nghiên cứu quy trình tạo hạt và các điều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano chitosan

Người thực hiện Tưởng Ngọc Thục Uyên BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN   TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜ

LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tơi Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác Mọi sự giúp đỡ và các thơng tin trích dẫn đã được nêu rõ nguồn gốc Người thực hiện

Tưởng Ngọc Thục Uyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

    TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO CHITOSAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUƠN MA THUỘT, NĂM 2010

-Lãnh ñạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo Phòng Sau ñại học, Khoa Khoa học tự nhiên -Công nghệ, Khoa Nông Lâm nghiệp

- Các Thầy Cô giáo ñã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu trong quá trình học tập

- Ban Giám hiệu Trường THPT chuyên Nguyễn Du

- Các bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Trân trọng cảm ơn

Người thực hiện

Tưởng Ngọc Thục Uyên

MỤC LỤC

Trang LỜI CAM ĐOAN ……… i

LỜI CẢM ƠN ……… ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG ……… vi

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ viii

DANH MỤC CÁC HÌNH x

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Tính cấp thiết 1

1.2 Mục tiêu ñề tài 2

1.3.Ý nghĩa khoa học 3

1.4.Ý nghĩa thực tiễn 3

1.5.Giới hạn ñề tài 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

2.1 Tổng quan về chitosan ……… 4

2.2 Tổng quan về nano chitosan 6

2.2.1 Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan 6

2.3 Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học 14

2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư 16

2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) 17

2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa 17

2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing) 18

2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng 19

2.3.6 Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc 19

2.3.7 Hoạt tính kháng khuẩn ……… 21

2.3.8 Hoạt tính chống ñông máu của dẫn xuất sulfated chitosan 27

2.3.9.Ứng dụng làm tá chất cho vaccin 28

2.4 Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus 31

2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli 31

2.4.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 36

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

3.1 Nội dung nghiên cứu 40

3.1.1 Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 40

3.1.2 Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 40

3.2 Phương pháp nghiên cứu 40

3.2.1 Hóa chất 40

3.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu 41

3.2.3 Thời gian thực hiện 41

3.2.4 Phương pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 41

3.2.5 Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano Chitosan 43

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

4.1 Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 50

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến kích thước hạt, ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan 50

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ CS:TPP (w/w) ñến kích thước và ñiện thế hạt nano chitosan 56

4.2 Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 62 4 2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả năng kháng khuẩn 62 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan ñến khả

năng kháng khuẩn 64

4.2.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 69

4.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 73

4.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 76

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79

5.1 Kết luận 79

5.2 Kiến nghị 79

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU , CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Số thứ tự

Chữ ciết tắt

Nghĩa của các chữ viết tắt

CS CMC CNP TEM SEM kDa

E.coli S.aureus

LMWC

Sắc kí lỏng cao áp Nồng ñộ ức chế tối thiểu Deoxyribo nucleic acid Plasmide deoxyribo nucleic acid Diethylmethylchitosan

Tri polyphosphate Polymethacrylic axit Chitosan

Cacboxymethyl cellulose Chitosan nanoparticles Kính hiển vi ñiện tử truyền quang Kính hiển vi ñiện tử quyét

Kilo Dalton

Escherichia coli Staphylococcus aureus

Khối lượng phân tử thấp

DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang

2.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế

và khả năng hấp phụ BSA 8

2.2 Tính chất vật lý của chitosan oligomer/CMC nanoparticles

hấp phụ với pDNA 11

2.3 Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan ñến ứng dụng trong sinh y học 15

2.4 Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 24

2.5 Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn 25

2.6 Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của kháng sinh

Doxycycline và Chitosan nanoparticles 27

4.1 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến tính chất hạt nano chitosan 50

4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Chitosan: TPP ñến tính chất hạt nano

chitosan (Chitosan 30kDa) 56

4.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ ñến khả năng kháng khuẩn

của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus 62

4.4 Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và

chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 65

4.5 Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67

4.6 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng

kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70

4.7 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 72

4.8 Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của

nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74

4.9 Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của

nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75

4.10 Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 76

4.11 Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 77

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ STT Tên ñồ thị Trang

4.1 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng

lượng phân tử 20 kDa 53

4.2 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng

lượng phân tử 30 kDa 54

4.3 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng

lượng phân tử 300 kDa 55

4.4 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 3:1 57

4.5 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 4:1 58

4.6 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 5:1 59

4.7 Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ

CS:TPP là 6:1 60

4.8 Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 7:1 61

4.9 Khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus 63

4.10 Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 66

4.11 Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67

4.12 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70

4.13 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 73

4.14 Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng khuẩn

của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74

4.15 Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng

khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75

4.16 Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 77

4.17 Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn

của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 78

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên hình ảnh Trang

2.1 Sơ ñồ phương pháp tạo hạt nanochitosan 7

2.2 Cơ chế tạo hạt chitosan nanoparticles với axit methacrylic 9

2.3 TEM của hạt nanoparticles CS-PMAA 10

2.4 Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp kết tủa 12

2.5 Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp sấy phun 13

2.6 Sơ ñồ tạo hạt bằng phương pháp mixel ngược pha 14

2.7 Ảnh hưởng của chitosan và chitosan oligomer (COS) ñến tế bào E.coli (Eaton,2008) 22

2.8 Cơ chế xâm nhập qua màng của chitosan mang vaccin có kích thước nm khác nhau 29

2.9 Ảnh hưởng của các loại adjuvant lên ñáp ứng miễn dịch của chuột với vaccin cúm H5N1 30

