Thực hành xét nghiệm dinh dưỡng và an toàn thực phẩm

Trình bày được nguyên tắc, các bước tiến hành, nhận định kết quả của xét nghiệm định lượng Cholesterol toàn phần, triglycerides trong huyết thanh 2.. Thực hiện đúng ca

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

-

THỰC HÀNH XÉT NGHIỆM DINH DƯỠNG VÀ

AN TOÀN THỰC PHẨM

Hà Nội, 2015 HUPH

BAN BIÊN SOẠN

Chủ biên: PGS TS Nguyễn Xuân Ninh

ThS Lưu Quốc Toản

Thư ký biên soạn: ThS Lê Thị Thu Hà

PGS TS Nguyễn Thanh Hà

Nhóm tác giả: PGS TS Nguyễn Xuân Ninh

PGS TS Lê Thị Hồng Hảo

TS Đặng Thế Hưng

TS Nguyễn Thu Hương ThS Bùi Mai Hương ThS Lưu Quốc Toản

HUPH

MỤC LỤC

BÀI 1: THỰC HÀNH LẤY MẪU, BẢO QUẢN MẪU THỰC PHẨM 2 BÀI 2: XÉT NGHIỆM SINH HOÁ CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DINH DƯỠNG VÀ CHUYỂN HOÁ 10 BÀI 3: XÉT NGHIỆM VI CHẤT CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DINH DƯỠNG VÀ CHUYỂN HOÁ 20 BÀI 4: XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ NĂNG LƯỢNG CỦA THỨC ĂN 28 BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN, LIPID, CARBOHYDRATE TRONG THỰC PHẨM 36 BÀI 6: PHÂN TÍCH VI CHẤT DINH DƯỠNG, ĐỘ ẨM VÀ HÀM LƯỢNG TRO TOÀN PHẦN CỦA THỰC PHẨM 48 BÀI 7: KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ VI KHUẨN HIỂU KHÍ 60 BÀI 8: ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP ĐẾM SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT 69 BÀI 9: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM 79 BÀI 10: PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM PERFRIGENS 87 BÀI 11: ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI CÓ PHẢN ỨNG DƯƠNG TÍNH VỚI COAGULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG THẠCH BAIRD-PARKER 101 BÀI 12: XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ BÀO TỬ NẤM MEN, MỐC TRONG THỰC PHẨM 114 BÀI 13: XÁC ĐỊNH HÀN THE VÀ PHẨM MẦU TRONG THỰC PHẨM

(PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG) 124 BÀI 14: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM TRỨNG GIUN SÁN TRONG RAU QUẢ VÀ NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP NỔI 140 BÀI 15: XÉT NGHIỆM HÀM LƯỢNG CHÌ TRONG THỰC PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ 150

HUPH

BÀI 1: THỰC HÀNH LẤY MẪU, BẢO QUẢN MẪU THỰC PHẨM

I LẤY MẪU THỊT

1.1 Dụng cụ

 Cân

 Dao, kéo, khoan

 Túi đựng mẫu

 Găng tay

 Khẩu trang

 Bút viết kính

 Đá lạnh

 Thùng đựng mẫu

1.2 Tiến hành lấy mẫu

 Chuẩn bị người lấy mẫu

 Cán bộ thực hiện lấy mẫu cần rửa tay và đi găng tay, mặc đồ bảo hộ lao động theo quy định

 Đổi găng tay mới khi tiến hành lấy mẫu tiếp theo

 Chuẩn bị dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng (dao, túi đựng mẫu, kẹp, kéo) để lấy mẫu thịt lợn xét nghiệm

Salmonella spp cần đảm bảo vô trùng

 Tiến hành

 Ghi nhãn mẫu lên túi đựng mẫu

 Chọn ngẫu nhiên mẫu thịt ở pha lọc của quầy hàng bán thịt lợn tại chợ

Mục tiêu:

Sau khi học xong bài học này, sinh viên có khả năng:

1 Thực hiện được quy trình lấy mẫu thịt lợn để xét nghiệm ô nhiễm

 Lấy mẫu tại nhiều điểm để đảm bảo tính đại diện của mẫu bằng cách cắt tại các mặt cắt khác nhau của miếng thịt, mỗi vị trí lấy khoảng 20 g, lấy từ 3 – 5 vị trí

 Gộp các phần thịt vừa cắt được thành một mẫu và cho vào túi đựng mẫu

 Ghi hồ sơ lấy mẫu

 Ngày lấy mẫu

 Thông tin quầy hàng thịt lợn đã lấy mẫu (tên, địa chỉ, số điện thoại)

 Mã số mẫu

 Loại mẫu

 Khối lượng mẫu

 Mục đích lấy mẫu

 Phương pháp lấy mẫu

 Nhiệt độ bảo quản

 Thông tin người thực hiện lấy mẫu

1.3 Bảo quản mẫu

 Nhiệt độ bảo quản mẫu phù hợp là từ 1-5o C để tránh việc tăng sinh của các vi sinh vật nếu có ô nhiễm trong mẫu

 Gửi mẫu tới phòng kiểm nghiệm ngay sau khi lấy

 Quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu từ thực địa tới phòng thí nghiệm cần đảm bảo không để mẫu đã đóng gói bị đông lại trong túi đá lạnh Mẫu bị đông lại sẽ

có khả năng tiêu diệt các mầm bệnh

 Không đặt túi đá lạnh trực tiếp lên mẫu

 Cần gói chặt mẫu để tránh mẫu bị xê dịch trong bao bì đựng mẫu nhưng không được buộc quá chặt tránh làm hỏng hoặc nén chặt mẫu trong quá trình vận chuyển

II LẤY MẪU RAU

2.1 Dụng cụ

 Cân

 Dao, kéo, kẹp

 Túi đựng mẫu

 Găng tay

 Khẩu trang

 Bút viết kính

HUPH

 Đá lạnh

 Thùng đựng mẫu

2.2 Tiến hành lấy mẫu

 Chuẩn bị người lấy mẫu

 Cán bộ thực hiện lấy mẫu cần rửa tay và đi găng tay, mặc đồ bảo hộ lao động theo quy định

 Đổi găng tay mới khi tiến hành lấy mẫu tiếp theo

 Chuẩn bị dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng (dao, túi đựng mẫu, kẹp, kéo) để lấy mẫu rau xét nghiệm

dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

 Tiến hành

 Quy trình lấy mẫu rau dưới đây được mô tả để thực hiện lấy mẫu rau tại ruộng sản xuất, dựa trên TCVN 9016:2011

o Bước 1: Ghi nhãn lên túi đựng mẫu

o Bước 2: Xác định vị trí lấy mẫu tại ruộng

o Bước 3: Tiến hành thu thập mẫu rau Sử dụng dao/kéo cắt các thân rau Mỗi điểm lấy một mẫu đơn từ một hay nhiều cây sao cho đủ khối lượng hoặc số lượng mẫu đơn tối thiểu Cây được lấy mẫu phải sinh trưởng bình thường, không dị dạng, không bị sâu bệnh gây hại và cách bờ tối thiểu 1

m, bỏ hàng ngoài cùng

 Sử dụng găng tay bằng nilon loại dùng một lần, lấy mẫu nhẹ nhàng bằng tay, không làm dập nát rau

