điều hòa bởi enzyme Nếu không có enzyme, nhiều phản ứng quan trọng sẽ không diễn ra ở mức độ cảm nhận được Mặc dù có nguồn gốc khác nhau, các enzyme đều chia sẻ những đặc tính chung.
Enzyme chỉ tham gia vào một hoặc một vài phản ứng cụ thể, và số lượng enzyme trong mỗi loài được điều chỉnh bởi gen cũng như các điều kiện phản ứng.
Enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác các phản ứng sinh hóa trong tế bào sống, cũng như khi tách ra khỏi tế bào, giúp giải phóng năng lượng từ các hợp chất hóa học Chúng tham gia vào tất cả các khía cạnh của quá trình trao đổi chất, bao gồm tiêu hóa thức ăn, nơi các phân tử dinh dưỡng lớn như protein, carbohydrate và chất béo được phân hủy thành các phân tử nhỏ hơn; đồng thời bảo toàn và chuyển đổi năng lượng hóa học; và xây dựng các đại phân tử tế bào từ các tiền chất nhỏ hơn Thiếu hụt enzyme cụ thể có thể dẫn đến nhiều bệnh di truyền ở người, như bệnh bạch tạng và bệnh phenylketon niệu.
Enzyme là những chất xúc tác quan trọng, được tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa từ 30 đến 40 độ C Trong quá trình sống, cơ thể và tế bào sản sinh ra các enzyme chịu nhiệt, ngoại trừ một số vi sinh vật sống trong điều kiện đặc biệt Một ví dụ điển hình là enzyme phytase, thường được sử dụng để cung cấp phosphate cho động vật và giảm ô nhiễm phosphate trong chất thải Nhiệt độ tối ưu cho hầu hết các phytase thực vật và vi sinh vật là từ 45 đến 60 độ C, điều này làm hạn chế khả năng hoạt động của phytase ở nhiệt độ dạ dày của lợn và gia cầm (37 đến 40 độ C) và có thể dẫn đến hiệu suất kém ở cá Một ví dụ khác là vi khuẩn Thermus aquaticus, sống trong suối nước nóng, có khả năng tổng hợp enzyme Taq polymerase, một enzyme chịu nhiệt không bị phân hủy ở nhiệt độ cao.
95 0 C (nhiệt độ biến tính phân tử AND)[36].
Bảng 1.2 Các thông số nhiệt động của 28 enzyme phù hợp với mô hình cân bằng [37]
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, được phát hiện bởi James Sumner vào năm 1926 Với kích thước phân tử lớn (khoảng 10.000 đến 2.000.000 dalton), enzyme không thể đi qua màng bán thấm Chúng được hình thành từ các chuỗi amino acid liên kết với nhau bằng liên kết peptide Dưới tác động của peptithydrolase, acid hoặc kiềm, enzyme có thể bị thủy phân hoàn toàn thành các L – α – amino acid Một phân tử enzyme protein lớn bao gồm một hoặc nhiều chuỗi amino acid, được gọi là chuỗi polypeptide.
Hình 1.4 Cấu trúc protein điển hình - hai amino acids nối với nhau bằng liên kết peptide [26]
Enzyme là protein có tính chất lý hóa như tan trong nước và tạo thành dung dịch keo, đồng thời cũng hòa tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ có cực Tuy nhiên, enzyme không bền và dễ bị biến tính khi chịu tác động của nhiệt độ cao, dẫn đến mất khả năng xúc tác Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tỷ lệ thuận với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm Ngoài ra, kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng có thể làm biến tính enzyme Giống như protein, enzyme có tính chất lưỡng tính và hoạt động của chúng phụ thuộc vào tính linh hoạt của protein.
Hình 1.5 Chuỗi amino acid Nguồn: U.S National Library of Medicine
Enzyme được hình thành trong tế bào dưới hai dạng protein: protein đơn giản và protein phức tạp Đa số enzyme thuộc loại protein phức tạp, do đó chúng được phân chia thành hai nhóm chính.
Enzyme đơn cấu tử: là những enzyme mà trong phân tử chỉ có thành phân protein (ví dụ: Pepsine, Amylase, Urease).
Enzyme là các protein phức tạp, thường bao gồm một nhóm ngoại không phải protein, như trong trường hợp của Catalase với nhóm ngoại là nhân Heme Phần lớn các enzyme đều là enzyme đa cấu tử, có cấu trúc phức tạp với hai thành phần chính.