2.10 Ảnh hưởng của chitosan và các tá chất khác ñến ñáp ứng miễn dịch của chuột với vaccin H5N1 và hiệu giá kháng thể (HIU) 31

4.1 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân tử là 20 kDa 53

4.2 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân tử là 30 kDa 54

4.3 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với trọng lượng phân tử là 300 kDa 55

4.4 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 3:1 57

4.5 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 4:1 58

4.6 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 5:1 59 4.7 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP làà 6:1 60 4.8 Ảnh TEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS: TPP là 7:1 61

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

   

TƯỞNG NGỌC THỤC UYÊN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TẠO HẠT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU NHẰM TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA NANO CHITOSAN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1.Tính cấp thiết

Khoa học và công nghệ nano là một lĩnh vực mới trong những năm gần

ñây nhưng ñã và ñang phát triển nhanh chóng vì sự hiệu quả và những ứng dụng rộng rãi của nó trong nhiều ngành như sinh y học, ñiện tử, vật lí, hóa học Vật liệu nano với kích thước nanomet siêu nhỏ ñã thể hiện nhiều tính chất mới lạ do hiệu ứng kích thước Hiện nay nhiều nước trên thế giới ñang xem công nghệ nano là mục tiêu mũi nhọn ñể ñầu tư phát triển

Việt Nam là nước ñang phát triển, vệ sinh an toàn thực phẩm ở mức rất thấp và chịu sự chi phối của nhiều yếu tố như: môi trường ô nhiễm dẫn ñến ô nhiễm vào nông sản và vật nuôi, quy trình sản xuất và chế biến thực phẩm còn nhỏ lẻ, không ñáp ứng ñiều kiện vệ sinh an toàn thực phẩm, hủ tục lạc hậu trong ăn uống hoặc vì lợi nhuận mà sử dụng phụ gia, bảo quản ngoài danh mục bộ y tế, kiểm soát thực phẩm qua biên giới và trên thị trường chưa chặt chẽ ñang gióng lên hồi chuông báo ñộng hơn bao giờ hết Các thuốc kích thích ở vật nuôi, dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, melanin trong sữa và nước mắm, 3-MCPD trong nước tương, urea, chlor, cloramphenicol, dipterex trong thủy hải sản , ñặc biệt thức ăn và nước uống nhiễm khuẩn ñã gây ra nhiều vụ ngộ ñộc tập thể, nguy hại cho sức khỏe của con người Khái niệm thực phẩm sạch ở Việt Nam vẫn là xa xỉ ñối với người dân, nhất là dân nghèo

Để chống lại sự nhiễm khuẩn, hiện nay việc sử dụng chất kháng sinh là giải pháp phổ biến ñể ñẩy lùi các bệnh dịch do vi khuẩn gây ra Tuy nhiên việc sử dụng thuốc kháng sinh cũng có những mặt trái là: do chất kháng sinh tính chọn lọc thấp nên dễ dẫn ñến hiện tượng các vi khuẩn có lợi cũng bị tiêu diệt, gây ra trạng thái mất cân bằng khu hệ vi sinh vật, ñặc biệt việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh dễ dẫn ñến nguy cơ kháng thuốc của vi

khuẩn và xa hơn nữa là gia tăng tính nguy hiểm của các triệu chứng lâm sàng tạo bởi các loài vi khuẩn Chính vì vậy, yêu cầu cấp thiết ñặc ra hiện nay là phải tìm một chất có khả năng ức chế sinh trưởng của vi khuẩn mà không gây

ra hiện tượng nhờn thuốc, không phá vỡ trạng thái cân bằng khu hệ vi sinh vật, không tác dụng phụ, không ñộc hại, không gây ô nhiễm môi trường Chitosan là một polisaccharide tự nhiên, là dẫn xuất từ quá trình khử acetyl của chitin Chitin là thành phần cấu trúc chính vỏ tôm, cua, là một polimer sinh học có nhiều trong tự nhiên, ñặc biệt ở Việt Nam có bờ biển dài, nhiều sông suối Chitosan không ñộc, có khả năng tự phân hủy sinh học cao,

là chất ăn ñược Chitosan mang ñiện tích dương, có ái lực cao với các axit mang ñiện tích âm, tương tác với các thành phần polianion của vách tế bào vi sinh vật, kết hợp DNA, gắn kết gây ñông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn Do ñó, chitosan có tính kháng khuẩn, kháng nấm rộng, làm con người trẻ lâu, hoạt hóa tế bào cơ thể, gia tăng khả năng miễn dịch, giải ñộc , bảo vệ gan trong cơ thể Đặc biệt hạt nano chitosan có kích thước nano, có nhiều ưu ñiểm như diện tích tiếp xúc và ñiện tích dương lớn hơn chitosan, do ñó có tiềm năng tăng cường hoạt tính sinh học, trong ñó có hoạt tính kháng khuẩn Vì vậy, việc nghiên cứu tạo hạt nano nhằm tăng cường tính kháng khuẩn của chitosan ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là vấn ñề cấp thiết hiện nay Ở Việt Nam, Nguyễn Anh Dũng ñã sử dụng chế phẩm chitosan ñể ức chế sinh trưởng của

vi khuẩn Escherichia coli, nghiên cứu tạo hạt nano chitosan làm tá chất miễn

dịch cho vaccin cúm A H5N1 và xây dựng mô hình thử nghiệm trên ñộng vật

Xuất phát từ ñó tôi ñã chọn ñề tài: “Nghiên cứu qui trình tạo hạt và các

ñiều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano chitosan”

