Khóa luận tốt nghiệp xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin và 2,3,5,4’ tetrahydroxystilben 2 o β d glucoside trong hà thủ ô đỏ

Tại Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng HTOĐ chỉ dừng ở mức đạt theo các chuyên luận Dược điển Việt Nam DĐVN V với quy định hàm lượng chất chiết được trong ethanol EtOH 30% và hàm lượng anth

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2021

Tài liệu VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

MÀO TƯỜNG VY

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN

VÀ 2,3,5,4’-TETRAHYDROXYSTILBEN-2-O-β-D-GLUCOSIDE

TRONG HÀ THỦ Ô ĐỎ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP BỘ PHẬN PHÁT HIỆN ĐA SÓNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp khóa luận được hoàn thành tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới:

ThS Bùi Thị Thương – Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Trường

Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

TS Nguyễn Thị Thanh Bình – Chủ nhiệm Bộ môn Hóa dược và Kiểm

nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dạy tôi nhiều kiến thức bổ ích và đưa ra những lời nhận xét, góp ý giúp tôi hoàn thiện khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện tốt

nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, các Phòng ban Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong

Trường vì những kiến thức đã dạy tôi trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và

rèn luyện tại Trường Tôi xin cảm ơn Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí cho đề tài (đề tài mã số CS.20.03)

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người

đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong cuộc sống cũng như trong học tập để tôi có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2021

Sinh viên

Mào Tường Vy

Tài liệu VNU

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

DAD Bộ phận phát hiện đa sóng (Diode Array Detector)

DĐHK Dược điển Hồng Kông

DĐTQ Dược điển Trung Quốc

DĐVN Dược điển Việt Nam

EtOH Ethanol

HDL Lipoprotein tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HTOĐ Hà thủ ô đỏ

ICH Hội nghị quốc tế về hài hòa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho

con người (International conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human use) LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MeOH Methanol

MPP+ 1-methyl-4-phenylpyridinium

PE Polyetylen

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

TC Cholesterol toàn phần (Total cholesterol)

TG Triglycerid

THSG 2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside

UV-VIS Tử ngoại - khả kiến (Ultraviolet-Visible)

Tài liệu VNU

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Các nghiên cứu định lượng EM và THSG bằng phương pháp HPLC 9

Bảng 2 1 Thông tin về các mẫu Hà thủ ô đỏ sử dụng trong nghiên cứu 12

Bảng 3 1 Chương trình gradient 1 đối với pha động ACN : H2O 20

Bảng 3 2 Thông số của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 254 nm 21

Bảng 3 3 Thông số của pic THSG trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 320 nm 22

Bảng 3 4 Chương trình gradient 2 đối với pha động ACN : H2O 23

Bảng 3 5 Thông số của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 290 nm 23

Bảng 3 6 Thông số của pic THSG trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 322 nm 24

Bảng 3 7 Thông số các pic của dung dịch chuẩn hỗn hợp EM 50 µg/ml và THSG 50 µg/ml tại điều kiện sắc ký tối ưu 26

Bảng 3 8 Thông số các pic của mẫu thử tại điều kiện sắc ký tối ưu 27

Bảng 3 9 Thông số các pic của mẫu thử thêm chuẩn tại điều kiện sắc ký tối ưu 28

Bảng 3 10 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của EM 29

Bảng 3 11 Kết quả phân tích hồi quy mối tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của THSG 30

Bảng 3 12 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi đối với EM 34

Bảng 3 13 Kết quả xác định tỷ lệ phục hồi đối với THSG 34

Bảng 3 14 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với EM 35

Bảng 3 15 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đối với THSG 35

Bảng 3 16 Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với EM 36

Bảng 3 17 Kết quả xác định độ chính xác trung gian của phương pháp đối với THSG 37

Bảng 3 18 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết 38

Bảng 3 19 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 39

Bảng 3 20 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết 40

Bảng 3 21 Kết quả định lượng EM và THSG trong 5 mẫu Hà thủ ô đỏ 41

Tài liệu VNU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1 1 Cây Hà thủ ô đỏ ra hoa (A) Các dạng củ và lát cắt của Hà thủ ô đỏ (B)

3

Hình 1 2 Công thức cấu tạo của EM và THSG 4

Hình 3 1 Sắc ký đồ của dung dịch EM chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 254 nm 20

Hình 3 2 Phổ hấp thụ UV-VIS của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml 21

Hình 3 3 Sắc ký đồ của dung dịch THSG chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 320 nm 21

Hình 3 4 Phổ hấp thụ UV-VIS của pic THSG trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml 22

Hình 3 5 Sắc ký đồ của dung dịch EM chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 290 nm 23

Hình 3 6 Sắc ký đồ của dung dịch THSG chuẩn nồng độ 100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 322 nm 24

Hình 3 7 Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp EM 50 µg/ml và THSG 50 µg/ml tại bước sóng phát hiện 290 nm (A) và 322 nm (B) 25

Hình 3 8 Sắc ký đồ của mẫu trắng tại các bước sóng phát hiện 290 nm (C) và 322 nm (D) 26

Hình 3 9 Sắc ký đồ của mẫu thử tại các bước sóng phát hiện 290 nm (E) và 322 nm (F) 27

Hình 3 10 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn tại các bước sóng phát hiện 290 nm (G) và 322 nm (H) 28

Hình 3 11 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của EM 30

Hình 3 12 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ dung dịch và diện tích pic của THSG 31

