nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn sinh iaa đến sự nảy mầm và sinh trưởng phát triển của đậu cô-ve tại buôn ma thuột

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN LÊ THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN SINH IAA ĐẾN SỰ NẢY MẦM VÀ SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA ĐẬU CÔVE TẠI BUÔN MA THUỘT CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGH



LÊ THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN SINH IAA ĐẾN SỰ NẢY MẦM VÀ SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA ĐẬU CÔVE TẠI BUÔN MA THUỘT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN



LÊ THỊ HƯỜNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN SINH IAA ĐẾN SỰ NẢY MẦM VÀ SINH TRƯỞNG PHÁT TRIỂN CỦA ĐẬU CÔVE TẠI BUÔN MA THUỘT

CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người HDKH: TS Võ Thị Phương Khanh

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Người cam ñoan

Lê Thị Hường

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc ñến:

TS Võ Thị Phương Khanh, người ñã dạy dỗ, gần gũi, tận tình hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường cũng như thời gian thực hiện ñề tài

Ban giám hiệu cùng toàn thể quý thầy cô trường THPT Tôn Đức Thắng ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp Quý thầy cô trong trường, các thầy cô trong khoa Khoa học tự nhiên và công nghệ, ñặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Sinh ñã nhiệt tình truyền ñạt cho tôi những kiến thức quý báu suốt ba năm học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại học Tây Nguyên

Các thầy cô giáo, cán bộ, nhân viên quản lý phòng thí nghiệm ñã tạo ñiều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện ñề tài

Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè, các bạn học viên lớp Sinh học thực nghiệm K03,… ñã ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài

Xin chân thành cảm ơn!

BMT, ngày 06 /10 / 2011

Học viên

Lê Thị Hường

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn sinh IAA 3

1.1.1 Đại cương về vi khuẩn sinh IAA 3

1.1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn 7

1.1.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ 7

1.1.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 7

1.1.2.3 Nước và ñộ ẩm môi trường 8

1.2 Auxin – chất kích thích sinh trưởng thực vật 8

1.2.1 Nguồn gốc 8

1.2.2 Cấu trúc hoá học và sự sinh tổng hợp 9

1.2.3 Tính chất sinh lý của auxin 10

1.2.3.1 Hoạt ñộng trong sự kéo dài tế bào 10

1.2.3.2 Hoạt ñộng trong sự phân chia tế bào 11

1.2.3.3 Hoạt ñộng trong sự phát sinh hình thái (rễ, chồi, quả) 11

1.3 Tổng quan tài liệu về cây ñậu Côve 13

1.3.1 Phân loại 13

1.3.2 Nguồn gốc và phân bố 13

1.3.3 Một số ñặc ñiểm sinh vật học của ñậu Côve 13

1.3.4.Yêu cầu sinh thái của cây ñậu Côve 14

1.4 Tình hình nghiên cứu 15

1.4.1 Nghiên cứu trong nước 15

1.4.2 Nghiên cứu trên thế giới 16

1.5 Điều kiện tự nhiên của Buôn Ma Thuột 18

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nội dung 19

2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 19

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh IAA ảnh hưởng ñến sinh trưởng của cây mầm ñậu Côve 19

2.3.1.1 Tạo dung dịch thí nghiệm 19

2.3.1.2 Xác ñịnh nồng ñộ vi khuẩn trong dung dịch 20

2.3.1.3 Xác ñịnh phương trình tương quan giữa chỉ số OD 530nm và nồng ñộ IAA (mg/l) 20

2.3.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn sinh IAA lên sự sinh trưởng cây mầm ñậu Côve 21

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn sinh IAA ñược tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng, phát triển của ñậu Côve 21

3.3.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng ñộ vi khuẩn sinh IAA ñược tuyển chọn ñến sự nảy mầm và sinh trưởng cây mầm ñậu Côve 21

3.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và số lần tưới của vi khuẩn sinh IAA ñược chọn ñến sinh trưởng phát triển cây ñậu Côve ……… 22

3.3.2.3 Phương pháp ñánh giá vi sinh vật ñất sau nuôi trồng ñậu Côve 24

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn ñược tuyển chọn ñể ñịnh danh và nhân nuôi sinh khối 25

3.3.3.1 Mô tả hình thái, màu sắc và ñặc ñiểm khuẩn lạc 25

3.3.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 25

3.3.3.3 Phương pháp xác ñịnh hoạt tính catalaza 26

3.3.3.4 Phương pháp xác ñịnh khả năng cố ñịnh nitơ phân tử 26

3.3.3.5 Phương pháp xác ñịnh ñường cong sinh trưởng 26

3.3.3.6 Phương pháp xác ñịnh nhiệt ñộ thích hợp của chủng vi khuẩn sinh IAA 27

3.3.3.7 Phương pháp xác ñịnh pH thích hợp của chủng vi khuẩn sinh IAA 27

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh IAA ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng cây mầm ñậu Côve 28

3.1.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn ñến tỷ lệ nảy mầm của hạt 28

3.1.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn ñến sinh trưởng của cây mầm 30

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của chủng vi khuẩn sinh IAA ñược tuyển chọn (chủng T5) lên sinh trưởng, phát triển của ñậu Côve 34

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng ñộ vi khuẩn T5 ñến sự nảy mầm 34

3.2.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng ñộ vi khuẩn T5 ñến sự sinh trưởng cây mầm ñậu Côve 36

3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và số lần tưới vi khuẩn T5 ñến sinh trưởng phát triển cây ñậu Côve 42

3.2.3.1 Ảnh hưởng ñến số lượng lá và diện tích lá 42

3.2.3.2 Ảnh hưởng ñến khả năng ra hoa và ñậu quả 43

3.2.3.3 Ảnh hưởng ñến chiều dài, ñường kính quả, năng suất, 47

3.2.3.4 Ảnh hưởng ñến số lượng nốt sần rễ ñậu Côve 51

3.2.4 Đánh giá lượng vi sinh vật ñất sau nuôi trồng ñậu Côve 53

3.3 Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn T5 ñể ñịnh danh và nhân nuôi sinh khối 55

3.3.1 Định danh vi khuẩn chủng T5 55

3.3.2 Xác ñịnh vi khuẩn Gram 55

3.3.3 Hoạt tính catalaza của vi khuẩn chủng T5 56

3.3.4 Nghiên cứu khả năng cố ñịnh nitơ phân tử của vi khuẩn chủng T5 57

3.3.5 Xác ñịnh ñường cong sinh trưởng của vi khuẩn chủng T5 57

3.3.6 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn chủng T5 59

3.3.7 Ảnh hưởng của pH ñến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn T5 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 Kết luận 64 Kiến nghị 64

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Kí hiệu các nghiệm thức theo nồng ñộ và số lần tưới dịch thí nghiệm 23 Bảng 3.1 Tương quan giữa nồng ñộ vi khuẩn và IAA trong dung dịch nuôi cấy 28 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn ñến tỉ lệ nảy mầm của hạt Côve 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn ñến chiều dài rễ, số rễ con và chiều dài thân mầm của cây ñậu Côve 31 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn ñến khối lượng khô rễ và thân mầm 33 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng ñộ vi khuẩn T5 ñến tỉ lệ nảy mầm của hạt ñậu 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng ñộ vi khuẩn ñến chiều dài rễ,

số rễ con và chiều dài thân mầm của cây ñậu Côve 40 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng ñộ vi khuẩn T5 ñến trọng lượng khô của rễ và thân mầm 41 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn chủng T5 và số lần tưới ñến số lượng

lá và diện tích lá của cây ñậu Côve 43 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng ñộ vi khuẩn và số lần tưới ñến thời gian bắt ñầu

ra hoa, số hoa/ chùm, tỉ lệ ñậu quả 45 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng ñộ vi khuẩn và số lần tưới ñến chiều dài, ñường kính quả và năng suất, khối lượng khô của cây 49 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nồng ñộ vi khuẩn và số lần tưới ñến số lượng nốt sần

rễ ñậu Côve 52 Bảng 3.12 Tổng số vi sinh vật trước và sau khi tưới dịch vi khuẩn 54 Bảng 3.13 Đặc ñiểm khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn chủng T5 55