Phần protein được gọi là feron, apoprotein hay apoenzyme Apoenzyme thường quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme.
Nhóm ngoại, hay còn gọi là nhóm ghép hay yếu tố phụ, là phần không chứa protein nhưng thường bao gồm các chất đặc hiệu có khả năng gắn chặt hoặc liên kết lỏng lẻo với protein Những yếu tố này có thể dễ dàng tách rời khỏi protein khi thực hiện thẩm tích qua màng.
Nhiều enzyme yêu cầu sự hiện diện của các hợp chất gọi là cofactors để có thể hoạt động hiệu quả Phức hợp hoàn chỉnh của enzyme, bao gồm apoenzyme (phần protein) kết hợp với các đồng yếu tố như coenzyme, nhóm prosthetic hoặc các ion kim loại, được gọi là holoenzyme.
Hình 1.6 Holoenzyme cộng thêm một số loại đồng yếu tố [26]
Prosthetic là một coenzyme hoặc ion kim loại liên kết cộng hóa trị với phần protein của enzyme Đồng yếu tố là thành phần hóa học bổ sung cần thiết cho hoạt động của enzym, tham gia trực tiếp vào sự kiện xúc tác Đồng yếu tố có thể là coenzym, một phân tử hữu cơ phi protein như vitamin, hoặc ion kim loại vô cơ Nhiều enzyme chứa kim loại làm đồng yếu tố, hay còn gọi là cofactor, bao gồm các kim loại như K+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, và Zn2+.
Các ion kim loại như Mn 2+, Mg 2+, Ca 2+ và Mo 3+ đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành các phức hợp chelate giữa các nhóm chức của cơ chất và enzyme.
Sự phân biệt giữa coenzym và nhóm ngoại là tương đối, do không có tiêu chuẩn rõ ràng để phân loại “liên kết chặt chẽ” và “liên kết không chặt chẽ” Nhiều coenzym kết hợp với apoenzyme thông qua liên kết đồng hóa trị.
Nhiều đồng yếu tố sinh học là dẫn xuất của vitamin B, và sự thiếu hụt vitamin này có thể dẫn đến các tình trạng bệnh lý do apoenzyme không hoạt động Các apoenzyme cần có sự liên kết chặt chẽ với coenzyme để thực hiện chức năng của chúng.
(đồng yếu tố enzyme được sửa đổi)
Vitamin B1 (Thiamine) Thiamine Diphosphate (TPP)
Vitamin B2 (Riboflavin) Flavin Mononucleotide (FMN)
Flavin Adenine Dinucleotide (FAD FADH 2 )
Vitamin B3 (Niacianamide) Nicotinamide adenine dinucleotide
Vitamin B3 (Niacin) Nicotinamide dinucleotide phosphate carboxylic acid form (NADP NADPH)
Bảng 1.3 Một số Vitamin B thiết yếu và các đồng yếu tố enzyme được biến đổi của chúng [39]
Tính chất
Tốc độ phản ứng hóa học phụ thuộc vào năng lượng hóa học; năng lượng càng cao thì tốc độ càng chậm Chất xúc tác, như enzyme trong các phản ứng sinh học, giúp giảm năng lượng hóa học và tăng tốc độ phản ứng Enzyme có khả năng xúc tác mạnh mẽ hơn nhiều so với các chất xúc tác vô cơ.
1.5.2 Tính đặc hiệu của enzyme
Tính đặc hiệu của enzyme là đặc điểm quan trọng trong chẩn đoán và điều trị, nhờ vào cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử enzyme, đặc biệt là trung tâm hoạt động Enzyme có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hoặc một số chất nhất định theo kiểu phản ứng cụ thể, điều này được gọi là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên hóa của enzyme.
Đặc hiệu kiểu phản ứng
Mỗi enzyme đều có tính đặc hiệu với một loại phản ứng hóa học nhất định Khi một chất có khả năng tham gia vào nhiều phản ứng khác nhau, mỗi phản ứng đó cần một enzyme đặc hiệu để xúc tác Ví dụ, amino acid có thể tham gia vào các phản ứng như khử carboxyl, khử amin bằng cách oxy hóa và vận chuyển nhóm amino, do đó mỗi phản ứng này đều cần enzyme tương ứng là decarboxylase, aminoacid oxydase và aminotransferase.