Hình 3 13 Sắc ký đồ của EM tại LOD (S/N=2,6) 32

Hình 3 14 Sắc ký đồ của EM tại LOQ (S/N=10,2) 32

Hình 3 15 Sắc ký đồ của THSG tại LOD (S/N=2,8) 33

Hình 3 16 Sắc ký đồ của THSG tại LOQ (S/N=9,7) 33

Tài liệu VNU

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2

1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố và bộ phận dùng 2

1.2 Thành phần hóa học 3

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học 5

1.4 Độc tính 7

1.5 Các phương pháp định lượng EM và THSG trong Hà thủ ô đỏ 8

1.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng 10

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.2 Hóa chất 12

2.3 Thiết bị, dụng cụ 13

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1.Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 13

2.4.2.Khảo sát điều kiện sắc ký 14

2.4.3.Thẩm định quy trình định lượng 15

2.4.3.1 Thẩm định tính đặc hiệu 15

2.4.3.2 Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị 16

2.4.3.3 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 16

2.4.3.4 Thẩm định độ đúng 16

2.4.3.5 Thẩm định độ chính xác 16

2.4.3.6 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 17

2.4.4.Định lượng EM và THSG trong một số mẫu Hà thủ ô đỏ 19

2.4.5.Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 20

Tài liệu VNU

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 20

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện 20

3.1.2 Xác định chương trình rửa giải 22

3.2 Thẩm định quy trình định lượng 25

3.2.1 Thẩm định tính đặc hiệu 25

3.2.2 Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị 29

3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 31

3.2.4 Thẩm định độ đúng 33

3.2.5 Thẩm định độ chính xác 34

3.2.6 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 37

3.3 Định lượng EM và THSG trong một số mẫu Hà thủ ô đỏ 41

3.4 Bàn luận 43

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47

4.1 Kết luận 47

4.2 Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu VNU

1

MỞ ĐẦU

Hà thủ ô đỏ (HTOĐ) có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.)

Haraldson, được phân bố rộng rãi trên thế giới, tập trung nhiều ở các nước Châu

Á như Trung Quốc, Nhật Bản Ở Việt Nam, HTOĐ đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh trong y học cổ truyền với tác dụng bổ huyết, bổ gan thận, mạnh gân cốt, nhuận tràng, làm đen râu tóc, kéo dài tuổi thọ, [2]

Xét về thành phần hóa học, emodin (EM) và

2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside (THSG) được xác định là chất đánh dấu hóa học của HTOĐ

trong Dược điển Trung Quốc (DĐTQ) (2015) [10], Dược điển Hồng Kông (DĐHK) (2008) [9],… cũng như trong nhiều công bố quốc tế [12,15,27] Hai hoạt chất này đều có nhiều tác dụng dược lý đã được chứng minh như tác dụng bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa, chống lão hóa, chống viêm, chống tăng lipid máu, điều hòa miễn dịch [12,19]

Tại Việt Nam, tiêu chuẩn chất lượng HTOĐ chỉ dừng ở mức đạt theo các chuyên luận Dược điển Việt Nam (DĐVN) V với quy định hàm lượng chất chiết được trong ethanol (EtOH) 30% và hàm lượng anthraquinon dạng dẫn xuất (tính theo EM và physcion (PS)) [2] Do đó, nhiều hoạt chất chính có trong HTOĐ chưa được đánh giá dẫn đến chất lượng chưa đảm bảo Vì vậy, việc nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng một số thành phần hóa học chính có trong HTOĐ

là hết sức cần thiết, giúp cho công tác kiểm soát chất lượng dược liệu này ở Việt Nam chặt chẽ hơn Trên cơ sở đó, đề tài này được tiến hành với hai mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời EM và THSG trong HTOĐ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng

2 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng EM và THSG trong một số mẫu HTOĐ trên thị trường

Tài liệu VNU

2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật, phân bố và bộ phận dùng

HTOĐ có tên khoa học là Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson, hay

Polygonum multiflorum (Thunb.), thuộc họ Rau răm (Polygonaceae), bộ Cẩm

chướng (Caryophyllales) Ngoài ra, dược liệu còn có tên gọi khác như: Dạ giao đằng, Dạ hợp, Địa tinh,… [1,3]

Cây HTOĐ là một loại dây leo bằng thân quấn, sống lâu năm Thân mềm, nhẵn, mọc xoắn vào nhau Mặt ngoài thân có màu xanh tía có những vân hoặc bì khổng lồ, mặt thân nhẵn, không có lông Rễ phình thành củ, màu nâu đỏ, củ nguyên

có hình giống củ khoai lang Lá mọc so le, có cuống dài Phiến lá hình tim hẹp dài 4-8 cm, rộng 3-4 cm, đầu nhọn, phía cuống lá hình tim hoặc hình mũi tên, mép nguyên hoặc hơi lượn sóng, cả hai mặt đều nhẵn và không có lông [1,3]

Cụm hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành thành chùy phân nhánh, hoa nhỏ nhiều, đường kính 2 mm, có cuống ngắn 1-3 mm Cánh hoa màu trắng Nhị 8 với 3 nhị hơi dài hơn Bầu hình 3 cạnh, vòi ngắn gồm 3 cái rời nhau, nuốm hình mào gà, rủ xuống Quả hình 3 cạnh, nhẵn bóng, nằm trong bao hoa mà 3 mảnh ngoài phát triển thành những cánh rộng Mùa hoa tháng 9-11; mùa quả tháng 12-2 hàng năm [1,3]

Ở Việt Nam, HTOĐ mọc hoang ở rừng núi, nhiều nhất là các tỉnh phía Tây Bắc như Hà Giang, Lai Châu, Lào Cai, Sơn La sau đến các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ

An, Hòa Bình… HTOĐ là loại cây ưa khí hậu ẩm mát của vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới núi cao, cây ưa sáng và có thể hơi chịu bóng Nơi mọc tự nhiên thích hợp nhất là các quần thể rừng núi đá vôi, độ cao tới 1700 m, nhiệt độ trung bình quanh năm dưới 20oC Ngoài ra cây còn mọc ở các nước khác như Trung Quốc (Giang

Tô, Quảng Đông, Tứ Xuyên, Hồ Bắc), Nhật Bản, Ấn Độ [1,3]

Bộ phận dùng là phần rễ củ phơi hay sấy khô của cây HTOĐ Thu hoạch cây thường tiến hành vào mùa thu hoặc mùa xuân Đào về rửa sạch đất, bổ đôi hay

bổ tư, đồ rồi phơi khô, có nơi không đồ mà phơi ngay, nếu muốn có hà thủ ô miếng thì hái về còn tươi, đem thái ngay, đồ chín rồi phơi hoặc đồ chín rồi mới thái và phơi [3]

Tài liệu VNU

3

Hình 1 1 Cây Hà thủ ô đỏ ra hoa (A) Các dạng củ và lát cắt của Hà thủ ô đỏ (B)

1.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của rễ HTOĐ đã được xác định qua rất nhiều nghiên

cứu trên thế giới, đặc biệt ở Trung Quốc Hơn 103 hợp chất hóa học được tìm thấy

trong rễ củ HTOĐ, trong đó một số nhóm hợp chất chính đã được xác định gồm:

stilben, quinon, flavonoid [17,19]

Ở Việt Nam, theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2007) HTOĐ chứa 1,7%

anthraquinon; 1,1% protein; 45,2% tinh bột; 3,1% lipid; 4,5% chất hữu cơ; 26,4%

các chất tan trong nước [1]

− Nhóm stilben:

Stilben là nhóm hoạt chất chính có nhiều trong rễ củ HTOĐ, bao gồm:

2,3,5,4′-tetrahydroxystilben-2-O-β-D-glucoside (THSG), 2,3,5,4′- tetrahydroxystilben

-2-O-β-D-(2''-O-monogalloyl estes)-glucopyranosid, 2,3,5,4′-

tetrahydroxystilben-2-O-β-D-(3''-O-monogalloyl estes)-glucopyranosid, polydatin, rhaponticosid,

2,3,5,4′-tetra-2-O-(6''-O-acetyl)-β-D-glucopyranosid và polygonumosid A, B, C,

D [16,20] Trong đó THSG đã được quy định là chất đánh dấu hóa học cho HTOĐ

trong DĐTQ (2015) với yêu cầu hàm lượng THSG không được thấp hơn 1% (tính

theo dược liệu khô kiệt) [10]

− Nhóm quinon:

Tài liệu VNU

trong một số nghiên cứu khác gồm có emodin-8-O-D-glucopyranosid, methyl ether-8-O-D-glucopyranosid, physcion-8-O-β-D-glucopyranosid [14]…

emodin-3-Hiện nay, DĐTQ (2015) [10] và DĐVN V (2018) [2] đều quy định dược liệu HTOĐ phải chứa không dưới 0,1% anthraquinon kết hợp, tính theo tổng hàm lượng của EM và PS (tính theo dược liệu khô kiệt)

− Các hợp chất khác:

Ngoài các hợp chất đã nêu ở trên, HTOĐ còn chứa các hợp chất phenolic (bao gồm catechin, acid gallic, methyl gallat,…), các hợp chất có chứa nitơ và hợp chất coumarin glucosid [17]

Tài liệu VNU

5

1.3 Công dụng và tác dụng sinh học

Theo y học cổ truyền Việt Nam, HTOĐ có vị đắng chát, hơi ngọt, tính ấm

có tác dụng bổ máu, chữa thận suy, gan yếu, thần kinh suy nhược, mạnh gân xương, nhuận tràng, uống lâu làm đen râu tóc đối với người bạc tóc sớm, làm tóc đỡ khô

và đỡ rụng [1]

Theo y học cổ truyền Trung Quốc, HTOĐ sống tươi và khô có tác dụng thông tiểu, giải độc, chữa táo bón cho phụ nữ sau đẻ hoặc người già, mụn nhọt HTOĐ chế có tác dụng bổ gan thận, dùng làm thuốc an thần, thuốc bổ và tăng lực trong các chứng thân thể suy yếu, hoa mắt, mất ngủ, kích thích tạo hồng cầu và bạch cầu trong các bệnh về máu…Ở Ấn Độ, rễ HTOĐ được dùng làm thuốc bổ, làm đen tóc, ngoài ra còn có tác dụng đối với bệnh tăng đường máu [1]

Theo y học hiện đại, các nghiên cứu cho thấy HTOĐ có nhiều tác dụng sinh học khác nhau, bao gồm tác dụng bảo vệ thần kinh, chống oxy hóa, chống lão hóa, chống viêm, chống tăng lipid máu, điều hòa miễn dịch, chống ung thư:

− Tác dụng bảo vệ thần kinh: HTOĐ cho thấy tác dụng bảo vệ thần kinh

thông qua hoạt động của EM và THSG Nghiên cứu của Ahn và cộng sự (2016) tiến hành trên chuột thực nghiệm đã chứng minh được EM trong dịch chiết HTOĐ

có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh chống lại độc tính do glutamate gây ra [6] Trong khi đó, nghiên cứu của Lin và cộng sự (2015) cũng cho thấy THSG có khả

năng ngăn ngừa độc tính, giảm tổn thương tế bào thần kinh trên cả in vitro và in

vivo Cụ thể, THSG bảo vệ các tế bào SH-SY5Y chống lại độc tính thần kinh bắt

nguồn từ MPP+ (một chất độc đặc hiệu của tế bào thần kinh dopaminergic), góp

phần làm giảm các triệu chứng của bệnh Parkinson [17]