 Mỗi mẫu đơn được đựng riêng trong một túi

 Quả được lấy đều ở phần thân và nhánh nhưng không lấy quả ngọn, quả gốc; ngắt cuống quả bằng tay nếu quả nhỏ hoặc dùng dụng cụ lấy mẫu, thu lấy từng quả

 Trong trường hợp lấy mẫu rau ăn lá, cắt cây loại bỏ phần gốc, lá già, lá gốc hoặc cắt lấy phần thân lá ngọn ăn được

 Đối với rau ăn củ, nhổ nhẹ nhàng từng củ lên khỏi mặt đất hoặc phải đào bới, lật đất thu cắt lấy từng củ Trong trường hợp rau quả được lấy bị vấy bùn bẩn và ướt, nên sử dụng giấy mềm sạch lau chùi thật nhẹ nhàng đến khi sạch khô

 Ghi hồ sơ lấy mẫu

 Ngày lấy mẫu

HUPH

 Địa chỉ lấy mẫu

 Mã số mẫu

 Loại mẫu

 Khối lượng mẫu

 Mục đích lấy mẫu

 Phương pháp lấy mẫu

 Nhiệt độ bảo quản

 Thông tin người thực hiện lấy mẫu

2.3 Bảo quản mẫu

 Nhiệt độ bảo quản mẫu phù hợp là từ 10-15o C

 Gửi mẫu tới phòng kiểm nghiệm càng nhanh càng tốt sau khi lấy

 Đối với kiểm nghiệm dư lượng thuốc BVTV trong rau, mẫu rau có thể được chuyên chở bằng xe thường, không nhất thiết phải bảo quản lạnh

III LẤY MẪU SỮA

 Thùng đựng mẫu

3.2 Tiến hành lấy mẫu

 Chuẩn bị người lấy mẫu

 Cán bộ thực hiện lấy mẫu cần rửa tay và đi găng tay, mặc đồ bảo hộ lao động theo quy định

 Đổi găng tay mới khi tiến hành lấy mẫu tiếp theo

 Chuẩn bị dụng cụ

Các dụng cụ sử dụng (ống đong, lọ đựng mẫu) để lấy mẫu sữa cần đảm bảo vô trùng

 Tiến hành

 Việc lấy mẫu phải được thực hiện sao cho thu được mẫu đại diện của sản phẩm

HUPH

 Nếu việc lấy mẫu để phân tích vi sinh vật, lý hoá và kiểm tra cảm quan được thực hiện riêng rẽ, thì các mẫu để kiểm tra vi sinh phải được lấy trước bằng kỹ thuật

vô trùng và sử dụng dụng cụ, vật chứa đã khử trùng

 Chú ý để đảm bảo rằng, khi mẫu được lấy để kiểm tra mùi, thì dùng dụng cụ lấy mẫu hoặc ống lấy mẫu không làm ảnh hưởng đến mùi của mẫu

 Phương pháp lấy mẫu cụ thể và khối lượng hoặc thể tích của sản phẩm được lấy phụ thuộc vào bản chất của sản phẩm và mục đích của việc lấy mẫu

 Nếu sản phẩm chứa các hạt thô, thì có thể phải tăng cỡ mẫu tối thiểu Ngay sau khi lấy mẫu xong, đậy ngay vật chứa mẫu

 Đối với trường hợp các vật chứa sản phẩm bán lẻ, thì mẫu sẽ bao gồm một hoặc nhiều vật chứa chưa mở

 Nếu cần, lấy thêm một mẫu để kiểm tra nhiệt độ trong suốt quá trình vận chuyển đến phòng thử nghiệm

o Bước 1: Ghi nhãn mẫu lên lọ đựng mẫu

o Bước 2: Khuấy đều sữa trong dụng cụ đựng cho đồng nhất Trong quá trình khuấy trộn cần tránh việc tạo bọt, lượng bọt nhiều sẽ làm thay đổi các tính chất vật lý và cảm quan của sản phẩm được lấy mẫu

o Bước 3: Lấy mẫu sang dụng cụ đựng mẫu một lượng theo yêu cầu

o Bước 4: Bảo quản mẫu và vận chuyển về phòng thí nghiệm

 Ghi hồ sơ lấy mẫu

 Ngày lấy mẫu

 Thông tin cơ sở

 Mã số mẫu

 Loại mẫu

 Khối lượng mẫu

 Mục đích lấy mẫu

 Phương pháp lấy mẫu

 Nhiệt độ bảo quản

 Thông tin người thực hiện lấy mẫu

3.3 Bảo quản mẫu

 Chất bảo quản được bổ sung vào mẫu trong trường hợp:

 Hướng dẫn của phòng thử nghiệm

HUPH

 Bản chất của chất bảo quản này không ảnh hưởng đến các phép phân tích và phép thử về cấu trúc và mùi;

 Tuân thủ các hướng dẫn an toàn đối với chất bảo quản được sử dụng

 Nhiệt độ bảo quản mẫu phù hợp là từ 1-50C để tránh việc tăng sinh của các vi sinh vật nếu có ô nhiễm trong mẫu

 Gửi mẫu tới phòng kiểm nghiệm ngay sau khi lấy

 Thời gian gửi mẫu đến phòng thử nghiệm phải càng ngắn càng tốt, tốt nhất là trong vòng 24 h Nếu có yêu cầu, mẫu phải được gửi đi theo chỉ dẫn của phòng thử nghiệm

HUPH

BIÊN BẢN LẤY MẪU

Số /BB-

Hôm nay, …… giờ, ngày… tháng… năm……

1 Tên cơ sở :………

2 Địa chỉ:………

3 Điện thoại/Fax:………

4 Người đại diện hợp pháp của cơ sở:………

5 Sản phẩm được lấy mẫu: ………

………

6 Nguồn gốc sản phẩm được lấy mẫu:………

7 Địa chỉ sản phẩm sẽ được tiêu thụ:………

8 Mục đích lấy mẫu: Kiểm tra ô nhiễm vi sinh vật □, kiểm tra ô nhiễm hóa chất □, kiểm tra chất tồn dư □ 9 Số lượng mẫu: 10 Phương pháp lấy mẫu: ………

……… ……

11 Nhiệt độ của mẫu tại thời điểm thu thập mẫu:………

12 Nhiệt độ bảo quản mẫu: ………

Biên bản này được lập thành 02 bản: 01 bản do cơ quan lấy mẫu giữ; 01 bản do

chủ cơ sở hoặc người đại diện giữ

Đại diện cơ sở được lấy mẫu

(Ký, ghi rõ họ tên)

