THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẢM GVHD TS PHAN THỊ ANH ĐÀO SVTH TRẦN THỊ THANH PHƯƠNG Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/201[.]
TỔNG QUAN
Tổng quan về tôm thẻ chân trắng
Hình 1.1: Tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương
Theo báo cáo của Boone, 2011 phân loại khoa học của tôm thẻ chân trắng được báo cáo trong bảng 1.1
Bảng 1.1: Phân loại khoa học của tôm thẻ chân trắng
Phân loại Tên khoa học
Tôm thẻ chân trắng có tên tiếng anh: Whiteleg Shrimp, tên khoa học: Litopenaeus vannamei hoặc Penaeus vannamei
Tôm thẻ chân trắng, hay còn gọi là tôm bạc, có vỏ mỏng màu trắng đục và thường mang màu xanh lam Đặc điểm nhận diện của chúng là chân ngực 4 và 5 có màu trắng đục, trong khi chân bò có màu trắng ngà Phần chuỳ kéo dài từ bụng, dưới chuỳ có từ 2 đến 4 răng cưa, đôi khi có thể lên tới 5 - 6 răng cưa ở phía bụng, kéo dài đến đốt thứ hai Kích thước tối đa của tôm đực là 187mm và tôm cái là 230mm (Boone, 2011).
Vỏ đầu ngực có đặc điểm nổi bật với gai gân và gai râu rõ ràng, không có gai mắt và gai đuôi (gai telssm), đồng thời không có rãnh sau mắt Đường gờ sau chuỳ thường dài, đôi khi kéo dài từ mép sau vỏ đầu ngực, trong khi gờ bên chuỳ ngắn, chỉ kéo dài tới gai thượng vị (Boone, 2011).
Có 6 đốt bụng, ở đốt mang trứng, rãnh bụng rất hẹp hoặc không có Telsson (gai đuôi) không phân nhánh Râu không có gai phụ và chiều dài râu ngắn hơn nhiều so với vỏ giáp Xúc biện của hàm dưới thứ nhất thon dài và thường có 3-4 hàng, phần cuối của xúc biện có hình roi Gai gốc (basial) và gai ischial nằm ở đốt thứ nhất chân ngực (Boone,
Tôm Litopenaeus vannamei, hay còn gọi là tôm chân trắng, là loài tôm nhiệt đới phân bố ven bờ phía Đông Thái Bình Dương, từ biển Peru đến Nam Mexico và Ecuador Hiện nay, tôm chân trắng đã được nuôi trồng tại nhiều quốc gia Đông Á và Đông Nam Á như Trung Quốc, Thái Lan, Philippines, Indonesia, Malaysia và Việt Nam Ở Việt Nam, tôm thẻ chân trắng chủ yếu tập trung tại các tỉnh Nam Trung Bộ, đặc biệt là Ninh Thuận, Bình Thuận, Khánh Hòa, Phú Yên, cùng với các tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long.
Tôm thẻ chân trắng là loài tôm phổ biến nhất trên toàn cầu nhờ vào khả năng nuôi trồng dễ dàng và thời gian sinh trưởng nhanh chóng.
1.1.3 Tập tính Ở vùng biển tự nhiên, tôm chân trắng sống nơi đáy bùn, độ sâu khoảng 72m, có thể sống ở độ mặn trong phạm vi 5-50‰, thích hợp ở độ mặn nước biển 28-34‰, pH = 7,7-8,3; nhiệt độ thích hợp 25-32 o C
Tôm chân trắng là loài ăn tạp giống như những loài tôm khác Song không đòi hỏi thức ăn có hàm lượng đạm cao như tôm sú
Tôm chân trắng có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn tôm sú, với thời gian từ tôm bột đến khi đạt kích thước 40g chỉ khoảng vài tháng trong điều kiện tự nhiên.
180 ngày hoặc từ 0,1g-15g trong giai đoạn 90-120 ngày Là đối tượng nuôi quan trọng sau tôm sú (Boone, 2011)
1.1.4 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng tôm
Chất lượng tôm đông lạnh được đánh giá theo tiêu chuẩn TCVN 4381:2009, với các thông tin chi tiết trong bảng 1.2 và 1.4 Đồng thời, yêu cầu vệ sinh đối với thủy sản đông lạnh được quy định theo TCVN 5289:2006, như thể hiện trong bảng 1.3.
Bảng 1.2: Chỉ tiêu hóa học
Tên chỉ tiêu Yêu cầu
Hàm lƣợng NH 3 , tính bằng g/kg không lớn hơn 0.5
Dƣ lƣợng kháng sinh Không có
Bảng 1.3: Chỉ tiêu vi sinh vật trong tôm
Tên chỉ tiêu Yêu cầu giới hạn tối đa
Tổng khuẩn hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm không lớn hơn 10 6
Clostridium perfringens số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm không lớn hơn 10 2
Staphylococcus aureus số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm không lớn hơn 10 2
Escherichia coli số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm không lớn hơn 10 2
Salmonella trong 25g sản phẩm Không có
Vibrio parahaemolyticus số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm không lớn hơn 10 2
Bảng 1.4: Chỉ tiêu cảm quan
Tên chỉ tiêu Yêu cầu
Hình dạng Thân tôm còn nguyên vẹn, tỷ lệ thân tôm bị nứt, vỡ vỏ (vết vỡ không lớn hơn 1/3 chu vi đốt) không lớn hơn 7%
Màu sắc Sáng bóng, tỷ lệ số thân tôm có vết đen đuôi, đen viền bụng không lớn hơn 5%
Mùi, vị Mùi đặc trưng của sản phẩm tươi, không có mùi lạ Tôm sau khi luộc có mùi thơm, vị ngọt tự nhiên
Trạng thái Sang khi luột thịt săn chắc, cho phép không quá 20% số thân đốt có đầu hơi bở
1.1.5 Giá trị kinh tế của tôm thẻ chân trắng
Tôm là thực phẩm phổ biến toàn cầu nhờ giá trị dinh dưỡng cao và hương vị thơm ngon, vượt trội hơn cá và nhiều loại động vật trên cạn Thịt tôm chứa các thành phần hóa học quan trọng như protein, lipid, glucide, khoáng chất, vitamin, enzyme và hormone.
Bảng 1.5: Thành phần dinh dưỡng của tôm thẻ chân trắng trong 100g phần ăn được
Nguồn: (Nguyễn Công Khẩn,Hà Thị Anh Đào, 2007)
Thành phần dinh dƣỡng Đơn vị Hàm lƣợng
Tôm thẻ chân trắng là loài tôm có giá trị kinh tế cao và tốc độ tăng trưởng nhanh, thích hợp cho các hình thức nuôi thâm canh và bán thâm canh tại Việt Nam Để đạt được năng suất cao, người nuôi cần áp dụng đúng kỹ thuật nhằm tránh tình trạng tôm chậm lớn.
2016, kim ngạch xuất khẩu tôm của nước ta cán mốc 3,1 tỷ USD tăng gần 4% so với năm
Những biến đổi của tôm trong suốt quá trình bảo quản
Sau khi tôm chết, các enzyme nội tại và vi sinh vật trong cơ thể tôm gây ra hàng loạt biến đổi phức tạp, đặc biệt là về mặt hóa học, dẫn đến quá trình tự phân giải và phân hủy tự nhiên Những biến đổi này làm cho nguyên liệu tôm bị biến chất và không còn sử dụng được Các quá trình chính trong sự biến đổi của cơ thịt tôm bao gồm: sự tiết chất nhớt, phân giải glycogen, hiện tượng tê cứng cơ thịt, sự mềm hóa, tác dụng tự phân giải và sự thối rữa.
1.2.1 Sự biến đổi hóa sinh
Adenosintriphosphate (ATP) là một hợp chất thiết yếu, đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển năng lượng tự do trong quá trình oxy hóa các chất trao đổi.
Quá trình phân hủy ATP trong mô cơ thịt tôm diễn ra nhanh chóng nhờ vào các enzyme nội tại, dẫn đến sự giảm hàm lượng Inosinmonophosphate (IMP) và mất đi mùi thơm đặc trưng của tôm tươi Tốc độ phân hủy ATP phụ thuộc vào giống loài tôm, vị trí cơ thịt trên cơ thể tôm, cũng như quy trình đánh bắt, xử lý và bảo quản tôm.
Sau khi tôm chết, glycogen trong cơ thể bị phân giải qua quá trình kị khí phức tạp, chủ yếu thông qua con đường Embden – Meyerhof – Parnas và amylose phân Quá trình này, dưới tác động của các enzyme nội tại, sản sinh acid lactic, dẫn đến sự thay đổi pH trong cơ thịt Môi trường acid hóa này giúp hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây thối rữa Tuy nhiên, sự biến đổi của các chất đường và đường chứa phospho trong mô cơ cũng làm mất dần vị ngọt và hương vị đặc trưng của thịt tôm tươi.
