nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại buôn ma thuột

Khưu Phương Yến Anh 2007, Nghiên cứu khả năng enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học sư phạm TP.. Nguyễn

=======***=======

ĐẬU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Buôn Ma Thuột, năm 2010

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

=======***=======

ĐẬU THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT

Chuyên Ngành Sinh Học Thực Nghiệm

Mã Số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn: TS.Võ Thị Phương Khanh

Buôn Ma Thuột, năm 2010

[1] Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng enzyme

cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ, Luận

văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh

[2] Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học,

tập 3 : Enzyme và ứng dụng, Nxb Giáo dục, trang 45 – 94

[3] Nguyễn Thị Kim Cúc, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Lê

Văn Nhương (1999), Phân lập và ñịnh loại một số tính chất của chủng vi nấm,

xạ khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong quy trình xử lý vỏ cà phê , Báo cáo khoa

học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc; NXB KHKT; tr 206-213

[4] Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản

xuất enzyme cellulase của một số chủng vi sinh vật ưa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB

KHKT; tr 790-796

[5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (1978), Một

số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2,3, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật

[6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi

sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo dục

[7] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng

Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

học, Nhà xuất bản Khoa học kĩ thuật

[8] Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh

vật học, tập 2, NXB khoa học và kỹ thuật

[9] Lê Gia Hy, (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi streptomyces sinh

chất kháng sinh chống nấm gây bệnh ñạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam,

Luận án Phó tiến sĩ sinh học

[10] Nguyễn Lan Hương, Lê Văn Nhương, Hoàng Đình Hoà (1999);

Phân lập và hoạt hóa vi sinh vật ưa nhiệt có hoạt tính cellulase cao ñể bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo khoa học Hội

Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT, tr 531-535

[11] Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hoà, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn

một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa

học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT; tr 177-182

[12] Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh

tổng hợp Cellulase của Atinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công

Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT; tr 804- 809

[13] Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Một số tính chất

enzyme cellulase của xạ khuẩn Actinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị

Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT, tr 580-583

[14] Đinh Thị Kim Nhung (2005), Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ

cho việc tạo thành xenlulase của Acetobacter xylinum, Đại học Sư Phạm Hà Nội

2; Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, NXB KHKT

[15] Ngô Đại Nghiệp (2009), Giáo trình enzyme học, Trường Đại học

Quốc gia TP.Hồ Chí Minh

[16] Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng

(1982), Enzyme vi sinh vật, Nxb KH&KT

[17] Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB

Đại học Quốc gia Hà Nội

[18] Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện KH&CNVN Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính Viện Công Nghệ Môi

Trường, Viện KH&CNVN (2005), Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn

ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza cao, Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong

khoa học sự sống, NXB KHKT; tr 872-875

[20] GS.TS Nguyễn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh vật học công

nghiệp, NXB Giáo dục

[21] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà

xuất bản giáo dục

[22] Hồ Sĩ Tráng (2004), Cơ sở hoá học gỗ và cellulose tập 1,2, NXB

khoa học kỹ thuật Hà Nội

[23] Allister J Lyons, JR., and Thomas G Pridham (1965), Colorimetric

Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes, Journal of

bacteriology, American Society for Microbiology, 89(1), pp 159-169

[24] Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology (1989), Vol 4

[25] Becker, B., M.P Lechevalier and H.A.Lechevalier (1965), Chemical

composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyce, J.Appl Microbiol., 13, pp 236-243

[26] Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification

and identification of named taxe included in the International Stepmyces project,

Inter.J Syst Bac., 3, pp.139-148

[27] Faiez Alani, William A Anderson, Murray Moo-Young (2007), New isolate of Streptomyces sp with novel thermoalkalotolerant cellulases, Biotechnol Lett DOI 10.1007/s10529-007-9500-9 Original research paper

[28] Hung-Der Jang and Kuo-Shu Chen (2002), Production and

characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant

T3-1, World Journal of Microbiology & Biotechnology 19: 263–268, 2003 Kluwer Academic Publishers Printed in the Netherlands

[29] John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley , Stanley T Wikkiams, 1994, Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, Ninth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, p 605-703