Bảng 3.14 Sự biến ñộng OD610nm của dung dịch nuôi cấy vi khuẩn T5 theo thời gian 59 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự sinh trưởng của vi khuẩn T5 60 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của pH ñến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn T5 61 Bảng 3.17 Khả năng sinh IAA của chủng vi khuẩn ñược tuyển chọn trên các môi trường nuôi cấy 63

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các nhóm vi khuẩn có khả năng sinh IAA 6 Hình 1.2 Công thức hóa học của IAA 9 Hình 1.3 Hoạt ñộng của IAA trong sự kéo dài tế bào 10

Hình 3.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn sinh IAA ñến tỉ lệ nảy mầm của hạt ñậu Côve 30 Hình 3.2 Chiều dài rễ mầm, thân mầm và số lượng rễ con sau 3 ngày……….38 Hình 3.3 Chiều cao thân mầm sau 5 ngày 39 Hình 3.4 Thí nghiệm sử dụng dung dịch vi khuẩn T5 nồng ñộ 1010 CFU/ml với

số lần tưới khác nhau lên ñất trồng ñậu Côve 46 Hình 3.5 Thí nghiệm tưới 3 lần các dung dịch khác nhau lên ñất trồng ñậu Côve 46 Hình 3.6 Kích thước quả ñậu 50 Hình 3.7 Bộ rễ ñậu Côve sau khi trồng 52 Hình 3.8 Vi sinh vật tổng số ở nghiệm thức tưới dịch vi khuẩn T5 1, 2, 3 lần nồng ñộ vi khuẩn 1010 CFU/ml 53 Hình 3.9 Hình khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn chủng T5 55 Hình 3.10 Tế bào vi khuẩn T5 nhuộm Gram âm 56

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu ñồ 3.1 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn chủng T5 59

Biểu ñồ 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sự sinh trưởng vi khuẩn T5 60

Biểu ñồ 3.3 Ảnh hưởng của pH ñến sự sinh trưởng vi khuẩn T5 ………62

MỞ ĐẦU

Sự sinh trưởng và phát triển của thực vật chịu nhiều tác ñộng của các yếu tố bên trong cũng như bên ngoài môi trường sống bao gồm nguồn dinh dưỡng, nước, nhiệt ñộ, ẩm ñộ, ánh sáng, các chất ñiều hòa sinh trưởng, …[26] Mỗi yếu

tố có một vai trò ñối với ñời sống của thực vật Chất ñiều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong việc ñiều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển, các hoạt ñộng sinh lý của thực vật ngay từ lúc noãn bào ñược thụ tinh phát triển thành phôi cho ñến cây ra hoa, kết quả và kết thúc chu kỳ sống của mình

Hiện nay, bằng con ñường hóa học, con người cũng ñã tổng hợp nên hàng loạt các chất có hoạt tính sinh lý tương tự chất ñiều hòa sinh trưởng của thực vật Các chất này rất phong phú và ñã có những ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp [26] Tuy nhiên việc sử dụng các chất ñiều hòa sinh trưởng nhân tạo không ñúng nguyên tắc sẽ ảnh hưởng ñến môi trường, giảm chất lượng nông sản, gây hại ñến sức khỏe người tiêu dùng

Trong tự nhiên, ngoài thực vật, một nhóm vi sinh vật cũng có khả năng tạo

ra chất kích thích sinh trưởng cho thực vật vào môi trường ñất và có tác dụng trực tiếp lên cây trồng, góp phần tăng năng suất, chất lượng nông sản, ñảm bảo

an toàn cho người tiêu dùng [58], [59] Đó là nhóm vi khuẩn có khả năng tổng

hợp IAA (indol acetic acid) hoặc GA (gibberellin) thuộc chi Rhizobium,

Azotobacter, Azospirrillum, Bradyrhizobium, …[7], [27], [29], [30], [37]

Đăk Lăk là một trong các tỉnh Tây Nguyên có tiềm năng phát triển nông nghiệp có tổng diện tích tự nhiên 1.312.537 ha, trong ñó ñất nông nghiệp chiếm 533.404 ha thích hợp cho nhiều loại cây trồng khác nhau kể cả các cây họ ñậu

Để tạo ñiều kiện cho việc thâm canh các cây họ ñậu hiệu quả nhưng vẫn ñảm

bảo tính bền vững môi trường sinh thái, ñề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của vi

khuẩn sinh IAA ñến sự nảy mầm và sinh trưởng phát triển của ñậu Côve tại Buôn Ma Thuột ” ñược thực hiện

- Xác ñịnh các chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA ñược phân lập tại Buôn

Ma Thuột, góp phần ñánh giá sự ña dạng của vi sinh vật ñất ở Tây Nguyên

- Đánh giá vai trò của một số vi khuẩn trong tự nhiên ñối với sự nảy mầm của hạt cũng như ñối với sự sinh trưởng, phát triển ở ñậu Côve

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả ñề tài góp phần vào việc sử dụng các vi khuẩn có khả năng sinh IAA và giúp sự phát triểnnền nông nghiệp theo hướng bền vững, có thể giảm sử dụng chất kích thích sinh trưởng nhân tạo cho cây trồng, từ ñó ñảm bảo an toàn cho người sử dụng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn sinh IAA

1.1.1 Đại cương về vi khuẩn sinh IAA

Vi sinh vật là sinh vật có cấu tạo ñơn giản, kích thước rất nhỏ bé nhưng số lượng của chúng trong môi trường vô cùng lớn Vi khuẩn trong ñất là một nhóm

vi sinh vật sử dụng nguồn dinh dưỡng nitơ lấy từ môi trường có từ xác ñộng thực vật Đặc biệt một số loài có khả năng sử dụng nitơ từ không khí Những vi khuẩn này có vai trò quan trọng ñối với cây trồng góp phần phát triển nền nông nghiệp bền vững Ngoài ra, một số vi khuẩn cố ñịnh ñạm còn có khả năng sinh tổng hợp IAA (indol acetic acid) là chất kích thích sinh trưởng ở thực vật Đó là vi khuẩn

thuộc chi Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobacter, Azospirrillum, [8], [20],

[23], [25], [39], [43], [47], [48], [51], [58], [60]

- Rhizobium sp là vi khuẩn cố ñịnh nitơ cộng sinh với rễ cây bộ ñậu (còn

gọi là vi khuẩn nốt sần), dạng hình que có khả năng di ñộng hoặc hình que phân nhánh mất khả năng di ñộng

Vi khuẩn nốt sần thuộc loại hiếu khí, ưa pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt

ñộ thích hợp từ 28 - 300C, theo khóa phân loại Bergey thì có phạm vi nhiệt ñộ rộng hơn, ñộ ẩm từ 60 - 80%, có khả năng sử dụng nitơ không khí, ñặc biệt là khả năng sinh IAA kích thích sự sinh trưởng, phát triển của cây trồng qua sự hình thành lông rễ và kéo dài rễ

Vi khuẩn nốt sần khi còn non có tế bào hình que, kích thước vào khoảng 0,5

- 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, bắt màu ñồng ñều và có khả năng di ñộng nhờ tiên mao, khi già vi khuẩn nốt sần trở nên bất ñộng Lúc ñó, tế bào trở nên bắt màu từng ñoạn, chúng thường có dạng hình cầu di ñộng hoặc không di ñộng

Trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, chi Rhizobium là nhóm mọc nhanh Trên môi trường ñặc, Rhizobium thường có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, vô màu

Chất nhầy do vi khuẩn nốt sần sinh ra là polysaccharit cấu tạo bởi các hexose, pentose và acid uronic

Mỗi loại vi khuẩn nốt sần chỉ nhiễm lên một nhóm cây nhất ñịnh trong bộ

Đậu Ở Việt Nam, vi khuẩn nốt sần Điền thanh hoa vàng (S.cannabana) có thể tạo nốt sần trên cây Điền thanh hoa tròn (S.paludosa) và ngược lại Đôi khi vi

khuẩn nốt sần xâm nhập vào loại ñậu không ñặc hiệu với chúng, khi ñó ít nốt sần ñược tạo ra và khả năng cố ñịnh nitơ yếu [8], [30]

- Bradyrhizobium: cũng là vi khuẩn nốt sần, hiếu khí, có thể phát triển

ñược trong trường hợp chỉ có áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm, pH thích hợp

từ 6,5 - 7,5 Sự sinh trưởng của chúng bị hạn chế khi pH hạ thấp ñến 4,5 - 5,0 hoặc nâng lên 8,0 Nhiệt ñộ thích hợp từ 25 - 300C, ở 370C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt [8], [9], [32], [45]

Trên môi trường ñặc, khuẩn lạc vi khuẩn có dạng trơn, bóng, nhầy, không màu, ñường kính không quá 1mm Vi khuẩn Bradyrhizobium hình que, có kích

thước là 0,5 - 0,9 * 1,2 - 3,0 µm

- Azotobacter sp là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí sống tự do trong ñất,

không sinh bào tử, có khả năng cố ñịnh nitơ phân tử

Tế bào Azotobacter sp có hình cầu hoặc hình que Khi còn non, tế bào hình

que, sinh sản theo kiểu trực phân, di ñộng nhờ tiên mao mọc quanh cơ thể Bên cạnh các tiên mao khá dài còn có những khuẩn mao nhỏ bé Về già, tế bào

Azotobacter sp mất khả năng di ñộng, kích thước thu nhỏ thành hình cầu ñược

bao bọc bởi lớp vỏ nhầy dày và tạo thành nang xác Khi gặp ñiều kiện thuận lợi, nang xác nứt ra, tạo thành các tế bào mới Khuẩn lạc có dạng hình cầu lồi, nhầy, nhẵn, có khi nhăn nheo Khi già khuẩn lạc màu vàng lục, hồng, nâu ñen; ñây là

một tiêu chuẩn phân loại của loài Azotobacter sp

Azotobacter sp Thích hợp với pH 7,0 - 8,2 và chúng ít tồn tại trong môi

trường ñất chua có pH < 5,6 - 5,8 [8], [36], [37] Azotobacter sp ñòi hỏi một ñộ

ẩm khá cao của ñất tương tự như nhu cầu của cây trồng Tuy vậy bào xác của

Azotobacter sp chịu ñược rất lâu sự khô hạn của ñất

Nhiệt ñộ thích hợp nhất ñối với sự phát triển của Azotobacter sp khoảng 26

- 300C Ở vùng nhiệt ñới, Azotobacter sp thích hợp với những nhiệt ñộ cao hơn

Ở 70C, Azotobacter sp cố định nitơ thấp hơn 5 lần so với ở nhiệt độ 450C Tế

bào dinh dưỡng của Azotobacter sp khơng tồn tại khi xử lý ở nhiệt độ 500C trong 30 phút, ở 800C vi khuẩn sẽ chết rất nhanh

Trong đất, Azotobacter sp tập trung ở vùng gần rễ cây, cĩ tác dụng tăng cường thức ăn nitơ cho cây trồng Tác dụng của Azotobacter sp đối với cây

trồng cịn được chứng minh ở khả năng kích thích sinh trưởng của chúng đến sự

nảy mầm và sinh trưởng của mầm hạt Azotobacter sp cĩ khả năng tiết vào mơi

trường các vitamin, acid amin cũng như các chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA, gibberelin) [6], [8], [13], [35], [36], [37], [44]

- Azospirillum: vi khuẩn gram âm, dạng xoắn, sống tự do, cố định nitơ phân

tử, được phát hiện từ năm 1974 Những vi khuẩn thuộc giống Azospirillum sống

tự do hoặc kết hợp với rễ của cây ngũ cốc và một số loại cỏ Vi khuẩn chuyển động trong mơi trường lỏng nhờ một tiên mao ở đầu Trong mơi trường đặc ở

300C, nhiều tiên mao bên ngắn hơn được thành lập Những hạt Poly β hydroxybutyrate (PHB) cĩ màu hồng lấp đầy hầu hết những tế bào vi khuẩn và khuẩn lạc

Sự tăng sinh Azospirillum xảy ra dưới cả 2 điều kiện hiếu khí và kỵ khí với

sự hiện diện hoặc khơng của hợp chất nitơ trong mơi trường Nhiệt độ tối thích của vi khuẩn là 35 - 370C Những khuẩn lạc Azospirillum trên mơi trường khoai

tây- agar cĩ màu hồng nhạt hoặc đậm, thường cĩ nếp gấp và khơng cĩ chất nhầy

Một số dịng Azospirillum là vi sinh vật tự dưỡng khơng bắt buộc Vi khuẩn

Azospirillum phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ như malate,

succinate hoặc pyruvate Fructose và những đường đơi khác cũng cĩ thể được vi khuẩn sử dụng làm nguồn carbon, vi khuẩn khơng sử dụng đường đơn khác Một

số dịng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của chúng [8]

Azospirillum sống thành tập đồn ở vùng rễ của nhiều lồi thực vật vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới Ngồi khả năng cố định nitơ, chúng cịn cĩ khả năng khử nitrat, chống lại vi khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm

Azospirillum có khả năng sinh tổng hợp các hormone tương tự hormone

sinh trưởng của thực vật như IAA, gibberelin, cytokinin Azospirillum có thể

kích thích thực vật sinh trưởng bởi sự kích thích hình thành rễ, tăng ñộ dài rễ [12], [27], [28], [40], [61]

Hình 1.1 Các nhóm vi khuẩn có khả năng sinh IAA

A: Vi khuẩn Rhizobium sp B: Vi khuẩn Bradyrhizobium

C: Vi khuẩn Azotobacter sp D: Vi khuẩn Azospirillum

1.1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn

1.1.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Nhiệt ñộ ảnh hưởng sâu sắc ñến sự sinh trưởng của vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật có khả năng phát triển trong một giới hạn nhiệt ñộ nhất ñịnh Phần lớn các vi sinh vật là ưu ấm, nhiệt ñộ thích hợp vào khoảng 20 - 400C, tối ưu: 30 - 370C

Nhiệt ñộ thấp thường không gây chết vi sinh vật ngay mà tác ñộng lên khả năng chuyển hoá các hợp chất, làm ức chế hoạt ñộng của các hệ enzyme, thay ñổi khả năng trao ñổi chất của chúng Vì thế, vi sinh vật mất khả năng phát triển

và sinh sản, nhiều trường hợp sẽ bị chết Khả năng gây chết của nhiệt ñộ thấp chậm và từ từ, không ñột ngột như ở nhiệt ñộ cao Dựa vào ñặc tính này, người

ta tiến hành cất giữ thực phẩm, bảo quản giống vi sinh vật ở nhiệt ñộ thấp

Nhiệt ñộ cao thường gây chết vi sinh vật một cách nhanh chóng Đa số vi sinh vật bị chết ở 60 - 800C Một số khác chết ở nhiệt ñộ cao hơn Đặc biệt bào

tử có khả năng tồn tại ở nhiệt ñộ trên 1000C Nhiệt ñộ cao thường gây biến tính protein, làm hệ enzyme lập tức không hoạt ñộng ñược, vi sinh vật dễ dàng bị tiêu diệt Lợi dụng ñặc ñiểm này, người ta tiến hành những phương pháp sấy khô thực phẩm, phương pháp tiệt trùng,… [8], [17]