1.2.2 Sự biến đổi hóa học
Sự thay đổi hóa học trong thủy sản liên quan đến số lượng vi khuẩn và có thể ảnh hưởng đến chất lượng của cá và động vật giáp xác Các yếu tố như oxy hóa lipid, tổng số base hóa hơi (TVB), trimethylamine (TMA), K-value, pH, và sự chuyển hóa của các hợp chất chứa nitơ đều góp phần vào quá trình phân hủy chất lượng của sản phẩm thủy sản.
Quá trình oxy hóa lipid trong tôm có thể khởi đầu từ nhiều yếu tố, bao gồm oxy hóa thông thường, oxy hóa do ánh sáng, hoặc các phản ứng enzym liên quan đến lipoxygenase, peroxidase và enzym do vi khuẩn sinh ra (Bak L và cộng sự, 1999).
Sự thay đổi pH trong cơ thịt tôm xảy ra do sự hình thành acid lactic trong quá trình phân giải glycogen sau khi tôm chết Bên cạnh đó, pH cũng bị ảnh hưởng bởi sự giải phóng phospho vô cơ và amoniac từ sự phân hủy ATP, cũng như giá trị pH ban đầu của mô cơ.
Sự chuyển hóa của các hợp chất chứa nitơ trong mô cơ thịt tôm sau khi chết là nguyên nhân chính dẫn đến sự suy giảm chất lượng của tôm Quá trình phân hủy các hợp chất protein và phi protein tạo ra mùi khó chịu và các hợp chất bay hơi có mùi thối, đồng thời gây ra những thay đổi về tính chất thẩm thấu và màu sắc của cơ thịt Trong giai đoạn đầu, quá trình tự phân giải do các enzyme nội tại chủ yếu tham gia, nhưng sau đó, sự phát triển của vi sinh vật dẫn đến sự thối rữa hoàn toàn của sản phẩm Các enzyme nội tại và enzyme vi sinh vật tham gia vào nhiều phản ứng phân hủy, ảnh hưởng đáng kể đến chất lượng tôm.
Quá trình phân hủy các hợp chất nitơ phi protein ở tôm sau khi chết gây ra mùi thối do vi sinh vật chuyển hóa Trimethylamine N-oxide (TMAO) thành TMA, cùng với các enzyme phân hủy TMAO thành DMA và formaldehyde Ngoài ra, mùi hôi còn phát sinh từ sự phân hủy các acid amin tự do trong mô cơ và các acid amin được giải phóng từ quá trình phân hủy protein nhờ tác động của enzyme, vi sinh vật hoặc các phản ứng khác.
Sự biến đổi protein trong tôm có ảnh hưởng lớn đến giá trị của chúng Quá trình thủy phân và phân giải protein diễn ra nhanh chóng dưới tác động của các yếu tố vật lý, hóa học và sinh học, dẫn đến sự hình thành NH3 NH3 là chỉ số quan trọng để đánh giá mức độ phân hủy protein, độ tươi và mức độ hư hỏng của tôm trong quá trình bảo quản Sau khi tôm chết, tốc độ biến đổi phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ, vi sinh vật và cấu trúc của tôm, khiến NH3 tích tụ trong thịt tôm, gây ra màu sắc biến đổi và mùi khó chịu.
1.2.3 Sự biến đổi vi sinh
Vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong việc hư hỏng các sản phẩm thủy sản, thông qua việc sản sinh ra các hợp chất như amine, sulfide, alcohol, aldehyde, xeton và axit hữu cơ.
Mùi khó chịu trong thực phẩm thường liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn, đặc biệt là Pseudomonas, vi khuẩn sản xuất H2S và vi khuẩn lactic acid (LAB), cùng với Enterobacteriaceae, một loại vi khuẩn gram âm phổ biến Hàm lượng axit amin tự do và các chất không nitơ hòa tan có thể tạo điều kiện cho sự phát triển của các vi sinh vật này Sự đa dạng của vi sinh vật gây hư hỏng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như loài, môi trường, phương thức đánh bắt, loại thực phẩm, cũng như điều kiện khí hậu và lưu trữ (Gram, 2002; Zeng Q Z và cộng sự, 2005; Sallam, 2007).
1.2.4 Sự biến đổi vật lý và cảm quan
Lạnh đông sâu có thể gây ra hiện tượng đóng băng thực phẩm, dẫn đến giảm năng lực giữ nước (WHC) và lực cắt của tôm (Zeng Q Z và cộng sự, 2005) Trong quá trình bảo quản, sự phá vỡ cấu trúc protein trong mô tôm có thể làm mất hoàn toàn tính chất vật lý (Rutherford và cộng sự, 2007) Sự mềm hóa của tôm và cá thường liên quan đến sự phân giải protein bởi các enzyme nội sinh hoặc vi sinh vật (Benjakul S S., 1997) Lopez-caballero et al (2007) đã chỉ ra rằng WHC giảm nhẹ ở tôm hồng nước sâu (Parapenaeus longirostris) khi xử lý bằng các hợp chất chứa 4-hexylresorcinol (4-HR) kết hợp với axit hữu cơ và chất tạo chelat Việc xử lý bằng hợp chất chứa sulfite giúp giảm hư hỏng trong suốt 14 ngày bảo quản Thepnuan et al (2008) cho biết tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương (Litopenaeus vannamei) xử lý bằng pyrophosphate và 4-HR, đóng gói theo MAP-2 (80% CO2, 20% N2) có lực cắt cao nhất trong 6 ngày đầu bảo quản, nhưng không có sự khác biệt rõ rệt về WHC giữa các phương pháp xử lý khác nhau.
Nghiên cứu của Erickson et al (2007) cho thấy rằng hình dạng bên ngoài của tôm tươi và đông lạnh chỉ khác nhau giữa các loài Tôm tươi được đánh giá là ngọt và nhiều nước hơn so với tôm đông lạnh Zeng et al (2005) chỉ ra rằng tôm được bảo quản trong nước đá ở nhiệt độ -1.5°C có điểm cảm quan cao nhất, vượt trội hơn so với tôm bảo quản ở nhiệt độ +1.5°C và các phương pháp bảo quản khác Sự giảm sút về tính chất cảm quan chủ yếu do hiện tượng hình thành các điểm biến đen trên bề mặt tôm, ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm.
Enzyme polyphenoloxidase (PPO) vẫn hoạt động trong quá trình làm lạnh, bảo quản bằng đá, và sau khi đông và rã đông, do đó không thể ngăn cản hoàn toàn hiện tượng này mà chỉ có thể làm chậm quá trình hình thành chúng.
1.2.5.Quá trình peroxide hóa lipid
Tổng quan về enzyme polyphenoloxidase (PPO)
Polyphenoloxidase (PPO), hay còn gọi là tyrosinase (monophenol, L-3,4-dihydroxyphenylalanine, L-DOPA), là một enzyme oxy hóa khử có mã EC 1.14.18.1 Enzyme này tồn tại trong mô của động vật giáp xác (Garcia-Molina et al, 2007) và có khả năng xúc tác phản ứng hydroxyl hóa monophenol để tạo thành o-diphenol, sau đó tiếp tục oxy hóa o-diphenol thành các sản phẩm khác.
11 quinone bởi oxy phân tử (Likhitwitayawuid, 2008) (Garcia-Molina F M.-R.-L.-C., 2007) (Decker, 2000)
PPO là enzyme được chiết xuất từ nhiều nguồn sinh học khác nhau, bao gồm động vật nhân thực, nấm, thực vật, động vật chân khớp, động vật lưỡng cư và động vật có vú, với cấu trúc và chức năng tương tự nhau (Garcia-Molina et al., 2005).
Cơ chất enzyme có sự khác biệt giữa thực vật và động vật bậc cao, nhưng ở động vật bậc cao, tính đặc trưng của enzyme không có nhiều khác biệt Trong tế bào động vật có vú, enzyme chủ yếu sử dụng DOPA (dihydroxyphenylalanine) hoặc các cơ chất liên quan chặt chẽ.
Enzyme PPO được tìm thấy ở mai, đầu ngực, khu vực đuôi và trong các lớp biểu bì ở bụng tôm, đặc biệt là ở những đoạn kết nối với chân bụng (Benjakul S V., 2005) Hoạt tính và tính chất của PPO có thể khác nhau tùy thuộc vào loài, vị trí cơ thể và giới tính (Ferrer, 1989) Đáng chú ý, các cơ bắp, chân ở bụng và chân hàm không cho thấy hoạt động của PPO.