[30] Lechevalier, M P and H.A.Lechevalier (1970) Chemical

composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes, Int J

System Bact., 20, pp 435-443

[31] Sherling, E.B and D.Gottlieb (1966), Methods for characterization

of Streptomyces species, Intern J Syst Bact., 16(3), pp 313-340

[32] Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of

an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes,

Applied microbiology, American Society for Microbiology., 13(1), pp 43-61 TP.Hồ Chí Minh

[33] Tresner, H.D., E.J.Buckus (1963), System of color wheels for

Streptomyces taxonomy, Appl.Microbiol, 11, pp 335-338

[34] Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes, vol.2 Classification, idetification

and description of the genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore

[35] Williams, S.T., M.Goodfellow, G.Alderson, E.M Wellington,

P.H.A.Sneath and M.J Sackin (1983), Numerical classification of Streptomyces and

related genera, J.Gen Microbiol., 129, pp.1743-1813

[36] Witt, D., W Liesack and E Stackebbandt (1989), Identification of

Streptomyces by 16S RNA Sequences and oligonucleotide probes, Recent

advances in microbial ecology, Tokyo, Japan Scientific Press

[37] Witt, D and E Stackebbandt (1990), Unification of the genera

Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443, System.Appl Microbiol., 13, pp 361- 371

Phụ lục 1: Đường chuẩn CMCase

Đường chuẩn CMCase

y = 1.2317x - 0.0066

R2 = 0.9789

00.20.40.60.8

Nồng ñộ

Phụ lục 2: Tương quan hàm lượng glucose(mg/ml) và chỉ số OD540n.m Nồng ñộ glucose (IU/ml) Chỉ số OD Trung bình OD Sai số

0.106 0.100

0.226 0.222

0.363 0.364

0.550 0.552

0.602 0.604

0.698 0.702

STT Chủng Chỉ số

OD 540n.m

Trung bình

OD

Nồng ñộ ñường khử(IU/ml)

Đường kính vòng thủy phân (mm)

Mức ñộ phân giải

0.695 0.702

0.705 0.579

32.0 29.0 26.0

Mạnh

0.924 0.903

0.857 0.702

33.0 30.0 30.0

Mạnh

0.996 0.987

0.953 0.780

30.0 28.0 29.0

Mạnh

0.741 0.891

0.819 0.672

31.0 28.0 30.0

Mạnh

0.775 0.750

0.770 0.632

37.0 30.0 25.0

Mạnh

1.193 1.081

1.132 0.926

32.0 31.0 30.0

Mạnh

1.046 1.090

1.065 0.871

35.0 36.0 31.0

Mạnh

0.624 0.684

0.671 0.551

18.0 23.0 22.0

Khá

0.980 0.960

0.948 0.776

20.0 22.0 20.0

Khá

0.622 0.602

0.638 0.525

28.0 30.0 25.0

Mạnh

0.656 0.568

0.601 0.495

29.0 25.0 20.0

Mạnh

0.525 0.616

0.562 0.463

20.0 18.0 20.0

Mạnh

Phụ lục 4: Khả năng chịu nhiệt của các chủng xạ khuẩn

Chủng Nhiệt ñộ Chỉ số OD

540n.m Trung bình Sai số

Nồng ñộ ñường khử(IU/ml)

A2

450C

0.858 0.910 0.920

500C

0.775 0.826 0.756

550C

0.536 0.436 0.551

600C

0.379 0.324 0.327

650C

0.392 0.445 0.438

C2

450C

0.750 0.706 0.739

500C

0.920 0.786 0.776

550C

0.773 0.758 0.782

600C

0.611 0.478 0.531

650C

0.781 0.753 0.774

C3

450C

0.903 0.740 0.757

500C

0.756 0.749 0.805

550C

0.532 0.556 0.536

600C

0.365 0.381 0.290

C4

450C

0.935 0.841 0.899

500C

0.803 0.861 0.928

550C

0.715 0.592 0.653

600C

0.541 0.519 0.560

650C

0.601 0.543 0.628

500C

1.029 1.064 1.022

550C

0.928 1.004 0.822

600C

0.389 0.342 0.330

650C

0.449 0.427 0.449

C7

450C

1.001 1.018 0.903

500C

0.729 0.673 0.676

550C

0.494 0.553 0.542

600C

0.332 0.316

650C

0.319 0.328 0.316

Ctm

450C

0.768 0.689 0.749

500C

0.817 0.906 0.860

550C

0.630 0.690 0.711

600C

0.548 0.519 0.437

650C

0.290 0.318 0.329

(IU/ml)

