TỔNG QUAN
Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Trichosanthes
1.1.1 Vị trí phân loại chi Trichosanthes
Dựa theo hệ thống phân loại thực vật APG IV (2016) [35], vị trí phân loại chi Trichosanthes được tóm tắt như sau:
Lớp Ngọc Lan: Magnoliopsida Phân lớp Hoa Hồng: Rosidae
Họ Bầu bí: Cucurbitaceae Chi: Trichosanthes
1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Trichosanthes
Trichosanthes là chi lớn nhất trong họ Cucurbitaceae, với hơn 90 loài
Chúng sống chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, nổi bật với nhiều loài có công dụng chữa bệnh, đặc biệt là các bệnh hiểm nghèo như tiểu đường và ung thư Chi Qua có dạng cây leo, thân cỏ hoặc hoá gỗ, sinh trưởng lâu năm hoặc hàng năm, với trung tâm đa dạng ở Đông Nam Á và trải dài từ Ấn Độ qua châu Á đến Đài Loan, bao gồm các khu vực như Pakistan, Ấn Độ, Sri Lanka, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Malaysia và Australia.
Trong hệ thực vật Việt Nam, theo Nguyễn Hữu Hiến (Danh mục các loài thực vật Việt Nam, 2005) chi Qua lâu hiện đã thống kê được 12 loài [8]
Bảng 1.1: Phân bố các loài thuộc chi Trichosanthes ở Việt Nam
Tên thường gọi Tên khoa học Phân bố
Mướp tây Trichosanthes anguina L Hà Giang, Khánh Hoà, Đồng Nai, Hồ Chí Minh
Qua lâu Ba Vì Trichosanthes baviensis
Dưa núi Trichosanthes cucumerina L Đồng Nai đến An Giang
Qua lâu nhiều lá bắc
Qua lâu nhân Trichosanthes kirilowii Maxim Bắc Bộ, Ninh Thuận,
Bình Thuận Qua lâu lá bắc đều
Qua lâu trứng Trichosanthes ovigera Blume Cao Bằng, Lào Cai,
Qua lâu chân vịt Trichosanthes pedata Merr &
Qua lâu pierre Trichosanthes pierrei Gagnep Bà Rịa - Vũng Tàu
Qua lâu hoa đỏ Trichosanthes rubriflos Thorel
Dây đỏ mỏ Trichosanthes villosa Blume Lào Cai, Ninh Bình,
Kon Tum, Lâm Đồng, Bình Phước
Các loài thuộc chi Qua lâu thường là cây hàng năm, có thân leo cỏ hoặc thân leo gỗ, sử dụng tua cuốn ở gốc lá để leo Lá mọc cách, xếp xoắn với cuống lá, có thể là lá đơn hoặc lá kép hình chân vịt Bề mặt lá có thể có lông hoặc nhẵn Hoa đực thường tập trung thành chùm ở nách lá, trong khi hoa cái thường đơn độc với bộ nhị cái gồm 3 lá noãn hợp, bầu dưới 3 ô Quá trình thụ phấn diễn ra nhờ côn trùng Quả của cây có hình dạng từ cầu đến hình thoi dài, thường mọng và nạc, với hạt dẹt và dài.
Dưới đây là hình ảnh một số loài Trichosanthes tìm thấy ở Việt Nam:
Trichosanthes rubriflos Trichosanthes kirilowii Maxim
Trichosanthes pedata Merr & Chun Trichosanthes ovigera Blume Hình 1.1 Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Trichosanthes ở Việt Nam
1.1.3 Thành phần hóa học của chi Trichosanthes
Các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Trichosanthes đã chỉ ra sự đa dạng với hơn 130 hợp chất khác nhau Ngoài các hợp chất phổ biến như steroid, flavonoid, lignan và các hợp chất chứa nitơ, còn có những chất đặc trưng riêng cho chi này.
Trichosanthes như triterpenoid, các hợp chất khung cucurbitane [3]
Hợp chất chiết xuất từ các loài Trichosanthes có hoạt tính đáng chú ý như gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm và chống oxy hóa Đặc biệt, hoạt tính gây độc tế bào ung thư thể hiện sự ức chế mạnh mẽ trên nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau.
Hầu hết các loài trong chi Trichosanthes được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh khác nhau như bệnh tiêu hóa, ung nhọt, nóng trong người và các bệnh ngoài da Các bộ phận của loài này, bao gồm hạt (qua lâu nhân), vỏ quả (qua lâu bì) và rễ củ (thiên hoa phấn hay qua lâu căn), đều là những vị thuốc quý trong y học cổ truyền Tại Việt Nam, chi này có một loài được biết đến với tên khoa học là
Trichosanthes ovigera Blume, hay còn gọi là Trichosanthes cucumeroides (Ser.) Maxim, thường được biết đến với tên gọi cây Qua lâu trứng hoặc Hoa bát Loài cây này chủ yếu sinh trưởng trên đất rừng, đặc biệt ở các vùng núi cao từ 2000m, trải dài từ Lào Cai đến Di Linh.