1.3.3 Phân loại và chức năng
PPO có 3 dạng chính tùy thuộc vào cơ chất đặc hiệu và cơ chế phản ứng của enzyme bao gồm tyrosinase, catechol oxidase và laccase (Melda Zeynep Guray, 2009)
PPO kết hợp với melanosis đóng vai trò bảo vệ cho cơ thể động vật giáp xác, đặc biệt là trong việc xơ cứng lớp biểu bì của tôm và tôm hùm Ngoài ra, PPO còn có chức năng miễn dịch quan trọng, nhờ vào O-quinone, tham gia vào quá trình tổng hợp melanin - một hợp chất có khả năng kháng khuẩn và kháng virus, làm cho PPO trở thành thành phần thiết yếu trong các phản ứng miễn dịch bẩm sinh của động vật giáp xác.
Hình 1.4: Các cấu trúc chức năng của tyrosinase từ Streptomyces castaneoglobisporus
Nguồn: (Francisco J Enguita, 2011) Các cấu trúc chức năng của tyrosinase từ Streptomyces castaneoglobisporus Hình
A, tổng thể cấu trúc bậc ba của tyrosinase liên kết với đồng (thể hiện bằng màu xanh lá cây) được tạo phức với một protein caddy (thể hiện qua màu xanh dương) được xử lý bằng phương pháp X-ray crystallography (mã PDB: 2ZWE) (Matoba Y, 2006) Các nguyên tử đồng được biểu diễn dưới dạng hình cầu màu đỏ và các phần còn lại quấn quanh phối trí với đồng được thể hiện bằng que Hình B, biểu diễn chi tiết hình cầu phối trí hình cầu của đồng kép ở vị trí trung tâm và vị trí của cơ chất tyrosine (DeLano WL., 2002)
1.3.4 Đặc điểm của PPO trong tôm thẻ chân trắng
PPO từ các loài tôm khác nhau có cấu trúc và trọng lượng phân tử đa dạng Trọng lượng phân tử của PPO cũng thay đổi theo giai đoạn lột xác Cụ thể, trọng lượng phân tử PPO ở tôm thẻ chân trắng dao động trong khoảng 20-25 kDa.
1.3.4.2 pH tối ưu và tính ổn định pH của PPO được phân lập từ các loài động vật giáp xác thì khác nhau và thay đổi theo loài Trong trường hợp của tôm thẻ chân trắng, PPO có hoạt tính trong phạm vi pH 6,5-9,0 Sự thay đổi về pH có thể gây ra những thiệt hại đáng kể đến hoạt tính của enzyme Hoạt tính PPO giảm đi rõ rệt trong cả hai vùng pH acid hoặc kiềm (Whitaker, 1995) Tôm thẻ chân trắng không ổn định khi pH dưới 5,0 (Simpson B K., 1987)
1.3.4.3 Nhiệt độ tối ưu và tính ổn định
Nhiệt độ tối ưu của enzyme PPO thay đổi theo loài và điều kiện môi trường sống Cụ thể, PPO ở tôm thẻ chân trắng đạt hoạt tính tối đa trong khoảng 40-45 °C Nghiên cứu của Simpson et al (1987) cho thấy rằng sự ổn định nhiệt của PPO từ tôm chân trắng giảm đáng kể khi enzyme bị làm nóng đến 50 °C Tuy nhiên, enzyme này vẫn duy trì hoạt tính khi được bảo quản trong điều kiện lạnh, đông lạnh và sau khi rã đông.
Các phương pháp bảo quản tôm
1.4.1 Ướp lạnh Ướp lạnh thường (-2 ÷ -4°C cho lạnh sâu) hoặc cao hơn (0 5°C) được sử dụng trong ngành công nghiệp để giữ hải sản tươi sau khi thu hoạch (Espejo-Hermes, 1998) Phương pháp làm lạnh này chỉ được sử dụng để làm chậm quá trình hư hỏng của cá tôm khi mới đánh bắt
1.4.2 Lạnh đông Để bảo quản hải sản trong thời gian dài người ta thường sử dụng phương pháp lạnh đông Dưới điều kiện thích hợp, thường (-12÷ -20°C) lạnh đông có thể giúp bảo quản các sản phẩm trong vài tháng mà không thay đổi đáng kể chất lượng Lạnh đông là phương pháp ngưng lại một phần hoặc hoàn toàn các hoạt động có hại của vi sinh vật và enzyme (Chu Thị Thơm, 2006)
1.4.3 Sử dụng chất bảo quản
Trong ngành công nghiệp thực phẩm, việc hạn chế sự biến đen của tôm lạnh đông là rất quan trọng Để kiểm soát sự suy giảm chất lượng trong sản phẩm thủy sản, các chất bảo quản đã được áp dụng Một trong những phương pháp nghiên cứu phổ biến nhất là bổ sung chất chống oxy hóa, nhằm ngăn chặn sự đổi màu và oxy hóa lipid trong thịt cá và hải sản (Gokoglu, 2008).
Việc sử dụng chất ức chế sự biến đen trong chế biến thực phẩm gặp nhiều hạn chế do độc tính, vấn đề an toàn, và ảnh hưởng đến mùi vị, hương vị, kết cấu và chi phí Các chất này được phân loại theo cơ chế hoạt động chính, như được trình bày trong bảng 1.6 (Norman F Haard, 2000).
Bảng 1.6: Phân loại các chất ức chế sự biến đen ở tôm (AJ McEvily, 1992)
Tác nhân thuộc nhóm Sunfite Acid ascorbic và các chất tương tự Cysteien
Chất làm chua Acid citric
Acid aromatic carboxylic Aliphatic alcohol
Tổng quan về rau răm
1.5.1 Đặc điểm thực vật học
Hình 1.5: Hình ảnh minh họa rau răm
Rau răm có tên khoa học là Polygonatum odoratum hay còn có tên khác là
Persicaria odorata thể hiện trong hình 1.4
Cây thảo nhỏ, sống hằng năm, cao từ 10 đến 30 cm, có thân bò và bén rễ ở các mấu Thân cây đứng mảnh, màu trắng hoặc tía với các khía mờ Lá cây mọc so le, có hình mũi mác với gốc tròn và đầu thuôn nhọn, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng có thể xuất hiện vết trắng chữ V Gân giữa lá có ít lông nhỏ, bè chìa mỏng, ngắn, ôm lấy thân và có nhiều gân song song kéo dài thành những sợi nhỏ Cuống lá dính ở phần cuối của bè chìa.
Hoa có màu trắng, đôi khi pha hồng hoặc tím, mọc thành bông hẹp và mảnh Lá bắc hình phễu, có lông nhỏ ở mép, trong khi bao hoa gồm dài và tràng Cây có 8 nhị thọt, không bằng nhau, và quả nhỏ, bế, có 3 cạnh, nhọn đầu và nhẵn bóng Toàn cây tỏa ra mùi hắc, và mùa hoa quả diễn ra từ tháng 1 đến tháng 3 (Đỗ Huy Bích, 2006).
Bảng 1.7: Phân loại khoa học của rau răm
1.5.3 Phân bố và sinh thái
Rau răm là loài thực vật đặc hữu của Việt Nam, Lào và Campuchia, thường xuất hiện trong tự nhiên cũng như được trồng rộng rãi Tại Việt Nam, rau răm được xem là một loại rau gia vị phổ biến, được sử dụng ở hầu hết các địa phương.
Rau răm là loại cây thích hợp với khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, phát triển tốt ở vùng đồng bằng, trung du và núi có độ cao dưới 1000m Tuy nhiên, ở độ cao trên 1500m như Sa Pa, cây sinh trưởng chậm và có thể chết khi nhiệt độ giảm xuống 0°C Rau răm ưa ẩm, có khả năng sống trong môi trường đất ngập nước nhưng không chịu được hạn hán.
Phân loại khoa học Tên
Rau răm chứa tinh dầu màu vàng nhạt với thành phần chủ yếu là các alkan aldehyde (Đỗ Huy Bích, 2006)
According to research by Nguyễn Xuân Dũng and colleagues, the essential oil of Persicaria odorata contains 50 compounds, with 29 identified, including the primary components decanal (27.73%), dodecanal (44.05%), and decanol (10.88%) (Nguyễn Xuân Dũng, Lê Văn Hạc & Piet A Leclercq, 2011) Additionally, a study by Jamaludin Mohamed et al (2014) identified the chemical composition of Persicaria odorata, which includes (Z)-3-hexenal, (Z)-3-hexenol, undecanal, aldehydes, eucalyptol, various alcohols, acids, and several terpenes such as β-elemene and β-caryophyllene, along with flavonoids and saponins.