Enzyme có đặc hiệu cơ chất đa dạng, được phân loại thành nhiều nhóm Đặc hiệu tuyệt đối là khi enzyme chỉ xúc tác cho một phản ứng cụ thể với cơ chất xác định, như urease chỉ phân giải ure Đặc hiệu nhóm tuyệt đối cho phép enzyme tác động lên các chất có cấu trúc phân tử tương tự, ví dụ như maltase chỉ xúc tác thủy phân liên kết glucoside Đặc hiệu nhóm tương đối cho phép enzyme tác động lên một kiểu liên kết hóa học nhất định mà không phụ thuộc vào cấu trúc chi tiết, như lipase có thể thủy phân mọi mối liên kết este Cuối cùng, đặc hiệu quang học cho thấy enzyme chỉ tác động lên một trong hai dạng đồng phân không gian của cơ chất, cho thấy tính chọn lọc cao trong hoạt động của chúng.
1.5.3 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme
Trong enzyme học, enzyme không được định lượng trực tiếp mà thường được xác định gián tiếp thông qua độ hoạt động của enzyme, do nồng độ trong huyết tương hoặc dịch cơ thể rất thấp Các phương pháp như so màu, đo khí, đo độ phân cực, đo độ nhớt và chuẩn độ thường được sử dụng để nghiên cứu định lượng enzyme Các phương pháp này có thể được chia thành ba nhóm chính.
Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định.
Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm với một nồng độ enzyme nhất định.
Chọn nồng độ enzyme như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Đơn vị đo hoạt độ enzyme
Hoạt độ enzyme được đo bằng đơn vị hoạt độ, và khái niệm đơn vị enzyme quốc tế (hoặc đơn vị enzyme tiêu chuẩn) đã được giới thiệu tại hội nghị quốc tế về hóa sinh enzyme vào năm 1961 Hoạt động enzyme được biểu diễn qua các đơn vị cụ thể.
Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI): là lượng enzyme tối thiểu có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 μ M cơ chất sau một phút ở điều kiện chuẩn.
Katal (Kat): Đơn vị Kat là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 mol cơ chất sau một giây ở điều kiện chuẩn.
1 Kat=1 mol cơ chất /¿ giây
Tác nhân ảnh hưởng tới enzyme
Trong kìm chế cạnh tranh, các chất kìm hãm có cấu trúc tương tự như cơ chất và thường là chất kìm hãm thuận nghịch Chúng kết hợp với TTHĐ, chiếm chỗ của cơ chất, làm giảm khả năng tiếp cận của cơ chất đến trung tâm hoạt động của enzyme Sự cạnh tranh giữa chất kìm hãm và cơ chất phụ thuộc vào nồng độ của cả hai và ái lực của chúng với enzyme.
Hình 1.10 Kìm hãm cạnh tranh [45]
Hình 1.11 Sự phụ thuộc của nồng độ cơ chất và nồng độ phản ứng theo Lineweaver – Burk khi có kìm hãm cạnh tranh[45]
1.6.2 Kìm hãm không cạnh tranh
Hình 1.12 Phản ứng ảnh hưởng của chất kìm hãm không cạnh tranh[45]
Hình 1.13 Sự phụ thuộc của nồng độ cơ chất và nồng độ phản ứng theo Lineweaver – Burk khi kìm hãm không cạnh tranh [45]
Kìm hãm không cạnh tranh (noncompetitive inhibition) xảy ra khi chất kìm hãm không chiếm TTHĐ của enzyme mà gắn vào vị trí khác, dẫn đến thay đổi cấu trúc không gian của enzyme theo chiều bất lợi, làm giảm hoạt động của enzyme Bên cạnh đó, còn tồn tại kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất, ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình enzymatic.
1.6.3 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa enzyme là các phân tử giúp tăng cường hoạt động của enzyme bằng cách chuyển chúng từ trạng thái không hoạt động sang hoạt động Chúng có thể là anion, ion kim loại hoặc các hợp chất hữu cơ phức tạp và chỉ có hiệu quả ở một nồng độ nhất định; nếu vượt quá nồng độ này, chúng có thể ức chế hoạt động của enzyme hoặc làm enzyme hoạt động không đặc hiệu Ví dụ, ion Mg²⁺ có khả năng kích hoạt enzyme với cơ chất là pyrophosphate và adenosintriphosphatase (ATP) Các cation kim loại có thể thể hiện tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng tùy thuộc vào nồng độ.