A2

55

0.470 0.381 0.425

0.137

0.00001

0.118

55

0.417 0.305 0.435

0.201

0.00096

0.170

C6

0.360

60

0.426 0.454 0.416

0.441

0.00113

0.365

Ctm

55

0.253 0.186 0.224

0.277

0.00160

0.231

Tốc ñộ sinh trưởng sau 5 ngày nuôi cấy (lần)

Average 0.731667 0.827333 0.771 0.54 0.769333 0.727867 Variance 0.000524 0.006465 0.000147 0.004483 0.000212 0.012144

Average 0.8 0.77 0.541333 0.345333 0.372 0.565733 Variance 0.008029 0.000931 0.000165 0.00236 0.001029 0.041068

Average 0.891667 0.864 0.653333 0.54 0.590667 0.707933 Variance 0.002249 0.003913 0.003782 0.000421 0.001886 0.023832

Average 1.204667 1.038333 0.918 0.353667 0.441667 0.791267 Variance 0.000792 0.000506 0.008356 0.000972 0.000161 0.121909

Average 0.974 0.692667 0.529667 0.325667 0.321 0.5686 Variance 0.003853 0.000992 0.000984 7.23E-05 3.9E-05 0.065473

Average 0.735333 0.861 0.677 0.501333 0.312333 0.6174 Variance 0.0017 0.001981 0.001767 0.003314 0.000404 0.040596

SUMMARY 5.5 6 6.5 7 7.5 8 Total

Sum 1.276 1.224 0.904 0.593 0.955 0.544 5.496 Average 0.425333 0.408 0.301333 0.197667 0.318333 0.181333 0.305333 Variance 0.00198 0.001668 0.000257 0.00038 0.00043 0.001246 0.009894

Average 0.368333 0.403333 0.25 0.314 0.341667 0.137 0.302389 Variance 0.000694 0.001433 0.000367 0.002647 0.00188 2.7E-05 0.009002

Sum 1.157 1.048 1.164 1.054 1.199 0.879 6.501 Average 0.385667 0.349333 0.388 0.351333 0.399667 0.293 0.361167 Variance 0.004961 0.004008 0.014128 0.00063 0.00201 0.000217 0.00441

Sum 1.038 1.012 1.064 0.845 0.975 0.604 5.538 Average 0.346 0.337333 0.354667 0.281667 0.325 0.201333 0.307667 Variance 0.011596 0.000449 0.001064 1.23E-05 0.000589 0.000961 0.004698

Sum 1.204 1.296 1.567 1.507 1.654 1.52 8.748 Average 0.401333 0.432 0.522333 0.502333 0.551333 0.506667 0.486 Variance 0.00453 0.000388 0.00053 0.00563 0.0019 0.00435 0.004927

Sum 0.843 1.12 1.305 1.346 1.246 1.322 7.182 Average 0.281 0.373333 0.435 0.448667 0.415333 0.440667 0.399 Variance 0.000763 0.001797 3.7E-05 0.000246 0.005406 0.003752 0.005003

Sum 0.663 0.909 0.858 1.023 0.926 0.832 5.211 Average 0.221 0.303 0.286 0.341 0.308667 0.277333 0.2895

SUMMARY 1%CMC 0.05%G:1%CMC 0.1%G:1%CMC 0.15%G:1%CMC 0.05%S:1%CMC 0.1%S:1%CMC 0.15%S:1%CMC Total

Sum 0.265 0.374 0.742 1.277 0.149 0.327 0.397 3.5 Average 0.088 0.124666667 0.24733333 0.425666667 0.049666667 0.109 0.132333333 0.2 Variance 0.004 7.23333E-05 0.00332033 0.001449333 0.001352333 0.001767 0.003282333 0

Sum 0.503 0.469 0.984 0.328 0.337 0.993 1.345 5 Average 0.168 0.156333333 0.328 0.109333333 0.112333333 0.331 0.448333333 0.2 Variance 0.007 0.000325333 0.019029 0.001336333 0.007765333 0.005059 0.002242333 0