Tổng quan về polyphenol
Polyphenol là nhóm hợp chất tự nhiên có mặt trong trái cây, rau củ và một số thực vật khác, nổi bật với khả năng trung hòa gốc tự do nhờ vào các nhóm chức năng của chúng Chúng đang được nghiên cứu sâu rộng để cải thiện sức khỏe và điều trị bệnh, dẫn đến sự quan tâm lớn đối với các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến nồng độ polyphenol trong nguồn thực vật, cũng như các phương pháp phân lập và xác định chúng (Cowan, 1999).
Thực vật có khả năng tổng hợp hàng ngàn hợp chất thơm, chủ yếu là phenol và các dẫn xuất oxy của chúng, với ít nhất 12.000 chất đã được phân lập Những hợp chất này, thường là chất chuyển hóa thứ cấp, giúp thực vật chống lại vi sinh vật, côn trùng và động vật ăn cỏ Terpenoid tạo ra mùi hương cho thực vật, trong khi các hợp chất khác như quinone và tannin đóng vai trò trong sắc tố Nhiều hợp chất cũng mang lại hương vị đặc trưng cho thực vật, như capsaicin trong ớt, và một số thảo mộc, gia vị được sử dụng trong thực phẩm có lợi ích như thực phẩm chức năng.
1.6.1 Những hợp chất polyphenol đơn giản
Các hợp chất polyphenol đơn giản chiếm một tỷ lệ nhỏ trong tổng số polyphenol, bao gồm những hợp chất chỉ có một vòng benzen và tồn tại tự nhiên Ví dụ điển hình là resorcinol (1,3-).
17 dihydroxybenzen) và phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzen) là những hợp chất được hình thành từ nhựa cây và vỏ cây ăn trái (Hình 1.6) (Thông, 2016)
Hình 1.6: Một số cấu trúc của các hợp chất polyphenol đơn giản
Acid phenolic, bao gồm các hợp chất như acid gallic và acid vanillic, có đặc điểm của nhóm chức carboxylic, trong khi aldehyd hydroxybenzoic, như aldehyd vanillin, thuộc nhóm chức aldehyd Ngoài ra, các acid cinnamic phổ biến gồm acid cinnamic, acid p-coumaric, acid caffeic, acid ferulic, acid 5-hydroxyferulic và acid sinapic (Thông, 2016).
Flavone là một dạng polyphenol có cấu trúc chứa nhóm carbonyl, và khi thêm nhóm 3-hydroxyl, nó trở thành flavonol Flavonoid, một dạng polyphenol phổ biến, chứa nhóm hydroxyl tại vị trí C6-C3 với vòng thơm, và được nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt là catechin trong trà xanh, nổi bật với khả năng chống oxy hóa và ức chế một số vi khuẩn Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra hiệu quả của các flavonoid như swertifrancheside, glycyrrhizin từ cam thảo, và chrysin trong việc chống lại virus Isoflavone, có trong một số cây họ đậu, có tác dụng ngăn ngừa nhiễm trùng sán máng Anthocyanin, một hợp chất màu tự nhiên thuộc nhóm flavonoid, có màu đỏ, đỏ tía và cũng là một chất chống oxy hóa quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh tật.
18 ngừa các bệnh về thần kinh, tim mạnh, ung thư và tiểu đường (Carlos Andrés Galán-Vidal,
Tannin là một nhóm các chất phenolic polyme có mặt ở hầu hết các bộ phận của cây như vỏ cây, lá, quả và rễ Chúng được chia thành hai loại: loại có khả năng thủy phân, ví dụ như Procyanidine B-2, và loại không có khả năng thủy phân, như Pentagalloylglucose.
Hình 1.7: Cấu trúc một số hợp chất tanin
Tình hình nghiên cứu về chất chống oxy hóa tự nhiên
1.7.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Chất chống oxy hóa và kháng khuẩn từ nguồn gốc thực vật đang được chú ý sử dụng làm phụ gia thực phẩm Nhiều nghiên cứu khoa học trên thế giới đã chỉ ra hiệu quả của các chất chống oxy hóa tự nhiên này.
A.K Biswas và cộng sự, 2012 đã nghiên cứu “Khả năng chống oxy hoá của cà ri (Murraya koenigii L.) và bạc hà (Mentha spicata) Ảnh hưởng của cao trích này đến màu sắc và sự oxy hóa ở thịt heo thô trong suốt quá trình bảo quản lạnh” Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng dịch trích của hai loại lá trong dung môi EtOH cho thấy hoạt tính DPPH và ABTS + cao hơn Lá bạc hà có hàm lượng phenolic cao nhất, trong khi ở lá cà ri lại là thấp nhất Ngược lại, ở lá cà ri lại cho thấy hoạt động thu hồi anion oxit (%) là cao nhất Tuy nhiên, pH và giá trị TBARS cao hơn trong các mẫu đối chứng không phụ thuộc vào thời gian bảo quản Điều này cho thấy cao trích của hai loại lá trên trong dung môi EtOH có tiềm năng được sử dụng như các chất chống oxy hoá tự nhiên để giảm thiểu sự oxy hóa lipid của các sản phẩm thịt lợn
Theo nghiên cứu của Angel B Encarnacion, 2011 “Dịch trích của nấm ăn được (Flammulina velutipes) ức chế melanosis trong tôm Kuruma (Marsupenaeus japonicus)”
Nghiên cứu này so sánh hiệu quả của dịch trích từ nấm Flammulina velutipes trong việc ngăn ngừa melanosis ở tôm Kuruma với các hợp chất chống vi khuẩn khác Dịch trích nấm chứa ergothioneine (ESH) với nồng độ 9,1 mg/ml Khi ngâm tôm sống trong dung dịch chiết xuất nấm 0,5% (w/v), hoạt tính PPO trong hemolymph của tôm giảm đáng kể, từ đó ức chế sự phát triển của melanosis trong quá trình bảo quản lạnh Bên cạnh đó, Natri metabisunphit ascorbat và 4-hexyl-1,3-benzenediol cũng cho thấy tác dụng tương tự.
Theo báo cáo của Sara Basiri (2014), dịch trích vỏ lựu (PPE) có ảnh hưởng tích cực đến chất lượng tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong quá trình bảo quản lạnh Nghiên cứu cho thấy hoạt tính ức chế của PPE đối với enzyme polyphenol oxidase (PPO) phụ thuộc vào liều lượng sử dụng Khi xử lý tôm với nồng độ 1g/100ml hoặc 2g/100ml, PPE có khả năng làm chậm sự phát triển của vi khuẩn và giảm đáng kể sự thay đổi của các chỉ số chất lượng như Nito (TVB-N), trimethylamine (TMA) và acid Thiobarbituric (TBA) Đến ngày thứ 6, tôm xử lý PPE có chỉ số melanosis thấp hơn, và sau 10 ngày, chất lượng cảm quan như mùi vị, kết cấu và màu sắc vẫn được duy trì tốt Do đó, PPE có thể được sử dụng như một chất bảo quản tự nhiên, thay thế cho Natri metabisunphit trong bảo quản tôm.
1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam trong những năm gần đây cũng đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về chất chống oxy hóa tự nhiên trong các loại rau quả trái cây
Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Duy và Nguyễn Anh Tuấn (2013) đã tiến hành sàng lọc các loại thực vật có hoạt tính chống oxi hóa, nhằm tìm ra thực vật có hiệu quả cao nhất trong chế biến thủy sản Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ 15 loại thực vật và một loại nấm rơm tại Việt Nam đã được xác định Sau khi lựa chọn được loại thực vật phù hợp, nghiên cứu tiếp tục đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết trong mô hình dầu - nước và khả năng ức chế polyphenoloxidase Cuối cùng, dịch chiết được áp dụng trong các quy trình chế biến.
Nghiên cứu cho thấy dịch chiết từ lá ổi (GLE) có hoạt tính chống oxi hóa cao nhất, với khả năng ức chế gốc tự do DPPH và giá trị IC50 là 22µL GLE cũng hiệu quả trong việc ngăn chặn sự hình thành hydoperoxide và ức chế enzyme PPO, từ đó hạn chế sự xuất hiện đốm đen và oxi hóa chất béo trong tôm và cơ thịt cá trong quá trình bảo quản lạnh (p < 0,05) Kết quả nghiên cứu này chỉ ra tiềm năng sử dụng dịch chiết thực vật chứa chất chống oxi hóa và chất chống biến đen trong chế biến thủy sản.
Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Duy và Hồ Bá Vương (2013) đã khảo sát hoạt tính chống oxi hóa và ức chế enzyme polyphenoloxidase (PPO) của sáu loại thực vật ăn được tại Việt Nam, bao gồm lá trà xanh, lá trầu không, lá ổi, lá khoai lang, lá lốt và lá nhàu Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua khả năng khử gốc tự do DPPH, năng lực khử và khả năng ức chế oxi hóa chất béo Kết quả cho thấy tất cả sáu loại thực vật đều có khả năng chống oxi hóa khác nhau, với hàm lượng polyphenol dao động từ 11,73 đến 188,19 mg GAE/g chất khô Đặc biệt, hoạt tính ức chế PPO cao nhất thuộc về lá ổi (64,77%), tiếp theo là lá trầu không (61,66%) và lá trà xanh (43,87%).
Năm 2016, Phan Thị Bích Trâm và Nguyễn Thị Diễm My đã tiến hành nghiên cứu về hoạt tính các hợp chất kháng oxy hóa trong lá và thân cây chùm ngây (Moringa oleifera) Mục tiêu của nghiên cứu là khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chiết tách và dung môi hữu cơ đến hoạt tính của các hợp chất này Kết quả cho thấy lá chùm ngây có khả năng kháng oxy hóa cao hơn so với thân cây Ngoài ra, hợp chất chiết bằng phương pháp Soxhlet cho thấy hoạt tính cao hơn so với phương pháp chiết nóng, và việc sử dụng dung môi metanol mang lại hiệu quả tốt hơn etanol Hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) và flavonoid tổng số (TFC) đạt cao nhất trong mẫu dịch chiết metanol từ lá bằng phương pháp Soxhlet, lần lượt là 9,68 mg GAE/g VCK và 19,8 mg.
Lượng quercetin trong lá cây chùm ngây đạt 21 QE/g chất khô Khả năng loại bỏ gốc tự do được xác định bằng thử nghiệm DPPH trên mẫu dịch chiết metanol, với phương pháp chiết Soxhlet, cho giá trị IC50 thấp nhất là 0,537 mg/mL.
Định hướng và điểm mới của nghiên cứu
Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để chiết tách hợp chất chống oxy hóa tự nhiên, nhưng nghiên cứu về các loại rau gia vị vẫn còn hạn chế Các loại rau gia vị không chỉ chứa nhiều thành phần chống oxy hóa mà còn dễ trồng và có giá thành thấp Với những lợi thế này, rau gia vị có tiềm năng lớn trong việc ứng dụng bảo quản thay thế cho các chất oxy hóa tổng hợp.
Tôm là một loại thủy sản giàu dinh dưỡng nhưng dễ bị biến đen và oxy hóa lipid, ảnh hưởng đến thời gian bảo quản và giá trị sản phẩm (Nirmal, N P và Benjakul, S, 2011b) Những vấn đề này không chỉ gây tổn thất kinh tế mà còn làm giảm sự chấp nhận của người tiêu dùng Để khắc phục, các chất ức chế điểm biến đen như sulphit và 4-hexylresorcinol đang được sử dụng (Martinez-Alvarez O., 2008a) Tuy nhiên, người tiêu dùng thường lo ngại về phụ gia hóa học, do đó, khuyến khích sử dụng các hợp chất tự nhiên để hạn chế hiện tượng biến đen.
Từ những nhận định trên chúng tôi đưa ra định hướng nghiên cứu như sau:
Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của một số rau gia vị được thực hiện thông qua việc xác định tổng hàm lượng phenolic và hoạt tính thu gom gốc tự do DPPH Nghiên cứu này nhằm đánh giá khả năng chống oxy hóa của các loại rau gia vị, góp phần vào việc hiểu rõ hơn về giá trị dinh dưỡng và lợi ích sức khỏe của chúng.
- Lựa chọn 1 mẫu rau gia vị có hoạt tính chống oxy hóa mạnh phục vụ cho quá trình nghiên cứu bảo quản tôm
- So sánh, đánh giá kết quả đạt được, từ đó đề xuất hướng sử dụng phụ gia trong bảo quản tôm sau thu hoạch
1.8.2 Điểm mới của nghiên cứu
Các nghiên cứu trước đây chủ yếu tập trung vào việc trích ly và tối ưu hóa quy trình, xác định tổng hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa tự nhiên Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào ứng dụng chất chống oxy hóa và ức chế enzyme PPO.
Nghiên cứu đã chỉ ra 22 loại rau gia vị có khả năng bảo quản tôm thẻ chân trắng hiệu quả Điểm nổi bật của nghiên cứu là xác định được loại rau có hoạt tính mạnh, từ đó ứng dụng để ức chế enzyme PPO, giúp hạn chế hiện tượng biến đen ở tôm.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) được mua ở chợ Hiệp Phú, kích cỡ 45-
Tôm được vận chuyển từ các trang trại nuôi tôm lân cận với giá 50 con/kg, được bảo quản trong bể oxy để đảm bảo tôm vẫn còn sống.
Mười loại rau gia vị dùng trong nghiên cứu có nguồn gốc ở Đà Lạt được mua từ siêu thị Coop-mart – quận 9 – Thành phố Hồ Chí Minh
Bảng 2.1: Danh mục các mẫu rau gia vị sử dụng (Đỗ Huy Bích, 2006)
STT TÊN GỌI TÊN KHOA HỌC BỘ PHẬN
SỬ DỤNG THÀNH PHẦN HÓA HỌC
1 Diếp cá Houttuynia Cordata Lá Nước, protid, glucid, lipit, cellulose, khoáng: calcium, kali, caroten, vitamin C…
Tinh dầu: methylnonylketon, decanonylacetaldehyde, myrcen, cordalin, sterol…
2 Húng cay Ocimum Africanum Lour Lá Tinh dầu: estragol, eugenol, methyl eugenol, citral, linalool, geraniol and thymol
3 Húng lủi Mentha Crispa L Lá Tinh dầu: menthofuran, methyl acetate, menthol, methone piperitone, menthone
4 Húng quế Ocimum Basilicum Lá Chứa nhiều flavonoid như orientin và vicenin
Tinh dầu: methyl chavicol, eugenol, citronellol, linalool, citral, limonene và tecpineol
5 Kinh giới Elsholtzia Cristata Lá Tinh dầu: elsholtzia keton, d-menthol, menthol racemic và d-limonen
6 Ngải cứu Artemisia Vulgaris Lá Tinh dầu, flavonoid, acid amin
7 Ngò gai Eryngium Foetidum Lá
Chứa khoáng: Ca, Mg, P, K; vitamins: B1, B2, B6, C
Tinh dầu: pyranocoumadins, monoterpenes glycosides, aldehyde, acid hữu cơ, flavonoids
8 Rau om Limnophila Aromatica Lá Chứa nước, protein, glucide, cellulose, vitamin B, C
Tinh dầu: flavonoid, tanin, stigmastero, enydrin
9 Rau răm Persicaria Odorata Lá Tinh dầu: decanal, dodecanal, decanol, sesquiterpene
10 Tía tô Perilla Frutescens Lá Tinh dầu: perillaldehyde, a-pinen, dihydrocumin, L-perilla-alcohol, a-pinen, elsholtziaketone, limonen
Hóa chất và thiết bị
- 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) (Sigma-Aldrich, USA)
- Acetone (Chemsol, Việt Nam), EtOH 99,5 (Chemsol, Việt Nam)
- Ammonium sulfate (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Disodium hydrophosphate (Na2HPO4.12H2O) (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Ferricyanide kali (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Folin-Ciocalteu’s phenol reagent (FC) (Merck, Đức)
- (3,4 dihydroxylphenyl) alanine (L-DOPA) (Sigma-Aldrich, USA)
- Malondialdehyde (MDA) (Eagle Biosciences, USA)
- Monosodium orthophosphate (NaH 2 PO 4 2H 2 O) (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Polyoxyethylene (23) lauryl ether (Brij-35) (Sigma-Aldrich, USA)
- Ferric chloride (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Sodium metabisulfite (SMS) (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Thiobarbituric acid (TBA) (Sigma-Aldrich, USA)
- Trichloroacetic acid (TCA) (Merck, Đức)
- Acid Gallic: 98% (New Jersay, USA)
- KNO 3 loại tinh khiết phân tích (Merck, Đức)
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị
- Bể điều nhiệt (Memmert, Đức)
- Cân phân tích 4 số (Precisa, Thụy Sỹ)
- Cuvette thủy tinh (Chrom Tech, USA)
- Hệ thống cô quay chân không (Yamamoto, Nhật Bản)
- Hệ thống Soxhlet (Trade Raypa, Tây Ban Nha)
- Màng thẩm tách (Cell Dialysis Membrane, Fseqchem, Việt Nam)
- Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis (Hitachi, Nhật Bản)
- Máy đo pH (Seven easy pH, Trung Quốc)
- Máy đồng hóa (Ika, Đức)
- Máy ly tâm (Hettich, Đức)
- Máy ly tâm lạnh (Hermle, Đức)
- Máy xay (Philips HR2106, Trung Quốc)
- Tủ lạnh (Hitachi, Nhật Bản)
Nội dung nghiên cứu
Chọn 5 mẫu cao kết quả tối ƣu nhất
Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 40 mẫu cao trích ly từ 10 loại rau gia vị ở Việt Nam Ứng dụng bảo quản tôm
So sánh và đánh giá với phụ gia natri metabisunfite và mẫu đối chứng
Tính hiệu suất thu hồi
- Phương pháp xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
- Xác định khả năng khử của cao trích
Trích ly Tính hiệu suất thu hồi
- Xác định sự thay đổi pH trong quá trình bảo quản
- Đánh giá cảm quan biến đen
- Xác định các chỉ tiêu vi sinh
- Xác định các chỉ tiêu hóa lý
- Trích ly bằng đệm và tủa với amoni sunfate
- Xác định hoạt độ PPO
- Xác định khối lƣợng PPO
- Xác định hoạt tính ức chế PPO Điều chế 40 mẫu cao từ 10 loại rau gia vị ở Việt Nam
- Dung môi nước và EtOH (tách và không tách diệp lục)
- Phương pháp Soxhlet Điều chế enzyme PPO
Chọn 1 mẫu cao có hoạt tính - mạnh nhất
Hình 2.1: Quy trình thực hiện nghiên cứu
Trong đó (i), (ii), (iii), (iv) là nơi thực hiện thí nghiệm
(i) Thực hiện tại Trường ĐH Sư phạm Kỹ thuật TP.HCM
(ii) Thực hiện tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng
(iii)Thực hiện tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM
(iv) Thực hiện tại Viện Pastuer TP.HCM
Trong giai đoạn 1, chúng tôi điều chế cao từ 10 loại rau gia vị Việt Nam bằng hai dung môi phân cực là EtOH và nước Mỗi dung môi tạo ra hai mẫu cao, bao gồm mẫu giữ diệp lục và mẫu tách diệp lục, dẫn đến tổng cộng 40 mẫu cao được thu thập sau quá trình điều chế.