1.1.2.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Vi sinh vật sống và phát triển trong môi trường lỏng chịu ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp của các ion H+ và OH- Độ pH ñược ño bằng nồng ñộ các ion H+

và OH- trong dung dịch [17]

Mỗi vi sinh vật ñều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất ñịnh Vi sinh vật

ưa acid (acidophile) có pH cho sinh trưởng tốt từ 0 - 5,5 ; ñối với vi sinh vật ưa trung tính: pH = 5,5 - 8,0 ; ñối với vi sinh vật ưa kiềm: pH = 8,5 - 11,5 Vi sinh vật ưa kiềm cực ñoan có mức sinh trưởng tối ưu ở pH = 10 hay cao hơn nữa Nhìn chung, các nhóm vi sinh vật khác nhau ñều có phạm vi pH sinh trưởng riêng của mình Phần lớn vi khuẩn và ñộng vật nguyên sinh ưa pH trung tính Mặc dầu vi sinh vật thường có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH khá rộng, nhưng tính chịu ñựng của chúng cũng có giới hạn nhất ñịnh Khi pH trong

tế bào chất có sự thay ñổi ñột ngột sẽ phá vỡ màng sinh chất hoặc làm ức chế hoạt tính của enzyme hay protein vận chuyển màng, do ñó làm tổn thương ñến vi sinh vật [8], [17]

1.1.2.3 Nước và ñộ ẩm môi trường

Cơ thể vi sinh vật chứa 80 - 98% nước nên hầu hết quá trình sống của vi sinh vật ñều có liên quan ñến nước Nước và ñộ ẩm của môi trường là yếu tố quan trọng Đa số vi sinh vật thuộc loại ưa nước, chúng cần nước tự do ñể hấp thu Khi môi trường thiếu nước sẽ xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào, vi sinh vật trao ñổi chất bị giảm và tế bào bị chết Vì thế trong công nghệ vi sinh cần coi nước là nguồn nguyên liệu quan trọng, các môi trường lên men hoặc môi trường nuôi cấy cần một lượng nước rất lớn Đối với ñộ ẩm môi trường, từ 55 - 60% là thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật [8]

1.2 Auxin – chất kích thích sinh trưởng thực vật

1.2.1 Nguồn gốc

Năm 1880, Darwin ñã phát hiện bao lá mầm của cây họ hòa thảo rất nhạy cảm với ánh sáng Nếu chiếu sáng một chiều thì gây quang hướng ñộng, nhưng nếu che tối hoặc bỏ ñỉnh ngọn thì hiện tượng trên không xảy ra Darwin cho rằng ngọn bao lá mầm là nơi tiếp nhận kích thích của ánh sáng

Năm 1926, một sinh viên tốt nghiệp ñại học tại Hà Lan tên Fritz Went ñã công bố phương pháp phân lập chất kích thích tăng trưởng bằng cách ñặt những khối thạch trắng bên dưới ñỉnh của lá bao mầm trong một thời gian nhất ñịnh sau

ñó lấy ra và ñặt vào thân cây khác ñã bị bấm ngọn Sau khi ñặt các khối thạch

ñó, các thân cây bị bấm ngọn bắt ñầu tăng trưởng trở lại Năm 1928, Went ñã triển khai một phương pháp ñịnh lượng chất kích thích tăng trưởng này Went thường ñược biết ñến như người tiên phong sử dụng thuật ngữ “auxin”, nhưng thật sự phải kể ñến Kogl và Haagen - Smit Họ là những người ñã tinh chế ñược hỗn hợp axít auxentriolic (auxin A) từ nước tiểu của người vào năm 1931 Sau

ñó, Kogl ñã phân lập ñược những hỗn hợp khác từ nước tiểu có cấu trúc và chức năng tương tự auxin A, trong ñó có IAA

Indole acetic acid (IAA) thường ñược hình thành gần ñỉnh tăng trưởng và sau

ñó ñi xuống phần dưới của cây Quá trình ñó khiến cho các lá non mọc dài hơn IAA ñã kích thích cây cối phát triển hướng theo ánh sáng và phát triển bộ rễ Vào năm 1954, hội ñồng các nhà sinh lý học thực vật ñược thành lập ñể ñịnh danh cho các nhóm auxin Thuật ngữ này xuất phát từ tiếng Hy Lạp, có nghĩa là “tăng trưởng” Các hợp chất ñược gọi chung là auxin nếu chúng ñược tổng hợp trong các loại thực vật và là những chất chia sẻ những hoạt ñộng tương

tự với IAA [11], [26]

1.2.2 Cấu trúc hoá học và sự sinh tổng hợp

Hình 1.2 Công thức hóa học của IAA

Auxin là một hợp chất hữu cơ tương ñối ñơn giản, có nhân indole, công thức là: C10H9O2N, ñược gọi là acid β-indol-acetic

Auxin ñược tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm và cả ở vi khuẩn Ở thực vật bậc cao, IAA ñược tổng hợp chủ yếu ở ñỉnh chồi ngọn và từ

ñó ñược vận chuyển xuống dưới với vận tốc 0,5 - 1,5cm/giờ

Sự vận chuyển của auxin trong cây có tính chất phân cực rất nghiêm ngặc, tức là chỉ vận chuyển theo hướng gốc Chính vì vậy càng xa ñỉnh ngọn, hàm lượng auxin càng giảm, tạo nên một gradien nồng ñộ giảm dần của auxin từ ñỉnh ngọn xuống gốc của cây Ngoài ñỉnh ngọn ra auxin còn ñược tổng hợp ở các cơ quan còn non khác như lá non, quả non, phôi hạt ñang sinh trưởng, mô phân sinh tầng phát sinh Quá trình tổng hợp auxin xảy ra thường xuyên và mạnh mẽ ở trong cây dưới xúc tác của các enzyme ñặc hiệu Acid β-Indol Acetic là loại

auxin phổ biến trong cây, ñược tổng hợp từ tryptophan bằng con ñường khử amin, carboxyl và oxy hóa[11], [26]

1.2.3 Tính chất sinh lý của auxin

Auxin can thiệp vào nhiều quá trình sinh học của cây Hoạt ñộng của nó tuỳ thuộc vào nồng ñộ và các sự tương hỗ qua lại của auxin với các chất ñiều hoà khác Một số hoạt ñộng chính của auxin bao gồm:

1.2.3.1 Hoạt ñộng trong sự kéo dài tế bào

Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào ở ngọn chồi Sự kéo dài tế bào là một quá trình phức tạp, kết hợp nhiều hiện tượng: hấp thu nước; dãn dài vách với sức trương; ñặt các hợp chất mới của vách giữa các mạng vi sợi cellulose; sinh tổng hợp protein và các chất khác

Hình 1.3 Hoạt ñộng của IAA trong sự kéo dài tế bào

Vai trò của auxin là gây nên sự giảm pH của thành tế bào bằng cách hoạt hóa bơm proton ( H+) nằm trên màng ngoại chất Khi có mặt của auxin thì bơm proton hoạt ñộng và bơm H+ vào thành tế bào làm giảm pH và hoạt hóa enzyme xúc tác cắt ñứt các cầu nối ngang của các polysaccarit Enzyme tham gia vào quá trình này là pectinmetylesterase, khi hoạt ñộng sẽ metyl hóa các nhóm carboxyl

và ngăn chặn cầu nối ion giữa nhóm carboxyl với calxi ñể tạo nên pectat calxi,

do ñó mà các sợi cellulose tách rời nhau

Ngoài ra, auxin cũng kích thích sự tổng hợp các mRNA - các chất ribosome tham gia vào sự tổng hợp các chất protein