Tính chất hoạt hóa của các loại cation kim loại:
Mỗi loại cation kim loại hoạt hóa cho một phản ứng nhất định
Cation kim loại có tính đặc biệt tương đối hay tuyệt đối
Cation kim loại có thể có sự đối kháng ion
Phụ thuộc nồng độ cation kim loại
Cation kim loại làm thay đổi pH tối thích
Phụ thuộc bản chất cation kim loại
1.6.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Tăng nhiệt độ môi trường có thể làm tăng vận tốc phản ứng theo quy luật Vant – Hoff, với việc tăng 10°C sẽ làm tốc độ phản ứng tăng gấp đôi Đối với các phản ứng có xúc tác enzyme, tốc độ cũng tăng khi nhiệt độ tăng, nhưng chỉ trong những trường hợp nhất định Enzyme là protein và nhiều enzyme nhạy cảm với nhiệt độ cao; khi nhiệt độ vượt quá 40-50°C, enzyme có thể bị phá hủy và biến tính Do đó, sau nhiệt độ tối ưu, tốc độ phản ứng sẽ giảm, giúp phân biệt phản ứng hóa sinh với các phản ứng vô cơ thông thường.
Mỗi enzyme có nhiệt độ tối ưu khác nhau, thường nằm trong khoảng 40-60 độ C, tùy thuộc vào nguồn gốc của enzyme Một số enzyme, đặc biệt là từ các chủng ưa nhiệt, có thể hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ rất cao.
Hình 1.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng [26]
Sau một thời gian, enzyme sẽ bị vô hiệu hóa ở nhiệt độ vừa phải, vì vậy việc bảo quản enzyme ở nhiệt độ 5 độ C hoặc thấp hơn là tối ưu nhất Tuy nhiên, cần lưu ý rằng một số enzyme có thể mất hoạt động khi đông lạnh.
1.6.5 Ảnh hưởng của pH tới enzyme
Sự phân li của phân tử protein thay đổi theo giá trị pH, ảnh hưởng đến tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động của enzyme, dẫn đến các giá trị xúc tác khác nhau Độ pH tối ưu là điểm mà enzyme hoạt động hiệu quả nhất Hình 1.15 minh họa điều này.
Hình 1.15 Ảnh hưởng của pH đến tốc độ phản ứng[26]
Giá trị pH quá cao hoặc quá thấp có thể làm mất hoạt tính của hầu hết các enzyme, trong khi độ pH cũng ảnh hưởng đến sự ổn định của enzyme Mỗi enzyme có một vùng pH tối ưu riêng, và giá trị này có thể khác nhau đáng kể tùy thuộc vào loại enzyme Do đó, việc tối ưu hóa các thông số vật lý như nhiệt độ và hóa học như pH là cần thiết để đảm bảo phản ứng enzyme diễn ra chính xác và có thể lặp lại.
Độ pH ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của enzyme, với sự thay đổi không thuận nghịch trong một phạm vi pH hẹp Ở hai bên của pH tối ưu, có thể xảy ra sự phân ly của nhóm prosthetic hoặc coenzyme, cũng như thay đổi mức ion hóa của cơ chất Điều này dẫn đến sự biến đổi trong ái lực liên kết giữa enzyme và cơ chất, ảnh hưởng đến hoạt tính tối đa của enzyme Việc xác định Vmax và Km theo giá trị pH giúp làm rõ bản chất của các nhóm tham gia vào liên kết cơ chất và quá trình tự xúc tác.
1.6.6 Một số yếu tố khác Ánh sáng: Có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng đỏ có tác động yếu nhất Ánh sáng vùng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi, enzyme ở trạng thái dung dịch bền hơn khi được kết tinh ở dạng tinh thể, nồng độ enzyme trong dung dịch càng thấp thì càng kém bền, tác động của tia tử ngoại sẽ tăng lên khi nhiệt độ Ví dụ: dưới tác động của tia tử ngoại ở nhiệt độ cao, enzyme amylase nhanh chóng mất hoạt tính.