Sum 0.676 0.712 1.021 1.368 0.384 1.017 0.832 6 Average 0.225 0.237333333 0.34033333 0.456 0.128 0.339 0.277333333 0.3 Variance 0.005 0.001170333 0.00484233 0.010612 0.001516 0.000189 0.000754333 0

Sum 0.293 0.475 0.557 0.608 0.457 0.433 0.332 3.2 Average 0.098 0.158333333 0.18566667 0.202666667 0.152333333 0.1443333 0.110666667 0.2 Variance 4E-04 0.001210333 0.00059633 4.93333E-05 3.23333E-05 0.0002003 0.000677333 0

C6

Sum 0.689 0.647 0.789 0.708 1.23 1.422 1.364 6.8 Average 0.23 0.215666667 0.263 0.236 0.41 0.474 0.454666667 0.3 Variance 0.008 0.007570333 0.015739 0.007141 0.080101 0.004548 0.041281333 0

Sum 0.721 0.406 0.412 0.518 0.439 0.412 0.26 3.2 Average 0.24 0.135333333 0.13733333 0.172666667 0.146333333 0.1373333 0.086666667 0.2 Variance 0.002 0.002725333 0.00047633 8.63333E-05 0.003644333 2.233E-05 8.13333E-05 0

Sum 1.058 0.787 1.35 0.274 2.216 1.462 0.829 8 Average 0.353 0.262333333 0.45 0.091333333 0.738666667 0.4873333 0.276333333 0.4 Variance 2E-04 0.011797333 0.001612 0.001256333 0.005841333 0.0128363 0.006946333 0

Sum 4.205 3.87 5.855 5.081 5.212 6.066 5.359 Average 0.2 0.184285714 0.27880952 0.241952381 0.248190476 0.2888571 0.255190476 Variance 0.01 0.005081514 0.01437796 0.021126148 0.063819362 0.0255856 0.026888562

LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên là Đậu Thị Dung, học viên lớp cao học Sinh Học thực nghiệm khóa II (2007-2010) trường ñại học Tây Nguyên Tôi xin cam ñoan ñây là luận văn tốt nghiệp do chính bản thân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của

TS Võ Thị Phương Khanh

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam ñoan trên

Người thực hiên:

Đậu Thị Dung

Xin chân thành cảm ơn!

ĐăkLăk, tháng 01 năm 2011

Học viên thực hiện

Đậu Thị Dung

MỤC LỤC

Trang

Mở ñầu 1

1 Đặt vấn ñề 1

2 Mục tiêu của ñề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

4 Giới hạn ñề tài 2

Phần I Tổng quan tài liệu nghiên cứu 3

I Vi sinh vật phân giải cellulose 3

1.1 Vi sinh vật phân giải cellulose hiếu khí 3 1.2 Vi sinh vật phân giải cellulose kỵ khí 4

II Đại cương về xạ khuẩn 5

2.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn 5 2.1.1 Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên……… 5 2.1.2 Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới ……….6 2.2 Hình thái, kích thước và cấu tạo xạ khuẩn 8 2.2.1 Đặc ñiểm hình thái, kích thước 8 2.2.2 Cấu tạo tế bào 9 2.3 Sinh sản ……….11 2.4 Phân loại ñịnh tên xạ khuẩn 12 2.4.1 Phân loại 12 2.4.1.1 Phương pháp phân loại truyền thống 13 2.4.1.1.1 Đặc ñiểm hình thái và tính chất nuôi câý 14 2.4.1.1.2 Đặc ñiểm hoá phân loại (Chemotaxonomy) 15 2.4.1.1.3 Đặc ñiểm sinh lý-sinh hoá 16 2.4.1.2 Phương pháp phân loại sinh học phân tử 17 2.4.1.3 Phân loại số (Numerical taxonomy) 17