Với 40 mẫu cao đã được điều chế, tiến hành sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp (khảo sát hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH, xác định tổng hàm lượng polyphenol) Từ đó chọn ra 5 mẫu cao tối ưu nhất Sau đó thử khả năng khử của chúng bằng (xác định khả năng khử săt của cao trích)
Tiến hành trích ly enzyme PPO thô từ tôm thẻ chân trắng và khảo sát hoạt tính của enzyme này bằng các phương pháp xác định hoạt độ và khối lượng nguyên tử của enzyme PPO.
Khảo sát hoạt tính của enzyme PPO được thực hiện thông qua phương pháp xác định hoạt tính ức chế Dựa vào hai kết quả thu được và khả năng khử sắt của các mẫu cao trích, chúng tôi đã chọn ra mẫu cao tối ưu nhất.
Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng mẫu cao tối ưu trong bảo quản tôm, so sánh hiệu quả với phụ gia thương mại natri metabisunphit và mẫu đối chứng không xử lý Để đánh giá hiệu quả bảo quản, các phương pháp được sử dụng bao gồm thử hoạt tính chống oxy hóa TBARS, xác định sự thay đổi pH, kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh, các chỉ tiêu hóa lý, và đánh giá cảm quan biến đen của tôm.
Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các loại rau gia vị ở Việt Nam
2.4.1 Phương pháp điều chế cao
Phương pháp điều chế cao được thực hiện theo Simpson 1987 theo hình 2.2
Xử lý sơ bộ Sấy Nghiền
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình điều chế cao 2.4.1.2.Thuyết trình quy trình
- Xử lý sơ bộ: Các loại rau gia vị sau khi mua về được loại bỏ cuống, thân, rễ sau đó rửa sạch và để ráo
Rau được sấy với lượng từ 100-200g, dàn đều và ở nhiệt độ 60 độ C để bảo toàn các thành phần chống oxy hóa Trong quá trình sấy, cần đảo trộn thường xuyên để tránh hiện tượng hầm rau, và thời gian sấy sẽ khác nhau tùy thuộc vào từng loại lá.
- Nghiền: Rau sau khi sấy khô được nghiền mịn thành bột, quá trình này nhằm mục đích hỗ trợ cho quá trình trích ly
Bột rau gia vị được trích ly bằng hệ thống Soxhlet với 100ml dung môi trong 6 giờ, ở nhiệt độ 60°C cho cao EtOH và 80°C cho cao nước.
- Lọc: sử dụng giấy lọc nhằm loại bỏ các cặn không hòa tan, thu dịch trích chuẩn bị cho quá trình cô quay
Cô quay được thực hiện bằng cách dịch chiết cao trích chân không ở nhiệt độ 60 o C/80 o C trong 30 phút, nhằm loại bỏ dung môi và thu hồi cao trích hiệu quả Trong quá trình này, cao trích vẫn ở dạng paste do chưa loại bỏ hoàn toàn dung môi.
- Sấy: Cao trích được dàn đều trong đĩa petri và sấy khô ở 60 o C trong 12 giờ, đến khi dung môi đã hoàn toàn bay hơi
Lượng bột thu được cần được bảo quản trong hũ bi kín và bọc giấy bạc để tránh ánh sáng Đối với mẫu cao EtOH và cao nước loại diệp lục, trước khi trích ly, cần loại diệp lục bằng cách ngâm mẫu bột trong 400-500ml Acetone 90% ở nhiệt độ 4-8°C trong 4-5 ngày, tùy thuộc vào từng loại rau Sau đó, Acetone được loại bỏ bằng phương pháp bay hơi ở nhiệt độ phòng.
Thu suất quá trình trích ly được tính theo công thức:
(2.1) m cao - khối lượng cao thu được sau khi loại bỏ hoàn toàn dung môi (g) m bột – khối lượng bột rau gia vị trích ly (g)
2.4.2 Xác định hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
DPPH (1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là một gốc tự do bền trong dung dịch, có màu tím và bước sóng hấp thu cực đại tại 517nm Các chất chống oxy hóa có khả năng trung hòa gốc DPPH bằng cách cung cấp hydro, dẫn đến sự giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và làm nhạt màu dung dịch từ tím sang vàng.
Phản ứng trung hòa gốc DPPHcủa các chất kháng oxy hóa được minh họa trong hình 2.3
Hình 2.3: Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH
Dung dịch DPPH 100àM, dung dịch làm việc của mẫu cao cú nồng độ 500àg/mL, dung dịch EtOH 95%
Hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của chiết xuất từ rau gia vị được xác định theo phương pháp của Fu và Shieh (2002), như được mô tả trong hình 2.4.
V 2 (μL) Ethanol Ủ Đo độ hấp thu quang
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Mỗi mẫu ban đầu được thử nghiệm ở bốn nồng độ khác nhau: 100, 50, 25 và 10 µg/mL, với mỗi nồng độ được lặp lại ba lần Nếu hoạt tính của mẫu thử mạnh, sẽ tiếp tục thử nghiệm ở các nồng độ thấp hơn là 10, 5, 2 và 1 µg/mL để xác định I%.
- Phối trộn: Lấy V2 (àL) EtOH 95% thờm vào V1 (àL) mẫu cú nồng độ 500àg/mL được 1500àL dung dịch và thờm tiếp 1500àL DPPH 100àM
- Ủ: Để yên hỗn hợp trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong bóng tối
- Đo độ hấp thu: đo độ hấp thụ ở bước sóng 519nm bằng máy đo quang phổ hồng ngoại khả kiến
Các mẫu control ở mỗi nồng độ đã được chuẩn bị tương tự và thay thế mẫu bằng EtOH
Tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử ta chuẩn bị một mẫu blank Mẫu trắng tương tự như mẫu thử nhưng thay DPPH bằng EtOH
Để đánh giá hoạt tính của các mẫu cao khảo sát, chúng tôi đã sử dụng acid gallic làm chất đối chứng dương, do nó có khả năng ức chế gốc tự do DPPH mạnh mẽ.
2.4.2.5 Khả năng chống oxy hóa được tính dựa trên phần trăm ức chế (I%)
AC - Gía trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control)
A S - Gía trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)
Mẫu control: Ta thay V 1 (àL) bằng V 2 (àL) EtOH
Mẫu blank: Được chuẩn bị tương tự mẫu sample nhưng ta thay V DPPH bằng
IC 50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hay yếu của các mẫu cao
IC 50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do hoặc enzyme Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp
Tiến hành khảo sỏt hoạt tớnh của mẫu ở 4 nồng độ 100; 50; 25; 10àg/mL
Đối với các mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính theo nồng độ, chúng ta có thể vẽ một đường thẳng đi qua tất cả các điểm, trong đó trục y đại diện cho % ức chế và trục x là nồng độ.