Người lấy mẫu

(Ký, ghi rõ họ tên)

HUPH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 TCVN 6400: 2010 Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu

2 TCVN 9016:2011 Rau tươi – Lấy mẫu

3 VIETGAP (2013) Sổ tay hướng dẫn VIETGAP/GMP – Chuỗi sản xuất kinh doanh thịt lợn

HUPH

BÀI 2: XÉT NGHIỆM SINH HOÁ CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DINH DƯỠNG

H2O2 phản ứng với các chất lên màu tạo thành sản phẩm màu đặc trưng (Red quinone)

Đo cường độ màu của Red quinone giúp xác định được nồng độ Cholesterol trong mẫu huyết thanh/huyết tương được xét nghiệm

Sơ đồ tóm tắt các phản ứng định lượng Cholesterol huyết thanh dưới đây:

Chol - Esterase

Cholesterol ester + H2O -> Cholesterol + acid béo

CHOD

Mục tiêu:

Sau khi học xong bài học này, sinh viên có khả năng:

1 Trình bày được nguyên tắc, các bước tiến hành, nhận định kết quả của xét nghiệm định lượng Cholesterol toàn phần, triglycerides trong huyết thanh

2 Thực hiện đúng các bước của quy trình xét nghiệm định lượng Cholesterol toàn phần, triglycerides trong huyết thanh

3 Đọc và hiểu đúng kết quả xét nghiệm định lượng Cholesterol toàn phần,

triglycerides trong huyết thanh

HUPH

Cholesterol + O2 -> 4-Cholesten-3-one + H2O2

POD 2H2O2 + Phenol + 4-Aminoantipyrine -> Red quinone + 4H2O

1.3 Hóa chất và sinh phẩm

Xét nghiệm cholesterol toàn phần trong huyết thanh/huyết tương được bằng máy sinh hóa bán tự động

Các loại hóa chất, sinh phẩm cần sử dụng gồm:

- Thuốc thử của hãng Diasys, Dialab

- Huyết thanh kiểm tra (Quality control serum - QC)

- Huyết thanh định chuẩn (Standard/Calibrator)

- Nước muối sinh lý (0,85%)

- Mẫu bệnh phẩm (huyết thanh/huyết tương)

1.4 Thiết bị và dụng cụ

- Máy hoá sinh bán tự động có bước sóng 546 nm

- Máy trộn ống nghiệm

- Pipet tự động loại 10 và 1000ul

- Máy li tâm

- Bể ổn nhiệt

- Khay đựng ống nghiệm có lỗ Ø 13mm

- Ống nghiệm nhựa loại 5 ml

- Ống Eppendorff

- Đầu côn ( vàng và xanh) cho pipet

- Găng tay

1.5 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

- Máu toàn phần hoặc máu được chống đông bằng Heparin hoặc EDTA

- Li tâm máu 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút

- Chắt lấy huyết thanh hoặc huyết tương và cho vào ống Eppendorff để bảo quản lạnh Thời gian và nhiệt độ bảo quản lạnh tùy thuộc vào hãng sản xuất Ví dụ:

- 2 ngày ở 15-25oC, 1 tuần ở 2-8oC, 8 tháng ở - 20oC

1.6 Tiến hành:

 Khởi động máy

HUPH

 Khởi động công tắc nguồn của hệ thống

 Đăng nhập các dữ liệu trên máy theo yêu cầu của nhà sản xuất, bao gồm các thông tin sau: thể tích dung dịch cần đo, bước sóng cần đo (bước sóng chính, ở đây là 546nm, bước sóng phụ), kiểu đo (endpoint) và các thông số khác nếu cần

 Chuẩn bị thuốc thử và sinh phẩm

 Kiểm tra tình trạng thuốc thử hiện có trong máy

 Chuẩn bị các ống sinh phẩm

 Chọn lấy ống nghiệm sạch, không nứt vỡ

 Đánh số hoặc mã ký hiệu các ống chuẩn (Standard), Trắng thuốc thử (Blank Reagent), các huyết thanh kiểm tra (Control serum) và bệnh phẩm của bệnh nhân

 Xắp xếp các ống nghiệm vào khay đựng ống nghiệm

 Trộn đều, ủ 20 phút ở nhệt độ 20-25oC hoặc 10 phút ở 37 oC

 Cho máy hoá sinh hút dịch lỏng trong các ống nghiệm theo thứ tự sau:

 Kết quả đo mật độ quang học (ABS) của từng mẫu kiểm tra chuẩn (Standard), Trắng thuốc thử (Blank Reagent), các huyết thanh kiểm tra (Control serum) và bệnh phẩm được đọc và ghi nhận riêng

 Trong một giới hạn nhất định (tùy thuộc vào loại máy và hãng sản xuất), giá trị

OD sẽ tuyến tính với nồng độ Cholesterol có trong mẫu bệnh phẩm được xét nghiệm, gọi là khoảng tuyến tính (Hình minh họa)

1.7 Tính kết quả

 Máy tự đọc ABS của các ống và tính kết quả theo công thức:

ABS bệnh phẩm Cholesterol (mmol/l) = ———————— x Nồng độ của chuẩn (mmol/l) ABS chuẩn

 Màu của dung dịch đo bền vững trong vòng 1 giờ

 Tùy theo nhà sản xuất, hệ thống xét nghiệm cholesterol toàn phần có thể đo mật độ quang học trong một giới hạn nhất định của nồng độ cholesterol mà vẫn đảm bảo độ tuyến tính phù hợp của kết quả đo Trong các trường hợp nồng độ cholesterol của các mẫu huyết thanh/huyết tương vượt ngưỡng đo thì cần pha loãng bệnh phẩm trước khi đưa vào máy Trong các trường hợp như vậy, kết quả thu được cần hiệu chỉnh với độ pha loãng mẫu bệnh phẩm đã thực hiện

1.8 Biện luận

 Giá trị bình thường:

Cholesterol toàn phần huyết thanh/huyết tương: 3.9 -5.2 mmol/l (BV Bạch Mai)

0 2 4 6 8 10

 Cholesterol toàn phần huyết thanh tăng cao trong các trường hợp sau: xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, đái tháo đường, hội chứng thận hư, bệnh thận mãn, xơ gan, suy giáp, nghiện rượu, nghiện thuốc lá, có thai

 Cholesterol toàn phần huyết thanh giảm thấp trong các trường hợp sau: chế độ ăn nghèo lipid, hội chứng giảm hấp thu, suy dinh dưỡng, suy gan, nhiễm trùng nặng, cường giáp

HUPH

II ĐỊNH LƯỢNG TRIGLYCERIDES TRONG HUYẾT THANH

2.1 Ý nghĩa

Định lượng Triglycerides trong huyết thanh được sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi hiệu quả điều trị các bệnh liên quan tới chuyển hóa, đặc biệt là chuyển hóa lipid trong cơ thể và các bệnh nội tiết như cao huyết áp, xơ vữa động mạch, các bệnh mạch vành, đái tháo đường, viêm tụy mãn

Có nhiều kỹ thuật định lượng toàn phần Triglycerides trong huyết thanh

2.2 Nguyên lý

Triglycerides được thủy phân thành Glycerol và các acid béo dưới tác dụng của enzyme Lipase Glycerol được phosphoryl hóa bởi ATP và enzyme Glycerol Kinase (GK) tạo thành Glycerol-3-Phosphate Chất này được oxy hóa thành Dihydroxyacetone phosphate và H2O2 nhờ enzyme Glycerolphosphate oxydase (GPO) H2O2 phản ứng với các chất lên màu tạo thành sản phẩm có màu đặc trưng (Red quinone)

Đo cường độ màu của Red quinone suy ra được nồng độ Triglyceridres trong bệnh phẩm

Sơ đồ tóm tắt các phản ứng định lượng Triglycerides huyết thanh dưới đây:

Lipase Triglycerides + 3H2O -> Glycerol + 3 Acid béo

GK, Mg2+

Glycerol +ATP -> Glycerol-3-phosphate + ADP

GPO Glycerol-3-phosphate + O2 -> Dihydroxyacetone phosphate + H2O2

POD 2H2O2 + Phenol + 4-Aminoantipyrine -> Red quinone + 4H2O

2.3 Thuốc thử

 Thuốc thử phản ứng: Thuốc thử của hãng Diasys, Dialab

 Huyết thanh kiểm tra (Quality control serum, QC)

 Huyết thanh định chuẩn (Standard /Calibrator)

 Nước muối sinh lý (0,85%)

HUPH

2.4 Thiết bị và dụng cụ:

 Máy hoá sinh bán tự động có bước sóng 546 nm

 Chuẩn bị máy:

 Đăng nhập các dữ liệu trên máy theo yêu cầu của nhà sản xuất Tối thiểu: thể tích dung dịch cần đo, bước sóng cần đo (bước sóng chính, ở đây là 546nm, bước

sóng phụ), kiếu đo (endpoint)

 Máy trộn ống nghiệm

 Pipet tự động loại 10 và 1000ul

 Máy li tâm

 Bể ấm nước 37oC

 Khay đựng ống nghiệm có lỗ Ø 13mm

 Ống nghiệm nhựa loại 5 ml

 Ống Eppendorff

 Đầu côn (vàng và xanh) cho pipet

 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

 Máu được chống đông bằng Heparin hoặc EDTA)

 Li tâm máu 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút

 Chắt lấy huyết thanh hoặc huyết tương và cho vào ống Eppendorff để bảo quản lạnh Thời gian và nhiệt độ bảo quản lạnh tùy thuộc vào hãng sản xuất Ví dụ; 2 ngày ở 15-25oC, 1 tuần ở 2-8oC, 8 tháng ở - 20oC

2.5 Tiến hành:

 Khởi động máy

 Khởi động công tắc nguồn của hệ thống

 Đăng nhập các dữ liệu trên máy theo yêu cầu của nhà sản xuất, bao gồm các thông tin sau: thể tích dung dịch cần đo, bước sóng cần đo (bước sóng chính, ở đây là 546nm, bước sóng phụ), kiếu đo (endpoint) và các thông số khác nếu cần

 Chuẩn bị thuốc thử và sinh phẩm

 Kiểm tra tình trạng thuốc thử hiện có trong máy

 Chuẩn bị các ống sinh phẩm:

 Chọn lấy ống nghiệm sạch, không nứt vỡ

 Đánh số hoặc mã ký hiệu các ống chuẩn (Standard), Trắng thuốc thử (Blank Reagent), các huyết thanh kiểm tra (Control serum) và bệnh phẩm của bệnh nhân

HUPH

 Sắp xếp các ống nghiệm vào khay đựng ống nghiệm

 Trộn đều, ủ 20 phút ở nhệt độ 20-25oC hoặc 10 phút ở 37 oC

 Cho máy hoá sinh hút dịch lỏng trong các ống nghiệm theo thứ tự sau:

 Máy tự đọc ABS của các ống và tính kết quả theo công thức:

ABS bệnh phẩm Triglycerides (mmol/l) = ———————— x Nồng độ của chuẩn (mmol/l)

ABS chuẩn

 Màu của dung dịch đo bền vững trong vòng 1 giờ

 Tùy theo nhà sản xuất, hệ thống xét nghiệm triglycerides có thể đo mật độ quang học trong một giới hạn nhất định của nồng độ triglycerides mà vẫn đảm bảo độ tuyến tính phù hợp của kết quả đo Trong các trường hợp nồng độ triglycerides của các mẫu huyết thanh/huyết tương vượt ngưỡng đo thì cần pha loãng bệnh phẩm trước khi đưa vào máy Trong các trường hợp như vậy, kết quả thu được cần hiệu chỉnh với độ pha loãng mẫu bệnh phẩm đã thực hiện

2 7 Biện luận

 Giá trị bình thường:

HUPH

Triglycerides huyết thanh/huyết tương: 0.5 -1.9 mmol/l (BV Bạch Mai)

 Triglycerides huyết thanh tăng cao trong các trường hợp sau: Viêm tụy, bệnh Gout, tăng huyết áp, đái tháo đường, hội chứng thận hư, bệnh thận mãn, xơ gan, nghiện rượu, suy giáp

 Triglycerides huyết thanh giảm thấp trong các trường hợp sau: chế độ ăn nghèo lipid, hội chứng giảm hấp thu, suy dinh dưỡng, nhồi máu não, bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính, cường giáp

HUPH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Đạt Anh và Nguyễn Thị Hương (2013): Các xét nghiệm thường quy áp dụng trong thực hành lâm sàng: 639-644

2 Tạ Thành Văn (2013), Hóa sinh lâm sàng, NXB Y học, Hà Nội

3 Tài liệu hướng dẫn vận hành máy xét nghiệm sinh hóa tự động Autolyzer 600 của hãng Dialab

HUPH

BÀI 3: XÉT NGHIỆM VI CHẤT CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH DINH DƯỠNG VÀ

Ngoài ra, xét nghiệm này còn dùng để đánh giá các bệnh lý ác tính do các tế bào ung thư giải phóng Ca và thường gây tăng Ca máu

Có nhiều kỹ thuật định lượng Ca toàn phần trong huyết thanh Bài này giới thiệu phương pháp Arsenzo III

hydroquiline-5-1.3 Thuốc thử, hóa chất và sinh phẩm

 Dung dịch lên màu:

 Phosphate buffer pH 7,5: 50mmol/l

 8 hydroquiline-5-sulfonic acid: 5mmol/l

 Arsennozo III: 120 mol/l

 Detergents

Mục tiêu:

Sau khi học xong bài học này, sinh viên có khả năng:

1 Trình bày được nguyên tắc, các bước tiến hành, nhận định kết quả của xét nghiệm định lượng can xi toàn phần trong huyết thanh và iod trong nước tiểu

2 Thực hiện đúng các bước của quy trình xét nghiệm định lượng can xi toàn phần trong huyết thanh và iod trong nước tiểu

3 Đọc và hiểu đúng kết quả xét nghiệm định lượng can xi toàn phần trong

huyết thanh và iod trong nước tiểu

HUPH

 Thuốc thử bền vững trong nhiều tháng ở nhiệt độ 20oC - 25oC

 Huyết thanh kiểm tra (Quality control serum)

 Huyết thanh định chuẩn (Standard/Calibrator)

 Mẫu bệnh phẩm

1.4 Thiết bị và dụng cụ:

Máy hoá sinh bán tự động có bước sóng 340-900 nm

 Chuẩn bị máy:

 Có nhiều loại máy xét nghiệm hóa sinh bán tự đông

 Đăng nhập các dữ liệu trên máy theo yêu cầu của nhà sản xuất Tối thiểu: thể tích dung dịch cần đo, bước sóng cần đo (bước sóng chính ở đây là 660nm, bước sóng phụ), kiếu đo ( endpoint, kinetic )

o Máy trộn ống nghiệm

o Pipet tự động loại 10 và 1000ul

o Máy li tâm

o Bể ấm nước 37oC

o Khay đựng ống nghiệm có lỗ Ø 13mm

o Ống nghiệm nhựa loại 5 ml

o Ống Eppendorff

o Đầu côn (vàng và xanh) cho pipet

1.5 Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm:

 Máu được chống đông bằng Heparin Không dùng chất chống đông là EDTA

 Li tâm máu 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút

 Chắt lấy huyết thanh hoặc huyết tương và cho vào ống Eppendorff để bảo quản lạnh Thời gian và nhiệt độ bảo quản lạnh tùy thuộc vào hãng sản xuất Ví dụ; 2 ngày ở 15-25oC, 1 tuần ở 2-8oC, 8 tháng ở - 20oC

1.6 Tiến hành:

 Khởi động máy

 Khởi động công tắc nguồn của hệ thống

 Đăng nhập các dữ liệu trên máy theo yêu cầu của nhà sản xuất, bao gồm các thông tin sau: thể tích dung dịch cần đo, bước sóng cần đo (bước sóng chính, ở đây là 546nm, bước sóng phụ), kiếu đo (endpoint) và các thông số khác nếu cần

 Chuẩn bị thuốc thử và sinh phẩm

HUPH

 Kiểm tra tình trạng thuốc thử hiện có trong máy

 Chuẩn bị các ống sinh phẩm:

 Chọn lấy ống nghiệm sạch, không nứt vỡ

 Đánh số hoặc mã ký hiệu các ống chuẩn (Standard), Trắng thuốc thử (Blank Reagent), các huyết thanh kiểm tra (Control serum) và bệnh phẩm của bệnh nhân

 Sắp xếp các ống nghiệm vào khay đựng ống nghiệm

 Lắc nhẹ cho đều, để 5 phút

 Cho máy hoá sinh hút dịch lỏng trong các ống nghiệm theo thứ tự sau:

HUPH

1.8 Biện luận

 Giá trị bình thường:

 Huyết thanh, huyết tương: 2,15 - 2,57 mmol/l

 Canxi tăng trong các trường hợp bệnh lý sau:

 Ưu năng giáp trạng (do tăng hoạt động, tăng sản hoặc u)

 Bệnh thừa vitamin D (Thèm ăn uống nhiều canxi)

 Ngoài ra có thể gặp trong cường giáp trạng, bệnh Addison, paget, cushing

 Canxi giảm trong các trường hợp bệnh lý:

 Thiểu năng cận giáp trạng gây co giật tetani Trường hợp sau phẫu thuật tuyến cận giáp trạng

 Thiếu vitamin D, còi xương

 Thận hư, bệnh viêm tuỵ cấp, bệnh thưa xương

Tài liệu tham khảo:

1 KIT định lượng Canxi huyết thanh của hang Diasys, Dialab…

2 Nguyễn Đạt Anh và Nguyễn thị Hương (2013).- Các xét nghiệm thường quy áp dụng trong thực hành lâm sàng: 75-86

II XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG IOD TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG

PHƯƠNG PHÁP APS (AMMONIUM PERSULFATE)

2.1 Ý nghĩa

Trong điều tra, giám sát công tác phòng chống bệnh bướu cổ và các rối loạn do thiếu iod, xét nghiệm iod trong nước tiểu (iod niệu) là một chỉ tiêu sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Iod niệu phản ảnh tình trạng thu nhập iod hằng ngày của cơ thể Thiếu iod sẽ gây nên bênh bướu cổ và các rối loạn khác như chậm phát triển trí tuệ, thậm chí đần độn, sảy thai, thai chết lưu Dựa vào mức iod niệu người ta điều chỉnh việc bổ sung iod vào các chế phẩm ăn uống hằng ngày, nhất là muối ăn cho cộng đồng dân cư với hàm lượng vừa đủ và nằm trong giới hạn an toàn

Có nhiều kỹ thuật định lượng iod niệu Trong y học cộng đồng, hay dùng nhất là các phương pháp động học xúc tác, trong đó lấy iod làm chất xúc tác

2.2 Nguyên lý

Nước tiểu được xử lý (tiêu khử) bằng Ammonium Persulfate (APS) để loại trừ

các chất can thiệp có trong mẫu Iod trong nước tiểu được xác định bằng tác dụng xúc tác của nó tới phản ứng oxy hoá khử giữa Ce+4 với As+3 (phản ứng Sandell-Kolthoff )

HUPH

trong môi trường acid mạnh Đo tốc độ mất màu vàng của Ce+4 sẽ tính ra được lượng iod tham gia xúc tác

2.3 Hóa chất, thuốc thử, sinh phẩm

 Hoá chất (loại đặc biệt tinh khiết dùng trong phân tích):

 APS (Ammonium Persulphate)

 As2O3 (Arsenic trioxide)

 NaCl (Sodium chloride)

 H2SO4 (Sulfuric acid) đậm đặc 96-100%, 36N

 Ce(NH4)4(SO4)4.2H2O (Cericammonium sulfate Dihydrate)

 KIO3 (Potassium iodate)

 Nước cất

 Sinh phẩm: Mẫu nước tiểu

 Pha chế thuốc thử :

 Dung dịch APS: Hoà tan 228.2g APS trong 1000ml nước cất Bảo quản trong lọ màu và trong điều kiện lạnh

 Dung dịch acid Arsenic: Cho vào bình Erlenmeyer

o As2O3 : 5g

o NaCl: 25g

o H2SO4 5N: 200ml

o Nước cất khoảng 500ml

o Đun nóng và khuấy liên tục cho tới khi tan hoàn toàn Để nguội về nhiệt độ phòng

o Thêm nước cất vừa đủ 1000ml Bảo quản ở chỗ mát, tối

 Dung dịch acid sulfuric 3,5N: Lấy 97ml dung dịch H2SO4 96% nhỏ từ từ vào 800ml nước cất, thêm nước cất vừa đủ tới vạch 1000ml trong bình định mức

 Dung dịch CAS : Hoà tan 24g CAS trong 1000ml dung dịch H2SO4 3,5N Chuẩn

bị dung dịch này ít nhất là 24 giờ trước khi dùng, bảo quản ở chỗ tối

 Dung dịch iod chuẩn :

o Dung dịch A (có hàm lượng iod 100 g/ml): Hoà tan 0.168g KIO3 trong nước cất tới vừa đủ 1000ml Bảo quản trong tủ lạnh

o Dung dịch B (có hàm lượng iod 0,5 g/ml ): Trộn 0.5ml dung dịch A với nước cất tới vừa đủ 100ml Bảo quản trong tủ lạnh

HUPH

o Trước khi xét nghiệm, từ dung dịch iod chuẩn B, pha các dung dịch iod chuẩn 20, 50, 100, 150, 200 và 300 gI/l

2.4 Thiết bị

 Quang phổ kế có giải sống đo từ 340 đến 600nm

 Bể đốt khô có nhiệt độ lên tới 110oC hoặc 200oC

 Tủ hốt hút khí hơi độc

 Cân phân tích có sức cân 200g với độ chính xác 0,1mg

 Các pipet và các bình phân phối dung dịch tự động

 Máy trộn

 Máy khuấy từ gia nhiệt

 Ống nghiệm thuỷ tinh chịu nhiệt kích cỡ 13x100mm

 Cốc, phễu, chai lọ thuỷ tinh không màu và có màu

 Bình định mức 100ml; 1000ml

2.5 Quy trình xét nghiệm

 Giai đoạn tiêu khử

 Các dung dịch iod chuẩn, nước tiểu kiểm tra (QC) và các mẫu nước tiểu được để ở nhiệt độ phòng

 Trộn kỹ các mẫu nước tiểu

 Lấy 250 µl dung dịch iod chuẩn, nước tiểu kiểm tra và nước tiểu vào các ống nghiệm thuỷ tinh 13x100mm

 Thêm 1000 µl dung dịch APS vào mỗi ống, trộn đều

 Đun nóng tất cả các ống nghiệm trong bể đốt khô ở nhiệt độ 91-95oC trong thời gian 30 phút

 Để nguội các ống nghiệm về nhiệt độ phòng

 Sau khi cho CAS vào ống thứ nhất 30 phút đọc độ ABS trên quang phổ kế với bước sóng 420nm và cứ tuần tự đọc ABS của các ống tiếp theo đúng 30 giây như khi cho CAS

2.6 Cách tính kết quả

Xây dựng đường cong chuẩn iod: trục tung là mật độ quang học ABS và trục hoành là nồng độ iod của các chuẩn iod (có thể chuyển đổi) Có thể dùng đường cong chuẩn dưới dạng logarit hóa

Dựa vào đường cong chuẩn iod nói trên, đọc nồng độ iod của các mẫu kiểm tra

và các mẫu nước tiểu trên trục hoành ứng với ABS tương ứng

2.7 Biện luận: Đánh giá tình trạng thiếu iod

Phân loại tình trạng thiếu iod Hàm lượng iod niệu (Median)

Thiếu iod nhẹ từ 5 đến 9.9 µgI/dl

Thiếu iod vừa từ 2 đến 4.9 µgI/dl

Thiếu iod nặng ˂ 2 µgI/dl

HUPH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Pino Sam, Fang SL, Braverman L.: Ammoniumpersulfate: a safe alternative oxidizing reagent for measuring urinary iodine.- Clin Chem 1996;42: 239-243

2 ICCIDD/UNICEF/WHO (2001): A guide for programme managers -Second

BÀI 4: XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ NĂNG LƯỢNG CỦA THỨC ĂN

I XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ NĂNG LƯỢNG CỦA THỨC ĂN BẰNG BOM

CALOR

1.1 Nguyên lý

Năng lượng đo được bằng bom calo gọi là năng lượng thô (Gross energy) của thực phẩm, nó biểu thị tổng năng lượng hoá học của thực phẩm thông qua đốt cháy carbohydrate, lipid, protein và rượu chuyển sang nhiệt khi bị đốt cháy Lượng nhiệt thải

ra đo bằng bom calorie

1.2 Thiết bị, dụng cụ

Sau khi học xong bài học này, sinh viên có khả năng:

1 Trình bày được nguyên tắc, các bước tiến hành, nhận định kết quả của xét nghiệm xác định giá trị năng lượng của thức ăn

2 Thực hiện đúng các bước của quy trình xét nghiệm xác định giá trị năng

lượng của thức ăn

3 Đọc và hiểu đúng kết quả xét nghiệm xác định giá trị năng lượng của thức ăn

HUPH

 Pank

 Cốc thủy tinh chuyên dụng

 Găng tay

1.3 Quy trình thực hiện:

 Cân một lượng thức ăn (tương đương 20 g) thực phẩm để vào cốc chuyên dụng

 Đặt cốc đựng thức ăn vào trong khối hình trụ bằng thép của bom calor

 Đóng chặt bom và cho oxy vào với áp suất cao

 Đặt bom vào thùng nước có thành làm bằng chất cách nhiệt tốt

 Mở nguồn điện nối với bom calor để đốt cháy thức ăn trong cốc

 Lượng nhiệt thải ra đo bằng lượng tăng nhiệt của nước trong thùng

1.4 Tính kết quả:

 Ghi nhận lượng tăng nhiệt độ của nước trong bom calor sau khi đốt cháy hoàn toàn thức ăn trong cốc

 Khi đốt ở bom calorie:

o 1g carbohydrate cho 4,1 Kcal (16,74 kJ) → glucose 3,9 Kcal

o 1g lipid cho 9,1 Kcal (37,66 kJ)

o 1g protein cho 4,1 Kcal (16,74 kJ)

o 1g rượu ethylic cho 7,1 Kcal

Cả 3 loại chất dinh dưỡng sinh nhiệt qua oxy hoá trong cơ thể đều sinh ra năng lượng, và cả 3 loại đều có thể chuyển hoán được cho nhau trong quá trình chuyển hoá, nhưng không thể thay thế nhau hoàn toàn, trong các bữa ăn hợp lý cần phải có sự phân bổ theo một tỷ lệ thoả đáng

Giá trị năng lượng được biểu thị bằng kilocalori (Kcal) Nếu chuyển thành kilojoul (Kj) thì tính theo hệ số 1Kcal=4,184 Kj HUPH

II XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ NĂNG LƯỢNG THỨC ĂN BẰNG OXY HÓA VỚI ACID CHROMIC

2.1 Nguyên lý

Xác định giá trị năng lượng của thực phẩm bằng việc oxy hóa với dung dịch

K2Cr2O7 trong acid sulfuric Giá trị năng lượng được tính bằng lượng K2Cr2O71.5N được sử dụng để ôxy hóa 1g mẫu dựa vào hàm lượng protein Kỹ thuật này là đơn giản, nhanh chóng, áp dụng đối với số lượng lớn các mẫu và cho kết quả phù hợp tốt với những kết quả được đo bằng bom nhiệt lượng

2.2 Phạm vi áp dụng: Thực phẩm, thức ăn chăn nuôi có hàm lượng từ 0 đến 100% 2.3 Thiết bị, dụng cụ

 Cân phân tích

 Dung dịch Kali Iodine

 Cân chính xác 100g KI và 32g NaHCO3 hòa tan hoàn toàn trong nước cất và định mức 500mL Dung dịch này cũng được chuẩn bị và dùng ngay trong ngày

 Natri thiosulphate 0,15N: được chuẩn bị và dùng ngay trong ngày

2.5 Chuẩn bị mẫu

 Cân mẫu thức ăn

 Trộn, nghiền mịn mẫu thức ăn

Lưu ý: Tất cả mẫu được cân để phân tích tại một thời điểm để loại trừ các sai số gây ra bởi độ ẩm

2.6 Tiến hành

 Lấy 0,5 g mẫu đã được nghiềm nhỏ và chuẩn bị như tromg mục 4, cho vào bình tam giác 1000mL, đã được hiệu chỉnh ở mức vạch 1100 mL

HUPH

 Thêm 80ml K2Cr2O7 1,5N vào bình bằng buret

 Thêm tiếp 160 ml acid sulfuric bằng ống đong

 Thực hiện song song với mẫu trắng là các dung dịch oxi hóa

 Lắc đều và liên tục bình định mức trong 1,5h

 Chuẩn bị dung dịch oxy hóa đã được pha loãng, làm nguội Đổ đầy dung dịch oxy hóa pha loãng đến 1100 mL

 Lấy 100mL dung dịch thu được từ mỗi bình, thêm vào 40 mL dung dịch KI

 Để trong bóng tối trong 25 phút

 Pha loãng huyền dịch thu được với 200 mL nước cất và chuẩn độ iod tự do với Natri thiosulphate 0,15N chỉ thị hồ tinh bột Lượng K2Cr2O7 1,5N dư sẽ được tính toán từ chuẩn độ và được trừ vào giá trị mẫu trắng để có được lượng K2Cr2O7 1,5N đã được sử dụng trong quá trình oxy hóa

Bảng I Giá trị năng lượng trên mẫu có hàm lượng béo không quá 10%

Vật liệu % protein tính

trên chất khô

K2Cr2O7 1,5N (ml/g) oxy hóa liệu thô

Năng lượng (cal/g) vật thô

Sản phẩm từ đậu tương 85,32 85,32 3989,5

Bảng II Giá trị năng lượng trên mẫu có hàm lượng béo trên 10%

Vật liệu % protein tính

trên chất khô

% lipid tính trên chất khô

K2Cr2O7 1,5N (ml/g) oxy hóa liệu thô

Năng lượng (cal/g) vật thô

 Với độ lệch chuẩn là 0,18 và khi hàm lượng chất béo > 10%, tổng năng lượng được tính theo công thức:

C =24,02 – 0,1055P + 0,000621P2

 Với độ lệch chuẩn 0,25 (P là % protein)

HUPH

III XÁC ĐỊNH GIÁ TRỊ NĂNG LƯỢNG TRONG THỨC ĂN THÔNG QUA

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM CÁC CHẤT SINH NĂNG LƯỢNG

Điều kiện tiên quyết của quy trình này yêu cầu xác định hàm lượng các chất sinh năng lượng trong thực phẩm (protein, lipid, glucid)

3.1 Nguyên lý

 Các chất sinh năng lượng trong thức ăn khi đốt chát sẽ giải phóng ra năng lượng nhất định cung cấp cho các hoạt động của cơ thể

 Giá trị năng lực của thực phẩm được tính theo các hệ số sau:

o 1g protein cho 4 Kcal,

o 1g lipid cho 9 Kcal,

o 1g glucid cho 4 Kcal,

o 1g cồn (alcol etylic) cho 7 Kcal

 Giá trị năng lượng: Được biểu thị bằng Kilocalori (Kcal) Nếu chuyển thành kilojoul (Kj)

o Thì tính theo hệ số: 1 Kcal =4,184Kj

o Trong đó:

Protein: Được xác định theo tổng số nitơ trong thực phẩm theo phương pháp Kjeldahl,

sau đó được chuyển đổi theo protein theo hệ số:

Loại thực phẩm Hệ số chuyển đổi Loại thực phẩm Hệ số chuyển đổi

Thực phẩm ngũ cốc, đậu

Lipid: Được xác định bằng phương pháp chiết Soxhlet

Glucid tổng số: Được tính toán theo công thức: Glucid = 100-(nước + protein + lipid +

3.3 Phương pháp thực hiện

(Chi tiết xem bài 5)

3.4 Tính kết quả

 Giá trị năng lượng thức ăn (Kcal):

C=m1*4 + m2*9 + m3*4

 Trong đó:

o m1: hàm lượng protein trong mẫu thực phẩm

o m2: hàm lượng lipid trong mẫu thực phẩm

o m3: hàm lượng glucid trong mẫu thực phẩm

HUPH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Lê Thị Hương (2012), Xét nghiệm Dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm,

NXB Y học, Hà Nội

2 Phạm Duy Tường (2012), An toàn vệ sinh thực phẩm, NXB Y học, Hà Nội

3 Phạm Duy Tường (2012), Dinh dưỡng và an toàn vệ sinh thực phẩm, NXB Y học,

6 TCVN 6668-2 (ISO 8262-2), Sản phẩm sữa và thực phẩm từ sữa - Xác định hàm lượng chất béo bằng phương phấp khối lượng Weibull-berntrop (phương pháp chuẩn) Phần 2: Kem lạnh và kem lạnh hỗn hợp

7 TCVN 6668-3 (ISO 8262-3), Sản phẩm sữa và thực phẩm từ sữa - Xác định hàm lượng chất béo bằng phương phàp khối lượng Weibull-berntrop (phương pháp chuẩn) - Phần 3: Các trường hợp đặc biệt

8 TCVN 6687 (ISO 8381), Thực phẩm từ sữa dành cho trẻ em nhỏ - Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp khối lượng của Rose-Gottlieb (phương pháp chuẩn)

HUPH

BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN, LIPID, CARBOHYDRATE TRONG THỰC

1.2 Thiết bị, dụng cụ

 Ống vô cơ hóa mẫu (ống Kjeldahl) Dung tích từ 250 ml

 Ống chưng cất mẫu Tương tự như ống vô cơ hóa mẫu, nhưng phía trên được đậy bằng nắp cao su và được nối với ống dẫn trọng hệ thống cất Sử dụng bình nón 500

ml để hứng dung dịch chảy ra từ hệ thống cất

 Bếp vô cơ hóa mẫu Có thể điều chỉnh nhiệt độ theo chương trình

 Bộ phận chưng cất mẫu

 Cân phân tích

 Pipet tự động

 Buret chuẩn độ

Sau khi học xong bài học này, sinh viên có khả năng:

1 Trình bày được nguyên tắc, các bước tiến hành, nhận định kết quả của xét nghiệm định lượng protein, lipid, glucid trong thực phẩm

2 Thực hiện đúng các bước của quy trình xét nghiệm định lượng protein, lipid, carbonhydrate trong thực phẩm

3 Đọc và hiểu đúng kết quả xét nghiệm định lượng protein, lipid,

carbonhydrate trong thực phẩm

HUPH

 Dung dịch xúc tác đồng sulfat CuSO4.5H2O Không chứa nitơ Pha dung dịch 0.05 g/mL trong nước

 Kali sulfat K2SO4 Không chứa nitơ

 Dung dịch natri hydroxid 50% theo khối lượng

 Đá bọt thủy tinh

 Dung dịch chỉ thị màu methyl red/bromocresol green Hòa tan 0.2 g methyl red và pha loãng thành 100 mL trong ethanol 95% Hòa tan 1.0 g bromocresol green và pha loãng thành 500 mL trong ethanol 95% Trộn 1 phần dung dịch methyl red với 5 phần dung dịch bromocresol green

 Dung dịch boric acid 4% Hòa tan 40 g H3BO3 và pha loãng thành 1 lít trong nước cất, thêm 3 mL hỗn hợp chỉ thị methyl red/bromocresol green Dung dịch sẽ có màu

da cam nhạt

 Dung dịch chuẩn acid hydrochloric 0.1000N Sử dụng ống chuẩn

 Ammonium sulfat 99.9% (NH4)2SO4

 Tryptophan hoặc lysine hydrochloride 99% C11H12N2O2 hoặc C6H15CN2O2

 Đường sucrose Không chứa nitơ

1.4 Chuẩn bị mẫu

 Thêm 12g K2SO4, 1 mL CuSO4 5H2O và 8-10 viên đá bọt vào ống Kjeldahl

 Cân 1-5+0.1 g mẫu (ghi lượng cân chính xác tới 0.0001 g) và chuyển ngay vào bình Kjeldahl

 Thêm 20 mL H2SO4, nếu còn mẫu dính ở cổ hoặc thành ống, cần rửa hết xuống đáy

Có thể đậy nắp ống Kjeldahl và chờ đến khi vô cơ hóa

 Tiến hành song song đối với mẫu trắng (có đầy đủ hóa chất như trên nhưng không chứa mẫu) cùng thời gian với mẫu thử

1.5 Các bước tiến hành

 Vô cơ hóa mẫu:

 Ban đầu, đặt nhiệt độ của bếp vô cơ hóa mẫu thấp (khoảng 180-230oC) để giảm sự trào bọt ra ngoài Đốt trong 30 phút đến khi có khói trắng

 Tăng nhiệt độ lên 410-430oC và đốt đến khi mẫu trắng Chú ý không để bọt sôi lên quá cao quá (cách bộ phận hút khí 4-5 cm)

 Sau khi mẫu trắng hoàn toàn, tiếp tục đốt tiếp ít nhất 1 giờ Tổng thời gian đốt mẫu khoảng 1.75-2.5 giờ

HUPH

 Sau khi vô cơ hóa, mẫu phải trong suốt và không màu

 Để nguội, có thể thấy toàn bộ mẫu là một dung dịch đồng nhất và có vài tinh thể ở đáy ống Nếu có quá nhiều tinh thể ở đáy là biểu hiện acid H2SO4 quá ít và có thể dẫn đến sai số thiếu Để giảm bớt sự mất mát acid trong quá trình vô cơ hóa, điều chỉnh để tốc độ hút khí không quá lớn Sau khi mẫu đã trắng hoàn toàn, để nguội đến nhiệt độ phòng, thêm 85 ml nước cất (đối với mẫu trắng thêm 100 ml nước cất) vào mỗi ống Lắc để trộn đều, để nguội đến nhiệt độ phòng Trong điều kiện này, bình thường trong ống có thể hình thành một số tinh thể nhưng không ảnh hưởng đến kết quả Đậy nắp các ống chứa mẫu và chuẩn bị cho qua trình chưng cất

 Chưng cất mẫu:

 Chuyển dung dịch NaOH 50% (hoặc 40%) vào bình chứa trong hệ thống cất Đặt thể tích phân phối NaOH là 55ml (hoặc 65 mL đối với dung dịch NaOH 40%)

 Lắp ống chứa mẫu đã thủy phân vào hệ thống cất Đặt bình nón 500 ml chứa 50 ml dung dịch H3BO3 với chất chỉ thị vào vị trí hứng mẫu, chú ý để đầu ra ống chưng cất nhúng ngập trong dung dịch H3BO3

 Bắt đầu cất đến khi thu được >150 mL (tổng thể tích > 200 mL) Lấy dịch cất thu được và chuẩn độbằng dung dịch chuẩn HCl 0.1000N đến khi thấy xuất hiện màu hồng nhạt Ghi lại số ml HCl với độ chính xác đến 0.05 mL

1.6 Xác định độ thu hồi nitơ

 Cần xác định độ thu hồi nitơ để kiểm tra độ chính xác của quy trình và thiết bị

 Kiểm tra sự mất mát nitơ Cân 0.12 g ammonium sulfate và 0.85 g sucrose vào ống Kjeldahl

 Thêm các thuốc thử khác và tiến hành như mục vô cơ hóa mẫu

 Vô cơ hóa mẫu và chưng cất với cùng điều kiện như trên Độ thu hồi phải đạt tối thiểu 99%

 Kiểm tra hiệu năng của quá trình vô cơ hóa Sử dụng 0.16 g lysine hydrochloride hoặc 0.18 g tryptophan, với 0.67 g sucrose cho mỗi bình Kjeldahl Tiến hành các giai đoạn vô cơ hóa và chưng cất như trên Độ thu hồi tối thiểu phải đạt là 98%

1.7 Tính toán kết quả

 Hàm lượng nitơ toàn phần trong mẫu được tính theo công thức sau:

1.4007 x (số mL HCL/mẫu - mL HCL/mẫu trắng) x nồng độ HCL

HL nitơ g % = -

HUPH