III Cellulose và enzyme cellulase 18

iv

3.1 Cellulose 18 3.2 Enzyme cellulase 19 3.2.1 Cấu trúc 19 3.2.2 Ứng dụng 21

IV Tình hình nghiên cứu và ứng dụng xạ khuẩn ở trong và ngoài nước 23

4.1 Trên thế giới 24 4.2 Ở Việt Nam 24

Phần II Nội dung và phương pháp nghiên cứu 27

I Nội dung nghiên cứu 27

II Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 27

2.1 Vật liệu 27 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 27 2.1.2 Hoá chất 27 2.1.3 Thiết bị 27 2.2 Địa ñiểm nghiên cứu 28

III Phương pháp nghiên cứu 28

3.1 Phương pháp thu mẫu 28 3.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn chịu nhiệt phân giải cellulose 28 3.2.1 Môi trường phân lập 28 3.2.2 Pha loãng và cấy mẫu 28 3.3 Phương pháp mô tả một số ñặc ñiểm hình thái của các chủng xạ khuẩn

thu ñược 29 3.4 Phương pháp khảo sát khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ

khuẩn phân lập 29 3.4.1 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính enzyme cellulase của chủng xạ

khuẩn bằng ñường kính vòng phân giải [21, 14]……… 29 3.4.1.1 Nguyên tắc ……… 29 3.4.1.2 Tiến hành thí nghiệm……… 30 3.4.1.3 Đánh giá kết quả……… 30

3.4.2 Phương pháp xác ñịnh nồng ñộ ñường khử của dung dịch nuôi cấy

xạ khuẩn bằng phương pháp DNS (dinitro salicylic acid) [1, 12]……… 31 3.4.2.1 Nguyên tắc……… 31 3.4.2.2 Tiến hành thí nghiệm……… 31 3.4.2.3 Tính kết quả ………33 3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt tính

enzyme cellulose của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 33 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ……… 33 3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH ……… 33 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ glucose và saccharose bổ sung………….34 3.5.4 Nghiên cứu tốc ñộ sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn trên môi

trường có bổ sung ñường……….34 3.5.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy chủng xạ khuẩn

C2 bổ sung glucose 1% ñến hoạt tính enzyme cellulose……… 34 3.5.6 Định danh các chủng xạ khuẩn ưu thế ……….35

Phần III Kết quả và thảo luận 36

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn chịu nhiệt có khả năng sinh tổng hợp cellulose 36 3.1.1 Đặc ñiểm hình thái các chủng xạ khuẩn phân lập……… ……36 3.1.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose……….43 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ñến hoạt tính của enzyme

cellulase của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 46 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ……… 46 3.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường……… 48 3.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ ñường bổ sung 49 3.3 Định danh các chủng xạ khuẩn ưu thế 61

vi

Phần IV Kết luận và kiến nghị 63

I Kết luận 63

II Kiến nghị 64

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Trang Bảng 1.1 Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose hiếu khí trong tự nhiên 3 Bảng 1.2 Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose kỵ khí trong tự nhiên 4 Bảng 3.1 Đặc ñiểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty của các chủng xạ khuẩn chịu

nhiệt ñược phân lập 37 Bảng 3.2 Đánh giá khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập 43 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hoạt tính enzyme cellulase của các

chủng xạ khuẩn tuyển chọn 47 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính enzyme của các chủng xạ khuẩn 49 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ ñường bổ sung ñến tốc ñộ sinh trưởng và khả

năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 5 ngày nuôi cấy 51 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ bổ sung gluose ñến sự sinh trưởng của các

chủng xạ khuẩn tuyển chọn 56 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỉ lệ ñường bổ sung ñến hoạt tính enzyme cellulase

của các chủng xạ khuẩn 58 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy với tỉ lệ bổ sung glucose 1% ñến

hoạt tính enzyme cellulase của chủng xạ khuẩn C2 60

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Trang Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử cellulose 19 Hình 1.2 Cơ chế tác ñộng của enzyme cellulase …21 Hình 3.1 Khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập trên

môi trường thạch của các chủng C1 , C2 , C3 39 Hình 3.2 Khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập trên

môi trường thạch C4 , C5, C6 40 Hình 3.3 Khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập trên

môi trường thạch C7 , C8 , C9 41 Hình 3.4 Khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập trên

môi trường thạch C10 , C11 , C12 42 Hình 3.5 Khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn phân lập trên

môi trường thạch 45 Hình 3.6 Khả năng phân giải cellulose trên ñĩa thạch của các chủng tuyển chọn

với các tỷ lệ nguồn cacbon khác nhau 55

bã mía, mùn cưa kể cả trong rác thải sinh hoạt rất phong phú

Một phần nhỏ nguồn phế liệu này ñược sử dụng với mục ñích cung cấp nhiệt năng, một phần nhỏ dùng làm thức ăn gia súc nhưng hiệu quả rất thấp, phần lớn thải ra môi trường và gây ô nhiễm một cách nghiêm trọng vì