Sự chiếu điện với cường độ cao tạo ra tác động phá hủy mạnh mẽ, đặc biệt là đối với dịch enzyme có nồng độ thấp Hiện tượng này có thể xảy ra do sự hình thành các gốc tự do, từ đó gây ảnh hưởng tiêu cực đến các phản ứng enzym.
Sóng siêu âm: Tác động rất khác nhau đối với từng loại enzyme, có enzyme bị mất hoạt tính, có enzyme lại không chịu ảnh hưởng.
Độ bền của enzyme phụ thuộc vào trạng thái tồn tại của nó; enzyme càng tinh khiết thì độ bền càng thấp Ngoài ra, độ loãng của dịch cũng ảnh hưởng đến độ bền, với dịch càng loãng thì enzyme càng kém bền Một số ion kim loại, như Ca 2+ với nồng độ khoảng 10 – 3M, có tác dụng làm tăng tính bền của enzyme trong dịch.
Vai trò và ứng dụng của enzyme trong công nghệ thực phẩm
Vai trò
2.1.1 Tăng tốc quá trình chuyển hóa thực phẩm
Enzyme là chất xúc tác tự nhiên có khả năng tăng tốc độ phản ứng hóa học trong thực phẩm, giúp giảm thời gian cần thiết cho các quá trình chuyển hóa Nhờ đó, enzyme không chỉ nâng cao hiệu suất sản xuất mà còn giảm thiểu sự mất mát trong quá trình chế biến Việc sử dụng enzyme trong sản xuất thực phẩm ngày càng phổ biến, mang lại hiệu quả cao và tiết kiệm thời gian cho các nhà sản xuất.
2.1.2 Cải thiện chất lượng sản phẩm
Enzyme, với bản chất là protein, có khả năng cải thiện chất lượng sản phẩm thực phẩm bằng cách tác động đến cấu trúc và thành phần của chúng Chúng có thể làm mềm bánh và thịt, đồng thời loại bỏ tạp chất, cải thiện độ trong suốt và màu sắc của sản phẩm nước Ngoài ra, enzyme còn hỗ trợ xúc tác quá trình lên men trong sản xuất bia và rượu.
2.1.3 Điều chỉnh hương vị và màu sắc
Hương vị và phụ gia thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao hương vị, màu sắc và kết cấu của thực phẩm, đồng thời kéo dài thời gian bảo quản Trong ngành công nghiệp thực phẩm, enzyme được sử dụng như phụ gia thực phẩm, giúp sản xuất hiệu quả hơn Những enzyme này là các chất không độc hại, chứa protein tự nhiên có trong thực phẩm và có thể được sản xuất bởi vi sinh vật để xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau.
2.1.4 Độ tươi mới của sản phẩm
Enzyme có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa và phân hủy, giúp kéo dài tuổi thọ và độ tươi mới của thực phẩm đông lạnh Đặc biệt, enzyme còn duy trì chất lượng sản phẩm và hạn chế tối đa việc mất hương vị ban đầu sau khi giải đông.
Ứng dụng
Ứng dụng enzyme trong ngành công nghiệp thực phẩm dựa trên ba nguyên tắc chính: kiểm soát chất lượng thực phẩm, thay đổi thuộc tính của phụ gia thực phẩm và sửa đổi thực phẩm Nhiều enzyme hiện đang được sử dụng làm phụ gia thực phẩm cho các ứng dụng đa dạng.
Bánh mì và các loại bánh nướng là nguồn thực phẩm dinh dưỡng quan trọng, với sản lượng bột mì toàn cầu đạt 600 triệu tấn mỗi năm Người Châu Âu phụ thuộc vào bột mì để cung cấp gần một nửa nhu cầu carbohydrate và một phần ba nhu cầu protein hàng ngày.
Từ thời cổ đại, người Ai Cập đã sử dụng enzyme nội sinh có trong bột mì mà chưa hiểu rõ tác dụng của chúng Dù hiện nay có nhiều hóa chất như sodium metabisulfite, cysteine, azodicarbonamide (ADA) và potassium bromate có hiệu quả tương tự, nhưng xu hướng hiện tại trong ngành thực phẩm là ưu tiên sử dụng các sản phẩm tự nhiên.