1.2 Mục tiêu ñề tài

1.2.1 Xây dựng quy trình tạo hạt nano chitosan bằng tripolyphosphate (TPP)

1.2.2 Xác ñịnh các ñiều kiện tối ưu ñể nâng cao hiệu quả kháng khuẩn của hạt nano chitosan

PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1 Tổng quan về chitosan

Chitin là thành phần cấu trúc nên vỏ côn trùng, tôm, cua, vách tế bào nấm Chitin có cấu tạo tương tự như cellulose, nhưng có khác biệt là ñơn vị cấu tạo nên chitin là N-acetyl-D-glucosamine, các ñơn vị này nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside

Công thức cấu tạo của chitin và chitosan

Tính chất, hoạt tính sinh học của chitin, chitosan phụ thuộc rất nhiều

vào khối lượng phân tử (Mw) và mức ñộ deacetyl hóa (DD: degree of deacetylation)

Mức ñộ deacetyl hóa dùng ñể chỉ % số nhóm acetyl trong phân tử chitin, chitosan bị khử Mức ñộ deacetyl hóa tỷ lệ thuận với mật ñộ của nhóm

NH3+ trong phân tử do ñó ảnh hưởng ñến tính chất ña ñiện phân và ñộ tan của chitin, chitosan Chitin có mức ñộ deacetyl hóa trung bình nằm trong khoảng 10-15% Có sản phẩm chitin deacetyl hóa một phần (partially deacetyl chitin)

có mức ñộ deacetyl hóa từ 30-40% Trong khi ñó chitosan phải có mức ñộ deacetyl hóa > 50%, với mức ñộ deacetyl hóa này chitosan mới dễ tan trong

một số acid hữu cơ loãng như acetic, lactic Mức ñộ deacetyl hóa ñược xác ñịnh bằng nhiều phương pháp khác nhau như: IR spectrophotometry, sắc ký lọc gel, UV spectrophotometry, 1H NMR, 13C- NMR, phương pháp chuẩn ñộ

Khối lượng phân tử trung bình của chitin biến ñộng từ 1.0 – 2.5 x106, khối lượng phân tử của chitin sẽ giảm xuống khi mức ñộ deacetyl hóa tăng lên

Chitosan có ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công, nông nghiệp, y dược, thực phẩm… nhờ vào những ñặc tính sau (Rinaudo, 2006)

- Tính chất ña ñiện ly mang ñiện tích dương (cationic polyelectrolyte) cho phép gắn kết với các thành phần sinh học mang ñiện tích âm

- Có thể tái sinh theo các con ñường sinh học trên trái ñất

- Có khả năng phân hủy sinh học bằng enzyme trong cơ thể

- Có khả năng tương hợp sinh học với các cơ quan, mô và tế bào ñộng thực vật

- Có khả năng kích thích quá trình làm lành vết thương và ñông máu

- Có khả năng tương tác chuyên biệt với các receptor trên màng

- Giảm chlolesterol do liên kết có chọn lọc với các acid béo

- Không gây ñộc do các sản phẩm sau thủy phân ñều là các chất chuyển hoá tự nhiên

- Không gây ñáp ứng miễn dịch trong mô và cơ quan ñộng vật

- Có tác dụng hỗ trợ trong ñiều hòa miễn dịch

- Có thể sử dụng dưới nhiều dạng sản phẩm như dạng miếng, bột mịn, hạt, màng, tấm xốp (scaffolds), bông, sợi và gel [43]

2.2 Tổng quan về nano chitosan

2.2.1 Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan

Chitosan nanoparticles là các hạt chitosan có kích thước nanomet Chitosan nanoparticles do có kích thước siêu nhỏ nên dễ dàng ñi qua màng tế bào, diện tích và ñiện tích bề mặt cực lớn nên ñược ứng dụng nhiều trong sinh

y học mang thuốc, vaccine, trong công nghệ sinh học làm vector chuyển gen Hiện nay có nhiều phương pháp tạo nano chitosan Theo Sulnin (2004)

5 phương pháp chủ yếu ñể tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulsion cross linking), phương pháp tạo giọt (coacervation) trong NaOH-methanol, phương pháp sấy phun (dry spraying), phương pháp tạo gel ionic (ionic gel) trong tripolyphosphate (TPP) và phương pháp rây (sieving method) Trong ñó phổ biến nhất là phương pháp tạo hạt gel trong tripolyphosphate[43]

2.2.1.1 Phương pháp tạo chitosan nanoparticles bằng liên kết cộng hóa trị

Ohya ñã nghiên cứu tạo nano chitosan ñể nhốt thuốc chống ung thư

5-FU bằng cách cho dung dịch chitosan khâu mạch cộng hóa trị với glutaraldehyde Nhóm kép - CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –

NH2 của chitosan ñể khâu mạch (cross-linking) tạo nano chitosan Phương pháp này có ưu ñiểm là kích thước và tính chất hạt nano chitosan rất ổn ñịnh [11]

2 2.2.1.Phương pháp tạo gel ion

Phương pháp này dựa trên khả năng tạo gel ion giữa chitosan ñiện tích dương và TPP, polyacrylic acid, polyaspartic acid, plasmid DNA (pDNA) mang ñiện tích âm