ñó là nơi trú ẩn của nhiều loại sâu hại và mầm bệnh

Xử lí chất thải hữu cơ bằng vi sinh vật ñể làm phân bón , bảo vệ môi trường rất ñược nhà khoa học, nhà sản xuất, nông dân quan tâm ĐăkLăk là một tỉnh có nhiều ưu thế về phát triển nông lâm nghiệp,nên xử lý phế thải của nông lâm nghiệp là việc làm hết sức cần thiết

Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật phân giải cellulose như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi.Trong ñó xạ khuẩn với những ñặc tính ưu việt như phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững, tạo ra các chất kháng sinh, vitamin, chịu ñược các biến ñộng bất lợi của môi trường… với nhiều công trình ñã và ñang ñược nghiên cứu

Như vậy việc nghiên cứu và tuyển chọn xạ khuẩn ưa nhiệt thích hợp sẽ giúp cho quá trình phân hủy vỏ, xác cà phê, rơm rạ, mùn cưa,… nhanh chóng

và hiệu quả, góp phần phát triển caphê bền vững, bảo vệ môi trường xung quanh và không làm ô nhiễm nguồn nước ngầm

Để giảm nhiễm môi trường do nguồn rác thải chứa nhiều cellulose, nguồn phế liệu này cần tích cực xử lý Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng ñáng chú ý vẫn là phương pháp sinh học [11] Trong phương pháp này các tác nhân sinh học từng ñược sử dụng là xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi ñể

phân giải cellulose thành các nguồn cacbon ñơn giản mà cây trồng dễ sử dụng

Tính chịu nhiệt và khả năng sinh tổng hợp cellulase cao là hai yếu tố quyết ñịnh hiệu quả của khả năng phân giải cơ chất của các vi sinh vật.Mặt khác, quá trình dị hoá là quá trình toả nhiệt nên thường làm môi trường cơ chất nóng lên Điều ñó càng ñòi hỏi tính chịu nhiệt cao của vi sinh vật phân giải

Trên cơ sở ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài "Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt thu thập tại Buôn Ma Thuột"

2 Mục tiêu của ñề tài

1 Tuyển chọn trong tự nhiên ở Buôn Ma thuột các chủng xạ khuẩn chịu nhiệt có khả năng sinh tổng hợp cellulase

2 Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố của môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính enzyme cellulase của các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt ñã tuyển chọn

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học

Thu thập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt phân giải cellulose ñể bảo tồn nguồn gen quý của vi sinh vật trong tự nhiên tại Buôn Ma thuột

- Ý nghĩa thực tiễn

Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp từ phế liệu nông lâm nghiệp thành các hợp chất ñơn giản dễ sử dụng ñối với cây trồng sẽ ñược sử dụng trong thành phần của phân hữu cơ vi sinh, ñáp

ứng nhu cầu phát triển bền vững của nền nông nghiệp ñịa phương

4 Giới hạn ñề tài

Do thời gian có hạn, chúng tôi chỉ phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn hiếu khí chịu nhiệt trong tự nhiên ở các ñống ủ vỏ cà phê, mụn cưa, rơm rạ

3

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

I Vi sinh vật phân giải cellulose

Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ cellulose nhờ có hệ enzyme cellulase ngoại bào Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật Việc tổng hợp cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những chất khác Do ñó, vi sinh vật phân giải cellulose có vai trò ñặc biệt quan trọng trong vòng tuần hoàn cacbon Sự phân giải tiến hành trong ñiều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiềm hoặc acid,