“xanh” hơn, vì thế các chất xúc tác sinh học ngày càng được ưa chuộng Có thể nói enzyme tác động rất nhiều trong quá trình làm bánh mì[49].
Thủy phân tinh bột là một bước quan trọng trong quá trình làm bánh, chủ yếu do enzyme amylase thực hiện Amylase, được phát hiện bởi Anselme Payen vào năm 1833, là enzyme phổ biến trong vi sinh vật Enzyme này thuộc nhóm thủy phân, giúp chuyển đổi tinh bột thành đường đơn, có vai trò quan trọng trong việc hóa lỏng tinh bột và sản xuất các loại siro như fructose và glucose, cũng như trong nước ép trái cây α-Amylase cắt đứt liên kết 1,4-glycoside, tạo ra dextrin và làm giảm khả năng giữ nước của bột Do đó, sự hiện diện của α-Amylase trong bột nhão có thể ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình nướng.
Amylase có khả năng tăng độ acid của bột nhào, trong đó β-amylase cắt đứt liên kết glycoside của α-1,4-glucan để tạo ra maltose, từ đó nâng cao chất lượng sản phẩm Amylose trong nấm mốc chỉ mất hoạt tính khi nhiệt độ vượt quá 70 o C, không ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình nướng, nên thường được sử dụng trong sản xuất bánh mì Tại Việt Nam, mầm lúa thường được sử dụng để sản xuất amylase.
Glucoamylase là enzyme được sử dụng để nâng cao chất lượng bột, làm chậm quá trình ôi thiu và cải thiện tính chất của bột, từ đó mang lại hiệu quả gia công tốt hơn Ngoài ra, enzyme này còn giúp tăng cường màu sắc vỏ bánh mì, tẩy trắng bột và cải thiện chất lượng của các sản phẩm nướng.
Pentosan trong bột mì có tác động tích cực đến đặc tính của bột nhào và bánh mì, nhờ vào khả năng tạo gel oxy hóa và làm chậm quá trình ôi của vụn bánh mì trong quá trình bảo quản Khi các pentosan không tan trong nước được chuyển thành dạng hòa tan nhờ hoạt động của pentosanase, thể tích ổ bánh có thể đạt gần mức đối chứng Enzym pentosanase và hemicellulase giúp giải phóng nước tự do bằng cách phá hủy sự hấp thụ nước của pentosan, từ đó tăng thể tích ổ bánh Việc thêm enzym pentosanase, hoặc kết hợp với cellulase, đều giúp giải quyết vấn đề và gia tăng tính gia công của bột.
Pullulase là enzyme quan trọng trong ngành công nghiệp tinh bột, chuyên dùng để thủy phân liên kết α-1,6-glycoside Enzyme này giúp chuyển đổi hiệu quả các polysacarit phân nhánh thành các loại đường lên men nhỏ trong quá trình đường hóa Việc sử dụng pullulanase không chỉ tăng nồng độ glucose cuối cùng mà còn cho phép giảm lượng glucoamylase cần thiết.
Cellulase là enzyme chủ yếu được sản xuất bởi vi khuẩn, động vật nguyên sinh và nấm, có vai trò quan trọng trong việc phân hủy cellulose bằng cách cắt đứt liên kết β-1,4 giữa các đơn vị β-glucose, tạo ra monosacarit như beta-glucose và oligosacarit Do cấu trúc phức tạp của cellulose, cellulase có ba dạng chính: exoglucanase, endoglucanase và cellobiase Enzyme này được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất ethanol sinh học từ tàn dư thực vật cellulose và trong công nghệ thực phẩm để cải thiện khả năng hấp thu, nâng cao hương vị và làm mềm thực phẩm, đặc biệt là thực phẩm cho trẻ em Cellulase cũng ảnh hưởng đến quá trình nướng bánh, giúp giảm kích thước polyme cellulose thành polyme glucose nhỏ hơn, với cellulase từ Humicola insolens được sử dụng để tăng độ mềm và xốp cho bánh mì.