1.2.3.2 Hoạt ñộng trong sự phân chia tế bào

Kích thích sự phân chia tế bào tượng tầng

Auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng (tầng phát sinh libe - mộc), nhưng hầu như không tác ñộng trên mô phân sinh sơ cấp Như vậy, auxin tác ñộng trên sự tăng trưởng theo ñường kính

Ở nồng ñộ cao, auxin kích thích sự tạo mô sẹo từ các tế bào sống nhờ vào chất “histogene” (là chất tạo ra nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn) Đây là ñặc tính tốt ñược áp dụng trong nuôi cấy tế bào

Phân hoá mô dẫn

Auxin kích thích phân chia của tượng tầng, ñồng thời giúp sự phân hoá của các mô dẫn (libe và mạch mộc) Auxin có khả năng cảm ứng trực tiếp sự phân hoá tế bào nhu mô thành các tổ chức mô dẫn

1.2.3.3 Hoạt ñộng trong sự phát sinh hình thái (rễ, chồi, quả)

Kích thích phát triển chồi

Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng ñộ cao, auxin ngăn cản sự phát triển của phát thể chồi vừa thành lập hay chồi nách, các chồi bây giờ vào trạng thái tiềm sinh

Auxin gây hiện tượng ưu thế ngọn Hiện tượng ưu thế ngọn là hiện tượng phổ biến trong cây Khi chồi ngọn hoặc rễ chính sinh trưởng sẽ ức chế sinh trưởng của chồi bên và rễ bên Ðây là một sự ức chế tương quan vì khi loại trừ

ưu thế ngọn bằng cách cắt bỏ chồi ngọn hoặc rễ chính thì cành bên hoặc rễ bên ñược thoát khỏi ức chế và lập tức sinh trưởng Nguyên nhân: auxin ñược tổng hợp chủ yếu ở ngọn chính và vận chuyển xuống dưới làm cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin nên bị ức chế sinh trưởng Khi cắt ngọn chính, lượng auxin tích luỹ trong chồi bên giảm sẽ kích thích chồi bên sinh trưởng

Kích thích phát triển rễ

Auxin ở nồng ñộ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thể non của rễ), nhưng cản sự tăng trưởng của các sơ khởi này Đặc tính này ñược ứng dụng phổ biến trong giâm cành Sự hình thành rễ phụ trong giâm cành có thể chia làm 3 giai ñoạn: giai ñoạn ñầu phản phân hoá tế bào trước tầng phát sinh, tiếp theo xuất hiện mầm rễ và cuối cùng mầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc thủng vỏ ra ngoài Giai ñoạn ñầu cần hàm lượng auxin cao, giai ñoạn rễ sinh trưởng cần ít auxin và có khi không cần có auxin

Kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt

Tế bào trứng sau khi thụ tinh tạo nên hợp tử và phát triển thành phôi Phôi hạt là nơi tổng hợp auxin nội sinh quan trọng sẽ khuyếch tán vào bầu, kích thích

sự sinh trưởng của bầu ñể hình thành quả Việc xử lý auxin ngoại sinh cho hoa sẽ thay thế ñược nguồn auxin nội sinh vốn ñược hình thành trong phôi và do ñó không cần quá trình thụ phấn thụ tinh nhưng bầu vẫn lớn lên thành quả Trong trường hợp này quả không qua thụ tinh và do ñó không có hạt

Kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây

Auxin ức chế sự hình thành tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốn ñược cảm ứng bởi các chất ức chế sinh trưởng Vì vậy cung cấp auxin ngoại sinh có thể giảm sự rụng lá, tăng sự ñậu quả và hạn chế rụng nụ, quả non làm tăng năng suất [11], [18], [26]

1.3 Tổng quan về cây ñậu Côve

1.3.3 Một số ñặc ñiểm sinh vật học của ñậu Côve

Cây ñậu Côve thân thảo hàng năm, hoặc thân leo, thân bụi Ở dạng thân bụi, cây thấp, chỉ cao 50 - 60cm, ít ñốt, sinh trưởng hữu hạn

Hệ rễ gồm rễ chính ăn sâu khoảng 25 - 40 cm và nhiều rễ phụ phân bố chủ yếu ở tầng mặt 20 - 30 cm, trong phạm vi bán kính 50 - 70 cm Trên rễ ñậu

Côve có vi khuẩn nốt sần cố ñịnh ñạm (Rhizobium bacteria), góp phần cung cấp

thêm chất ñạm cho cây và tăng ñộ màu mỡ cho ñất

Lá thật thuộc loại lá kép gồm 3 lá chét Chiều dài cuốn lá bằng ñộ dài phiến

lá, gân lá phân bố ñều trên các thùy lá, lá mọc cách trên thân, màu xanh hoặc xanh vàng, phiến lá phẳng và hơi nhám

Hoa ñậu Côve thuộc hoa cánh bướm, mọc thành chùm, hoa lưỡng tính gồm

10 nhị ñực, trong ñó có 9 nhị bao quanh nhụy cái, 1 nhị riêng rẽ ở vị trí cao hơn Khi hoa nở là quá trình thụ tinh ñã kết thúc Màu sắc hoa có thể là trắng, hồng,

ñỏ hoặc tím tùy giống Hoa chủ yếu tự thụ phấn

Quả dài từ 8 - 20 cm màu xanh hoặc vàng tùy theo giống, quả thẳng, quả bóng (quả non có thể có lông), mỗi quả có 4 - 8 hạt, hạt hình trứng, hơi tròn, chiều dài 5 - 8 mm, rộng 4 - 5 mm, nặng 0,3 - 0,5g Vỏ hạt màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, một số giống hạt có hỗn hợp nhiều màu trắng, ñen, nâu, cà phê sữa,… Hạt ñậu Côve chứa lượng protein khá cao, khoảng trên 20%

Thời gian sinh trưởng của các giống ñậu lùn từ 80 - 100 ngày, ñậu leo từ

100 - 120 ngày, năng suất quả tươi trung bình 15 - 20 tấn/ha [3]

Đậu Côve chủ yếu ñược dùng làm rau ăn, có giá trị dinh dưỡng cao Trong quả non chứa 2,5% ñạm, 0,5% chất béo, 7% chất ñường bột, nhiều chất khoáng (Ca, Fe, P,…), nhiều loại vitamin ( ñặc biệt là vitamin A, B1, B2, C) [3]

1.3.4 Yêu cầu sinh thái của cây ñậu Côve

- Khí hậu: ñậu Côve thích hợp khí hậu ấm áp, ôn hòa, không thích hợp nhiệt

ñộ cao; khả năng chịu rét kém

- Nhiệt ñộ: hạt ñậu có thể nảy mầm ở nhiệt ñộ khoảng 100C, thích hợp nhất

từ 25 - 300C Cây sinh trưởng, phát triển trong phạm vi 15 - 250C Khi nhiệt ñộ cao trên 300C thường gây rụng nụ, rụng hoa Ở giai ñoạn quả hình thành và phát triển, nhiệt ñộ thích hợp khoảng 20 - 270C

- Ánh sáng: thiếu ánh sáng năng suất ñậu thường bị giảm Đậu Côve dạng cây

bụi có khả năng chịu bóng hơn dạng leo Lá ñậu Côve có ñặc tính xoay chuyển ñể tăng khả năng sử dụng ánh sáng hoặc tránh sánh sáng có cường ñộ cao