− Tác dụng chống oxy hóa, chống lão hóa: Nghiên cứu của Chen và cộng sự

(2018) với dịch chiết nước ấm của HTOĐ cho thấy tác dụng chống oxy hóa trên

cả in vitro và in vivo Cụ thể, trên in vitro, HTOĐ làm tăng hoạt động của các

enzym chống oxy hóa như superoxide dismutase (SOD) và glutathione peroxidase

(GPx); trên in vivo, HTOĐ có khả năng thu dọn và làm giảm hoạt động của các gốc tự do, từ đó góp phần làm giảm quá trình lão hóa của con người [7]

Tài liệu VNU

6

− Tác dụng chống viêm: Tác dụng chống viêm của HTOĐ chủ yếu thông qua

hoạt động của EM và THSG Nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2007) trên chuột thực nghiệm cho thấy THSG trong dịch chiết từ rễ củ HTOĐ có tác dụng chống viêm bằng cách ức chế enzym COX-2 trong tế bào đại thực bào [30] Ngoài ra, Zeng Cheng và cộng sự (2011) đã chứng minh THSG là hợp chất dẫn đầu trong điều trị bệnh viêm đường ruột nhờ khả năng ức chế các chất trung gian gây viêm TNF-α, IL-6 và COX-2 [29] Mới đây, Tsai và công sự (2018) đã chỉ ra tác dụng

chống viêm xương khớp của THSG bằng cách sử dụng mô hình in vitro và in vivo

Cụ thể, THSG ức chế sản xuất oxit nitric và prostaglandin E₂ làm giảm phù chân

và cải thiện trọng lượng cơ thể [24] Trong nghiên cứu khác của Lin và cộng sự (2015) trên chuột thực nghiệm cho thấy EM có tác dụng làm giảm viêm tuyến vú

do nội độc tố lipopolysaccharid gây ra, giảm sự biểu hiện và nồng độ của các chất

gây viêm như TNF-α, IL-6, IL-1β tùy thuộc liều lượng [17]

− Tác dụng làm giảm các yếu tố gây bệnh tiểu đường type 2: Nghiên cứu của

Feng Ying và cộng sự (2010) trên chuột thực nghiệm cho thấy EM là một chất ức chế mạnh và có chọn lọc enzym 11β-HSD1 (một enzym đóng vai trò quan trọng trong tiến triển của bệnh béo phì, kháng insulin và bệnh tiểu đường type 2), do đó cải thiện độ nhạy insulin và tăng chuyển hóa lipid, đồng thời làm hạ đường huyết [11] Thử nghiệm khác của Tang và cộng sự (2017) trên chuột thực nghiệm cho thấy THSG cũng có tác dụng làm hạ đường huyết và cải thiện tình trạng không

dung nạp glucose và kháng insulin [23]

− Tác dụng điều hòa miễn dịch: Tác dụng điều hòa miễn dịch của HTOĐ chủ

yếu do các polysaccharid và anthraquinon glycosid có trong dược liệu [17] Nghiên cứu của Chen và cộng sự (2012) đã cho thấy khi sử dụng một phần polysaccharid được tinh chế từ HTOĐ làm tăng nồng độ IL-2 trong huyết thanh, tăng cường các thành phần chống oxy hóa, thúc đẩy quá trình tạo máu của tế bào

B, T và đại thực bào [8] Sun và cộng sự (2006) đã tiến hành một thử nghiệm in

vitro để đánh giá ảnh hưởng của anthraquinon glycosid lên chức năng miễn dịch

tế bào của chuột, kết quả cho thấy hợp chất này đã làm tăng sinh tế bào lympho T,

lympho B, cải thiện hoạt động thực bào và đại thực bào [22]

Tài liệu VNU

7

− Tác dụng chống ung thư: Nghiên cứu của Liu và cộng sự (2011) chứng

minh EM trong HTOĐ có tác dụng chống tăng sinh các tế bào ung thư tuyến tụy [18] Trong nghiên cứu khác của Huang và cộng sự (2018) còn cho thấy EM có tác dụng tăng cường khả năng gây độc tế bào của các loại thuốc hóa trị liệu trong

tế bào ung thư tuyến tiền liệt thông qua ức chế kháng đa thuốc [13]

− Tác dụng chống tăng lipid máu: Tác dụng chống tăng lipid máu của dược

liệu này chủ yếu là nhờ một số thành phần như THSG, polysaccharid, anthraquinon Nghiên cứu của Lin và cộng sự (2015) cho thấy THSG với liều 30

và 60 mg/kg/ngày, dùng đường uống trong 28 ngày có thể làm giảm đáng kể nồng

độ cholesterol toàn phần (TC), triglycerid (TG), lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), giảm tỷ lệ cholesterol toàn phần/ cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (TC/HDL), tăng nồng độ cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao (HDL), oxit nitric (NO) và superoxide dismutase (SOD) trong huyết thanh [17] Nghiên cứu khác của Wang

và cộng sự (2014) trên chuột thực nghiệm cho thấy EM, THSG, PS đều có tác dụng ức chế enzym HMG-CoA reductase – một enzym quan trọng trong quá trình

tổng hợp TC và TG [26]