Transglutaminase (E.C.2.3.2.13) là một enzyme quan trọng trong việc hình thành liên kết chéo giữa các phân tử protein, mang lại những đặc tính độc đáo như khả năng tạo gel, độ ổn định nhiệt và khả năng giữ nước Enzyme này có mặt rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy ở nhiều mô động vật, cá và thực vật Một loại transglutaminase từ Streptoverticillium sp đã được ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt trong hải sản, sản phẩm surimi, thịt, mì, sản phẩm từ sữa và đồ nướng Nó có tiềm năng lớn trong việc cải thiện độ cứng, độ đàn hồi, độ nhớt và khả năng giữ nước của thực phẩm chế biến sẵn thông qua phản ứng enzyme nhẹ, mở ra nhiều cơ hội nghiên cứu và ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Protease là một loại enzyme thủy phân quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm và sản xuất chất tẩy rửa Enzyme này xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptide trong protein, tạo ra amino acid, pepton hoặc di-tripepton Protease được phân loại dựa trên cấu trúc và đặc điểm hoạt động, có khả năng cắt đứt các peptide phức tạp thành các liên kết đơn giản Sự lựa chọn loại protease ảnh hưởng đến tính chất vật lý của bột nhào, có thể làm bột nở to hơn hoặc mất tính dính dẻo Ngoài ra, protease còn tác động đến hương vị và màu sắc sản phẩm, như việc sử dụng peptidase trong bánh mì có thể cải thiện hương vị và màu sắc của vỏ bánh Các amino acid và peptide sinh ra từ hoạt động của peptidase không chỉ tạo mùi thơm mà còn tham gia vào phản ứng Maillard, góp phần làm phong phú thêm hương vị và màu sắc cho sản phẩm.
Bảng 2.6 Ứng dụng enzyme khác nhau trong sản xuất bánh mì [66]
2.2.2 Chế biến rau củ quả
Trong chế biến rau quả, enzyme như pectinase, cellulase, tannase và amyl glucosidase đóng vai trò quan trọng, giúp phá vỡ thành tế bào, giải phóng chất lỏng và đường, đồng thời cải thiện thời gian bảo quản cho sản phẩm thực phẩm đã qua chế biến.
Các ứng dụng của pectinase đã được quan sát và nghiên cứu vào những năm 1930[68],
Enzyme pectinase, hay còn gọi là enzyme pecitc, thuộc họ polysaccharides, có vai trò quan trọng trong việc phân hủy polyme pectin thành các sản phẩm như acid galacturonic, galactose, arabinose và metanol Đây là nhóm enzyme được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất nước trái cây và rượu vang, nhằm cải thiện chất lượng nước ép và tăng năng suất Tuy nhiên, việc sử dụng pectinase trong nước cam cần được kiểm soát do sự kết tủa không hấp dẫn có thể xảy ra Pectinase cũng được sử dụng trong quá trình xử lý nghiền trái cây để làm trong và tăng màu sắc, đặc biệt ở táo, lê, nho, cam, xoài, ổi, dứa và đu đủ Enzyme này hoạt động bằng cách phá vỡ các liên kết glycoside trong pectin, giúp tăng hiệu suất chiết xuất và tạo ra các sản phẩm như acid pectic và methanol.
Cellulase là enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong cellulose, giúp tạo ra glucose và các đường đơn giản, do đó được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của cellulase khoảng 50°C với pH 5,5 Dịch quả sau khi ép thường chứa tế bào thịt quả và chất xơ polysaccharide, gây ra độ nhớt cao và màu đục Cellulase, cùng với xylanase và pectinase, tạo thành phức hợp enzyme macating, được sử dụng để chiết xuất và làm trong nước ép trái cây, giúp tăng năng suất và giảm độ nhớt cho nước ép từ các loại trái cây nhiệt đới như xoài, đào và đu đủ Ngoài ra, cellulase cũng giúp kéo dài tuổi thọ cho thực phẩm, đặc biệt là trái cây dễ thối.
Hình 2.16 Cơ chế thủy phân cellulose và hệ phức cellulose[76]
Glucanase là enzyme quan trọng trong việc phá vỡ thành tế bào và thủy phân polysaccharide, giúp giảm độ nhớt của dịch quả, từ đó thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong Khi kết hợp với hemicellulase và pectinase, glucanase tạo thành chế phẩm enzyme viscozyme, chủ yếu được sử dụng để xử lý màng tế bào đậu tương Trong sản xuất nước cà rốt, endoglucanase thường được áp dụng ở giai đoạn dịch hóa, giúp tăng cường lượng pectin trong sản phẩm.