- Lượng nước: ñậu Côve có khả năng chịu hạn và chịu úng kém, trừ một số

giống ñậu lùn có khả năng chịu hạn khá Khi thiếu nước cây sinh trưởng kém, hoa rụng nhiều, quả nhỏ và nhiều xơ

- Độ ẩm ñất: thích hợp cho cây ñậu Côve từ 70 - 80% Giai ñoạn cây có 2 -

3 lá thật và khi ra hoa kết quả rất cần ñủ ñộ ẩm

- Đất ñai: cây ñậu Côve có thể trồng trên nhiều loại ñất nhưng tốt nhất là

trồng trên loại ñất thịt nhẹ, ñất thịt pha cát, tơi xốp và thoát nước tốt Độ pH thích hợp của ñất trồng là 6,0 - 6,5

- Dinh dưỡng: nhu cầu của cây ñậu Côve khá lớn, ngoài các ña lượng như

ñạm, lân, kali …, còn cần các nguyên tố trung vi lượng như : Calxi, Mangan, Kẽm, Sắt,…[3]

1.4 Tình hình nghiên cứu

1.4.1 Nghiên cứu trong nước

Năm 2003, Phạm Việt Cường và cộng sự (Viện Công nghệ Sinh học) ñã

nghiên cứu về khả năng tạo IAA của một số chủng vi khuẩn chi Bacillus Kết

quả cho thấy khả năng tổng hợp IAA của các chủng nghiên cứu thay ñổi tùy theo chủng giống, môi trường nuôi cấy và một số nhân tố khác [4]

Vũ Thúy Nga và cộng sự tại Viện KHKT Nông nghiệp Việt Nam (2003), nghiên cứu ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn và môi trường nuôi cấy ñến khả

năng tổng hợp IAA của vi khuẩn Bradyrhizobium Nhóm tác giả kết luận: “ Khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn Bradyrhizobium không phụ thuộc vào mật ñộ

vi khuẩn mà phụ thuộc vào chủng giống vi khuẩn, môi trường nuôi cấy, hàm

lượng tryptophan Mức ñộ phân giải phosphat vô cơ của Bradyrhizobium phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy” [16]

Năm 2003, Phạm Bích Hiên và Phạm Văn Toản (Viện KHKT Nông nghiệp

Việt Nam) ñã nghiên cứu và tuyển chọn ñược một số chủng Azotobacter ña hoạt

tính, có khả năng sinh IAA sử dụng làm phân vi sinh chức năng Hầu hết các

chủng Azotobacter chroococcum thử nghiệm ñều có khả năng sinh trưởng, phát

triển tốt ở nhiệt ñộ 25 - 300C, pH: 5,5 - 8,0 và trong môi trường có nguồn ñường thay thế là rỉ ñường [10]

Tại Trung tâm Giống Nông nghiệp cây trồng, Thành phố Cần Thơ, Lăng

Ngọc Dậu (2003) nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillum

lipoferum Trong ñiều kiện có tryptophan, sau 2 ngày nuôi, một số chủng tổng

hợp ñược nhiều IAA ( > 10ppm) [5]

Năm 2003, Phạm Văn Toản (Viện KHKT Nông nghiệp Việt Nam), nghiên cứu hiệu quả sử dụng phân bón chứa hỗn hợp vi sinh vật có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng ñối với cà chua, khoai tây, ñậu phộng [22]

Năm 2008, Nguyễn Kim Anh và Phạm Thị Ngọc Anh (Trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng), ñã phân lập và tuyển chọn ñược 08 chủng vi khuẩn thuộc chi

Azotobacter có khả năng cố ñịnh ñạm và sinh tổng hợp IAA từ 30 mẫu ñất của

thôn Bình Kỳ- Hòa Quý - Ngũ Hành Sơn - thành phố Đà Nẵng [1]

Năm 2010, Cao Bình ñã phân lập 23 chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA

từ ñất trồng và rễ cây ñậu phộng, ñậu tương, ñậu Côve và ngô Sau khi ñánh giá khả năng sinh IAA của các chủng ñã chọn ñược 11 chủng vi khuẩn Thời gian nuôi cấy thích hợp ñể các chủng vi khuẩn sinh IAA mạnh nhất trong môi trường Nfb với nồng ñộ tryptophan phù hợp là khác nhau giữa các chủng khác nhau [2]

1.4.2 Nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về các chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA, từ vi khuẩn sống cộng sinh ở nốt sần của rễ cây ñến vi khuẩn sống tự

do trong ñất như: Rhizobium, Azotobacter, Azospirrillum, Bradyrhizobium,…

[41], [42], [46], [48], [49], [52], [55], [57], [62]

Năm 1986, Paola Barbieri và Tiziano Zanelli (Ytalia), nghiên cứu ảnh

hưởng của vi khuẩn Azospirillum brasilense Sp6 lên lúa mì Khi lúa mì ñược nhiễm chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense Sp6, số lượng và chiều dài rễ bên

tăng lên ñáng kể: 15,67 rễ bên và 18,80 cm so với ñối chứng không nhiễm vi khuẩn: 8,25 rễ bên và 5,78 cm [56]

Năm 1996, Elazar Fallik’ và Yaacove Okon (Iran), nghiên cứu ảnh hưởng

của vi khuẩn sinh IAA Azospirillum brasilense lên sự tăng trưởng của ngô Thí

nghiệm ñược tiến hành trong ñiều kiện nhà kính, ngô ñược xử lý với vi khuẩn

Azospirillum brusilense cho kết quả tăng chiều cao thân, trọng lượng khô cây và

tăng trọng lượng hạt [38]

Năm 2000, Maria Guineth Torres - Rubio (Colombia) cùng cộng sự ñã phân

lập ñược một số chủng Azotobacter và Pseudomonas có khả năng sinh IAA từ vùng rễ cây lúa Lượng IAA do vi khuẩn Azotobacter và Pseudomonas sinh ra

biến ñộng: 3,5 - 32,2 mg/l sau 3 ngày nuôi cấy [54]

Năm 2001, Vivek Kumar và cộng sự (Ấn Độ), nghiên cứu ảnh hưởng của vi

khuẩn sinh IAA Azotobacter chroococcumlên sinh trưởng và phát triển cây lúa

mì Kết quả nghiên cứu cho thấy những nghiệm thức ñược xử lý với vi khuẩn

sinh IAA Azotobacter chroococcumcó trọng lượng hạt (1000 hạt) tăng 11,4%; trọng lượng rơm tăng 11,3% so với ñối chứng không dùng vi khuẩn [63]

Năm 2007, Gh Abbas Akbari và cộng sự (Iran) ñã phân lập và tuyển chọn

ñược một số chủng Azosopirrillum sp có khả năng sinh tổng hợp IAA kích thích

sinh trưởng cây lúa mì IAA ñược sinh ra bởi một số chủng vi khuẩn

Azosopirrillum sp là ñộng lực giúp cây sinh trưởng, hình thành rễ tốt [27]

Năm 2009, Fabricio Cassan và cộng sự (Argentina), nghiên cứu ảnh hưởng

của 2 chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense Az39 và Bradyrhizobium

japonicum E109 ñến sự nảy mầm, sinh trưởng thân mầm của ñậu tương và bắp

Các nghiệm thức ñược xử lý ñộc lập hay kết hợp 2 chủng vi khuẩn trên ñều cho chiều dài rễ và trọng lượng khô thân cao hơn so với ñối chứng không sử dụng vi khuẩn [40]

Năm 2009, Mandira Malhotra và Sheela Srivastava (Ấn Độ), nghiên cứu

ảnh hưởng của vi khuẩn sinh IAA Azospirillum brasilense SM lên sự sinh trưởng, phát triển của lúa miến Khi lúa miến ñược nhiễm vi khuẩn Azospirillum

brasilense SM sau 2 tuần gieo trồng cho chiều dài rễ mầm: 7,8 cm, thân mầm:

19,2 cm, số lượng rễ con: 24,5 rễ con so với ñối chứng không sử dụng vi khuẩn

có chiều dài rễ mầm: 6,12 cm, chiều dài thân mầm 19,0 cm, và 17 rễ con [53] Năm 2011, B.S Saharan và V Nehra (Ấn Độ), nghiên cứu ảnh hưởng của các vi khuẩn vùng rễ ñến sự sinh trưởng, phát triển của cây Kết quả nghiên cứu

cho thấy vi khuẩn Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm, thúc ñẩy cây sinh

trưởng, tăng năng suất thu hoạch [59]

1.5 Điều kiện tự nhiên của Buôn Ma Thuột

Mang nét ñặc trưng của khí hậu Tây Nguyên, Thành phố Buôn Ma Thuột

có hai mùa mưa và khô rõ rệt Trong ñó, mùa mưa kéo dài từ tháng 5 ñến hết tháng 10, có ñặc ñiểm mưa nhiều, lượng mưa lớn, tập trung, trung bình 69,9 mm/tháng, 1.830 - 2.200 mm/năm Mùa khô kéo dài từ tháng 11 ñến tháng 4 năm sau Vào mùa khô do trải qua giai ñoạn nắng nóng 6 tháng liên tục với số giờ nắng qua các năm biến ñộng từ 1.966 - 2.487,5 giờ Điều này thuận lợi cho quá trình quang hợp và hạn chế sự phát triển của sâu bệnh trên các loại cây trồng như rau, nhưng mùa khô thường gây hạn hán Do ñó thiếu nước tưới cho trồng trọt do lượng mưa quá ít, mạch nước ngầm giảm thấp và quá trình thoát hơi nước quá nhanh

Nhiệt ñộ trung bình các tháng trong năm giao ñộng từ 23,60C - 260C, tốc ñộ gió từ 1,3 - 4,7 m/s

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh IAA cao T5, P5, V1 phân lập trong ñất trồng và rễ cây ñậu tương, ñậu phộng, ñậu Côve của Easup, Đắk lắk

- Hạt giống ñậu Côve ñược bán tại thị trường (giống TLP - 68)

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu

- Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học thực nghiệm - Khoa Khoa học Tự Nhiên và Công nghệ, trường Đại học Tây Nguyên

- Vườn thực nghiệm của Khoa Nông Lâm nghiệp, trường Đại học Tây Nguyên

- Thời gian nghiên cứu: tháng 09/ 2010 ñến tháng 09/2011

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh IAA ảnh hưởng ñến sinh trưởng của cây mầm ñậu Côve

Thực hiện trên 3 chủng vi khuẩn sinh IAA : T5, P5, V1

2.3.1.1 Tạo dung dịch thí nghiệm

- Môi trường nhân nuôi Nfb (g/l): KH2PO4 0,5g, MgSO4.7H2O 5g, NaCl 0,2g, CaCl2.2H2O 0,02g, KOH 4,5g, Biotin 0,01g, acid malic 5g, Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N: 3ml, FeEDTA 1,64%: 10ml Vi lượng: 2ml (MgS04.7H2O 0,2g/l, H3BO3 1,4g/l, ZnSO4 0,12g/l, CuSO4 0,04g/l,

Na2MoO4.2H2O 1g/l), nước cất không ñạm 1000ml, pH = 6,8

- Chuẩn bị môi trường lỏng trong các bình tam giác, 200ml/bình Khử trùng

ở áp suất 1atm, trong 30 phút Để nguội, cấy chủng vi khuẩn vào các bình, lắc

200 vòng/phút, nhiệt ñộ phòng

- Sau 5 ngày nuôi cấy, thu dung dịch, xác ñịnh nồng ñộ tế bào vi khuẩn (CFU/ml), nồng ñộ IAA (mg/lít)

2.3.1.2 Xác ñịnh nồng ñộ vi khuẩn trong dung dịch

Dùng phương pháp ño OD610nm và ñếm khuẩn lạc trên ñĩa petri ñể xây dựng phương trình ñường chuẩn về mối tương quan giữa chỉ số OD610nm và nồng ñộ tế bào trong dung dịch nuôi cấy vi khuẩn Dựa vào phương trình ñường chuẩn, xác ñịnh nồng ñộ vi khuẩn qua chỉ số OD tương ứng

2.3.1.3 Xác ñịnh phương trình tương quan giữa chỉ số OD 530nm và nồng ñộ IAA (mg/l)

- Chuẩn bị dung dịch ñệm Phosphat(200ml)

A: KH2PO4 0,136 g/100ml nước cất

B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất

39ml A+ 61 ml B và cho thêm nước cất vừa ñủ 200ml, ñiều chỉnh pH =7

- Chuẩn bị thuốc thử Salkowski

553ml H2SO4 (98%) và nước cất ñủ 1 lít, ñể nguội sau 12 giờ ñược dung dịch H2SO4 ñậm ñặc 10,8 M

Cân 4,5g FeCl3 cho vào 1 lít H2SO4 10,8 M ñã pha ở trên ñể ñược thuốc thử Salkowski

- Xây dựng phương trình ñường chuẩn IAA

Phương trình xác ñịnh mối tương quan giữa chỉ số OD530nm và nồng ñộ IAA (mg/l) trong dung dịch nuôi cấy vi khuẩn

Cân 16 mg IAA tổng hợp hòa tan với 100ml dung dịch ñệm Phosphat ñược nồng ñộ 160mg/l, sau ñó tiến hành pha loãng ra các nồng ñộ 0, 5, 10, 16, 20, 40,

80 (mg/l)

4ml thuốc thử ñược cho vào các ống nghiệm có nồng ñộ IAA khác nhau có thể tích 2ml, mỗi nồng ñộ lặp lại 3 lần

Ủ 10 phút ở nhiệt ñộ phòng ñể phản ứng xảy ra hoàn toàn Đo OD530nm

Từ kết các quả trên, xác ñịnh ñược phương trình ñường chuẩn của dung dịch IAA thông qua chỉ số OD530nm

2.3.1.4 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn sinh IAA lên sự sinh trưởng cây mầm ñậu Côve

- Hạt ñậu Côve có trọng lượng: 400hạt/100g Chọn các hạt ñồng ñều, chắc

- Rửa hạt bằng nước sạch nhiều lần Ngâm hạt trong dung dịch thí nghiệm

12 giờ Gieo hạt trong các chậu nhựa chứa cát ñã rửa sạch Chậu nhựa có ñường kính 8cm, cao 10cm Lượng cát cho vào mỗi chậu 300g

- Bố trí thí nghiệm: hạt ñược ngâm trong các dung dịch sau:

+ Chủng T5: với các nồng ñộ tế bào 1011, 1010, 109, 108 CFU/ ml

+ Chủng P5: với các nồng ñộ tế bào 1011, 1010, 109, 108 CFU/ ml

+ Chủng V1: với các nồng ñộ tế bào 1011, 1010, 109, 108 CFU/ ml

+ Dung dịch IAA ( 1,5 ppm )

+ Nước

- Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Tỉ lệ nảy mầm (%) = (Số hạt nảy mầm/ tổng số hạt gieo) x 100

+ Chiều dài rễ, thân mầm (mm)

+ Số lượng rễ con

+ Trọng lượng tươi, khô của rễ, thân mầm sau 5 ngày gieo trồng (mg)

2.3.2 Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn sinh IAA ñược tuyển chọn lên sự nảy mầm của hạt và sinh trưởng, phát triển của ñậu Côve

2.3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian ngâm hạt và nồng ñộ vi khuẩn sinh IAA ñược tuyển chọn ñến sự nảy mầm và sinh trưởng cây mầm ñậu Côve