Để tạo nano chitosan –TPP: Dung dịch chitosan ñược hỗn hợp với dung dịch TPP và hỗn hợp ñược khuấy từ trong 10-60 phút sẽ thu ñược nano chitosan Có thể ly tâm 15.000 vòng /phút trong 1 giờ ñể thu ñược hạt nano chitosan

Hình 2.1 Sơ ñồ phương pháp tạo hạt nano chitosan

Quan Gan (2005) nghiên cứu tạo hạt nanon chitosan trong TPP với nồng ñộ chitosan khác nhau, khối lượng phân tử chitosan khác nhau và tỷ lệ chitosan/TPP khác nhau Kết quả cho thấy khối lượng phân tử và nồng ñộ chitosan càng lớn thì kích thước hạt nano chitosan càng lớn [41]

Theo Quan Gan thì tỷ lệ chitosan/TPP càng lớn thì kích thước hạt nano chitosan càng lớn pH cũng có ảnh hưởng nhất ñịnh ñến kích thước hạt nano chitosan, pH thích hợp nhất ñể tạo hạt nano chitosan là 5.5

Quan Gan (2007) nghiên cứu tạo nano chitosan làm chất mang protein, thuốc bằng phương pháp tạo hạt nano trong TPP Kích thước hạt nano chitosan cũng như ñiện tích của hạt nano chitosan phụ thuộc vào nồng ñộ và khối lượng phân tử của chitosan Nồng ñộ càng thấp thí kích thước hạt càng nhỏ và ñiện tích càng dương lớn[42]

Bảng 2.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế và khả năng hấp phụ BSA

Nồng ñộ

chitosan

(mg/ml)

Kích thước hạt (nm)

Điện thế (mV) Không

có BSA

Phương pháp hợp nhất với BSA

phương pháp ủ với BSA

Không

có BSA

Phương pháp hợp nhất với BSA

Phương pháp ủ với BSA 3,0 222,6 338,4 691,4 + 46,3 + 46,3 + 43,2 2,5 210,5 344,5 623,7 + 47,9 + 48,3 + 46,3 2,0 191,1 292,5 540,5 + 52,0 + 50,6 + 48,8 1,5 182,7 236,1 401,2 + 53,3 + 53,2 + 52,6 1.0 175,6 203,7 136,7 + 55,7 + 54,1 + 53,2

Điều kiện chuẩn bị hạt: Nồng ñộ BSA = 1,0mg/ml, tỷ lệ chitosan/TPP = 3:1,

Bao (2008) cũng nghiên cứu tạo nano chitosan –TPP Nồng ñộ chitosan

sử dụng là 0.5-2 mg/ml Kích thước hạt nano chitosan nằm trong khoảng

100-300 nm[16]

Marcia (2008), nghiên cứu tạo nano chitosan sử dụng polymethacrylic acid (PMAA) Cơ chế của quá trình tạo hạt nano chitosan tương tự như với TPP, theo sơ ñồ sau:

Hình 2.2 Cơ chế tạo hạt nano chitosan với acid methacrylic

CS: Chitosan PMAA (polymethacrylic acid)

Marcia cũng nghiên cứu ảnh hưởng của pH và tỷ lệ chitosan ñến kích thước hạt nano chitosan Kết quả nhận thấy pH trong khoảng từ 3-6 ít ảnh hưởng ñến kích thước hạt nano CS-PMAA Tuy nhiên, khi pH tăng >6 có sự gia tăng ñột biến kích thước hạt nano CS-PMAA Khác với phương pháp tạo hạt nano chitosan –TPP, tỷ lệ CS càng cao thì kích thước hạt càng nhỏ trong khoảng pH<6 và ngược lại Kết quả này ñược minh chứng rõ ràng bằng hình chụp TEM của hạt nano CS-PMAA Kích thước hạt nano CS-PMAA biến ñộng từ khoảng 20 nm – 140 nm ở pH <6 [31]

Chitosan nanoparticl

Hình 2.3 TEM của hạt nano CS-PMAA; a) CS 0.2%; b) CS 0.5%

Nano chitosan cũng có thể thực hiện bằng cách tạo phức hợp chitosan/pDNA nhờ khả năng tạo gel ion giữa DNA mang ñiện tích âm và chitosan mang ñiện tích dương Phương pháp này thường ñược ứng dụng trong kỹ thuật chuyển gen, liệu pháp gen Russell Mumper (2001) ñã công bố

sử dụng chitosan, chitosan oligomer phối hợp với carboxymethyl cellulose (CMC) với tỷ lệ khác nhau có hấp phụ trên bề mặt pDNA ñể tạo nanoparticles ứng dụng trong chuyển gen Các thông số vật lý của chitosan oligomer/nano CMC phủ pDNA cũng ñược xác ñịnh (bảng 2.2)

Yongli Zheng (2007) cũng nghiên cứu tạo nano bằng cách tạo phức hợp giữa chitosan và polyaspartic dựa trên nguyên lý tạo gel ion Kích thước hạt nano chitosan ñạt từ 85-300 nm, sử dụng ñể thải chậm 5-FU trong ñiều trị ung thư

Zheng sử dụng chitosan (45 kDa và 230 kDa) và trimethylchitosan có nồng ñộ 1mg/ml ở pH=5.6 sau ñó nhỏ vào dung dịch ñệm phosphate chứa 10 microgam pDNA (plasmide DNA) Kích thước hạt nano chitosan nhỏ hơn