Tổng quan về loài Qua lâu trứng
Tên khoa học: Trichosanthes ovigera Blume hay Trichosanthes cucumeroides (Ser.) Maxim [19]
Tên Việt Nam: Qua lâu trứng hay Hoa bát [2]
Cây thân cỏ leo, mảnh, có rãnh, có lông Cuống lá 4-12 cm, có khía, lông tơ dày; phiến lá đa dạng, dài: 7-19 × rộng: 7-8 cm, mỏng , không có lông hoặc
Tài liệu VNU mô tả lá với 3 thùy hoặc 3-5 thùy, có hình dạng trung bình như trứng, thuôn dài hoặc ngược Mặt dưới lá có lông sát dày và lông tơ ngắn, trong khi mặt trên có mép lá răng cưa thưa và đỉnh nhọn.
Hoa đực mọc thành chùm dài từ 10-26 cm, có vân và lông ngắn, trong khi lá bắc có hình cây thương hoặc dạng mác ngược, kích thước 1,6 × 0,5-0,6 cm, thon dần về gốc với mép lá tam giác và có răng cưa Đài hoa có hình ống trụ, hơi giãn ở đỉnh, dài khoảng 5 cm với các phân đoạn hình tam giác, kích thước 7-10 × 2-3 mm Hoa cái mọc đơn độc với cọng dài 2-3 cm, có vân và lông tơ dày, ống hình trụ dài 2-5 × 0,2-0,3 cm, có thể nhẵn hoặc có lông tơ; bầu nhụy hoa kích thước 1-1,5 × 0,3-0,5 cm Mùa hoa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 9.
Quả của cây T ovigera có hình dạng thuôn dài hoặc giống quả trứng, kích thước từ 5-7 × 2,5-4 cm, với bề mặt nhẵn, gốc tròn và đỉnh nhọn Hạt có màu nâu sẫm, gần giống hình tứ giác với các góc tròn, kích thước từ 6-8 x 5-9 x 3-5 mm, được bao quanh bởi hai đường vân dày theo chiều dọc, dày gần tâm, có 3 buồng, trong đó 2 buồng bên trống Mùa thu hoạch trái cây diễn ra từ tháng chín đến tháng mười hai.
Hình 1.2 Hình ảnh vi phẫu hạt của loài Trichosanthes ovigera Blume [16]
Chú thích: G Hạt, eps Biểu bì hạt, epl Tế bào lớn của biểu bì, hs Lớp dưới da của hạt, iz Khu vực bên trong, emb Phôi
Hình 1.3 Hình vẽ mô tả cây Qua lâu trứng
Chú thích: A Cây Qua lâu trứng, B Hoa, C Hạt, D Quả.
Cây Qua lâu trứng phân bố rộng rãi trên thế giới, mọc ở các thung lũng và sườn núi với độ cao từ 700-2500 m tại các khu vực như Quảng Đông, Quảng Tây, Quý Châu, Vân Nam của Trung Quốc, cũng như ở Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Nepal, Thái Lan và Việt Nam Tại Việt Nam, cây thường xuất hiện trên đất rừng, bên khe suối hoặc ven đường ở các vùng núi từ Lào Cai đến Di Linh, và cũng có mặt trên đất cát hoang ở Ninh Thuận và Bình Thuận.
Theo tài liệu thu thập, thành phần hóa học của loài Qua lâu trứng ở các bộ phận khác nhau bao gồm các nhóm chất như triterpenoid, steroid, flavonoid, lignan, chất béo, protein, các hợp chất có nitơ và một số hợp chất khác.
Vào năm 2002, từ phần trên mặt đất của cây Qua lâu trứng thu hái tại thành phố Hachioji, Nhật Bản, Zhimao Chao và các cộng sự đã phân lập và xác định được bốn hợp chất steroid.
Nghiên cứu của Du Jing và các cộng sự (2017) đã phân tích các thành phần chính của quả, hạt và rễ cây T.ovigera bằng nhiều phương pháp như micro-kjeldahl, chuẩn độ acid-base, chiết xuất soxhlet và đo màu anthrone Kết quả cho thấy hạt cây chứa 29,93 g chất béo và 31,75 g protein trên 100 g, trong khi quả có thể đạt 40,21 g protein trên 100 g Ngoài ra, hàm lượng flavonoid và polyphenol trong rễ cây lần lượt là 156,58 mg/100 g và 113,035 mg/100 g.
Researchers in Japan have discovered three new bitter triterpenoid glycosides from the fresh roots of T ovigera, along with methyl palmitate, palmitic acid, α-spinasterol, stigmast-7-en-3β-ol, α-spinasterol-3-O-β-D-glucopyranoside, stigmast-7-en-3β-ol 3-O-β-D-glucopyranoside, and vanillic acid.
Năm 2020, Jing Chen và các cộng sự đã thành công trong việc phân lập một tritepenoid mới cùng với chín hợp chất đã biết từ cây T.ovigera, được thu hái từ tỉnh.