ñộ ẩm thấp hoặc cao và ở các nhiệt ñộ khác nhau Tất cả vi sinh vật tham gia

vô cơ hóa cellulose ñều thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulase xúc tác việc phân giải cellulose thành cellobioase và glucose Vi sinh vật dùng các hợp chất sinh ra này làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng

1.1 Vi sinh vật phân giải cellulose hiếu khí

Có rất nhiều nhóm vi sinh vật trông tự nhiên có khả năng tiết ra enzyme

ñể phân hủy cellulose như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, nấm lớn

Bảng 1.1: Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose hiếu khí trong tự

nhiên [22]

- Achromobacter - Micromonospera - Cytophaga - Basidiomycetes - Trichoderma

- Cellulomonas - Actinomyces - Polyangium - Fomes

- Cellvibrio - Streptomyces - Sorangium

- Bacillus - Streptosporang - Archangium

Trong các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose hiếu khí trong tự nhiên phải

kể ñến các vi sinh vật trong nhóm vi khuẩn ưa nhiệt như: Cellulomonas, Cellvibrio, nhóm xạ khuẩn ưa nhiệt như: Streptomyces, Actinomyces,… Người ta thường sử dụng xạ khuẩn ñặc biệt chi Streptomyces trong việc phân huỷ rác thải sinh hoạt, nông nghiệp… Những xạ khuẩn này thường thuộc nhóm chịu nhiệt, sinh trưởng, phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ 45 – 500C nên rất thích hợp với quá trình ủ rác thải [17]

Xạ khuẩn ñược nghiên cứu một cách sâu sắc vì nó có vai trò lớn trong quá trình hình thành ñất và cải tạo ñộ phì nhiêu của ñất Xạ khuẩn là sinh vật

dị dưỡng có thể sử dụng nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau như: ñường, tinh bột, lipit, aminoaxit, protein, ngoài ra chúng còn sử dụng cá nguồn dinh dưỡng nitơ vô cơ khác như; muối amon, urea, nitrat

1.2 Vi sinh vật phân giải cellulose kỵ khí

Phân giải cellulose kỵ khí còn gọi là sự lên men cellulose ñể tạo thành các sản phẩm như: ethanon, lactate, axetate, CO2 Các vi sinh vật phân giải cellulose kỵ khí chủ yếu sống trong dạ cỏ của các loài ñộng vật nhai lại ñược tóm tắt trong bảng 1.2 [22]

Bảng 1.2: Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose kỵ khí trong tự nhiên

Clostridium thermocellum

Có nhiều trong phân ñộng vật, có dạng hình que và chuyển thành dạng uốn cong khi trưởng thành, kích thước khá dài, bào

tử sinh ra ở một ñầu của tế bào

Clotridium omelianski Trực khuẩn, kích thước 0.5 x 4 – 9 µm

Ruminococcus flavefaciens

Cầu khuẩn, sống trong dạ cỏ ñộng vật nhai lại, gram âm, thường xếp tạo thành chuỗi, có khả năng sinh sắc tố vàng

Ruminococcus albus Liên cầu khuẩn, sống trong dạ cỏ ñộng

vật nhai lại

5

Cellobacterium cellulosovens Trực khuẩn, không sinh bào tử, gram âm,

sống trong dạ cỏ ñộng vật nhai lại

II Đại cương về xạ khuẩn

2.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm Prokaryotes, chưa có nhân

giống như vi khuẩn Tuy vậy, ña số tế bào xạ khuẩn lại có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh phức tạp và có nhiều màu sắc giống như nấm mốc

2.1.1 Sự phân bố và ý nghĩa của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong ñất, trong nước ao hồ, một phần trong bùn và trong các cơ chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn khác và nấm mốc không phát triển ñược [17] Xạ khuẩn

có nhiều nhất trong lớp ñất bề mặt, số lượng xạ khuẩn trong ñất không chỉ phụ thuộc vào loại ñất mà còn phụ thuộc vào mức ñộ canh tác của ñất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu dinh dưỡng và lớp ñất trên bề mặt (40cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn Số ñơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của

xạ khuẩn trong 1g ñất canh tác thường ñạt tới hàng triệu mầm xạ khuẩn, trong ñất hoang hoá chỉ khoảng 10.000-100.000 Số lượng xạ khuẩn trong ñất cũng thay ñổi theo thời gian trong năm [1,19]