200 nm [54]

Bảng 2.2.Tính chất vật lý của chitosan oligomer/nano CMC hấp phụ với pDNA

Tỷ lệ

chitosan/CMC

(w/w)

pDNA (µg/ml)

Kích thước nanoparticles (nm)

Điện tích (mV)

Hiệu suất hấp phụ DNA (%)

2.2.1.3 Phương pháp tạo giọt coasecva (phương pháp kết tủa)

Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch có pH kiềm tính Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt coasecva ngay khi dung dịch chitosan tiếp xúc với dung dịch kiềm Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-methanol hoặc ethandiamine Dung dịch chitosan sẽ ñược một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm ñể tạo hạt nano chitosan như hình 2.4

Hình 2.4 Sơ ñồ tạo giọt bằng phương pháp kết tủa

Phương pháp này có thể ñược cải tiến hơn bằng cách nhỏ dung dịch sodium sulfate vào dung dịch chitosan (pH acid) trong ñiều kiện khuấy nhẹ và tác ñộng của sóng siêu âm (ultrasonic) Hạt nano chitosan thu bằng cách ly tâm, sau ñó tiếp tục bước làm cho cứng và bền hơn bằng cách khâu mạch với glutaraldehyde

2.2.1.4 Phương pháp sấy phun (spray-drying)

Sấy phun là kỹ thuật thường ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm ñể tạo bột, tạo hạt thực phẩm như sữa, tạo bột thuốc với tá dược Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc dung dịch huyền phù (suspension) ñược làm khô khi ñược phun trong dòng không khí nóng

Chitosan ñược hòa tan thành dung dịch, dược phẩm ñược hòa tan vào dung dịch chitosan, sau ñó bổ sung hoạt chất khâu mạch (cross-liking agent)

và ñược phun vào dòng không khí nóng

Hình 2.5 Sơ ñộ tạo hạt bằng phương pháp sấy phun

2.2.1.5 Phương pháp tạo mixel ngược pha (reverse micella )

Trong phương pháp này, các chất hoạt ñộng bề mặt (surfactant) ñược hóa tan trong dung môi hữu cơ ñể tạo hệ mixel ngược pha Sau ñó dung dịch chitosan ñược thêm vào và ñược vortex ñể tránh bị ñục Tiếp theo, dung dịch chất khâu mạch ñược thêm vào Quá trình khâu mạch ñược thực hiện qua ñêm

và khuấy ñều Sau ñó cho bay hơi dung môi hữu cơ và chất hoạt ñộng bề mặt cũng ñược kết tủa bằng muối, cuối cùng hỗn hợp ñược ly tâm và thu ñược hạt nano chitosan như trong sơ ñồ 2.5

Hình 2.6 Sơ ñồ tạo hạt bằng phương pháp mixel ngược pha

Ngoài ra nano chitosan còn có thể ñược chuẩn bị khi phối hợp với polyethylene glycon (PEG) Hoặc phủ bên ngoài một lớp alginate ñể tăng hiệu quả của nano chitosan mang vaccin viêm gan B qua ñường uống Kích thước hạt nano chitosan nằm trong khoảng 100 nm

2.3 Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học

Nhờ những ñặc tính ưu việt của chitin, chitosan là sản phẩm tự nhiên, không ñộc, phân hủy sinh học, tương hợp sinh học cùng với các hoạt tính sinh học của chúng như hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kích thích hoạt ñộng của hệ thống miễn dịch dẫn ñến chitin, chitosan ñược ứng dụng rộng rãi trong

y dược học

Đã có rất nhiều thử nghiệm ñã ñược tiến hành ñể xác nhận tính an toàn của chitosan như: thử nghiệm khả năng gây ñột biến; khả năng gây ñộc cấp tính, bán cấp tính và mãn tính; khả năng gây sốt, làm tan máu và gây dị ứng

Bảng 2.3 Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan ñến ứng dụng trong sinh y học (Rinaudo, 2006) [43]

Các ứng dụng trong sinh y học Tính chất của chitosan

Chỉ khâu trong phẫu thuật Tương hợp sinh học, phân hủy sinh

học Cấy ghép trong nha khoa Tương hợp sinh học, phân hủy sinh

học

(hydrogels) Vật liệu ly giải chậm thuốc Không ñộc, tương hợp sinh học

Bao nang thuốc Kháng khuẩn, kháng nấm, phân hủy

sinh học

Số liệu ghi nhận trên thỏ, gà mái và gà giò khi ñược cho ăn chitosan với liều lượng 0,7- 0,8g/kg khối lượng cơ thể/ngày trong 239 ngày là không có triệu chứng bất thường nào Khả năng tiêu hoá chitosan ở thỏ là 28- 38% còn

ở gà mái, gà giò là tiêu hóa hoàn toàn Khi tiêm chitosan và các phân ñoạn chitosan vào thỏ với liều lượng 4,5mg/kg khối lượng cơ thể/ ngày trong 7-11 ngày, không phát hiện ñược biểu hiện bất thường nào Trong nghiên cứu kéo dài 12 tuần trên người, không có triệu chứng lâm sàng nào ñược ghi nhận ở những người uống chitosan trong so với những người uống thuốc giả Chỉ có 2,6 – 5,4% ñối tượng có triệu chứng buồn nôn và táo bón tuy nhiên rất nhẹ và tạm thời Với tất cả các bằng chứng trên, việc ứng dụng các thuộc tính quý giá của chitosan trong lĩnh vực y sinh là hoàn toàn hợp lý