1.4 Độc tính

Nhìn chung, sử dụng HTOĐ đã qua chế biến là tương đối an toàn, trong khi HTOĐ chưa qua chế biến có thể gây độc tính trên gan, thận và các cơ quan khác Tuy nhiên, cơ chế gây ra độc tính trên các cơ quan này vẫn chưa được chứng minh

rõ ràng [17,19]

Các thảo dược thường gây ra độc tính thông qua hoạt động của các hợp chất hóa học hay các chất chuyển hóa trong quá trình chế biến Qua một số nghiên cứu cho thấy thành phần gây độc chủ yếu trong HTOĐ là EM (Yu và cộng sự (2011)), THSG (Lin và cộng sự (2017)), tanin (Liu và cộng sự (2005)) Đáng chú ý gần đây, một số báo cáo chỉ ra rằng độc tính của HTOĐ có thể không phụ thuộc vào hàm lượng tuyệt đối của các dẫn xuất EM hay hàm lượng THSG mà phụ thuộc vào tỷ lệ tương đối giữa hàm lượng EM và THSG Nguyên nhân có thể do hàm lượng EM nhỏ nên không gây độc tính ở liều sử dụng [19] Ngoài ra, Yu và cộng

Tài liệu VNU

8

sự (2017) đã tiến hành nghiên cứu in vitro đánh giá ảnh hưởng của THSG đến sự

hấp thu và chuyển hóa của EM, kết quả cũng cho thấy THSG có thể thúc đẩy quá trình hấp thu, ức chế quá trình chuyển hóa EM, dẫn đến tích tụ EM trong tế bào

và gây ra độc tính trên gan [28]

Nguy cơ gây độc của HTOĐ còn ảnh hưởng bởi một số yếu tố khác như kỹ thuật chế biến (thời gian chế biến, phụ liệu kết hợp, phương pháp xử lý mẫu), cách

sử dụng (thời gian và liều dùng) [15,27] Việc tuân thủ đúng quy trình chế biến và cách sử dụng HTOĐ là hết sức cần thiết để góp phần làm giảm độc tính, giảm tác dụng phụ, đảm bảo an toàn và mang lại hiệu quả điều trị

1.5 Các phương pháp định lượng EM và THSG trong Hà thủ ô đỏ

Hiện nay, nhiều quốc gia đã đưa chuyên luận dược liệu HTOĐ vào quy định trong Dược điển như Trung Quốc [10], Hồng Kông [9], Việt Nam [2],…

DĐTQ (2015) đã quy định sử dụng HPLC để định lượng THSG, EM và physcion trong rễ củ HTOĐ Đối với chỉ tiêu định lượng, quy định hàm lượng anthraquinon kết hợp tính theo tổng hàm lượng của EM và PS không được thấp hơn 0,1% trong HTOĐ thô Phương pháp định lượng là HPLC, thành phần pha động là methanol (MeOH) : nước (H2O) chứa 0,01% axit photphoric (80 : 20, tt/tt), detector UV 254 nm, tốc dòng là 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 10 µl Đối với chỉ tiêu định lượng THSG, quy định hàm lượng THSG không được thấp hơn 1,0% trong HTOĐ Mẫu định lượng được xử lý bằng phương pháp chiết hồi lưu trong EtOH Hệ dung môi pha động là acetonitril (ACN) : H2O (25:75), cột C18, detector

UV 320 nm, tốc dòng là 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu là 10 µl [10] Nhược điểm của chuyên luận này là hai phương pháp khác nhau về thành phần pha động vì vậy không định lượng được đồng thời EM và THSG trong một lần phân tích

DĐHK (2008) quy định hàm lượng THSG là tiêu chí để đánh giá chất lượng

HTOĐ Mẫu định lượng được xử lý bằng phương pháp siêu âm với dung môi EtOH 50% Phương pháp định lượng là HPLC rửa giải bằng ACN : H2O (17 : 83, tt/tt), tốc độ dòng là 1 ml/phút, sử dụng cột ODS (4,6 x 250 mm), thể tích tiêm mẫu là 10 µl, bước sóng phát hiện 320 nm, thời gian phân tích là 27 phút Tiêu

Tài liệu VNU

9

chuẩn định lượng hàm lượng là giới hạn của THSG không thấp hơn 2,2% Nhược

điểm của chuyên luận này là không đưa ra được phương pháp định lượng đồng

thời EM và THSG mà chỉ quy định sử dụng phương pháp HPLC với các chất

chuẩn được đưa vào đối chiếu trong định tính là THSG, EM, PS Chương trình sắc

ký định tính như sau: rửa giải bằng H2O (chứa 0,1% H3PO4): ACN (0 - 35 phút:

10 - 40; 35 - 55 phút: 40 - 100; 55 - 70 phút: 100:0); tốc độ dòng là 1 ml/phút, sử

dụng cột ODS (4,6 x 250 mm), bước sóng phát hiện là 290 nm [9]

Ở Việt Nam, chuyên luận HTOĐ trong DĐVN V chỉ quy định chỉ tiêu định

lượng anthraquinon kết hợp (tính theo EM, PS) bằng phương pháp HPLC/UV

Điều kiện xử lý mẫu, điều kiện phân tích HPLC và mức hàm lượng quy định trong

chuyên luận này tương tự chuyên luận HTOĐ trong DĐTQ (2015) [2]

Ngoài ra, nhiều tác giả khác cũng đã sử dụng phương pháp HPLC để định

lượng EM và THSG trong HTOĐ Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC

định lượng EM và THSG được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1 1 Các nghiên cứu định lượng EM và THSG