Đối với các mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta lựa chọn hai nồng độ ức chế nằm trên và dưới 50% Sau đó, tiến hành vẽ đường thẳng để thu được phương trình với hai hệ số a và b đã biết.
Thay vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x Đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50)
2.4.3 Xác định tổng hàm lượng polyphenol
Trong môi trường kiềm, thuốc thử Folin-Ciocalteu oxy hóa các hợp chất polyphenol, tạo ra các acid heteropoly màu xanh da trời có độ hấp thu cực đại tại 760nm, theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745.
Tổng hàm lượng phenolic được tính toán bằng cách quy về lượng tương đương với chất chuẩn acid galic, được biểu diễn theo số mg acid galic/g mẫu khô
Dung dịch acid gallic 1000àg/mL (w/v), dung dịch thuốc thử Folin-Ciocalteu (FC) (1:5) (v/v), dung dịch Na 2 CO 3 10% (w/v)
Na 2 CO 3 Đo mật độ quang
- Ủ 30 phút trong bóng tối Thuốc thử FC
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình xác định tổng hàm lượng phenolic 2.4.3.4 Thuyết minh quy trình
Lấy 60 µL acid gallic mẫu thử cho vào ống nghiệm, thêm V1 thuốc thử FC (tỉ lệ 1:5), lắc đều và để yên trong 5 phút Tiếp theo, thêm V2 dung dịch Na2CO3 10%, sau đó bổ sung nước cất đến đủ 3000 µL, lắc đều và ủ trong bóng tối trong 30 phút để phản ứng xảy ra Cuối cùng, tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 730 nm.
2.4.3.5 Khảo sát thể tích dung dịch Na 2 CO 3 (V 2 )
Màu sắc của dung dịch sau phản ứng phụ thuộc vào pH, vì vậy chúng tôi khảo sát lượng Na2CO3 sử dụng làm môi trường phản ứng Chúng tôi cố định thuốc thử FC và acid gallic, đồng thời thay đổi dung dịch Na2CO3 và quét sóng trong khoảng từ 500 đến 800nm.
2.4.3.6 Khảo sát thể tích thuốc thử Folin-Ciocalteau(V 1 )
Chúng tôi đã cố định thể tích dung dịch Na2CO3 tối ưu và acid gallic ở nồng độ 1000μg/mL để đảm bảo phản ứng đạt tính định lượng Đồng thời, chúng tôi thay đổi thể tích thuốc thử FC và tiến hành quét sóng trong khoảng từ 500-800nm.
Nghiên cứu một số tính chất của enzyme PPO
2.5.1 Điều chế cao trích PPO từ đầu ngực tôm
Phân tách PPO từ phần đầu ngực của tôm được thực hiện theo phương pháp của Nirmal N P (2009a) và Simpson B K (1987) với một số điều chỉnh, như thể hiện trong hình 2.7.
2.5.1.1.Quy trình trích PPO Đầu tôm
Hình 2.7: Sơ đồ quy trình chuẩn bị cao trích PPO thô từ tôm thẻ chân trắng
Tôm sau khi mua về được xử lý sơ bộ bằng cách ngâm phần đầu trong nitơ lỏng, với mục đích làm lạnh đông nhanh chóng xuống -196°C, giúp hỗ trợ quá trình xay mịn hiệu quả.
- Xay mịn: Đầu tôm sẽ được xay min bằng cối xay khô để thu được dạng bột mịn Bột này được bảo quản ở 20°C để sử dụng
Cân 50g bột phối trộn với 150ml dung dịch đệm Na3PO4 0,05M (pH 7,2) có chứa 1,0M NaCl và 0,2% Brij-35 Hỗn hợp này cần được khuấy trộn liên tục ở nhiệt độ 4ºC trong 30 phút.
Hỗn hợp được ly tâm lần 1 với tốc độ 8000g ở 4°C trong 30 phút bằng máy ly tâm lạnh, nhằm thu phần nổi trong hỗn hợp sau quá trình ly tâm.
Ly tâm lần 2 được thực hiện bằng cách thêm Amonium Sulphate vào hỗn hợp cho đến khi đạt độ bão hòa 40% Sau đó, hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 12500g tại 4ºC trong 30 phút để thu được phần lắng của hỗn hợp.
Thẩm tích là quá trình hòa tan hỗn hợp sau khi ly tâm bằng dung dịch đệm Sodium Sulphate (Na3PO4 0,05M; pH 7,2 chứa 1,0M NaCl và 0,2% Brij-35) Quá trình này được thực hiện với lượng dung dịch đệm gấp 15 lần so với lượng ban đầu, bao gồm 3 lần thay đổi dung môi ở nhiệt độ 4°C trong vòng 24 giờ.
Sau khi hoàn tất quá trình thẩm tích, tiến hành ly tâm lần 3 với tốc độ 3000g ở nhiệt độ 4°C trong 30 phút Kết quả thu được phần nổi trong hỗn hợp, chính là cao trích PPO thô.
Lượng PPO thô sau quá trình trích ly được bảo quản ở 2°C và sử dụng không quá 2 tuần
Thu suất quá trình trích ly được tính theo công thức:
(2.4) mcao - khối lượng cao thô thu được (g) mbột – khối lượng bột đầu tôm sau quá trình xay mịn với nitơ lỏng (g)
2.5.2 Xác định hoạt độ enzyme PPO
Hoạt động PPO được nghiên cứu thông qua việc sử dụng L-DOPA làm chất nền, theo phương pháp của Simpson et al (1987), với một số điều chỉnh nhỏ như thể hiện trong hình 2.8.
PPO thô Đo độ hấp thu quang
Dung dịch đệm Nước cất
Hình 2.8: Sơ đồ quy trình xác định hoạt độ enzyme PPO 2.5.2.2 Thuyết minh quy trình
Để tiến hành phối trộn, sử dụng 200μL cao trích PPO thô (1000μg/ml), 1200 μL dung dịch L-DOPA 15 mM trong nước cất, 800 μL đệm phosphate 0.05 M với pH 6.0 và 200 μL nước cất Tất cả các hóa chất cần được giữ ở nhiệt độ 45°C trước khi tiến hành phối trộn.
- Đo độ hấp thụ quang: đo độ hấp thụ ở bước sóng 475 nm trong 2 bằng máy quang phổ hồng ngoại khả kiến
Mẫu blank được chuẩn bị bằng cách chuẩn bị như mẫu thử nhưng thay enzyme và cơ chất bằng nước cất
Hoạt độ của enzyme (A) được tính theo phương pháp của Simpson năm 1987
2.5.3 Xác định khối lượng phân tử của enzyme
Phương pháp phân tích sắc ký lọc gel là kỹ thuật quan trọng trong việc xác định khối lượng phân tử của đại phân tử như protein, tinh bột và polysaccharide, đồng thời đánh giá độ phân tán của hệ keo.
2.5.3.2 Điều kiện phân tích mẫu
Pha dung dịch KNO3 với nồng độ 0.5 M và định mức tới 1 lít bằng nước khử ion Sau đó, lọc qua màng lọc 0.45 μm và đun sôi để loại bỏ bọt khí trong khoảng 45 phút.
- Pha tĩnh: Cột Ultrahydrogel 500 (300 mm x 7.8 mm ID)
- Tốc độ dòng pha động : 1 mL/phút
- Thể tớch mẫu tiờm : 20 àL
2.5.3.3 Các đại lượng cơ bản
Phân tử lượng trung bình số (Mn) được định nghĩa là tổng khối lượng của các phân tử trong một mẫu polymer chia cho tổng số mol của các phân tử trong mẫu đó.
Kích thước của các phân tử trong polymer phân bố từ i=1 đến NI, với NI là số mol hoặc số phân tử có phân tử lượng Mi Tổng khối lượng của polymer được tính bằng công thức W = M N i i, trong đó N i là tổng số mol của polymer.