2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư

Chitosan oligomer kích thích ñại thực bào và cho hoạt tính chống ung thư và ñược sử dụng trong công thức thực phẩm chức năng (Jeon, Shahidi, & Kim, 2000),[15] Chitosan khối lượng phân tử thấp (LMWC) 20 kDa ngăn cản sự tiến triển của bệnh tiểu ñường và biểu hiện cấu trúc tương tự lipopolysaccharid cao hơn chitosan Mw 140 kDa Tác ñộng cầm máu và hoạt tính chống ung thư (Malette & Quigley, 1984),[30] Hoạt ñộng sinh lý mạnh nhất ñược biểu hiện bởi oligosaccharide có ñộ dài chuỗi lớn hơn pentasaccharide Hexa-N-acetylchitohexaose [(GlcNAc)]6 có nhiều hứa hẹn tăng cường hoạt ñộng của hệ thống miễn dịch và hoạt tính chống ung thư Hạt nano chitosan cũng ñang ñược nghiên cứu ñể chống ung thư hiệu quả hơn Mitra (2001) nghiên cứu nhốt thuốc kháng ung thư doxorubicine ñể

ức chế khối u trên chuột Kết quả cho thấy nếu tiêm doxorubicine ñộc lập thì khối u ở chuột vẫn tăng lên 900 mm3 sau 50 ngày và chết, trong khi ñó ở thí nghiệm ly giải chậm doxorubicine trong hạt nano chitosan kích thước khối u giảm chỉ còn 170 mm3 và chuột vẫn sống khi 90 ngày thí nghiệm [33]

L Qi et al (2004) nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư trực tiếp của hạt nanochitosan dựa trên cơ chế polycation gây phá vỡ màng tế bào ung thư và hoạt tính cảm ứng apoptosis trên hai dòng tế bào ung thư là sarcoma S180 và hepatoma H22 Kết quả cho thấy hiệu quả làm giảm khối lượng tế bào ung thư với liều uống 2.5 mg/kg hạt nano chitosan trên S 180 và H 22 là 52-59%

và liều 0.5mg/kg là 43-53%, trong khi ñó chitosan chỉ là 30% [25]

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy kích thước hạt nano càng nhỏ thì hiệu quả kháng ung thư càng cao Kích thước hạt nano khoảng 350 nm Hiệu quả chống ung thư khi sử dụng hạt nano chitosan rất cao trên tế bào gây ung thư phổi ở chuột A549 ñồng thời làm giảm ñộc tính của thuốc chống ung thư

2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity)

Đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng giảm cholesterol và mỡ trong máu của chitosan Omrod (1998) thí nghiệm trên mô hình chuột quá dư thừa cholesterol trong máu do thiếu apolipoprotein E ñược tiến hành trong 20 ngày Mỗi ngày chuột thí nghiệm ñược ăn 5% chitosan trong khẩu phần thức

ăn còn lô ñối chứng thì không ñược cho ăn chitosan Hàm lượng cholesterol trong máu giảm ñáng kể sau 20 tuần, chỉ còn 64% so với lô ñối chứng Ngoài

ra, khả năng ức chế xơ vữa ñộng mạch của chuột ñược ăn chitosan ở ñộng mạch chủ là 42% và cung ñộng mạch chủ là 50% Chuột ñược ăn chitosan cũng lớn nhanh hơn rõ rệt [40] Thí nghiệm này cũng mở ra khả năng ức chế

sự phát triển chứng xơ vữa ñộng mạch trong ñiều trị bệnh cho người quá dư thừa hàm lương cholesterol trong máu

Do lợi ích giảm nồng ñộ cholesterol trong huyết tương, ñóng vai trò quan trọng trong sự giảm bớt và ñiều trị các bệnh tim mạch, chitosan ñã trở thành một thành phần ăn kiêng hữu ích Hoạt ñộng giảm cholesterol trong máu của chitosan ñược giải thích là nhờ vào giảm hấp thụ cholesterol và sự can thiệp và hấp thu acid mật, một cơ chế tương tự với chế ñộ ăn kiêng các thành phần sợi Hoạt ñộng giảm cholesterol của chitosan qua ñường uống ñược báo cáo nhiều (Sugano, Watanabe, Kishi, Izumi, & Ohtakara, 1988)[46] trong khi chitin, mặc dù biểu hiện sự tiết triglycerides trong phân cao hơn, nhưng không biểu thị hoạt tính giảm cholesterol

2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa

Xu hướng hiện nay sử dụng các phân tử chống oxi hóa có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng Chúng thuộc lớp chitosan và một số dẫn xuất của chúng, an toàn và không ñộc hại cung cấp sự bảo vệ từ các gốc tự do, vì vậy làm chậm sự tiến triển của nhiều bệnh mãn tính Được biết, tác ñộng chống

oxi hóa của chitosan khác nhau tùy vào trọng lượng phân tử và ñộ nhớt của chúng (Kamil, Jeon, & Shahidi, 2002) [17] Xử lý mẫu cá trích với chitosan, tuy nhiên, cho thấy giá trị peroxide trong aldehyde dễ bay hơi thấp hơn mẫu không xử lý Chitosan ñộ nhớt thấp cho thấy có hiệu lực chống oxi hóa mạnh nhất Oligochitosan (Mw 1.3 và 3.5 kDa) ngăn chặn oxy hóa trong chuột