10

(2012)

[27]

phút: 40:60; 60 phút: 100:0), tốc độ dòng 1ml/phút, thể tích tiêm mẫu là

Như vậy, qua tham khảo DĐTQ (2015), DĐHK (2008) và các công trình nghiên cứu khác, nhận thấy mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm riêng và chưa đạt được điều kiện tối ưu về định lượng đồng thời, thời gian phân tích, lượng dung môi hóa chất, có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất

1.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép bộ phận phát hiện đa sóng

HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Các chất được rửa giải sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện (detector) và được ghi lại nhờ máy ghi và bộ phận xử lý số liệu thành sắc ký

đồ với các thông số về pic của chất phân tích Bộ phận phát hiện là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp [5] Detector cần đáp ứng các yêu cầu sau:

- Đáp ứng nhanh và lặp lại

Tài liệu VNU

11

- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng độ thấp

- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng

- Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Tùy bản chất lí hóa của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

Bộ phận phát hiện đa sóng – DAD

Bộ phận phát hiện didode array có thể xem như là bộ phận phát hiện đo độ hấp thụ UV-VIS đa kênh, mỗi kênh phát hiện ánh sáng ở một bước nhất định Nguyên lý hoạt động là các phân tử hợp chất hữu cơ hấp thu ánh sáng UV và độ hấp thu tỷ lệ với nồng độ của chúng trong dung dịch Bộ phận phát hiện diode array dùng hệ quang học đảo, khi ánh sáng đi qua mẫu đo sẽ phân tán thành các bước sóng hợp phần hướng tới cách tử nhiễu xạ và hướng tập trung vào dãy diode

Do ánh sáng tác động lên các diode được đo một cách liên tục, vì vậy độ hấp thu ánh sáng của mẫu đo ở tất cả các bước sóng có thể xác định đồng thời [5]

Ưu điểm của detector DAD là dễ dàng sử dụng với độ tin cậy cao, sử dụng được trong trường hợp triển khai dung môi theo kiểu gradient, không hủy hoại mẫu thử, tương đối nhạy và đặc hiệu, phát hiện ở nhiều bước sóng khác nhau Ngoài ra detector DAD còn có chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic sẽ giúp tránh nhầm lẫn với hợp chất có cấu trúc tương tự và chứng minh được pic sắc ký không phải là của hai thành phần trở lên Nhược điểm của dector DAD là giá thành đắt hơn nhiều so với bộ phận phát hiện UV thông thường [5]

Tài liệu VNU

12

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là năm mẫu HTOĐ đạt tiêu chuẩn DĐVN V do Công

ty cổ phần xuất nhập khẩu Dược liệu Dương Thư cung cấp Cả 5 mẫu HTOĐ sử dụng trong nghiên cứu đều có dạng phiến, đường kính 3-5 cm, dày khoảng 1-2

mm và được bảo quản trong túi PE kín

Bảng 2 1 Thông tin về các mẫu Hà thủ ô đỏ sử dụng trong nghiên cứu

1 HTOĐ Trung Quốc HTOĐ.M1 DT/B-HTO.18 DĐVN V

− Nước khử ion đạt điện trở suất 18,2 MΩ.m

− Nước cất một lần bằng thiết bị Aquatron A4000D, Bibby, Anh

− Dung môi EtOH đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích được mua từ nhà sản xuất Guangdong, Trung Quốc

Tài liệu VNU

13

2.3 Thiết bị, dụng cụ

− Hệ thống HPLC Ultimate 3000 – Dionex, (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) trang bị bốn bơm cao áp và bộ phận tiêm mẫu tự động Đầu dò dãy diode quang DAD – 3000 Dionex, khoảng bước sóng đo được 190 - 800 nm Cột silicagel pha đảo Eclipse XDB – C18 (4,6 x 250 mm, 5µm, 120 Å) Xử lý tín hiệu bằng máy vi tính với hệ điều hành Microsoft Windows 7 trang bị phần mềm điều khiển Chromeleon Dionex phiên bản 7.1.2.1478

− Cân phân tích Shimadzu AUW220, Nhật Bản

− Máy siêu âm Utrasonic Cleaners AC – 150H, MRC Ltd, Isareal

− Máy lọc nước siêu sạch Thermo Scientific GenPure UV - TOC, USA

− Tủ sấy WiseVen Ovn - N105, Hàn Quốc

− Máy khuấy từ IKA C - MAG HS&, Đức

− Máy cất nước Aquatron A4000D, Bibby, Anh

− Pipetman Labnet BioPettePLUS, Mỹ Scientific

− Các dụng cụ thí nghiệm thủy tinh thông thường: bình định mức, phễu thủy tinh, ống đong,…

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

− Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan riêng các chất chuẩn EM và THSG trong MeOH để thu được các dung dịch chuẩn gốc có nồng độ chính xác khoảng

1000 µg/ml

− Dung dịch chuẩn khảo sát: Pha loãng các dung dịch chuẩn gốc EM 1000 µg/ml và THSG 1000 µg/ml trong MeOH để thu được các dung dịch chuẩn làm việc EM 200 µg/ml và THSG 200 µg/ml Pha loãng dung dịch EM 200 µg/ml hoặc dung dịch THSG 200 µg/ml trong MeOH để thu được các dung dung dịch khảo sát có nồng độ thích hợp

Tài liệu VNU

14

− Dãy dung dịch chuẩn: Pha loãng đồng thời 2 dung dịch EM 200 µg/ml và THSG 200 µg/ml trong MeOH để thu được dãy 5 dung dịch chuẩn chứa đồng thời EM và THSG với nồng độ EM là 2 - 200 µg/ml và nồng độ THSG

là 8 - 200 µg/ml

2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

Căn cứ vào điều kiện hiện có của phòng thí nghiệm và qua tham khảo nghiên cứu định lượng đồng thời EM và THSG bằng phương pháp HPLC - UV của tác giả Nguyễn Thị Hà Ly (2019) [4], xác định các điều kiện ban đầu như sau:

− Bước sóng phát hiện: quét phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn EM 100 µg/ml

và THSG 100 µg/ml trong khoảng 190 - 800 nm để tìm bước sóng hấp thụ cực đại của EM và THSG.