Chọn chủng tốt nhất trong 3 chủng vi khuẩn T5, P5, V1 qua kết quả thí nghiệm trên ñể tiến hành thí nghiệm

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh IAA: Nfb

- Các khoảng thời gian ngâm hạt trong dung dịch nuôi cấy vi khuẩn sinh IAA: 8, 12, 16, 20 giờ

- Các nồng ñộ vi khuẩn trong dung dịch nuôi cấy: 1010, 109, 108, 107CFU/ml

- Các nghiệm thức ñối chứng: dung dịch IAA 1,5 ppm, dung dịch Nfb, nước Mỗi chậu thí nghiệm gieo 5 hạt Mỗi nghiệm thức thực hiện 15 chậu Phun nước 2 lần/ngày Mỗi lần phun 2ml/chậu Theo dõi và lấy số liệu từ 1 - 5 ngày sau gieo trồng

- Các chỉ tiêu theo dõi

+ Tỉ lệ nảy mầm (%) = (Số hạt nảy mầm/ tổng số hạt gieo) x 100

+ Chiều dài rễ, thân mầm (mm)

+ Số lượng rễ con

+ Trọng lượng tươi, khô của rễ, thân mầm sau 5 ngày gieo trồng (mg)

2.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ và số lần tưới của vi khuẩn sinh IAA ñược chọn ñến sinh trưởng phát triển cây ñậu Côve

+ Chậu nhựa có ñường kính 25cm, sâu 30cm, có ñục lỗ nhỏ

+ Lượng ñất trong các chậu trồng ñậu ñồng nhất và 10 kg/chậu

+ Số lần tưới dịch trong giai ñoạn sinh trưởng của cây ñậu: 1 lần, 2 lần, 3 lần + Dung dịch của từng nghiệm thức ñược dùng ñể ngâm hạt 16 giờ trước khi gieo và tưới vào ñất trồng ñậu Gieo 2 hạt/chậu, tưới 5 ml/chậu/lần

- Chế ñộ tưới nước: Tùy vào ñiều kiện thời tiết, mỗi ngày tưới 1-2 lần, lượng nước vừa ñủ ñộ ẩm cho ñất 70 - 80%

- Chế ñộ phân bón: phân tổng hợp N-P-K có hàm lượng 16-16-8 vào thời

kỳ 15, 30, 45 ngày sau gieo trồng Sử dụng: 40g NPK/lít nước, phun 5ml/chậu

- Bố trí thí nghiệm: về nồng ñộ và số lần tưới theo các nghiệm thức sau:

Bảng 2.1 Ký hiệu các nghiệm thức theo nồng ñộ và số lần tưới dịch thí nghiệm

Dung dịch và nồng ñộ

xử lý

Số lần tưới dịch

Ký hiệu nghiệm thức

+Thời gian ra hoa: khi có 50% số cây nở hoa

+ Số hoa trên chùm: xác ñịnh trên 9 chùm Tính 2 ñợt

+ Tỉ lệ ñậu quả (%) = ( Số quả ñếm ñược/Số hoa ñếm ñược) * 100

+ Đường kính quả (mm), chiều dài quả (cm)

+ Năng suất quả tươi thu hoạch: ở các lần thu hoạch (g)

+ Trọng lượng khô của cây (mg): mẫu ñược sấy ở nhiệt ñộ 700C cho ñến khi trọng lượng mẫu không ñổi

+ Số nốt sần/cây

2.3.2.3 Phương pháp ñánh giá vi sinh vật ñất sau nuôi trồng ñậu Côve

* Môi trường nuôi cấy

- Môi trường ñịnh lượng vi khuẩn (nước thịt pepton): pepton 10g, nước mắm 20ml, agar 20g, nước 1.000ml

- Môi trường ñịnh lượng xạ khuẩn (Gause): tinh bột tan 20g, K2HPO4 3g, MgSO4 3g, KNO3 1g, FeSO4 0,01g, NaCl 0,5g, agar 20g, nước 1000ml, pH = 7,2

- Môi trường ñịnh lượng nấm mốc (PGA): khoai tây 200g, glucose 20g, agar 20g, nước 1000ml, pH = 6,5

* Thu mẫu ñất

Đất cách bề mặt 5 - 10cm ñược lấy bằng dụng cụ và túi polyetylen (PE) vô trùng Mỗi nghiệm thức gồm 10 chậu trồng ñậu, lượng ñất thu 100g/nghiệm thức Đồng nhất mẫu, phân tích vi sinh vật tổng số

Thời ñiểm thu mẫu ñất: trước khi gieo hạt và sau khi thu hoạch

* Pha loãng mẫu theo hệ số thập phân

Cân 10g mẫu cho vào bình tam giác có chứa 90 ml dung dịch nước muối 0,1% vô trùng, lắc ñều hỗn hợp trong 10 phút Dùng micropipet có ñầu típ vô trùng hút 1ml dung dịch mẫu trên vào một ống nghiệm có chứa 9 ml dung dịch nước muối 0,1% vô trùng ta ñược ñộ pha loãng 10-1 Tiếp tục tiến hành tượng tự

ta ñược các ñộ pha loãng từ 10-1 ñến 10-5 Mọi thao tác ñều phải thực hiện trong ñiều kiện vô trùng

* Cấy trãi trên ñĩa

Chọn 3 ñộ pha loãng liên tiếp: 10-3, 10-4, 10-5 Hút 0,05 ml dung dịch ñược pha loãng ở mỗi nồng ñộ vào các ñĩa petri chứa môi trường nuôi cấy Dùng que gạt thủy tinh vô trùng dàn ñều dung dịch lên mặt thạch của ñĩa petri, và ủ 3-5 ngày ở nhiệt ñộ phòng Thực hiện 3 ñĩa petri cho một ñộ pha loãng

* Xác ñịnh số lượng vi sinh vật tổng số

Sử dụng phương pháp ñếm khuẩn lạc mọc trên ñĩa petri, ñếm tất cả số khuẩn lạc xuất hiện trên các ñĩa sau khi ủ Chọn các ñĩa có số khuẩn lạc từ 20 ñến 200 ñể tính kết quả

Số lượng vi sinh vật trong 1g mẫu ñược tính như sau:

A (CFU/g) = N/(n1vf1 + n2vf2 + + nivfi)

Trong ñó: A: Số tế bào hình thành khuẩn lạc vi sinh vật trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc ñếm ñược trên các ñĩa ñược chọn

ni: Số lượng ñĩa có số khuẩn lạc ñược chọn tại mỗi ñộ pha loãng

v: Dung tích mẫu (ml) cấy vào mỗi ñĩa

fi: Độ pha loãng của ñĩa ñược ñếm [15], [21]

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng vi khuẩn ñược tuyển chọn ñể ñịnh danh và nhân nuôi sinh khối

2.3.3.1 Mô tả hình thái, màu sắc và ñặc ñiểm khuẩn lạc

Tiến hành quan sát khuẩn lạc ñơn dưới kính hiển vi soi nổi Thực hiện tiêu bản ướt quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 40, 100

Các chỉ tiêu mô tả hình thái vi khuẩn:

- Khuẩn lạc: dạng, cấu trúc, bề mặt, ñộ nổi, bìa và màu sắc

- Hình dạng và kích thước của tế bào

2.3.3.2 Phương pháp nhuộm Gram

1 Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm

2 Cố ñịnh mẫu bằng ngọn lửa ñèn cồn

3 Dùng tím Violet nhuộm mẫu trong 1 phút

4 Rửa nước tối ña 5 giây

5 Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút

6 Rửa bằng rượu trong 10 giây

7 Phủ lên mẫu với ethanol 95% vài lần cho ñến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (1 phút)

8 Rửa nước