Hồ Bắc, Trung Quốc bao gồm [21]:
Một số công thức hóa học của các hợp chất có trong các bộ phận của cây Qua lâu trứng được trình bày ở hình 1.4
Hình 1.4 Công thức cấu tạo các hợp chất phân lập từ cây Trichosanthes ovigera
1.2.4.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư
Năm 1995, Liang Rongneng và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bằng cách tinh chế và xác định hóa học, một thành phần hoạt động chính trong
T ovigera có hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ Nó thuộc về một họ hợp chất được gọi chung là cucurbitacin Kết quả cho thấy cucurbitacin từ T.ovigera đặc biệt hiệu quả chống lại các tế bào ung thư biểu mô vòm họng (NPC) trong ống nghiệm Khi nồng độ cucurbitacin là 20 g/ml, tỷ lệ gây độc tế bào là 82,6% Nếu nồng độ đã được nâng lên đến 80 g/ml tỷ lệ gây độc tế bào là 94,1% [26]
Năm 1990, Khoa sinh học của Đại học Tế Nam, Trung Quốc đã nghiên cứu hai loại glycoprotein từ rễ củ cây Qua lâu trứng, phân lập bằng cách kết tủa với axeton Glycoprotein acid cho thấy khả năng tiêu diệt tế bào ung thư phổi lên đến 58% Kết quả nghiên cứu cho thấy, với liều lượng 105μg/ml, tỷ lệ tiêu diệt ung thư phổi đạt 74,2%.
1.2.4.2 Tác dụng chống oxy hóa Để nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của polysaccharid và các phân đoạn hóa học phân cực khác nhau của chiết xuất từ cây T.ovigera Năm 2015, các nghiên cứu của Trường cao đẳng y tế quốc gia Youjiang, Baise, Quảng Tây đã đánh giá bằng xét nghiệm quét gốc tự do DPPH, và xét nghiệm gốc tự do hydroxyl (OH - ), gốc muối diammonium (ABTS+) và xét nghiệm tác động chống oxy hóa khử sắt (FRAP) Kết quả nghiên cứu chứng minh polysaccharides và các phân đoạn hóa học phân cực khác nhau được chiết xuất từ T.ovigera có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn polyphenol trong lá trà [31,
Tại hội nghị Y học cổ truyền Quốc tế lần thứ 3, Chao Zhimao đã công bố nghiên cứu về tác dụng chống viêm và long đờm của Triterpenes và mười hợp chất từ hạt T.ovigera Năm 2003, Tang Chunfeng đã nghiên cứu các thành phần triterpenoids và sterol trong hạt Qua lâu trứng, khẳng định tác dụng chống viêm của chúng, và nghiên cứu này đã được đăng trên tạp chí Quốc tế về Y học cổ truyền Trung Quốc.
1.2.5 Công dụng theo y học cổ truyền
• Tính vị: vị đắng, tính hàn [2]
• Quy kinh: quy vào kinh phế, vị, đại tràng
• Tác dụng và công dụng:
Theo y học cổ truyền, T.ovigera có rễ củ giúp thanh nhiệt, lợi tiểu, giảm đau và chữa các bệnh như viêm amidan, viêm họng Hạt của cây này còn có tác dụng bồi bổ cơ thể, chữa ho, tiểu đường, vàng da, và các triệu chứng khác liên quan đến huyết ứ và tiêu hóa.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Cây Qua lâu trứng có hoa được thu hái tại xã Phú Vinh, huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình vào tháng 12 năm 2020 Mẫu thực vật này đã được ThS Nguyễn Thúc Thu Hương, giảng viên Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, giám định và xác nhận tên khoa học.
Trichosanthes ovigera Blume họ Cucurbitaceae (Phiếu giám định số
UMP - 112021) Mẫu tươi gồm cả cây lá và hoa
2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị
- Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: nước javen, cloranhydrat, acid acetic, xanh metylen, đỏ carmin và nước cất
- Các hóa chất dùng để định tính: H2SO4 1N, NH3, NaOH 10%, Mg, HCl, FeCl3 5%, Na2CO3, thuốc thử Liebermann, Baljet, Legal, Mayer, Bouchardat, Dragendorff, Fehling A, B,…
- Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH) 70%, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), chloroform (CHCl3), methanol (MeOH), nước cất đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết
- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột: silica gel pha thường (Merck) cỡ hạt 0,063–0,200 mm và cỡ hạt 0,040–0,063 mm
- Kính hiển vi có gắn camera tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Sắc ký cột: sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063-0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký kích cỡ khác nhau
- Độ quay cực: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Trường
Tài liệu VNU đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội
- Nhiệt độ nóng chảy: Đo trên máy SMP10 BioCote tại Trường đại học
- Phổ khối ESI-MS: Đo trên máy Agilent 1100 LC/MSD tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: Được ghi trên máy Bruker AVANCE 500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền tại Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN sử dụng nhiều dụng cụ thí nghiệm như cốc có mỏ, bình nón, bình chiết, pipet, ống đong và ống nghiệm để phục vụ cho các nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực này.
Tại Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền cùng Bộ môn Bào chế và Công nghệ Dược phẩm, Trường đại học Y Dược, ĐHQGHN, các thiết bị quan trọng như cân phân tích, máy cô quay chân không, tủ sấy và tủ hút được sử dụng để phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực dược phẩm.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Sau khi thu hái cây Qua lâu trứng và tiến hành xử lý sơ bộ, cần phân tích và mô tả các đặc điểm hình thái đặc trưng của loài Đồng thời, việc giám định tên khoa học cũng là một bước quan trọng trong quá trình nghiên cứu.
- Nghiên cứu, mô tả đặc điểm bột và vi phẫu thân, lá của cây Qua lâu trứng
2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học
- Định tính các nhóm chất trong lá cây Qua lâu trứng bằng các phản ứng hóa học
- Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất có trong lá cây Qua lâu trứng.
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu dược liệu gồm dược liệu tươi và dược liệu đã phơi khô sau khi thu hái Dược liệu được bảo quản như sau:
Mẫu dược liệu cắt làm vi phẫu cần phải là mẫu tươi và được tiến hành ngay sau khi lấy mẫu Nếu không thể thực hiện ngay, cần bảo quản mẫu trong hỗn hợp cồn và nước theo tỷ lệ 1:1.
Mẫu dược liệu dùng để soi bột được sấy khô, nghiền thành bột, bảo quản trong lọ có nút kín, có ghi nhãn và để nơi khô ráo
Mẫu dược liệu cần được sấy ở nhiệt độ dưới 50 độ C trong tủ sấy, sau đó bảo quản trong túi ni lông kín, đặt ở nơi khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời để đảm bảo chất lượng cho việc định tính, chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc hóa học.
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật
2.3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái
- Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích
- Làm tiêu bản mẫu khô theo phương pháp làm tiêu bản cây khô
Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu được thực hiện bằng cách đối chiếu các đặc điểm mô tả với những đặc điểm thực vật đã được công bố trong các tài liệu liên quan đến loài T.ovigera [8, 13, 14, 16].
2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học
Nghiên cứu vi học của mẫu nghiên cứu được thực hiện theo tài liệu [4, 7, 11], trong đó mẫu sau khi thu hái sẽ được xử lý bằng phương pháp phù hợp trước khi tiến hành phân tích.
+ Chọn mẫu có kích thước lá và thân thích hợp
Tiêu bản vi phẫu thân được cắt ngang tại đoạn thứ 4 từ đầu cành, trong khi tiêu bản vi phẫu lá được cắt ngang ở vị trí khoảng 1/4-1/3 từ dưới gần gốc của lá trưởng thành.
+ Xử lý lát cắt: chọn những lát cắt mỏng đem nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu theo quy trình chuẩn [11]
Tại Bộ môn Dược liệu và Dược cổ truyền, Trường đại học Y Dược, Đại học quốc gia Hà Nội, chúng tôi thực hiện việc quan sát và mô tả các đặc điểm vi phẫu của dược liệu Quy trình này bao gồm việc chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn camera để ghi lại những hình ảnh chi tiết và chính xác nhất.
- Đặc điểm bột dược liệu:
+ Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột
+ Quan sát trực tiếp, nếm, gửi, xác định màu, mùi, vị
Làm tiêu bản bột dược liệu bằng phương pháp giọt ép giúp quan sát và mô tả các đặc điểm điển hình của bột dưới kính hiển vi có gắn camera Những hình ảnh đặc trưng của bột sẽ được chuyển vào máy tính và ghép thành ảnh hoàn chỉnh.
2.3.2 Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ
Nguyên liệu nghiên cứu là lá cây Qua lâu trứng đã được phơi sấy khô và bảo quản Dịch chiết được lấy bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau như nước, ethanol và n-hexan Sau đó, tiến hành xác định sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu thông qua các phản ứng hóa học phù hợp, theo quy trình chuẩn đã được ghi trong tài liệu tham khảo.
2.3.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất
2.3.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất
Lá cây Qua lâu trứng được thu hái, rửa sạch, phơi khô, ngâm chiết 3 lần, mỗi lần 4L bằng dung môi EtOH 70%, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40 o C
Trong vòng 30 phút, tiến hành lọc các dịch chiết EtOH qua giấy lọc, sau đó gộp dịch lọc lại Cuối cùng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được cao chiết tổng ethanol.
Phân tán cao chiết được thực hiện trong nước cất, sau đó chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc, mỗi dung môi được sử dụng ba lần Các dịch chiết n-hexan và EtOAc được cất dưới áp suất giảm để thu được các phân đoạn tương ứng.
Sử dụng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng (dùng để khảo sát) và sắc ký cột để phân lập các hợp chất
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng silicagel 60 F254 với độ dày 0,2 mm và RP-18 F254s (Merck) có độ dày 0,25 mm, được hoạt hóa ở 1100℃ trong 1 giờ Sau khi triển khai sắc ký, vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc bằng cách sử dụng dung dịch H2SO4 10% trong ethanol, sau đó sấy khô và hơ nóng trên bếp điện từ cho đến khi xuất hiện màu.
Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ silicagel pha thường với kích cỡ hạt từ 0,063–0,200 mm và 0,040–0,063 mm (Merck), kết hợp với các loại cột sắc ký có kích thước đa dạng.
2.3.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
Sử dụng các kỹ thuật hiện đại như ESI-MS, 1H-NMR và 13C-NMR để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã được phân lập, thông qua việc phân tích phổ và các tín hiệu, thông số liên quan.
✓ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả mô tả đặc điểm thực vật của cây Qua lâu trứng
3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái của Qua lâu trứng
Cây leo thân thảo, sống lâu năm Thân cây mảnh, có lông và tua cuốn
Rễ củ có hình dạng trụ tròn hoặc nửa hình trụ, thường uốn cong với một đầu nhỏ hơn, vỏ có màu trắng vàng thô Lá mọc so le với cuống dài từ 4-12 cm, có khía và lông tơ dày Mặt trên lá màu xanh đậm, phiến lá đa dạng kích thước từ 7-19 cm chiều dài và 7-8 cm chiều rộng, mỏng và có lông rất ngắn, thường có 3-5 thùy đến giữa hoặc đến gốc, với thùy có hình tam giác Mặt dưới lá màu xanh lục nhạt, có lông sát dày và lông tơ ngắn, mép lá có răng cưa thưa và đỉnh nhọn Các tua cuốn phân nhánh, bề mặt có lông tơ.
Hoa đực mọc thành chùm, dài từ 10-26 cm, có vân và lông ngắn, trong khi cánh hoa trắng với rìa dài và cuống ngắn khoảng 5 mm Lá bắc hình cây thương hoặc dạng mác ngược, kích thước 1,6 × 0,5-0,6 cm, thon dần về gốc, mép lá có răng cưa và đỉnh nhọn Đài hoa hình trụ, dài khoảng 5 cm, đường kính gốc 2 mm và đỉnh 7 mm, với thùy hình mũi mác Bao phấn dài 3 mm, có vách ngăn lông và các sợi ngắn Hoa cái mọc đơn độc, cuống dài 0,5-1 cm, có vân và lông tơ dày, đài hoa giống hoa đực, bầu nhụy dài 1-1,5 × 0,3-0,5 cm Mùa hoa từ tháng 5 đến tháng 9.
Quả có hình dạng thuôn dài hoặc giống quả trứng, kích thước từ 5-7 cm chiều dài và 2,5-4 cm chiều rộng, với bề mặt nhẵn, gốc tròn và đỉnh nhọn Khi chín, quả chuyển sang màu đỏ cam Hạt của cây T.ovigera có màu nâu sẫm, hình dáng thuôn dài theo chiều ngang, kích thước từ 6-8 mm chiều dài, 5-9 mm chiều rộng và 3-5 mm chiều dày, được bao quanh bởi hai đường vân dày theo chiều dọc, với 3 buồng, trong đó 2 buồng bên là trống Mùa thu hoạch trái cây diễn ra từ tháng chín đến tháng mười hai.
Hình 3.1: Hình ảnh các đặc điểm chi tiết của cây Qua lâu trứng
Chú thích: 1 Cây Qua lâu trứng; 2 Mặt trước lá; 3 Mặt sau lá; 4 Quả ;
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu thân
Thân non vi phẫu hình tròn có biểu bì cấu tạo từ một lớp tế bào đa giác, với kích thước không đều và có vách ngoài hóa cutin, cùng nhiều lỗ khí để thông hơi Biểu bì còn mang lông che chở đa bào Mô mềm vỏ gồm hai hàng tế bào xếp sát biểu bì, tạo thành hình tròn khép kín với các khoảng gian bào nhỏ Hệ thống dẫn bao gồm các bó libe-gỗ sắp xếp theo lối đồng tâm, với phần gỗ ở trong và phần libe ở ngoài, được bao bọc bởi lớp trụ bì khuyết Trụ bì khuyết gồm 2-3 lớp tế bào đa giác đã hóa thành mô cứng, tạo hình vòng cung trên bó libe-gỗ, trong khi mạch gỗ hình đa giác tròn xen kẽ với libe Mô mềm ruột chứa nhiều tế bào hình đa giác với thành mỏng và kích thước lớn.
Tài liệu VNU đồng đều, các góc có khoảng gian bào nhỏ Hình ảnh vi phẫu thân cây Qua lâu trứng được trình bày ở hình 3.2
1 Lông đa bào; 2 Biểu bì; 3 Mô mềm vỏ; 4 Bó libe-gỗ; 5 Trụ bì khuyết; 6 Mạch gỗ; 7 Libe; 8 Mô mềm ruột
Hình 3.2: Đặc điểm cấu tạo vi phẫu thân của loài Trichosanthes ovigera Blume
3.1.3 Đặc điểm vi phẫu lá
Quan sát ở vật kính nhỏ thấy vi phẫu lá gồm 2 phần: phần phồng to ở giữa là gân chính của lá, phần hẹp hai bên là phiến lá
Phần gân lá có cấu trúc vi phẫu đối xứng hai bên, với mặt dưới lồi và mặt trên hơi lồi nhẹ, được bảo vệ bởi lớp lông che chở đa bào Biểu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào đa giác sắp xếp đều đặn và có màng cutin Mô dày trên nằm ngay dưới biểu bì trên, cấu tạo bởi nhiều hàng tế bào hình trụ với thành dày ở các góc Mô mềm chứa lớp tế bào đa giác lớn với khoảng gian bào nhỏ, bên trong có các tinh thể canxi oxalat và hạt tinh bột Bó libe-gỗ ở giữa gân, với libe ở ngoài và gỗ ở trong, trong đó libe gồm các tế bào nhiều cạnh, gần tròn, nhỏ hơn so với mạch gỗ hình đa giác tròn Mô dày dưới nằm sát biểu bì dưới, bao gồm một hàng tế bào đa giác xếp sát nhau.
Phần phiến lá bao gồm biểu bì trên và dưới được cấu tạo từ một hàng tế bào đa giác sắp xếp đồng đều Mô giậu nằm ngay dưới biểu bì trên, được hình thành từ hai hàng tế bào hình chữ nhật sắp xếp một cách đều đặn Phía dưới là mô mềm khuyết.
(9) cấu tạo bởi các tế bào gần tròn xếp sát nhau
Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu lá của loài Trichosanthes ovigera Blume
Chú thích: 1 Lông đa bào; 2 Biểu bì trên; 3 Mô dày trên; 4.Mô mềm; 5 Bó libe-gỗ; 6 Mô dày dưới; 7 Biểu bì dưới; 8 Mô giậu; 9 Mô mềm khuyết
3.1.4 Đặc điểm bột dược liệu
3.1.4.1 Đặc điểm bột dược liệu thân Đặc điểm bột thân của loài T.ovigera được thể hiện ở hình 3.4
Bột dược liệu là bột từ thân cây khô, có màu xanh lá hơi vàng và vị đắng, không có mùi Khi quan sát dưới kính hiển vi, bột dược liệu có các đặc điểm như bó sợi dài với các sợi có vách mỏng xếp thành bó, mảnh biểu bì, tinh thể calci oxalat hình kim lớn, hạt tinh bột, lông che chở đa bào, mảnh mô mềm và mảnh bần.
Hình 3.4 : Đặc điểm vi phẫu bột thân
3.1.4.2 Đặc điểm bột dược liệu lá
Bột lá có màu xanh đậm và vị hơi đắng, khi quan sát dưới kính hiển vi, ta thấy các đặc điểm nổi bật như mảnh biểu bì, lông che chở, mạch xoắn, sợi có vách dày, tinh thể calci oxalat, mảnh biểu bì mang lỗ khí, tinh thể calci oxalat hình kim lớn và mảnh mô mềm.
Hình 3.5: Đặc điểm vi phẫu bột lá
Qua việc phân tích đặc điểm hình thái và vi phẫu của loài nghiên cứu, bài viết sẽ so sánh và đối chiếu với các tài liệu hiện có, đặc biệt là những đặc điểm thực vật được nêu trong cuốn sách.
Cuốn sách “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ [9] cùng với các ý kiến từ chuyên gia đã tiến hành nghiên cứu và thu hái mẫu tại xã Phú Vinh, huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình, với mã số UMP-112021, được xác định tên khoa học.
Trichosanthes ovigera Blume, họ Cucurbitaceae (Phiếu giám định ngày
Kết quả định tính thành phần hóa học trong lá cây Qua lâu trứng 24 3.3 Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất
Ngâm 10g bột dược liệu với 100ml cồn 25 độ trong 24 giờ, sau đó lọc lấy dịch chiết và loại tạp chất bằng chì acetat 30% cho đến khi không còn tủa đục Để lắng, lọc dịch vào bình gạn và lắc kỹ 3 lần với 25ml cloroform (10ml, 10ml, 5ml), sau đó gạn lấy dịch chiết và lọc qua bông để loại nước Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô và đem cô cách thủy đến khô để thu được cắn phục vụ cho phản ứng Liberman.
Cho 1ml anhydrid acetic vào ống nghiệm, lắc đều và nghiêng ống 45 độ Từ từ cho 1ml H2SO4 đặc theo thành ống Nếu thấy mặt tiếp xúc giữa hai lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính (-) b, Phản ứng Baljet
Để tiến hành thử nghiệm, cho 0,5ml etanol 90% vào ống nghiệm 2 và lắc đều Sau đó, nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet, được pha từ 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% Nếu xuất hiện màu đỏ cam, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính (-) c, Phản ứng Legal
Thêm 0,5ml ethanol 90% vào ống nghiệm 3 và lắc đều cho tan hoàn toàn Sau đó, nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều Nếu xuất hiện màu đỏ cam, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính(-) d, Phản ứng Keller-Kiliani
Hòa tan cắn còn lại trong 0,5ml ethanol 90% và thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, sau đó lắc đều Nghiêng ống nghiệm 45 độ và từ từ cho 0,5ml acid H2SO4 đặc vào thành ống, tránh xáo trộn chất lỏng Phản ứng dương tính được xác định khi giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng âm tính(-)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có glycosid tim
Lấy 2 g dược liệu đã làm nhỏ, cho vào bình nón dung tích 50 mL Thêm
15 mL dung dịch thấm ẩm H2SO4 1N Đun đến sôi, để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 mL
Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9–10 Tiến hành chiết xuất alcaloid base bằng chloroform, thực hiện 3 lần với mỗi lần 5 mL Gộp các dịch chiết chloroform và loại bỏ nước bằng natri sulfat khan Sau đó, lắc hỗn hợp với H2SO4 1N hai lần, mỗi lần 5 mL Cuối cùng, chia đều các dịch chiết nước vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1 mL để thực hiện các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Mayer: Thêm 2–3 giọt thuốc thử Mayer, nếu thấy xuất hiện tủa trắng thì phản ứng dương tính
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat: Thêm 2–3 giọt thuốc thử
Bouchardat, nếu thấy xuất hiện kết tủa nâu đỏ thì phản ứng dương tính
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff: Thêm 2–3 giọt thuốc thử
Dragendorff, nếu thấy xuất hiện kết tủa cam thì phản ứng dương tính
Kết quả: Các phản ứng âm tính (-)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có alcaloid
Cho 5g dược liệu vào bình nón 100ml, chiết bằng 30ml cồn 90 o , lọc dịch chiết bằng giấy lọc gấp nếp Dịch chiết cồn để làm phản ứng :
Khi tiến hành thí nghiệm, cho vài giọt dịch chiết công vào ống nghiệm chứa 5ml nước và lắc mạnh trong 1 phút, ta sẽ quan sát hiện tượng tạo bọt với cột bọt cao và bền vững trong vòng 15 phút.