Xạ khuẩn cũng thường sống trên các cây chết, rơm rạ, thường hoại sinh nhưng có thể kí sinh ở thân cây, ở củ và rễ cây Một số nghiên cứu cũng cho thấy

sự có mặt của xạ khuẩn trong trầm tích biển như các loài Actinomyces halophila,

Actinomyces mortivalis và Actinomyces iraquensis [19], Streptomyces như Streptomyces antibioticus (MU106, MU107) và Streptomyces rimosus (MU114)

hoặc trong các mẫu nước và bùn ao nuôi trồng thủy sản ñặc biệt là ở lớp bùn nơi xác các hợp chất hữu cơ lắng ñọng nhiều

Xạ khuẩn ñược nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên, tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp

chất trong ñất, trong nước, chúng có vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong ñất Bên cạnh ñó chúng còn sản sinh nhiều sản phẩm trao ñổi chất quan trọng nên ñã ñược dùng ñể sản xuất nhiều loại enzim như proteaza, amilaza, xenlulaza, glucoizomeraza, vitamin và các axít hữu cơ [6] Do có các loại enzim này nên chúng phân giải ñược các hợp chất bền vững như kitin, xenluloza, lignin… [23] Một ñặc ñiểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh có 60-70% xạ khuẩn phân lập ñược từ ñất có khả năng này Trong

số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện ñã ñược biết ñến trên thế giới thì trên 80% ñược tạo ra từ xạ khuẩn Một số xạ khuẩn (thuộc chi Frankia) có thể tạo nốt sần trên rễ một số cây không thuộc bộ Đậu và có khả năng cố ñịnh nitơ không khí thành dạng dễ sử dụng cho cây [6] Tuy nhiên, bên cạnh những xạ khuẩn có ích thì một số ít xạ khuẩn kị khí hoặc vi hiếu khí có thể gây bệnh cho người, cho ñộng vật và cho cây trồng Chúng sống trên rễ cây hoặc củ và gây bệnh, nhất là ở vùng ñất kiềm, ñất cát khi thời tiết khô hạn, làm cho củ lở loét, sần sùi ngay từ ngoài ñồng ruộng Các chủng Streptomyces spp sinh ñộc tố phytotoxin ảnh hưởng lớn tới mùa vụ, do chúng có thể tồn tại trong ñất trên 10 năm

2.1.2 Vị trí của xạ khuẩn trong sinh giới

Trước ñây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà vi sinh học do nó có những ñặc ñiểm vừa giống vi khuẩn, vừa giống nấm Trước thế kỉ 19, xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm nấm

Về sau, khi ñã nghiên cứu sâu hơn người ta ñã tìm ra các bằng chứng về mối liên hệ giữa xạ khuẩn và vi khuẩn như:

1 Một số xạ khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium

2 Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào

xạ khuẩn không chứa xenluloza

7 Tương tự với vi khuẩn, xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng axít của môi trường, ñặc ñiểm này không có ở nấm

8 Các ñặc ñiểm về sợi và nang bào tử lớn (sporangium) của chi Actinoplanes cho thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp

Từ những ñặc ñiểm trên, nên xạ khuẩn ñược xếp vào nhóm vi khuẩn thật Eubacteria [27]

Vị trí của nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) ñược xác ñịnh như sau: Năm 1978, Gibbbens và Murray chia các vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 4 ngành là ngành Gracilicutes (gồm các vi khuẩn Gram âm), ngành Tenericute (gồm xạ khuẩn và các vi khuẩn Gram dương), ngành Mendosicutes gồm các vi khuẩn không chứa Peptidoglican trong thành tế bào, và ngành Mollicutes gồm các vi khuẩn chưa có thành tế bào

Năm 1980, Woese và cộng sự chia vi khuẩn nhân nguyên thuỷ thành 2 giới

là giới vi khuẩn thật (Eubacteria) (tương ñương với 3 ngành Gracilicutes, Tenericute, Mollicutes theo Gibbbens và Murray) và giới vi khuẩn cổ (Archaebacteria) (tương ñương với ngành Mendosicutes) [6]

Xạ khuẩn thuộc về nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), lớp Actinobacteria,

bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện