Khóa luận tốt nghiệp dược học nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC NGUYỄN ANH ĐỨC GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA BỘ PHẬN LÁ CỦA SÂM VŨ DIỆP Panax bipinnatifidius Seem.. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y D

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN ANH ĐỨC

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA BỘ PHẬN

LÁ CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidius Seem.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà nội 2020

Tài liệu VNU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN ANH ĐỨC

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA BỘ PHẬN

LÁ CỦA SÂM VŨ DIỆP (Panax bipinnatifidius Seem.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

(NGÀNH DƯỢC HỌC)

Khóa: QH.2015.Y Người hướng dẫn 1: PGS.TS NGUYỄN HỮU TÙNG Người hướng dẫn 2: ThS NGUYỄN THỊ HOÀNG ANH

Hà Nội-2020

Tài liệu VNU

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ vô cùng quý báu của thầy cô giáo của Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè

Trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn

Thị Hoàng Anh - Khoa Y Dược Đại học Quốc gia Hà Nội và PGS TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Đại học Phenikaa; những người thầy đã trực tiếp hướng

dẫn, hết lòng chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc đã luôn tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận này

Lời cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập và đạt được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2020

Sinh viên

Nguyễn Anh Đức

Tài liệu VNU

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về Sâm vũ diệp 3

1.1.1 Tên khoa học, tên đồng danh 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Phân bố và sinh thái 4

1.1.4 Thành phần hóa học 5

1.1.5 Tính vị, công năng 12

1.1.6 Công dụng 12

1.1.7 Tác dụng dược lý 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Thiết bị, dụng cụ 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất 15

2.4.2 Phương pháp phân lập các hợp chất hóa học 15

2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập 16

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết 17

3.2 Đặc điểm vật lý và dữ liệu phổ của araloside A phân lập được 18

3.3 Biện giải cấu trúc của saponin stipuleanosid phân lập được: 24

3.4 Bàn luận 28

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

Tài liệu VNU

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

hưởng từ hạt nhân Cacbon 13)

từ hạt nhân proton)

hiệu năng cao)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

từ rễ SVD

7

thu hái tại Sapa, Lào Cai

13

phân đoạn BuOH

17

được

18

23

carbonyl và dữ liệu carbon trong vùng 60-100 ppm

24

phân tử trong đường

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên ngày càng tăng Từ xu hướng đó, các dược liệu quý trong nước cũng như trên thế giới trở thành mục tiêu cho việc nghiên cứu, tìm kiếm, khai thác nguồn tài nguyên này Việt Nam là một quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú với trên 5000 loài thực vật có khả năng được sử dụng làm thuốc Tuy nhiên trên thực tế các loài thảo dược này chỉ được sử dụng trực tiếp hoặc dưới dạng nguyên liệu thô thông qua một số phương pháp sơ chế đơn giản, điều này khiến cho giá trị các loài thảo dược này chưa

được phát huy hết tác dụng Một trong số đó phải kể đến sâm vũ diệp (Panax

bipinnatifidus Seem.)

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) là một dược liệu quý của vùng Dược

liệu Tây Bắc được sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền có tiềm năng để phát triển thành sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc tự nhiên Các kết quả nghiên cứu công bố gần đây khẳng định phần thân rễ Sâm vũ diệp chứa nhiều saponin có giá trị

Tuy nhiên liên hệ với loài Panax nổi tiếng khác như nhân sâm (P ginseng), tam thất (P notoginseng) cho thấy các bộ phận khác của cây bao gồm thân, lá và hoa đều giàu

hoạt chất saponin không kém phần thân rễ Bên cạnh đấy, phần thân lá của các loài trên cũng được sử dụng trong y học giống như phần dưới mặt đất của chúng Hơn nữa, lá và hoa là bộ phận tái sinh cùng với quá trình sinh trưởng của Sâm vũ diệp Nếu thành phần hoạt chất trong phần thân, lá Sâm vũ diệp có sự tương đồng với thành phần hoạt chất trong phần thân rễ của cây thì trong tương lai chúng ta có khả năng sử dụng phần trên mặt đất làm dược liệu thay thế cho phần thân rễ Sâm vũ diệp Trên cơ sở đó, kế thừa và phát triển tiếp nghiên cứu về đối tượng Sâm vũ diệp, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu đề tài “ Góp phần nghiên cứu thành phần Saponin của bộ phận lá của

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidius Seem.)”

Nội dung KLTN này là một phần trong đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học của cây sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) ở Việt Nam”

Tài liệu VNU

(Mã số: B2019_BKA.02 (2019-2020); CNĐT: PGS TS Vũ Đình Hoàng và TKĐT: PGS TS Nguyễn Hữu Tùng), đề tài nghiên cứu khoa học cấp bộ, Bộ Giáo dục và Đào tạo

Mục tiêu của đề tài: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hợp

chất phân lập được

Tài liệu VNU

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Sâm vũ diệp

1.1.1 Tên khoa học, tên đồng danh

Sâm vũ diệp là một loài thực vật thuộc chi Panax, họ Araliaceae được Seem

miêu tả lần đầu tiên vào năm 1868 SVD còn có những tên gọi khác như Tam thất lá

xẻ, Vũ diệp tam thất, Sâm hai lần xẻ, Phan xiết (Dao), Hoàng liên thất, Nữu tử thất, Tam thất lá lông chim, Hương sơn tam thất (Trung Quốc), Hoa diệp tam thất, Trúc tiết nhân sâm [1,3]

Ngoài tên khoa học cho loài là Panax bipinnatifidus (Seem.) Sâm Vũ Diệp còn

có những tên đồng danh khác như Aralia bipinnatifida (Seem.) C.B.Clarke; Aralia

quinquefolia (L.) Dec et Plan var major Burk; Aralia quinquefolia (L.) Dec et Plan

var elegantior Burk; Panax pseudoginseng Wall var bipinnatifidus (Seem.) Li; Panax

pseudoginseng Wall var major (Burk.) Li; Panax major Ting ex Pei; Panax pseudoginseng Wall Spp himalaicus Hara; Panax pseudoginseng Wall var elegantior (Burk) Hoo et Tseng; Panax japonicas Mey var bipinnatifidus (Seem.) Wu

et Feng [1,3]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây thân thảo sống lâu năm, cao 0,3- 0,5 m Rễ củ dài, vặn vẹo, có nhiều đốt và những vết sẹo to do thân cây rụng để lại, đầu rễ có hình con quay Thân khí sinh mảnh, thường đơn độc, mọc thẳng, rỗng giữa, có vạch dọc, cao 20-30 cm Lá kép chân vịt gồm 2-3 cái mọc vòng Lá chét 5-7 (ít khi 3) thuôn, dài 2,5- 14 cm, rộng 1,5- 4 cm, gốc tròn, đầu thuôn thành mũi nhọn, xẻ thùy lông chim không đều, mép khía răng, có lông Cụm hoa tán đơn mọc ở ngọn, hoa màu trắng đục; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2- 3 ô Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, màu đỏ khi chín, có châm đen to ở đầu, chứa 1-2 hạt Hạt hình cầu hoặc gần cầu, màu xám trắng; vỏ cứng, có rốn hạt [1,3]

Tài liệu VNU

Hình 1.1 Hình ảnh Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) 1.1.3 Phân bố và sinh thái

Sâm vũ diệp loài sâm mọc hoang dại được phát hiện vào năm 1868 Trên thế giới cây phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Nepal (vùng cận Hymalaya) Tại Việt Nam SVD được phân bố ở khu vực núi Hoàng Liên Sơn ở độ cao trên 1600m Năm 1973, cây được phát hiện ngay ở núi Hàm Rồng, sát thị trấn Sapa, ở độ cao 1600m Hiện nay vùng phân bố của sâm vũ diệp bị thu hẹp dần ở độ cao khoảng 1800m trở lên, cây được coi là cực hiếm Gần đây Sâm vũ diệp bước đầu được trồng thử ở Hà Giang và Lào Cai [1,3]

Sâm vũ diệp đặc biệt ưa bóng và đặc biệt ưa ẩm, mọc rải rác hay tập trung dưới tán rừng ẩm kín thường xanh núi cao Quần hệ rừng nơi có Sâm vũ diệp được xác định

là rừng thường xanh mưa ẩm nhiệt đới trên cao Cây gieo giống tự nhiên từ hạt Mùa hoa tháng 4-5, quả xanh cuối tháng 4-6, quả chín tháng 7 Quả chín thường rơi xuống gốc mẹ, tuy nhiên do tháng 7 rơi vào thời kỳ có lượng mưa lớn nên có thể bị cuốn trôi ảnh hưởng đến khả năng tái sinh tự nhiên của Sâm Vũ Diệp Quả chín chim thường ăn (bỏ hạt), hạt rơi xuống lại bị một loại sóc nâu nhỏ ăn nhân hạt Thân rễ bị gãy hoặc khai thác mất phần già, phần đầu thân rễ (có chồi ngủ) còn lại vẫn có khả năng tái sinh Toàn bộ phần thân mang lá tàn lụi vào mùa đông, đến đầu mùa xuân năm sau từ đầu mầm thân rễ sẽ mọc lên các chồi thân mới [8]

Tài liệu VNU

1.1.4 Thành phần hóa học

Ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của SVD Các bài báo nghiên cứu bước đầu cho thấy saponin là thành phần hóa học chính của SVD, trong đó khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp hơn

a Saponin

Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin từ lá khô

của cây Panax japonicus var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng thu hái ở dải núi Tần

Lĩnh, Thiểm Tây, Trung Quốc trong đó bao gồm 2 saponin mới là bipinnatifidusosid F1, F2 và 11 saponin đã biết được xác định là ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1,

Rb3, 24(S)-pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [11,12]

Tài liệu VNU

Ginsenosid F2

Majorosid F1

Rễ Sâm vũ diệp chứa saponin thuộc nhóm oleanan gồm những chất như chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginsenosid Ro, Rb1, Rd, Re, Rg1 và Rg2.[1,3]

Nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc năm 2011, phân lập một nhóm 10

saponin khung oleanan (1-10) từ dịch chiết methanol của rễ SVD thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới bifinosid A-C (1-3) và bảy hợp chất được biết bao gồm narcissiflorin methyl este (4), chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenosid RP1 methyl este (6), stipuleanosid R1 (7), pseudoginsenosid RT1 methyl este (8), momordin IIe (9) và stipuleanosid R2 methyl ester (10) [10]

Tài liệu VNU

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của 10 saponin được tách từ rễ SVD [5]

Năm 2017, Đỗ Văn Hào và cộng sự đã xác định được axít oleanolic và daucosterol Sử dụng phương pháp HPLC- DAD định lượng axít oleanolic cho thấy hàm lượng axít oleanolic trong cao Sâm vũ diệp và rễ Sâm vũ diệp lần lượt là: 0,034%

và 0,0066% tương đương với 340 μg/g và 66 μg/g; hàm lượng saponin trong cao Sâm

vũ diệp và dược liệu SVD lần lượt là 0,364% và 0,0698% tương đương 3640 µg/g và

698 μg/g [1]

axit oleanolic daucosterol

Nguyễn Thị Thu Thủy năm 2018, đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học

2 hợp chất saponin mới từ phân đoạn n-butanol của thân rễ Sâm vũ diệp thu hái tại

Sapa, đó là stipuleanosid R2, aralosid A methyl ester, trong đó hàm lượng

thấy của cây này tại Việt Nam [2]

Tài liệu VNU

Stipuleanosid R2 Aralosid A methyl ester

b Steroid [6]

β-sitosterol

c Lipit [6]

+ Xác định hàm lượng lipit thô

Kết quả cho thấy hàm lượng lipit thô trong Sâm vũ diệp là 5,86% + Axit béo

Tài liệu VNU

Bảng 1.1 Axit béo trong SVD STT (Số carbon: Số

liên kết đôi)

Tên axit béo Hàm lượng (% so

Bảng 1.2 Axit amin trong SVD

e Nguyên tố đa lượng và vi lượng [6]

Bảng 1.3 Nguyên tố đa lượng và vi lượng

Trong nghiên cứu của Trần Công Luận và cộng sự năm 2009, kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ và rễ củ SVD có chứa hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin

1.1.5 Tính vị, công năng

chỉ huyết tán ứ [1,3]

1.1.6 Công dụng

phụ nữ sau khi đẻ và người cao tuổi Cách dùng: rễ thái mỏng, phơi khô, sắc nước nóng, hoặc ninh với chân giò, hoặc tán bột hầm với thịt gà Sâm vũ diệp còn được dùng cầm máu, tán ứ tiêu sưng Khi dùng ngoài, rễ phơi khô tán bột mịn, rắc chữa chảy máu

và làm vết thương mau lành Rễ Sâm vũ diệp còn được ngâm rượu rồi chiết dưới dạng tinh sâm dùng rất tốt, lại có kích thích sinh dục Ngoài ra, nhân dân còn tận dụng cả thân và lá để nấu cao Cao này pha với nước hoặc rượu để uống cũng có tác dụng như

Tài liệu VNU

rễ Ở Trung Quốc, Sâm vũ diệp là thuốc chữa hư lao, thổ huyết, chảy máu cam, đòn ngã tổn thương [1,3]

1.1.7 Tác dụng dược lý

Vũ Diệp Theo như một số công bố thì cho biết SVD có tác dụng:

Tác dụng tăng cường tính đề kháng chung của cơ thể: bằng phương pháp chiếu

xạ tia gamma cho chuột cống trắng, trong thí nghiệm dùng gamma liều cao (1500 rengben), Sâm vũ diệp với liều 5g/kg có tác dụng kéo dài thời gian sống của động vật thí nghiệm, thời gian sống của chuột dùng sâm vũ diệp là 5 ngày còn đối với lô đối chứng là 4,8 ngày [1,3]

Tác dụng cầm máu: Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu trên in

vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn n-butanol, phân

đoạn ethylacetat có tác dụng ở các mức liều: 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, phân đoạn ether ở các mức liều 1-2-5 mg/mL [3,9]

Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư: nhóm nghiên cứu Trung

Quốc đã công bố kết quả sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư từ 57 cây trong hơn

2000 cây trong cơ sở dữ liệu y học cổ truyền Trung Quốc, Sâm vũ diệp (Panax

bipinnatifidus Seem.) là một trong số những loài thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển

của các tế bào ung thư [3,9]

Ảnh hưởng đối với hệ thần kinh trung ương: thí nghiệm trên chuột, ở liều thấp

(0,5 g/kg) không ảnh hưởng rõ rệt hoặc có chiều hướng rút ngắn thời gian gây ngủ của hexobarbital, đối với liều cao có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của hexobarbital chưa rõ rệt [1,3]

Tài liệu VNU

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là lá Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được thu hái ở

Sapa, Lào Cai vào tháng 3/2016 và được giám định thực vật học bởi TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN với mã số PB-001/2016

Hình 2.1 Mẫu lá Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thu hái tại Sapa, Lào

Cai 2.2 Thiết bị, dụng cụ

Khoa Y Dược ĐHQGHN và Trường Đại học PHENIKAA bao gồm:

- Năng suất quay cực đo trên máy Jasco DIP-360 digital polarimeter

- Điểm nóng chảy được đo trên máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản)

- Phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều được đo trên máy Brucker Biospin 500

Tài liệu VNU

2.3 Dung môi, hóa chất

Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như ethanol (EtOH), methanol

n-butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng Sắc ký cột tiến hành với chất hấp phụ silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 μm, YMC Co Ltd., Nhật Bản) Sắc ký bản mỏng tiến hành trên bản mỏng pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức) Phát hiện chất bằng đèn tử

khi hiện màu

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu và chiết xuất

Mẫu nghiên cứu sau khi thu hái, rửa sạch, phơi và sấy khô nghiền nhỏ thu được bột thô Sau đó mẫu được đem ngâm chiết với EtOH 80%, chiết hồi lưu 3 lần (mỗi lần 1,5 L trong 3 giờ) Các dịch chiết được gom lại, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu cắn chiết EtOH Cắn chiết được phân bố vào nước cất vừa đủ và

tiến hành chiết lần lượt với Ê-te, EtOAc và n-BuOH Cô quay dưới áp suất giảm để thu

được các cắn phân đoạn tương ứng Ê-te, EtOAc và BuOH

2.4.2 Phương pháp phân lập các hợp chất hóa học

Dược liệu được chiết hồi lưu bằng dung môi EtOH 80% Phân đoạn hóa bằng

dung môi kỹ thuật Ê-te, EtOAc và n-BuOH

Sử dụng sắc ký cột với chất nhồi cột là silica gel pha thường và pha đảo để phân lập các hợp chất

Tài liệu VNU

Theo dõi các phân đoạn chất bằng sắc ký lớp mỏng Đèn tử ngoại hoặc thuốc thử dùng để phát hiện vết chất, kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng sắc ký lớp mỏng

2.4.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất được phân lập

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng đầy đủ tổng hợp các phương pháp vật lý và hóa lý, đặc biệt đo phổ hồng ngoại IR, phổ khối MS và phổ cộng huởng

liệu thu đuợc từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

Tài liệu VNU

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết xuất và phân lập các hợp chất tinh khiết

Mẫu thân lá SVD (0,5 kg) sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được chiết hồi lưu bằng dung môi ethanol 70%, chiết 3 lần (mỗi lần 1,5 L) sử dụng thiết bị chiết hồi lưu trong 3 giờ Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất loại dưới dung môi dưới áp suất giảm cho 95,9 g cao chiết tổng ethanol

Lấy 95,0 g cao chiết hòa tan trong 500 mL nước cất và chiết phân bố bằng Ê-te, EtOAc và BuOH (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL) Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng Ê-te (6,52 g), EtOAc (3,70 g) và BuOH (18,3 g)

Hình 3.1 Quá trình chiết lá SVD ban đầu

Tiến hành phân tích phân đoạn BuOH trên cột sắc ký silica gel (85 mm Φ× 80

thu được 4 phân đoạn F1 (0,76 g), F2 (5,4 g), F3 (4,7 g), F4 (4,8 g) Phân tích phân đoạn F2 thu được tiếp 4 phân đoạn F2.1 (230 mg), F2.2 (900 mg), F2.3 (550 mg), F2.4

Tài liệu VNU

(900mg) Gom phân đoạn F2.2 và F2.3 (1450 mg) và tiếp tục tinh chế trên cột C18 pha

được 100 mg chất F223 có màu trắng ngà

Hình 3.2 Quá trình tách hợp chất chính aralosid A từ phân đoạn BuOH

Hợp chất saponin chính thu được được được đem đi phân tích, xác định cấu trúc hóa học trên cơ sở các đặc điểm vật lý (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, độ tan) và đặc biệt là các phương pháp phổ bao gồm phổ hồng ngoại IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ khối MS kết hợp với việc so sánh với dữ liệu trong tài liệu tham khảo

3.2 Đặc điểm vật lý và dữ liệu phổ của aralosid A phân lập được

Trên cơ sở đầy đủ cơ sở dữ liệu thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được hợp chất saponin phân lập được là aralosid A (Hình 3.3), là một saponin khung oleanan có

danh pháp là 3-O-[α-ʟ-arabinofuranosyl(1→4)-β-ᴅ-glucuronopyranosyl]oleanolic acid 28-O-β-ᴅ-glucopyranosyl ester Dữ liệu và biện giải cấu trúc sẽ được trình bày sau đây

Tài liệu VNU

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của aralosid A phân lập từ SVD

3.2.1 Đặc điểm, tính chất vật lý

- Đặc điểm cảm quan: bột vô định hình màu trắng, không mùi

- Tính tan: không tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực, tan trong dung môi phân cực

- Saponin F223 phân lập được dưới dạng bột màu trắng, năng suất quay cực riêng

= +16 (c 0,3, MeOH) Nhiệt độ nóng chảy 202-204oC

3.2.2 Dữ liệu phổ

3.2.2.1 Phổ IR

25 D

]α[

Tài liệu VNU

Hình 3.4 Phổ IR của aralosid A phân lập được

hydroxyl (OH), nhóm carbonyl và liên kết đôi với 1 carbon là CH

Tài liệu VNU

3.2.2.2 Phổ khối lượng

Hình 3.5 Phổ ESI-MS của aralosid A phân lập được

Trên phổ ESI-MS xuất hiện pic ion phân tử tại m/z 949,4 Pic này phù hợp với

3.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

a) Dữ liệu phổ phần aglycon

Dữ liệu phổ NMR của phần aglycon (triterpen khung oleanan) được ghi nhận

trong bảng dưới đây:

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1 H, 13 C, DEPT phần aglycon của chất F223

Vị trí carbon

tài liệu tham khảo [7]

tài liệu tham khảo [7]

13 C 1H (số H; độ bội; J=Hz) DEPT

3.3 Biện giải cấu trúc của saponin araloside A phân lập được:

Khi quan sát phổ 1H, phổ 13C cũng như phổ HSQC ta nhận thấy có 7 nhóm

δC 176,5 và vị trí 172,5, và các tín hiệu carbon nối đôi ở vị trí 122,7 và vị trí 144,0 Tất

cả những tín hiệu này gợi ý chất F223 có khung axit oleanolic Thêm vào đó, khi so sánh phổ của chất F223 với phổ của chất mormodin IIe ta có thể khẳng định khung aglycon của chất F223 chính là axit oleanolic [10]

Hình 3.6 Dữ liệu nhóm chức CH 3 trong phân tử dựa trên phổ 13 C và DEPT

Tài liệu VNU

Hình 3.7 Dữ liệu carbon mang nối đôi, nhóm chức carbonyl và dữ liệu carbon

trong vùng 60-100 ppm

Ngoài 30 tín hiệu của khung aglycon, ta còn quan sát được 13 tín hiệu carbon trong vùng 60-100 ppm, đặc biệt hơn khi quan sát trên phổ DEPT ta nhận thấy có 11

có một đường thuộc nhóm axit uronic

Phân tích COSY và HMBC cho biết thông tin về các đường liên kết trong phân

nằm trong phân tử, 1 đường thuộc nhóm pentose và 2 đường thuộc nhóm hexose

Tài liệu VNU

Hình 3.8 Dữ liệu HMBC thể hiện tương quan giữa các phân tử trong

đường ( → )

Các đường được xác định bao gồm β-ᴅ-glucopyranose, β-ᴅ-glucopyranuronic,

và một α-ʟ-arabinofuranose bằng việc phân tích hệ số tương quan của các anomeric

proton tương ứng (J=8 Hz) và so sánh với phổ của chất tương tự trong tài liệu tham

khảo Ngoài ra, sự xuất hiện của ghép cặp giữa H-1′ với C-3, giữa H-1′′ với C-4′ cho ta thấy phức giữa α-ʟ-arabinofuranose với β-ᴅ-glucopyranuronic (C-1′′ → C-4′) được gắn vào phần aglycon qua liên kết C-1′→C-3; sự xuất hiện của ghép cặp giữa giữa H-1′′′ với C-28 cho ta thấy β-ᴅ-glucopyranose được gắn vào phần aglycon qua liên kết C-1′′′→C-28

Tài liệu VNU