- Phản ứng với H2SO4 đậm đặc: Nhỏ 1 giọt H2SO4 đậm đặc vào cốc chứa cắn của dịch chiết cồn, không thấy xuất hiện màu tím hồng
Kết quả: Các phản ứng dương tính (+)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa saponin
Để chuẩn bị, đầu tiên hãy lấy dược liệu đã được xay nhỏ và cho nước ngập dược liệu khoảng 2cm Sau đó, đun sôi hỗn hợp trong 30 phút Sau khi đun, lọc dịch chiết nóng để thu được dịch lọc, và cuối cùng, cô dịch lọc đến cắn toàn phần.
Hòa tan cắn vào EtOH 90%, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc để làm các phản ứng:
Để kiểm tra phản ứng với hơi amoniac (NH3), nhỏ vài giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc và để khô Sau đó, hơ giấy lên miệng lọ amoniac đặc; nếu thấy vết chất chuyển sang màu vàng, thì kết quả là dương tính.
Để kiểm tra phản ứng với dung dịch kiềm loãng, cho dịch lọc vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt dung dịch NaOH 10% Nếu xuất hiện vẩn đục màu vàng, kết quả phản ứng là dương tính.
- Phản ứng Cyanidin: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 1 mL dịch
Khi thực hiện thí nghiệm với tài liệu VNU, sau khi phản ứng hoàn tất, cần quan sát màu sắc của ống phản ứng Nếu màu đỏ cam trong ống phản ứng đậm hơn so với ống đối chiếu, điều này cho thấy phản ứng là dương tính.
Để kiểm tra phản ứng với dung dịch sắt (III) chlorid, cho khoảng 1mL dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, sau đó thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Nếu lắc đều và thấy xuất hiện màu xanh đen, điều này cho thấy phản ứng dương tính.
Kết quả: Các phản ứng dương tính (+)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa flavonoid
Chuẩn bị dịch lọc như phần định tính flavonoid để làm phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 mL dịch lọc:
+ Ống 2: để nguyên Đun cả 2 ống trong 2 phút, để nguội, nếu thấy hiện tượng:
+ Ống 1: có tủa đục màu vàng
Thêm từ từ nước cất vào cả 2 ống đến 4 mL:
Thêm vài giọt HCl đặc vào ống 1, ống 1 trở lại đục như ống 2 thì phản ứng dương tính
Kết quả: Các phản ứng dương tính (+)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa coumarin
Phản ứng Borntraeger: Hòa tan một ít cắn vào 10 mL H2SO4 1N Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc cho vào bình gạn Chiết bằng
Để thực hiện phản ứng, lấy 10mL chloroform và gạn lấy lớp chloroform vào ống nghiệm Sau đó, cô đặc dung môi còn khoảng 1 mL và thêm 1 mL NaOH 10% Lắc nhẹ ống nghiệm, nếu xuất hiện màu đỏ sim thì phản ứng được coi là dương tính.
Kết quả: phản ứng âm tính (-)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có anthranoid
➢ Định tính acid hữu cơ
Hòa tan chất cần thử trong nước nóng, để nguội và lọc qua giấy lọc gấp nếp Sau đó, cho khoảng 2 mL dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ và thêm một ít tinh thể Na2CO3; nếu có bọt khí xuất hiện, điều này cho thấy phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính (+)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa aicd hữu cơ
Hòa tan cắn trong nước nóng Để nguội, lọc qua giấy lọc gấp nếp lấy dịch lọc Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ mỗi ống 2 mL dịch lọc
+ Ống 1: Thêm vài giọt sắt (III) chlorid 5% nếu thấy xuất hiện tủa màu xanh đen thì phản ứng dương tính
+ Ống 2: Thêm vài giọt chì acetat 10% nếu thấy xuất hiện tủa bông thì phản ứng dương tính
+ Ống 3: Thêm vài giọt gelatin 1% nếu thấy xuất hiện tủa bông trắng thì phản ứng dương tính
Kết quả: Các phản ứng dương tính (+)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa tanin
Hòa tan cắn vào 1 mL nước nóng, đem lọc thu được dịch lọc Thêm vào đó 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling A và 1 mL dung dịch thuốc thử Fehling
B Đun cách thủy sôi vài phút nếu thấy xuất hiện tủa đỏ gạch thì phản ứng dương tính
Kết quả: phản ứng âm tính (-)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có đường khử
Hòa tan 2 mL nước nóng, sau đó lọc nóng Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên miếng giấy lọc và hơ nóng cho đến khi hơi dung môi bay hết; nếu còn vết mờ trên giấy lọc thì phản ứng là dương tính.