(ii) Phân tử lượng trung bình khối MW
Phân tử lượng trung bình khối được xác định theo công thức Mw= PM i i (2.7)
Với P i là phần khối lượng của các phân tử có trong phân tử lượng M i
(iii) Phân tử lượng trung bình nhớt M v
Polymer có phân tử lượng càng lớn, độ nhớt của nó càng lớn
(iv) Chỉ số đa phân tán D: đặc trưng cho độ phân tán của mẫu polymer
D=1 đồng nhất về độ trùng hợp trong toàn mẫu polymer (điều kiện lý tưởng)
D>1 mẫu polymer có độ đa phân tán , D càng lớn mẫu càng phân tán
2.5.4 Xác định hoạt tính ức chế enzyme PPO
Hoạt tính của PPO được xác định bằng việc sử dụng L-DOPA theo phương pháp của (Nirmal N P., 2009b) và được mô tả theo hình 2.9
Khuấy đều Đo độ hấp thu quang Đệm phosphate
Hình 2.9: Sơ đồ quy trình xác định hoạt tính ức chế enzyme PPO 2.5.4.2 Thuyết minh quy trình
Dung dịch cao trích trong nước cất với nồng độ 1000 µg/mL được phối trộn với 100 µL cao trích PPO để tạo ra dung dịch mới có nồng độ cuối lần lượt là 0,5; 1 và 2; 4 mg/mL.
- Ủ: Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Khuấy đều: Hỗn hợp sau khi ủ được bổ sung thờm 400àL dung dịch đệm (0,05M đệm phosphate; pH 6,0)
- Ủ: Để bắt đầu phản ứng, thờm 600àL dung dịch L-DOPA 15mM và ủ thờm 3 phút
- Đo độ hấp thụ quang: đo độ hấp thụ ở bước sóng 475 nm bằng máy quang phổ hồng ngoại khả kiến
Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng thay thế cao trích bằng nước cất Kết quả được đánh giá bằng phần trăm ức chế, được tính toán theo công thức cụ thể.
A – Hoạt tính PPO của mẫu đối chứng
B – Hoạt tính PPO trong dịch chiết
Nghiên cứu và ứng dụng rau gia vị trong bảo quản tôm
2.6.1 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid
Xác định khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid có thể được thực hiện thông qua việc đo giá trị TBARS Peroxide hóa lipid là một cơ chế phổ biến gây tổn thương cho tế bào động thực vật Đo lường malondialdehyde (MDA), sản phẩm cuối cùng của quá trình này, là một phương pháp đơn giản và hiệu quả để đánh giá nồng độ lipid peroxide trong nhiều loại mẫu, bao gồm thuốc, thực phẩm và mô sinh học từ người và động vật.
MDA phản ứng với TBA tạo phức màu hồng có hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm trong môi trường pH 2-3, nhiệt độ 90-100 o C trong 10-15 phút Phức này được phát hiện bằng máy đo quang phổ hấp thu phân tử Các chất kháng oxy hóa làm giảm sự hình thành MDA, do đó, sự giảm cường độ hấp thu của phức có thể được sử dụng để xác định khả năng kháng oxy hóa của chất nghiên cứu (Robert, 1968).
Phản ứng tạo phức giữa MDA và TBA được biểu diễn như hình 2.1
Hình 2.10: Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và thiobarbituric acid
2.6.1.2 Xây dựng đường chuẩn MDA
Hình 2.11: Sơ đồ quy trình xác định độ hấp thụ quang
- Phối trộn: Pha MDA theo các nồng độ 10; 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1μg/mL với các dung dịch TBA và nước sao cho tổng thể tích đạt 10mL,
- Ngâm: ngâm dung dịch trong bể điều nhiệt 100 o C trong 15 phút
- Làm nguội: làm nguội nhanh dưới vòi nước
- Đo độ hấp thu: đo độ hấp thụ tại bước sóng 532nm
Giá trị TBARS được xác định bằng lượng mg MDA/kg thịt tôm:
T – giá trị TBARS (mgMDA/kg thịt tôm)
V1 – thể tích dung dịch TCA 7,5% đã dùng (mL)
V2 – thể tích dung dịch TBA 0,02M đã dùng (mL) a – nồng độ tương đương tớnh được từ đường chuẩn (àg/mL) m – khối lượng thịt tôm (g)
TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) trong các mẫu được xác định như mô tả của Nirmal và Benjakul (2010a) và được mô tả bằng hình 2.12
Làm nguội Đo độ hấp thụ quang
Hình 2.12: Sơ đồ quy trình xử lý tôm và đo quang 2.6.1.4 Thuyết minh quy trình
- Xay nhuyễn: Tôm được giã nhuyễn bằng cối sứ sau đó lấy 5,0g mẫu thịt tôm
- Phối trộn: tôm được trộn với 10(mL) dung dịch TCA 7,5%
- Lọc: loại bỏ cặn bả thu dịch lọc
- Phối trộn: dịch sau khi lọc (V 1 ) được trộn với V 2 dung dịch TBA 0,02M sao cho tổng V1 và V2 là 10ml
- Đun nóng: hỗn hợp được nung nóng 100 o C trong 15 phút,
- Làm nguội: làm nguội dưới vòi nước lạnh
- Đo sự hấp thụ: đo ở bước sóng 532nm bằng máy quang phổ
Giá trị TBARS được tính toán từ đường cong chuẩn của MDA (0-2ppm) và thể hiện theo mg MDA/kg thịt
2.6.2 Đánh giá sự thay đổi pH trong quá trình bảo quản
2.6.2.1 Sơ đồ quy trình Đo pH được thực hiện theo phương pháp của Lopez- Caballero et al (2005) và được mô tả theo hình 2.13 (Lopez, 2005a)
Hình 2.13: Quy trình xác định pH trong quá trình bảo quản 2.6.2.2 Thuyết minh quy trình
- Khuấy đều: 2g thịt tôm được trộn với 10mL nước cất,
- Ủ: hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút,
- Đo pH: được xác định bằng pH kế
Các mẫu sẽ được đo pH 1 ngày/lần trong suốt quá trình bảo quản
2.6.3 Xác định các chỉ tiêu vi sinh
Phương pháp xác định tổng vi sinh vật hiếu khí được thực hiện bằng cách đếm khuẩn lạc ở nhiệt độ 30 độ C, theo kỹ thuật đổ đĩa và tuân thủ TCVN 4884-1:2015 (ISO 4833-1:2013).
Xác định vi khuẩn Enterobacteriaceae bằng phương pháp phát hiện và định lượng Enterobacteriaceae bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc theo TCVN 5518-2:2007 (ISO 21528-2:2004)
Xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa bằng định lượng trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) trong thực phẩm bằng theo kỹ thuật đếm khuẩn lạc theo Số: 3347/2001/QĐ-BYT
2.6.4 Xác định các chỉ tiêu hóa lý
Xác định đạm toàn phần và protein bằng phương pháp xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô theo TCVN 3705:1990
Giá trị nitơ acid amin được xác định bằng phương pháp xác định hàm lượng nitơ axit amin theo TCVN 3708:1990
2.6.5 Phương pháp đánh giá cảm quan tôm
Phương pháp đánh giá cảm quan được sử dụng để khảo sát sự thay đổi hình thức bên ngoài, đặc biệt là màu sắc của tôm Nghiên cứu này áp dụng các mẫu cao trích và bảo quản tôm ở các ngày 0, 3, 5 và 7, đồng thời so sánh với mẫu đối chứng không xử lý bằng hóa chất.
Sự xuất hiện điểm đen ở tôm được đánh giá cảm quan dựa trên thang điểm 10
- Điểm 0: không có điểm biến đen nào, hoặc rất ít, dưới 20% diện tích bề mặt tôm bị ảnh hưởng
- Điểm 2: mức độ nhẹ, dưới 20% diện tích bề mặt tôm bị ảnh hưởng
- Điểm 4: trung bình, khoảng 20-40% diện tích bề mặt tôm bị ảnh hưởng
- Điểm 6: đáng chú ý, khoảng 40-60% diện tích bề mặt tôm bị ảnh hưởng
- Điểm 8: nghiêm trọng, khoảng 60-80% diện tích bề mặt tôm bị ảnh hưởng
- Điểm 10: rất nghiêm trọng, khoảng 80-100% diện tích bề mặt tôm bị ảnh hưởng
Các mẫu được đánh giá cảm quan điểm biến đen của tôm vào các ngày thứ 0; 3;
5; 7 của quá trình bảo quản lạnh Đối tượng cảm quan là sinh viên trường ĐH Sư phạm
Kỹ thuật TPHCM, gồm 15 người thử (n).
Phương pháp xử lý số liệu
Tất cả các số liệu được xử lý trên phần mềm SPSS 15.0 for Window Evaluation
Phiên bản của công ty IBM (Armonk, North Castle, New York, Hoa Kỳ) được báo cáo với giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn từ 3 lần thí nghiệm lặp lại song song Ý nghĩa thống kê của các kết quả đã được đánh giá thông qua phương pháp phân tích phương sai ANOVA và kiểm định Tukey HSD, với mức ý nghĩa p ≤ 0,05.