− Chương trình rửa giải: tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient với pha động ACN phối hợp với H2O theo các tỷ lệ khác nhau Lựa chọn chương trình phù hợp bằng cách đánh giá các thông số pic như thời gian lưu (tR), độ phân giải (Rs), hệ số độ đối xứng (As) Yêu cầu: tR của chất phân tích không quá dài, độ phân giải (Rs) tốt (Rs ≥ 1), độ đối xứng (As) tốt (0,9 < As < 1,2)

Tài liệu VNU

+ Mẫu thử: tham khảo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hà Ly [4]: Mẫu

dược liệu HTOĐ.M1 được xay nhỏ đến kích thước khoảng 1 mm, bảo quản trong túi PE kín Cân chính xác 0,5 g mẫu thử cho vào bình cầu

cổ nhám dung tích 100 ml, thêm 50,00 ml dung môi EtOH 50% (tt/tt), thấm ẩm dược liệu trong 10 phút, cân và ghi lại khối lượng (m1) Tiến hành chiết hồi lưu trong 1 giờ ở 70oC ± 5oC Để bình nguội về nhiệt độ phòng rồi bổ sung EtOH 50% đến khối lượng ban đầu Lọc qua màng celulose acetat tái sinh 0,45 µm (Minisart RC, Sartorius, Đức) thu được dung dịch để sắc ký (dung dịch A)

+ Mẫu thử thêm chuẩn: dung dịch hỗn hợp gồm 500 µl dung dịch A pha loãng 2 lần trong MeOH + 250 µl dung dịch chuẩn EM 100 µg/ml +

Tài liệu VNU

16

+ Ở mẫu thử thêm chuẩn, các pic của EM và THSG vẫn tinh khiết đồng thời có diện tích pic tăng lên so với dung dịch thử

2.4.3.2 Thẩm định tính tuyến tính và xác định miền giá trị

− Tiến hành sắc ký dãy dung dịch chuẩn chứa đồng thời EM và THSG để xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic tín hiệu y (mAU.min) và nồng

độ chất phân tích x (µg/ml) đối với từng chất

− Xác định giá trị R2 Yêu cầu: Hệ số hồi quy tuyến tính: 0,99 ≤ R2 ≤ 1

Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa các hệ số a, b; trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của các phương trình hồi quy

2.4.3.3 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

− Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp được xác định bằng phương pháp pha loãng dung dịch chuẩn

− LOD là nồng độ thấp nhất cho pic có chiều cao gấp 2-3 lần đường nền ở tất

− Yêu cầu: Trong các định lượng thường quy, tỷ lệ phục hồi thường được chấp thuận với giá trị 100 ± 2%

2.4.3.5 Thẩm định độ chính xác

− Độ lặp lại:

+ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn chứa đồng thời EM và THSG, nồng độ EM lần lượt là 200, 50, 2 µg/ml; THSG trong dung dịch lần lượt là 200, 100, 8 µg/ml Tiến hành sắc ký mỗi dung dịch ba lần trong cùng một ngày Xác định giá trị RSD giữa các lần đo

Tài liệu VNU

17

+ Yêu cầu: Đối với mỗi dung dịch, giá trị RSD (%) giữa các lần đo trong cùng một ngày ≤ 2,0% Các trường hợp giá trị RSD > 2% cần phải có sự giải thích phù hợp

− Độ chính xác trung gian:

+ Chuẩn bị các dung dịch chuẩn chứa đồng thời EM và THSG, nồng độ EM lần lượt là 200, 50, 2 µg/ml; THSG trong dung dịch lần lượt là 200, 100, 8 µg/ml Tiến hành sắc ký mỗi dung dịch 3 lần trong 3 ngày khác nhau Xác định giá trị RSD giữa các lần đo

+ Yêu cầu: Đối với mỗi dung dịch, giá trị RSD (%) giữa các lần đo trong ba ngày ≤ 2,0% Các trường hợp giá trị RSD > 2% cần phải có sự giải thích phù hợp

2.4.3.6 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

Lấy mẫu dược liệu theo phương pháp được quy định tại phụ lục 12.1, DĐVN V [2] Lượng mẫu cho mỗi lần thử nghiệm là 200 g Các mẫu dược liệu được xay nhỏ đến kích thước khoảng 1 mm, bảo quản trong túi PE kín

Xác định độ ẩm (d) của dược liệu theo phương pháp quy định tại phụ lục 9.6 (1 g, 105oC, 5 giờ), DĐVN V

Khảo sát một số yếu tố trong quá trình chiết dược liệu, dựa vào hàm lượng

EM và THSG để lựa chọn các thông số của quá trình chiết Tiến hành nghiên cứu trên mẫu HTOĐ.M2, mỗi thử nghiệm lặp lại 3 lần trong cùng điều kiện