Kanatt (2008) cũng sử dụng dẫn suất chitosan gắn glucose bằng phản ứng Maillard trong bảo quản thực phẩm Kết quả cho thấy phức hợp chitosan-glucose (GCC: glucose chitosan complex) vừa có hoạt tính kháng khuẩn lại vừa có hoạt tính chống oxy hóa và ñây là một phức hợp hứa hẹn làm chất bảo quản thực phẩm [18]

2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing)

Chữa các vết thương là một quá trình thúc ñẩy nhanh chóng sự phục hồi da và làm nhanh sự lành vết thương Một màng chitosan có cấu trúc xốp ñược thiết kế cho màng phủ chữa vết bỏng, vết thương Màng chitosan có tác dụng kiểm soát mất nước do bay hơi, ñảm bảo trao ñổi oxy cho da hô hấp và thúc ñẩy khả năng thoát chất lỏng Ngoài ra nhờ hoạt tính kháng khuẩn tự nhiên của chitosan nên màng phủ chitosan có hiệu quả hạn chế sự xâm nhiễm các vi sinh vật ngoại lai Vết thương ñược bao phủ bởi màng chitosan có tác dụng cầm máu và làm lành vết thương nhanh chóng Thí nghiệm về mô bệnh học ñã xác nhận sự tăng tỷ lệ phủ ñầy biểu mô cũng như tổ chức collagen dưới lớp biểu bì Vết thương chữa chitosan giảm sẹo do ức chế các sự hình thành sợi trong vết thương và nó ñược cầm máu và hình thành lớp film bao phủ bảo vệ Là một cơ chất cho lysozyme, sản phẩm phân hủy chitosan ñược hấp thu bên trong tế bào có tác dụng làm tăng hoạt tính ñại thực bào macrophage

Phức hợp Chitosan-alginate dạng màng cũng cho thấy khả năng lành vết thương rất tốt Hai dạng màng chitosan: Chit-LA và Chit –A A cho hiệu quả tốt trong ñiều trị vết thương Kết quả cho thấy vết thương lành hoàn toàn

và không hình thành sẹo Màng phối hợp giữa chitosan và cellulose cũng là một vật liệu chữa vết thương hiệu quả với ñặc tính kháng khuẩn cao Chúng

có thể bảo vệ vết thương nhờ khả năng khử nước và chống nhiễm trùng

2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng

Trong giải phẫu cấy ghép răng, quá trình phục hồi xương sử dụng vật liệu ghép vào xương ñã trở nên cần thiết Đối với thiết kế tái sinh tế bào xương, một loạt các polymer chống ñỡ như chất nền collagen loại-1, chất nền xốp poly-(lactide/gylcolide)/ hydroxyapatite 3-D polymer, chitosan ñã ñược tổng hợp Các kết quả cho thấy sự tạo ra xương nhân tạo sử dụng kỹ thuật mô hình mô là một triển vọng ñể phục hồi mô xương Lee (2002) kết quả một thử nghiệm sơ lược in vitro ñề nghị rằng chitosan có tiềm năng biệt hóa tế bào gốc tủy xương và thuận lợi hình thành xương[24] Chitosan-tricalcium phosphat xốp cũng hứa hẹn là một vật liệu chống ñỡ rất tốt cho cấy ghép vào các vị trí phục hồi xương in vivo

2.3.6 Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc

Hojo (2000) công bố gắn pentapeptide Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg có hoạt tính kháng tế bào ung thư lên chitosan ñã hạn chế khả năng bị phân hủy bởi enzyme tế bào thông qua cầu trung gian carbodiimide Nghiên cứu tạo phức hợp chitosan-(Gly)-Ala-Arg-Ser-Gly-Ile-Tyr-Ac, cho thấy hoạt tính ức chế rõ rệt trong thử nghiệm trên tế bào khối u phổi ác tính di căn B16-BL6 ở chuột Kết quả này cao hơn so với pentapeptide nguyên thủy YIGSR Hoạt tính chống khối u ñược tăng cường là nhờ phức hợp chitosan –petapeptide ñã bảo

vệ chống lại sự thủy phân của enzyme in vivo

Shabori (2002) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan ñể cố ñịnh thuốc cyclosporin A ñể uống, kích thước hạt nano là 150nm Kết quả cho thấy hiệu suất mang thuốc là 94%, nồng ñộ cyclosporin A trong máu là 2760 ng/ml cao gấp 2.5 lần so với sodium glycolate nanoparticles Hoạt tính của cyclosporin

A cố ñịnh trong hạt nano chitosan tăng 72%, gelatin nanochitosan chỉ tăng 18%, riêng sodium glycholate lại giảm tới 36% so với ñối chứng [10]

Xinge Zhang (2008) công bố nghiên cứu làm tăng khả năng hấp thu insulin qua niêm mạc mũi bằng hạt nano chitosan và PEG-hạt nano chitosan, kích thước hạt nano là 150-300 nm Hiệu quả hấp thu insulin qua niêm mạc mũi thỏ ở mẫu PEG-hạt nano chitosan cao hơn so với PEG-chitosan là 30-40% Kích thước hạt nano càng nhỏ, diện tích bề mặt càng lớn và ñiện tích dương trên bề mặt càng cao là nguyên nhân ảnh hưởng ñến khả năng hấp thu insulin vào máu qua niêm mạc mũi [52]