Kết quả: phản ứng âm tính (-)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có chất béo
Cho vào ống nghiệm nhỏ một ít cắn khô, nhỏ vài giọt H2SO4 đặc vào cắn nếu thấy xuất hiện màu xanh lá thì phản ứng dương tính
Kết quả: phản ứng âm tính (-)
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có caroten
Bàn luận
Trong nghiên cứu này, mẫu lá cây Qua lâu trứng (Trichosanthes ovigera Blume) được thu hái tại tỉnh Hòa Bình đã được phân tích chi tiết hơn về đặc điểm hình thái thực vật, với hình ảnh rõ nét Điều này giúp làm rõ những đặc điểm trước đây còn mơ hồ, chỉ được trình bày qua bản vẽ Kết quả nghiên cứu không chỉ xác định tên khoa học của mẫu là Trichosanthes ovigera Blume mà còn góp phần phân biệt loài này với các loài khác trong chi.
Trichosanthes là một nghiên cứu ban đầu nhằm tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn, góp phần xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn của chuyên luận về dược liệu này trong Dược điển Việt Nam.
Loài T.ovigera có một số đặc điểm thực vật khác biệt so với các loài khác như T.rubriflos, T.tricuspidata và T.pedata, đặc biệt là ở phiến lá, khi T.ovigera không có các điểm trắng nhỏ trên lá như các loài kia Ngoài ra, hoa của T.ovigera cũng khác biệt với T.cucumerina, khi lá bắc của T.ovigera có hình dạng cây thương hoặc dạng mác ngược với kích thước 1,6 × 0,5-0,6 cm, trong khi lá bắc của T.cucumerina rất nhỏ hoặc gần như tiêu biến.
Nghiên cứu đã phân tích vi phẫu và đặc điểm của bột dược liệu từ thân và lá cây Qua lâu trứng, cho thấy các đặc điểm vi học phù hợp với thực vật họ Cucurbitaceae Hình ảnh cấu tạo vi học của cây có thể dùng làm tư liệu cho việc tiêu chuẩn hóa dược liệu Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu, đặc biệt là bằng hóa học, đang được áp dụng phổ biến tại Việt Nam nhờ tính thuận tiện và hiệu quả Kết quả cho thấy lá cây Qua lâu trứng từ Hòa Bình chứa các nhóm chất như flavonoid, triterpenoid và acid hữu cơ, phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thành phần hóa học của loài này.
Lá cây Qua lâu trứng từ Hòa Bình chứa các thành phần như coumarin, tanin và polysaccharid Nghiên cứu sử dụng phương pháp chiết bằng dung môi EtOH 70% kết hợp với thiết bị chiết siêu âm và phân lập chất qua sắc ký cột Kết quả cho thấy hợp chất QL1, được xác định qua nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối và phổ cộng hưởng hạt nhân, có cấu trúc là (7''R, 8''R) Hydnocarpin, thuộc nhóm Flavonolignans.
(7''R, 8''R) Hydnocarpin: Đây là chất đầu tiên được phân lập từ lá cây
Qua lâu trứng nói riêng và chi Trichosanthes nói chung Trong tự nhiên, Hydnocarpin còn được được tìm thấy chủ yếu trong các cây thuộc chi
Hydnocarpus [24, 33, 34]; cây Silybum marianum [37]; cây Lonicera japonica
[29]; lá cây Verbascum thapsus [30]; cành, lá và cụm hoa của cây Brucea javanica [28]
Hợp chất này có nhiều tác dụng sinh học được biết đến như: chống viêm
[37], chống oxy hóa [30], gây độc trên tế bào, ức chế sự hình thành khối u đối với các loại ung thư biểu mô tuyến ruột kết [29, 27], u xương, u thần kinh đệm
Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra những phát hiện quan trọng trong việc phát triển các hoạt chất chống tế bào ung thư vú Những tiến bộ này hứa hẹn sẽ mang lại những phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân ung thư.
Năm 2013, Min-Ai Lee và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về hoạt động chống tăng sinh của hydnocarpin, một hợp chất tổng hợp từ cây Lonicera japonica Nghiên cứu này liên quan đến việc ức chế con đường truyền tín hiệu Wnt/β-catenin trong các tế bào ung thư ruột kết.
27] Bên cạnh đó, một nghiên cứu ở Việt Nam chỉ ra trong cây Brucea javanica chứa hydnocarpin có hiệu lực gây độc dòng tế bào ung thư vú ở người MCF-7
Nghiên cứu về Qua lâu trứng mới chỉ là bước khởi đầu, nhằm tạo nền tảng cho các nghiên cứu sâu hơn Bài viết này bổ sung tư liệu về việc sử dụng cây làm thuốc trong dân gian và hỗ trợ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu trong tương lai.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau một thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau:
- Đã mô tả được đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của cây Qua lâu trứng là Trichosanthes ovigera Blume, thuộc họ Bầu bí
- Đã định tính và xác định được một số nhóm chất có trong lá cây Qua lâu trứng là: saponin, flavonoid, polysaccharid, coumarin, tannin, acid hữu cơ
Hợp chất (7''R, 8''R) Hydnocarpin đã được chiết xuất và phân lập từ lá cây Qua lâu trứng bằng phương pháp sắc ký cột Cấu trúc của hợp chất này được xác định thông qua các phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối và phổ cộng hưởng hạt nhân, so sánh với dữ liệu phổ đã công bố của các chất tương tự Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ lá cây Qua lâu trứng.
- Tiếp tục nghiên cứu phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần khác từ loài Qua lâu trứng
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng dịch chiết từ cây Qua lâu trứng có tác dụng sinh học đáng kể, đặc biệt trong việc chống viêm, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và cung cấp khả năng chống oxy hóa hiệu quả.