Chuẩn bị dung dịch định lượng: Cân chính xác 0,5 g mẫu thử cho vào bình cầu cổ nhám dung tích 100 ml, thêm 50,00 ml dung môi EtOH (tt/tt), thấm ẩm dược liệu trong 10 phút, cân và ghi lại khối lượng (m1) Tiến hành chiết hồi lưu trong 1 giờ Để bình nguội về nhiệt độ phòng rồi bổ sung dung môi chiết đến khối lượng ban đầu Lọc qua màng celulose acetat tái sinh 0,45 µm (Minisart RC, Sartorius, Đức) thu được dung dịch để sắc ký [4]

Hàm lượng EM hoặc THSG trong mẫu thử tính theo dược liệu khô tuyệt đối được tính bằng công thức 1 (CT1):

Tài liệu VNU

18

X (%) = C x 50 x P x 100

1000 x m x (100-d)Trong đó: X (%): Hàm lượng phần trăm chất cần xác định trong dược liệu; C (µg/ml): Nồng độ dung dịch sắc ký; P (%): Độ tinh khiết của chất chuẩn; m (mg): Khối lượng mẫu thử; d (%): Độ ẩm của mẫu thử

a) Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết

− Các thông số ban đầu trong quá trình chiết được xác định như sau [4]: + Phương pháp chiết: chiết hồi lưu

+ Khối lượng dược liệu đem chiết: 0,5 g

+ Thể tích dung môi chiết: 50 ml

+ Nhiệt độ chiết: 70oC

+ Số lần chiết: 1 lần

− Thông số khảo sát:

+ Dung môi chiết: EtOH 30%, EtOH 50%, EtOH 70%, EtOH 90%

b) Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết

− Các thông số ban đầu trong quá trình chiết được xác định như sau [4]: + Phương pháp chiết: chiết hồi lưu

+ Khối lượng dược liệu đem chiết: 0,5 g

+ Thể tích dung môi chiết: 50 ml

+ Dung môi chiết: đã xác định được ở mục 2.4.3.6

+ Số lần chiết: 1 lần

− Thông số khảo sát:

+ Nhiệt độ chiết: 50oC, 70oC, 80oC, 90oC

c) Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết

Các thông số ban đầu trong quá trình chiết được xác định như sau [4]:

+ Phương pháp chiết: chiết hồi lưu

+ Khối lượng dược liệu đem chiết: 0,5 g

Tài liệu VNU

19

+ Thể tích dung môi chiết: 50 ml

+ Dung môi chiết: đã xác định được ở mục 2.4.3.6

+ Nhiệt độ chiết: đã xác định được ở mục 2.4.3.6

− Thông số khảo sát:

+ Số lần chiết: 1 lần, 2 lần, 3 lần

2.4.4 Định lượng EM và THSG trong một số mẫu Hà thủ ô đỏ

Tiến hành nghiên cứu trên các mẫu HTOĐ từ 5 lô khác nhau, mỗi thử nghiệm lặp lại 3 lần trong cùng điều kiện

− Điều kiện sắc ký: được xây dựng ở mục 2.4.2

− Chuẩn bị mẫu thử: đã xác định ở mục 2.4.3.6

− Cách tiến hành: Tiêm dung dịch thử vào hệ thống sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, ghi thời gian lưu, diện tích pic, độ tinh khiết, độ phân tách và số đĩa lý thuyết của các pic EM và pic THSG

− Tính kết quả: Hàm lượng EM và THSG trong mẫu thử tính được tính theo công thức (CT1) trình bày ở mục 2.4.3.6

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

Các phân tích thống kê, hồi quy được thực hiện bằng phần mềm Microsoft

Excel 2016 bao gồm: giá trị trung bình ( X ), độ lệch chuẩn (S), phương sai (SD),

độ lệch chuẩn tương đối (RSD), độ thu hồi, phương trình hồi quy, bình phương hệ

số tương quan R2

Tài liệu VNU

20

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện

Tiến hành sắc ký lần lượt các dung dịch chuẩn EM 100 µg/ml và dung dịch chuẩn THSG 100 µg/ml theo các điều kiện ban đầu được mô tả tại mục 2.4.2: Sử dụng cột silica gel pha đảo C18 (4,6 x 250mm, 5µm), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl, thời gian sắc ký 45 phút Bước sóng phát hiện đối với EM và THSG lần lượt là 254 và 320 nm Chương trình gradient pha động ACN : H2O được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3 1 Chương trình gradient 1 đối với pha động ACN : H 2 O

T (phút) 0 - 5 5 - 10 10 - 15 15 - 20 20 - 25 25 - 35 35 - 40 45

ACN (%) 10 - 30 30 30 - 70 70 70 - 100 100 100 - 10 Stop

Để xác định bước sóng phát hấp thụ cực đại của các chất này, thực hiện thêm một bước là quét phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn EM 100 µg/ml và THSG

100 µg/ml trong khoảng 190 - 800 Kết quả thu được như sau:

− Đối với EM:

Hình 3 1 Sắc ký đồ của dung dịch EM chuẩn nồng độ 100 µg/ml

tại bước sóng phát hiện 254 nm

Tài liệu VNU

21

Bảng 3 2 Thông số của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ

100 µg/ml tại bước sóng phát hiện 254 nm Tên pic t R (phút) A s R s Độ tinh khiết Số đĩa lý thuyết

Hình 3 2 Phổ hấp thụ UV-VIS của pic EM trong dung dịch chuẩn nồng độ 100 µg/ml

− Đối với THSG:

Hình 3 3 Sắc ký đồ của dung dịch THSG chuẩn nồng độ 100 µg/ml

tại bước sóng phát hiện 320 nm

Tài liệu VNU