Shedaghi (2008) nghiên cứu chế tạo trimethyl hạt nano chitosan ñể làm vật liệu ly giải chậm insulin Kết quả cho thấy ñộng học ly giải của insulin nhốt trong trimethyl hạt nano chitosan ổn ñịnh và kéo dài hơn [45]

Shadeghi (2008) nghiên cứu hấp phụ insulin trên vật liệu nano chitosan, diethylmethyl nano chitosan nanoparticles (DEMC) và trimethylchitosan nanoparticles (TMC) Kết quả về ñộng học ly giải chậm insulin khá ổn ñịnh cho cả ba vật liệu nanoparticle [45]

2.3.7 Hoạt tính kháng khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó ñã nhận ñược sự quan tâm ñáng kể trong những năm gần ñây Cơ chế kháng khuẩn của chitosan là nhờ một số cơ chế sau:

- Chitosan là một polycationic, chúng tương tác với thành phần polyanion vách tế bào (lipopolysaccharides và protein) của vi sinh vật, kết

quả là sự rò rỉ thành phần nội bào do các thay ñổi trong tính thấm của hàng rào (barrier); ngăn cản chất dinh dưỡng ñi vào tế bào; ngăn cản sự nhập vào tế bào (ñặc biệt là chitosan có khối lượng phân tử thấp LMWC )

- Chitoan có khả năng kết hợp với DNA và nhờ vậy chitosan có khả năng ức chế tổng hợp RNA và protein

- Chitosan có khả năng gắn kết gây ñông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn và dẫn ñến giết chết tế bào

Cơ chế tác ñộng của chitosan và chitosan oligomer ñối với E coli và S

aureus ñược Eaton (2008) nghiên cứu bằng kính hiển vi AFM (atomic force

microscope) như hình chụp dưới ñây Kết quả thấy rằng sau 24h xử lý, tế bào

bị phá vỡ màng và thẩm thấu dịch tế bào ra ngoài môi trường [7]

Hình 2.7 Ảnh hưởng của chitosan và chitosan oligomer (COS) ñến tế bào

mạnh hơn ở vi khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương Chỉ số MIC của chitosan biến ñộng trong khoảng 0.05-0.1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử

và loại vi khuẩn Hong Kyoon No cũng khẳng ñịnh rằng hoạt tính kháng khuẩn của chitosan thể hiện tốt hơn ở môi trường pH thấp [12]

Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng nghiên cứu khả năng kháng E.coli của chitosan, chitosan oligomer và chitosan oligomer cải biến bằng cách gắn với salicylic aldehyde ñã làm gia tăng hoạt tính kháng khuẩn lên nhiều lần MIC của chitosan ñối với E coli khoảng 250 ppm, oligoglucosamine khoảng 80-

100 ppm và salicyden oligoglucosamine (SO) chỉ còn 30-40 ppm [3]

Muối ammonium bậc bốn của chitosan thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rất cao Ví dụ: diethylmethylchitosan cloride thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao hơn chitosan Hydroxypropyl chitosan ghép với acid maleic natri ức chế

hơn 99% vi khuẩn Staphylococcus aureus và E coli trong 30 phút tiếp xúc

với nồng ñộ 100 ng/ml

Avadi (2004) nghiên cứu chế tạo dẫn suất diethylmethylchitosan (DEMC) ñể tăng khả năng hòa tan trong dung môi, nước và tăng tính kháng khuẩn gấp hai lần so với chitosan không cải biến (bảng 2.5) [6]

Nguyen Anh Dzung, Phạm Quang Anh, Pham Anh Hong (2007) nghiên cứu cải biến chitosan bằng cách gắn tạo nhánh chitosan với gốc ñường glucose, glucosamine, trimethyl chitosan ñể tăng hoạt tính kháng khuẩn Kết quả ghi nhận trong bảng 2.6 [38]

Bảng 2.4 Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC

Môi trường Kiểm chứng (mẫu

Bảng 2.5 Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn

Các dẫn suất

MIC (ppm) MSSA MRSA E faecalis E coli P

Tikhonov (2006) cũng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của chitosan khối lượng phân tử thấp (4,7 kDa) và chitosan cải biến Kết quả cho thấy chitosan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính kháng khuẩn thấp Ở nồng ñộ 1% chitosan (4.7 kDa) tỷ lệ chết của E.coli chỉ là 91.6% [49]

Vật liệu hạt nano chitosan có diện tích tiếp xúc và ñiện tích dương lớn hơn chitosan thông thường nên có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn nhiều lần so với chitosan Qi et al (2005) nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan ñể tăng hoạt tính kháng khuẩn Hạt nano chitosan ñược chuẩn bị bằng phương pháp tạo gel trong tripolyphosphate (TPP), kích thước hạt khoảng 30-50nm Các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên 4 loại vi khuẩn

E.coli, S typhimurium, S choleraesuis và S aureus cho thấy hoạt tính kháng

khuẩn tăng lên nhiều lần so với chitosan MIC (nồng ñộ tối thiểu ức chế) của hạt nano chitosan là 1/8-1/32 microgam/ml so với chitosan là 8-16 microgam/ml và kháng sinh doxycycline là 1-4 microgam/ml [41]