Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật cắt lạnh tại trung tâm giải phẫu bệnh và tế bào học bệnh viện bạch mai

Với tiêu bản kỹ thuật cắt lạnh, các nhà giải phẫu bệnh có thể nhận biết được tế bào là bình thường hay bất thường về hình thái, cấu trúc cũng như sự hoạt động của chúng thông qua các phư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

PHẠM TIẾN ĐẠT

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KỸ THUẬT CẮT LẠNH

TẠI TRUNG TÂM GIẢI PHẪU BỆNH VÀ TẾ BÀO HỌC

BỆNH VIỆN BẠCH MAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Hà Nội – 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

PHẠM TIẾN ĐẠT

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KỸ THUẬT CẮT LẠNH

TẠI TRUNG TÂM GIẢI PHẪU BỆNH VÀ TẾ BÀO HỌC

BỆNH VIỆN BẠCH MAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Khóa: QH.2019.XN Người hướng dẫn: TS BS Phạm Văn Tuyến

ThS Ninh Văn Quyết

Hà Nội – 2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: Ban giám hiệu, các Phòng ban – Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội cùng toàn thể các thầy cô giáo trong trường đã cho em những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường

Bệnh viện Bạch Mai, đặc biệt là Trung tâm Giải phẫu bệnh và Tế bào học đã tạo điều kiện tối đa để em có thể thực hiện khóa luận này

Em xin trân trọng cảm ơn thầy TS BS Phạm Văn Tuyến đã luôn hướng

dẫn chỉ bảo tận tình, đã cho em nhiều ý kiến nhận xét quý báu cũng như truyền đạt cho em tình thần làm việc hăng say, nghiêm túc trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy ThS Ninh Văn Quyết đã dành nhiều

thời gian, tâm huyết, tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Em cũng xin bày bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình thân, bạn bè đã luôn cạnh bên, động viên, khích lệ và ủng hộ em về mặt vật chất lẫn tinh thần để em

có thể hoàn thành được khóa luận này

Cuối cùng em xin kính chúc thầy cô luôn mạnh khỏe, công tác tốt, và luôn là những người giúp đỡ các thế hệ sinh viên sau này để các em là những người có ích cho đất nước và xã hội

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2023

Sinh viên

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đề tài: “ Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật cắt lạnh tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Tế bào học Bệnh viện Bạch Mai” là nghiên cứu do em tự thực hiện dưới sự hướng dẫn của thầy TS BS Phạm Văn Tuyến và thầy ThS Ninh Văn Quyết

Em xin cam đoan khóa luận này được tiến hành một cách trung thực, nghiêm túc, tuân thủ các đạo đức nghiên cứu

Em xin cam đoan tất cả số liệu trong khóa luận được thu thập một cách trung thực từ Trung tâm Giải phẫu bệnh và Tế bào học Bệnh viện Bạch Mai Các tài liệu tham khảo trong quá trình nghiên cứu được trích dẫn và ghi chú rõ ràng

Nếu có bất cứ sự gian lận nào không đúng với những điều trên, em xin chịu hoàn toàn trách nghiệm về nội dung khóa luận của mình

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2023

Sinh viên

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Máy cắt lạnh Leica CM1950 tại Trung tâm Giải Phẫu bệnh và Tế bào

học Bệnh viện Bạch Mai 13

Hình 1.2 Các bảng điều khiển bên ngoài và buồng máy của máy cắt lạnh

Leica CM1950 14

Hình 1.3 Kệ làm lạnh và thiết bị rút 14

Hình 1.4 Bộ phận cắt (máy cắt lạnh Leica CM1950) 15

Hình 1.5 Bộ phận tay quay 15

Hình 1.6 Thiết bị rút nhiệt 16

Hình 1.7 Khay giữ mẫu bệnh phẩm 16

Hình 1.8 Gel cắt lạnh Cryobloc và bình xịt làm lạnh nhanh 17

Hình 1.9 Bệnh phẩm sau phẫu tích chuẩn bị cho cắt lạnh 20

Hình 1.10 Dìm mô bệnh phẩm 21

Hình 1.11 Tạo khối mô cắt lạnh 22

Hình 1.12 Bảng thang nhiệt độ kiến nghị bởi hãng Leica [2] 23

Hình 1.13 Đặt khối mô cố định vào giá chuẩn bị cắt lạnh 24

Hình 1.14 Lưỡi dao cắt phá và lưỡi dao cắt mảnh 25

Hình 1.15 Cắt phá khối mô 25

Hình 1.16 Kỹ thuật bàn chải chuyển động liên tục 26

Hình 1.17 Lấy mảnh cắt 27

Hình 3.1 Lỗi nhăn gấp mô hạch AI1769 H&E 36

Hình 3.2 Biểu hiện lỗi rách, mất mô hạch AI1769 H&E 36

Hình 3.3 Tiêu bản mô tuyến giáp đạt chất lượng AH0841 H&E 37

Hình 3.4 Biểu hiện lỗi nhăn, gấp mô tuyến giáp AH4662 H&E 38

Hình 3.5 Biểu hiện lỗi rách, mất mô tuyến giáp AI1268 H&E 38

Hình 3 6 Chi tiết nhân và bào tương không đạt ở mô tuyến giáp AG0790 H&E 39

Hình 3.7 Chi tiết nhân và bào tương đạt ở mô hạch AI1268 H&E 40

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 3.1 Số liệu mẫu mô nghiên cứu 34

Bảng 3.2 Biểu hiện các lỗi trên mô hạch 34

Bảng 3.3 Biểu hiện các lỗi trên mô tuyến giáp 34

Bảng 3.4 Biểu hiện lỗi trên chi tiết nhân và bào tương mô hạch 34

Bảng 3.5 Biểu hiện lỗi trên chi tiết nhân và bào tương mô tuyến giáp 35

Biểu đồ 3.1 Biểu hiện các lỗi trên tiêu bản cắt lạnh mô hạch 35

Biểu đồ 3.2 Biểu đồ tỷ lệ các lỗi trên tiêu bản cắt lạnh mô tuyến giáp 37

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

FS Frozen section (Kỹ thuật cắt lạnh)

H&E Hematoxylin và Eosin

Microtome Máy cắt

OCT Optimal cutting temperature (Gel cắt lạnh)

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về kỹ thuật cắt lạnh 3

1.1.1 Khái niệm và lịch sử kỹ thuật cắt lạnh 3

1.1.2 Cơ sở khoa học 4

1.1.3 Ứng dụng và chỉ định của kỹ thuật cắt lạnh 5

1.1.4 Những ưu nhược điểm và hạn chế của kỹ thuật cắt lạnh 8

1.1.5 Kỹ thuật cắt lạnh và kỹ thuật chuyển đúc thường quy 9

1.1.6 Trang thiết bị phục vụ kỹ thuật cắt lạnh 12

1.1.7 Quy trình thực hiện kỹ thuật cắt lạnh tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Tế bào học bệnh viện Bạch Mai 18

1.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến tiêu bản cắt lạnh 29

1.2.1 Nhiệt độ của Block 29

1.2.2 Độ dai và độ cứng của mô 29

1.2.3 Độ dày của lát cắt 30

1.2.4 Các vết xước, rách mô 30

1.2.5 Cố định mảnh cắt 30

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Địa điểm nghiên cứu 31

2.2 Thời gian nghiên cứu 31

2.3 Đối tượng nghiên cứu 31

2.3.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 31

2.4 Phương pháp nghiên cứu 31

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu 31

2.4.2 Cỡ mẫu 32

2.5 Phương pháp thu nhập số liệu 32

2.6 Quy trình nghiên cứu 32

2.7 Các chỉ số/ biến số nghiên cứu 32

2.7.1 Chỉ số nghiên cứu 32

2.7.2 Biến số nghiên cứu 33

2.8 Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34

3.1 Kết quả đánh giá mô cắt lạnh 34

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tiêu bản cắt lạnh 34

3.2.1 Biểu hiện lỗi trên tiêu bản cắt lạnh mô hạch 35

3.2.2 Biểu hiện của lỗi trên tiêu bản cắt lạnh mô tuyến giáp 37

3.3 Ảnh hưởng của dung dịch cố định tới tiêu bản cắt lạnh 39

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 40

4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với mảnh cắt mô bệnh 41

4.1.1 Sự xuất hiện lỗi trên mô hạch 41

4.1.2 Sự xuất hiện lỗi trên mô tuyến giáp 42

4.2 Sự xuất hiện lỗi ở nhân và bào tương tế bào khi sử dụng dung dịch cố định trên tiêu bản cắt lạnh 43

KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

Kỹ thuật cắt lạnh (Frozen Section) là kỹ thuật mô bệnh học nhanh, thường áp dụng trong định hướng phẫu thuật Với tiêu bản kỹ thuật cắt lạnh, các nhà giải phẫu bệnh có thể nhận biết được tế bào là bình thường hay bất thường về hình thái, cấu trúc cũng như sự hoạt động của chúng thông qua các phương pháp nhuộm nhanh Đây là một trong những kỹ thuật phát triển và phổ biến hàng đầu trong giải phẫu bệnh, là trợ thủ đắc lực giúp các nhà giải phẫu bệnh có thể xác định bản chất, quy luật phát sinh và phát triển của tổn thương

tế bào và mô góp phần hỗ trợ chẩn đoán, định hướng phẫu thuật nhằm nâng cao

hiệu quả điều trị

Theo dòng phát triển của y học hiện đại, trong lĩnh vực Giải phẫu bệnh

có nhiều kỹ thuật chẩn đoán mô bệnh học và tế bào học, tuy nhiên trong nhiều trường hợp, việc thực hiện kỹ thuật cắt lạnh trên mảnh sinh thiết rất có ý nghĩa Hiện nay tại Việt Nam, vị trí của giải phẫu bệnh trong sàng lọc và chẩn đoán ngày một quan trọng, các cơ sở y tế có khoa ung bướu nhất thiết phải có kỹ thuật cắt lạnh trong xét nghiệm sinh thiết tức thì nhằm hỗ trợ phẫu thuật, đáp ứng nhiệm vụ y tế và vì sức khỏe người bệnh

Bên cạnh kỹ thuật hiển vi thông thường bằng mảnh cắt paraffine sử dụng với mô bệnh học thường quy, kỹ thuật cắt lạnh là công cụ giá trị được sử dụng

để xử lý mô nhanh chóng, tức thì, làm ra tiêu bản cắt mô phục vụ chẩn đoán nhanh Kỹ thuật cắt lạnh đã được sử dụng ở nhiều cơ sở y tế và nghiên cứu Trong bệnh lý ngoại khoa, các mảnh cắt đông lạnh được thực hiện tức thì trong phẫu thuật thường được sử dụng để chẩn đoán nhanh, cung cấp hướng dẫn cho phẫu thuật viên lựa chọn phương pháp phẫu thuật và điều trị [1] Trong phẫu thuật hiển vi, các phẫu thuật viên phụ thuộc rất nhiều vào kết quả kỹ thuật mảnh cắt đông lạnh để xác định mức độ cắt bỏ cần thiết nhằm loại bỏ khối ung thư [1] Nhiều nghiên cứu được tiến hành với nỗ lực áp dụng các kỹ thuật cao và phức tạp về hình thái học, hoá mô miễn dịch và sinh học phân tử, dựa trên các mảnh cắt đông lạnh

Khác với kỹ thuật vi thể thông thường, kỹ thuật cắt lạnh do yêu cầu về mặt thời gian, đặc tính kỹ thuật cũng như mô bệnh, chịu ảnh hưởng lớn từ rất

2

nhiều các yếu tố nổi trội như là tốc độ làm đông lạnh mô, nhiệt độ duy trì mô

và buồng cắt, kích thước và định hướng mô, kỹ thuật cá nhân của kỹ thuật viên,

sự cố định mảnh cắt trên lam kính tức thì, [1], [2] Những yếu tố này tuy nhiên lại phụ thuộc vào điều kiện riêng biệt từng labo Giải phẫu bệnh

Với một khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Kỹ thuật Y học, em đã tiến hành thực hiện đề tài: “ Đánh giá một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật cắt lạnh tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Tế bào học Bệnh viện Bạch Mai” với 2 mục tiêu chính:

1 Mô tả quy trình áp dụng kỹ thuật cắt lạnh trên mẫu mô phẫu thuật tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Tế bào học Bệnh viện Bạch Mai

2 Nhận xét, đánh giá kết quả cắt lạnh dưới tác động của nhiệt độ đông lạnh mẫu và dung dịch cố định mảnh cắt đến chất lượng tiêu bản cắt lạnh

3

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kỹ thuật cắt lạnh

1.1.1 Khái niệm và lịch sử kỹ thuật cắt lạnh

1.1.1.1 Khái niệm kỹ thuật cắt lạnh

Trong quá trình thực hiện các phẫu thuật, đôi khi cần có chẩn đoán nhanh

về tình trạng bệnh lý qua mô bệnh học Phẫu thuật viên cần biết việc cắt bỏ khối u, đặc biệt là u ác tính đã đạt yêu cầu hay chưa ( diện cắt còn u hay không, xác định có cắt thùy còn lại trong ung thư tuyến giáp, ) trước khi đóng lại, hay một diễn biến bệnh bất ngờ có thể được tìm thấy (các xâm lấn u tới các phủ tạng, mô xương, khối u chưa xác định đã thu nhập đúng mô phù hợp hay chưa [2] Điều này đòi hỏi một kỹ thuật chẩn đoán mô bệnh học nhanh chóng, tức thì Chính vì lẽ đó một kỹ thuật đảm bảo được các yêu cầu trên được ra đời, là

kỹ thuật cắt lạnh

Nguyên lý của kĩ thuật cắt lạnh là sự làm lạnh nhanh khiến nước chuyển

từ lỏng sang rắn trong mẫu mô, đóng vai trò như chất trung gian giữ hình dạng (khung) của mô, vì thế mô trở nên cứng và có thể cắt mỏng được Kỹ thuật cắt lạnh là kỹ thuật cắt mô nhanh bằng cách làm lạnh mô bởi nhiệt độ âm sâu dưới

sự trợ giúp của máy cắt lạnh Máy cắt lạnh là thiết bị vừa có chức năng làm đông lạnh bệnh phẩm đồng thời thực hiện được các lát cắt lạnh và gắn vào tiêu bản

Kỹ thuật cắt lạnh được tiến hành với các mẫu mô lấy ra khỏi cơ thể, chưa được cố định, chuyển đến labo Giải phẫu bệnh trong thời gian ngắn nhất và được đông lạnh nhanh chóng, cắt mảnh bằng máy cắt, nhuộm màu ngay lập tức

để chẩn đoán mô bệnh học nhanh các tổn thương, đặc biệt là tổn thương ác tính

Mô bệnh học được xử lý theo cách này sẽ không phù hợp đối với nghiên cứu chi tiết của tế bào, nhưng có giá trị bởi nó nhanh chóng, và cung cấp được cho phẫu thuật viên ngay lập tức thông tin liên quan đến sự ác tính của mô [2],[3]

1.1.1.2 Lịch sử kỹ thuật cắt lạnh

Lần đầu tiên sử dụng việc đóng băng để làm cứng các mô từ thế kỷ XIX

De Riemer năm 1818 đã tiên phong sử dụng FS để chẩn đoán mô bệnh học [2], [4] Kỹ thuật được Hazard và Stevenson giới thiệu vào năm 1949 với mẫu mô

4

tươi được đặt trong chất cố định có thể tích gấp mười Khối cố định sau đó được đông cứng giữa các miếng băng khô và cắt với độ dày 10-15µm Mỗi mảnh được chuyển vào một cốc nước cất Các mảnh sau đó được thực hiện bởi một que thủy tinh và một cốc có chứa carbol fucshin và dung dịch xanh toluidine, gắn vào một miếng kính sạch và ngay lập tức được bao phủ bằng dung dịch 30% đường sucrose, gắn lamen Quá trình này kéo dài trong một giờ và có thể

được bảo quản trong vài ngày [2], [4], [5]

Teloh HA đã hoàn thiện kỹ thuật này vào năm 1957 bằng cách trực tiếp đặt mẫu mô chưa trộn vào giai đoạn đóng băng bằng bốc hơi liên tục của khí carbon dioxide, gây đông lạnh nhanh Mẫu mô sau đó được cắt ở 25µm và nhuộm bằng cách thả dung dịch thionin Màu sắc phẩm nhuộm thionin sẽ biến

mất sau khoảng 48 giờ [4], [5]

Sự phát triển của máy cắt lạnh vào năm 1959, đã cách mạng hóa kỹ thuật

FS Phần nước ở trong mô được đông lạnh để tạo ra một ma trận cứng, làm nền cho việc cắt mô Các mảnh mô được cắt và thu nhập gắn trên lam kính, sẵn sàng để nhuộm màu [3], [5]

1.1.2 Cơ sở khoa học

Chẩn đoán mô bệnh học thường quy trong các xét nghiệm mô bệnh học hiện nay phần lớn được xác định bằng việc quan sát hình thái và cấu trúc, cách sắp xếp các tế bào trong mô Để đạt được quan sát chi tiết ở từng tế bào, yêu cầu bắt buộc là mô bệnh học phải được cắt thành những lát rất mỏng, độ dày 3-

5 µm, tương đương với một lớp tế bào, nhuộm màu và quan sát dưới kính hiển

vi quang học

Vấn đề được giải quyết qua quá trình chuyển bệnh phẩm Sử dụng paraffine làm chất nền cho bệnh phẩm, xâm nhập vào trong tế bào và làm khuôn giữ cho thành phần cũng như tổ chức mô được giữ nguyên khi cắt mảnh, chống lại sự thay đổi mối liên quan giữa tế bào và tổ chức do tác động của lưỡi dao [2], [6] Tuy nhiên, quá trình chuyển bệnh phẩm trải qua quá trình nhiều bước liên tiếp, phụ thuộc vào tốc độ ngấm hóa chất của mô, độ dày và tính chất của

mô, kéo dài ít nhất một vài tiếng, không thể đáp ứng nhu cầu cần kết quả ngay lập tức như đã đề ra

5

Một chất nền tồn tại ngay trong mô tại thời điểm làm xét nghiệm mà vẫn tạo được độ cứng cần thiết để phục vụ việc cắt mảnh là rất cần thiết để có được kết quả bệnh học nhanh và chính xác Tính chất mô học của cơ thể được cấu tạo bởi khoảng 70% là nước, người ta sử dụng nước bị đông đá ở nhiệt độ âm

để làm nên cho việc cắt mảnh Kết hợp với dung dịch Gel cắt lạnh (Optimal cutting temperature compound) len lỏi vào những khoảng trống của mô và lấp đầy chúng, tạo thành khối bao gồm mô bệnh và Gel Gel cắt lạnh được sản xuất nhằm mục đích hướng tới sự đồng nhất về độ cứng giữa khối Gel và mô cắt, đồng thời cũng là một chất dẫn nhiệt để làm lạnh đều và nhanh chóng mô bệnh Gel cắt lạnh không ngấm được vào mô ở cấp độ tế bào, không có tác động cố định bệnh phẩm cũng như làm nền cho quá trình cắt Chất Gel này sẽ bị loại bỏ

dễ dàng sau quá trình rửa trôi bằng nước và không ảnh hưởng đến sự cố định lại mô trong dung dịch formol [2], [7]

Mô bệnh sau khi được tạo khối và đông lạnh, được tiến hành cắt mảnh bởi máy cắt lạnh với nguyên lý giống với cắt mảnh thường quy Các mảnh cắt

ở đây đòi hỏi sự phức tạp và khéo léo hơn để chống lại hiện tượng bị cuộn mảnh Mảnh cắt được dán vào lam kính, cố định và tiến hành nhuộm màu Có nhiều phương pháp nhuộm được đưa ra, quá trình nhuộm mô bằng Hematoxylin

& Eosin kéo dài khoảng 3 phút, nhiều hơn so với nhuộm một màu xanh Toluidine Tuy nhiên hình thái tế bào cũng rõ ràng, tương phản hơn trên tiêu bản nhuộm Hematoxylin & Eosin giúp các nhà Giải phẫu bệnh đưa ra chẩn đoán dễ dàng và chính xác hơn [2], [8], [9]

1.1.3 Ứng dụng và chỉ định của kỹ thuật cắt lạnh

1.1.3.1 Giá trị của kỹ thuật cắt lạnh

- Xác định bản chất của tổn thương: Để xác định xem một tổn thương là lành tính hoặc ác tính là rất quan trọng đối với phẫu thuật viên, vì điều này sẽ quyết định bước tiếp theo cần thực hiện

- Xác định sự hiện diện của tổn thương: FS đôi khi được sử dụng để xác nhận có sự hiện diện hoặc không của tổn thương trong vùng mô nghi ngờ

- Xác định sự hiện diện của tổn thương lành tính: Điều này khá quan trọng trong trường hợp tổn thương xương (những xương mềm có thể cắt lạnh

6

được) Một tổn thương lành tính cần phải được xác nhận việc kết thúc phẫu thuật Tổn thương xương ác tính thường được chẩn đoán bằng cách sử dụng sinh thiết trước phẫu thuật

- Xác định có đủ mô để chẩn đoán hay không: FS đôi khi được sử dụng

để xác định liệu các mô được gửi cho chẩn đoán mô bệnh học đã đủ để chẩn đoán hay chưa

- Thiết lập mức độ tổn thương: Chẩn đoán khối u ác tính được thực hiện tốt nhất sau khi khối u được lấy hết ra Tuy nhiên, đôi khi việc này là cần thiết ngay trong phẫu thuật để hướng dẫn xử trí tiếp theo

- Xác định sự hiện diện của tổn thương bất thường: FS cũng có thể được

sử dụng để xác định sự hiện diện của một thương tổn khác được phát hiện thêm ngay trong cuộc phẫu thuật

- Xác định độ an toàn của diện cắt: Đánh giá diện cắt phẫu thuật là rất quan trọng đối với sự phục hồi hay tái phát trong trường hợp bệnh ác tính Một

số mô bệnh ở vùng sâu, khó can thiệp, lấy hết được tổn thương là điều rất quan trọng để tránh khỏi sự tái phát nhanh chóng và khó điều trị

- Xác định bằng chứng cho tổn thương xâm lấn: Đối với các tổn thương nghi ngờ u xâm lấn, cần phải lấy mẫu mô xác định có xâm lấn, di căn hay không

1.1.3.2 Chỉ định

- Chẩn đoán nhanh khối u lành hay ác tính nhằm giúp các phẫu thuật viên quyết định các bước tiếp xử trí tiếp theo

- Đánh giá diện cắt vùng rìa khối u cho đến khi diện cắt rìa âm tính

- Đánh giá sự thoả đáng của mẫu mô trong sinh thiết từ một thủ thuật mở hoặc thủ thuật phức tạp, tránh phải làm thủ thuật lần hai khi mẫu không đạt yêu cầu

- Ngoài ra còn được dùng lập kế hoạch sử dụng mẫu, các nghiên cứu miễn dịch enzyme tế bào, huỳnh quang, hoá mô miễn dịch

7

1.1.3.3 Chống chỉ định

Dường như không có chống chỉ định tuyệt đối đối với việc sử dụng chẩn đoán FS Tuy nhiên, những hạn chế tương đối và các biện pháp phòng ngừa cần được lưu ý Trong một số trường hợp, việc chỉ định FS là không phù hợp

FS đôi khi là không cần thiết mặc dù không gây hại cho bệnh nhân (Ví dụ: phẫu thuật lần 2 cho một khối u lớn đã phẫu thuật trước đó hoặc điều trị không có kết quả, đã có kết quả mô bệnh học thường quy trước đó)

Một số chỉ định FS không những không cần thiết mà còn có khả năng gây hại cho bệnh nhân (Ví dụ: đối với các tổn thương rất nhỏ, thực hiện FS trước khi tiến hành mô thường quy không đủ mô phục vụ cho chẩn đoán mô bệnh học thường quy)

1.1.3.4 Độ chính xác của cắt lạnh

Có nhiều nghiên cứu khác nhau về giá trị của sinh thiết tức thì Hầu hết chỉ ra rằng kỹ thuật này rất đáng tin cậy nếu thực hiện tốt Hầu hết các trung tâm báo cáo tỷ lệ chính xác từ 92% đến 98% tùy thuộc vào loại trường hợp được nghiên cứu Một trung tâm lớn như Mayo Clinic Rochester, Mỹ đã báo cáo độ chính xác lên tới 97,8% khi nghiên cứu 24.880 trường hợp cắt lạnh trong một năm Độ chính xác 97,56% được ghi nhận tại một bệnh viện đa khoa ở Malaysia có 215 mẫu FS trong thời gian 4 năm [10], [11]

Các trường hợp được báo cáo khác bao gồm tỷ lệ chính xác 94% ở tồn thương thần kinh trung ương, 98,4% đối với khối u của tinh hoàn và 91,1% đối với ung thư biểu mô tế bào đáy và tế bào vảy da Độ chính xác của FS trong các trường hợp phụ khoa có thể cao tới 97,5% Tuy nhiên, riêng đối với các trường hợp diện cắt của khối u buồng trứng, tỷ lệ chính xác này sẽ giảm Pinto

và cộng sự nghiên cứu 243 mẫu cắt lạnh cho các khối u buồng trứng ghi nhận

tỷ lệ chính xác 98,5% đối với khối u ác tính nhưng chỉ có 78,6% cho các khối

ở diện cắt [12], [11]

Sử dụng FS để xác định mức độ khối u cũng ít nhạy cảm hơn với độ chính xác chỉ 88,6% trong 260 ca ung thư nội mạc tử cung được nghiên cứu bởi Quinlivan JA và cộng sự Mặc dù tỷ lệ chính xác nói chung là rất cao, trong một số phẫu thuật đặc biệt là trong phẫu thuật đầu và cổ, xác định diện cắt có

8

thể khó khăn và không thể lấy hết được khối u DiNardo và cộng sự báo cáo độ chính xác 98,3% ở 80 bệnh nhân trải qua phẫu thuật đầu và cổ với 420 ca FS được thực hiện Tuy nhiên, 40% bệnh nhân có kết quả dương tính trên mẫu mô cắt bỏ, và 100% trường hợp diện cắt gần u < 15 mm không được phát hiện bởi các phân tích FS [12]

Đôi khi, độ chính xác chẩn đoán của FS có thể cao hơn nhiều so với phương pháp nghiên cứu chọc hút tế bào bằng kim nhỏ Trong một cuộc kiểm tra 31 trường hợp phẫu thuật cắt thính giác ở Singapore, 88% kết quả FS phủ hợp kết luận cuối cùng, tương phản với 66,6% kết quả của chọc hút bằng kim nhỏ [13]

1.1.4 Những ưu nhược điểm và hạn chế của kỹ thuật cắt lạnh

1.1.4.1 Ưu điểm

- Kỹ thuật cắt lạnh giúp việc chẩn đoán cho kết quả nhanh hơn so với xét nghiệm mô bệnh học thường quy

- Nếu cần thêm mô để chẩn đoán chính xác, phẫu thuật viên có thể lấy

mẫu bổ sung, tránh việc phải thực hiện phẫu thuật lần thứ hai

- Nếu mô được xác định là ung thư và xâm lấn tới các vùng khác có thể được loại bỏ ngay tại thời điểm đó theo hướng dẫn điều trị [8], [13]

- Nếu mô được xác định là lành tính, không cần thiết loại bỏ các thành phần khác và phẫu thuật có thể kết thúc

- Sinh thiết cho cắt lạnh có thể giúp đảm bảo rằng phần mô được loại bỏ

- Lấy mẫu hoặc diện cắt

9

Lấy mẫu mô / diện cắt

Đôi khi các nhà Giải phẫu bệnh và thậm chí cả bác sĩ chẩn đoán hình ảnh

có thể được yêu cầu đi vào phòng mổ để đánh giá mô đại diện được lựa chọn chẩn đoán tức thì

Lựa chọn mô đại diện không tốt

Mẫu mô gửi đến phòng thí nghiệm cho FS đôi khi lớn và do đó bác sĩ Giải phẫu bệnh phải quyết định lấy mẫu các vùng mô đại diện nhất Điều này đôi khi có thể ảnh hưởng đến chẩn đoán do định hướng của mô gửi là không rõ ràng, lúc này rất cần thiết sự liên lạc với phẫu thuật viên trong cuộc mổ

Khối u thoái hoá hoặc hoại tử

Đáp ứng yêu cầu lấy đúng và đủ trong một khối u lớn đôi khi khó khăn Phẫu thuật viên phải chọn mẫu tránh vùng bị hoại tử Nhận biết các khu vực phản ứng mô với khối u như phù nề và xơ hóa cũng rất quan trọng vì việc lấy mẫu các khu vực này đôi khi ảnh hưởng tới chẩn đoán mô bệnh học [2], [10], [16]

- Đánh giá kết quả

Đôi khi chẩn đoán FS có thể rất khó khăn Ưu tiên của nhà Giải phẫu bệnh học là đưa ra chẩn đoán gần nhất có thể cho phẫu thuật viên và tránh chẩn đoán xác định nếu có bất kỳ nghi ngờ nào Đối với những trường hợp đặc biệt, chẩn đoán cuối cùng cần được trì hoãn, chờ kết quả mô bệnh học thường quy, nhất là đối với các trường hợp việc xử trí u trong phẫu thuật không bị ảnh hưởng

1.1.5 Kỹ thuật cắt lạnh và kỹ thuật chuyển đúc thường quy

Chỉ định xét nghiệm mô bệnh học của kỹ thuật cắt lạnh và kỹ thuật chuyển đúc thường quy được đưa ra trong những trường hợp khác nhau (trong

mổ và sau mổ) Bên cạnh đó, sinh thiết tức thì sau khi được hoàn thành, mô bệnh bắt buộc phải được xử lý tiếp theo theo quy trình mô bệnh học thường quy Tuy nhiên, có thể đưa ra một vài so sánh về đặc tính kỹ thuật giữa hai kỹ thuật để tham khảo, bởi lẽ kỹ thuật mô bệnh học thường quy được biết đến và

10

áp dụng rộng rãi từ trước đó, và nhiều nghiên cứu đã và đang được thực hiện

để so sánh tính chính xác của kỹ thuật cắt lạnh và chuyển đúc thường quy

1.1.5.1 Chất lượng tiêu bản/ Hình ảnh mô bệnh học

Rất đơn giản để đưa ra khẳng định rằng trong hầu hết các trường hợp, chất lượng tiêu bản mô bệnh học thường quy tốt hơn nhiều so với mô cắt lạnh, biểu hiện ở chất lượng mảnh cắt, sự tương phản màu sắc và chi tiết nhân Thêm vào đó thì hình ảnh tế bào trong mô bệnh học thường quy được bảo toàn tốt

hơn trên tiêu bản cắt lạnh

1.1.5.2 Thời gian xét nghiệm

- Kỹ thuật cắt lạnh:

Kỹ thuật cắt lạnh bao gồm 2 khâu đoạn tách biệt: Trong mổ với chẩn đoán tức thì và sau mổ với việc xử lý lại mô cắt lạnh theo kỹ thuật mô bệnh học thường quy Ở đây chúng tôi đề cập đến thời gian từ lúc chuẩn bị bệnh phẩm, tạo ra mảnh cắt, nghiên cứu mô trên kính hiển vi cho đến thời điểm trả kết quả cho phòng mổ qua điện thoại Toàn bộ quá trình này, nếu mọi việc suôn sẻ, mất khoảng từ 5-10 phút

Trong một nghiên cứu liên quan đến 700 phòng thí nghiệm trên toàn thế giới, 90% xét nghiệm FS thực hiện trong vòng 20 phút, được đo từ thời điểm các nhà bệnh Giải phẫu bệnh nhận mẫu FS đến thời điểm thông báo kết quả phẫu thuật viên qua điện thoại [7], [17]

- Kỹ thuật chuyển đúc thường quy:

Trong quy trình kỹ thuật cổ điển, quá trình vùi paraffine vào mô bệnh phụ thuộc vào tính chất của mô, kích thước mô bệnh, và các yếu tố khác như nhiệt độ, hoá chất Thời gian hoàn thiện quy trình vùi cho mô bệnh học sinh thiết (kích thước < 0,5 cm đối với những mô mềm) tại Bệnh viện Bạch Mai là khoảng 3 giờ, bệnh phẩm kích thước > 0.5 cm là khoảng 12 giờ

Nhờ vào Khoa học công nghệ phát triển, hệ thống máy chuyển tự động

và bán tự động đi kèm với tăng nhiệt độ, microwave, cung cấp quy trình khép kín và thời gian rút ngắn hơn nhiều (khoảng 1,5 đến 2 giờ cho mô sinh thiết nhỏ và khoảng 4 - 6 giờ cho mảnh mô lớn)

11

Sẽ phải mất thêm khoảng 1 - 2 giờ cho khâu đúc bệnh phẩm, cắt, dán mảnh và nhuộm màu để hoàn thành chuỗi liên hoàn kỹ thuật Giải phẫu bệnh

mô bệnh học thường quy

Có thể thấy rằng, hai kỹ thuật có sự khác biệt rất lớn về thời gian thực hiện cho dù có sự hỗ trợ của máy móc hay không, điều này càng làm nổi bật giá trị cho chẩn đoán nhanh của kỹ thuật cắt lạnh

mô mỡ

1.1.5.4 Áp dụng các kỹ thuật cao hỗ trợ chẩn đoán

Mặc dù đã từng có những nghiên cứu về việc sử dụng mảnh cắt tức thì cho các kỹ thuật cao hơn phục vụ chẩn đoán, tuy nhiên chưa có báo cáo nào về việc thành công cho các nghiên cứu này Hiện nay, tiêu bản mảnh cắt lạnh mô chỉ có giá trị chẩn đoán bằng quan sát hình thái tại thời điểm đó và xem xét lại

về sau, việc áp dụng mảnh cắt lạnh cho các kỹ thuật cao hơn như nhuộm hoá

mô đặc biệt, sinh học phân tử, không thể thực hiện Có nhiều nguyên nhân dẫn đến điều đó như: Không xảy ra một quá trình cố định mô thực sự, mô bệnh vẫn có thể tiếp tục thoái hoá hoại tử, chất lượng kháng nguyên cho nhuộm Hoá

mô miễn dịch không được đảm bảo Thêm vào đó, những kỹ thuật cao hơn hoàn toàn có thể sử dụng mảnh cắt thường quy, cho kết quả tốt hơn rõ rệt [18], [19]

- Đội ngũ kỹ thuật viên được đào tạo, có khả năng thực hiện kỹ thuật tốt

- Vị trí labo Giải phẫu bệnh phải ở gần phòng phẫu thuật, có người chuyên chở vận chuyển bệnh phẩm

- Cơ sở hạ tầng đảm bảo, máy móc trang thiết bị đảm bảo

1.1.5.6 Lưu trữ - bảo quản

Mô bệnh học thường quy được cố định bởi dung dịch cố định, quá trình vùi bởi paraffine có thể bảo quản theo lý thuyết là rất lâu trong môi trường nhiệt

độ phòng Tuy nhiên mô cắt lạnh thì không được coi là môi trường bảo quản,

kể cả khi mà mô vẫn ở trong tình trạng đóng băng, do đó vẫn bắt buộc có quá trình vùi bệnh phẩm trong paraffine Tiêu bản nhuộm Hematoxylin & Eosin cũng tương tự, có thể bảo quản được đối với mảnh cắt thường quy nhưng sẽ là khó khăn đối với mảnh cắt lạnh [9], [14]

1.1.6 Trang thiết bị phục vụ kỹ thuật cắt lạnh

1.1.6.1 Giới thiệu về máy cắt lạnh

Máy cắt lạnh được đứng riêng biệt và có khả cách nhiệt rất tốt để đảm bảo nhiệt độ đã chọn được duy trì dễ dàng Một cửa trượt được thiết kế ngăn cách giữa mô trường bên ngoài (nơi kỹ thuật viên đứng và thực hiện kỹ thuật) với buồng nhiệt Nhiệt độ buồng làm việc bình thường là từ 0°C đến -35°C, điều này yêu cầu máy cắt lạnh sử dụng máy nén và làm lạnh Đối với những

mô cắt yêu cầu đông lạnh ở nhiệt độ thấp hơn -35°C cần sử dụng chất làm lạnh chẳng hạn như nitơ lỏng

Mặt bên của buồng lạnh là kệ đóng băng, là vùng các mô được được đông lạnh nhanh chóng hoặc lưu trữ các mẫu mô trước khi làm cắt mảnh Nhiệt

độ kệ trung bình thấp hơn nhiệt độ buồng lạnh -10°C (Hình 1.1 và 1.2)

13

Hình 1.1 Máy cắt lạnh Leica CM1950 tại Trung tâm Giải Phẫu bệnh và

Tế bào học Bệnh viện Bạch Mai

14

Hình 1.2 Các bảng điều khiển bên ngoài và buồng máy của máy cắt lạnh

Leica CM1950

Hình 1.3 Kệ làm lạnh và thiết bị rút

15

Hình 1.4 Bộ phận cắt (máy cắt lạnh Leica CM1950)

Hình 1.5 Bộ phận tay quay

16

1.1.6.2 Vận hành máy cắt lạnh

Tất cả các phụ kiện; hộp giữ dao, thiết bị chống cuộn, khay bàn chải, vv, phải được đặt vào buồng lạnh trước khi máy cắt được bật lên Nhiệt độ buồng lạnh đề nghị là -20°C (hoặc -20°C đến -25°C tuỳ thuộc vào labo) Chờ

ít nhất 24 giờ cho máy đông lạnh hạ xuống nhiệt độ vận hành đã chọn [9]

Trong một khoa Giải phẫu bệnh nên có hai đến một vài máy cắt lạnh để đảm bảo công việc khi một máy cắt lạnh đang trong quá trình rã đông hoặc bị các vấn đề kỹ thuật

1.1.6.3 Thiết bị đóng băng mẫu bệnh phẩm

Mục đích của các thiết bị này là làm đóng băng các mẫu bệnh phẩm càng nhanh càng tốt để loại bỏ sự hình thành tinh thể băng (hình ảnh giả tạo) Để đạt được sự đóng băng nhanh, kích thước của bệnh phẩm phải được kiểm soát, kích

vỡ mẫu mô có thể được chùi sạch nhờ khăn giấy hoặc miếng gạc ngâm cồn 70% [17]

Hình 1.8 Gel cắt lạnh Cryobloc và bình xịt làm lạnh nhanh

18

1.1.6.6 Bảo trì máy cắt lạnh

Giống như tất cả các trang thiết bị, máy cắt lạnh đòi hỏi phải bảo trì thường xuyên để đảm bảo hiệu suất tối ưu Có thể chia nhỏ các đợt vệ sinh ra hàng ngày, hàng tuần, hàng tháng và hàng năm

1.1.7 Quy trình thực hiện kỹ thuật cắt lạnh tại Trung tâm Giải phẫu bệnh và Tế bào học bệnh viện Bạch Mai

1.1.7.1 Kiểm tra tổng thể

Đây là bước đầu tiên và là một trong những bước quan trọng nhất Bác

sĩ Giải phẫu bệnh là người thực hiện và xác định đại thể không chỉ ở việc quan sát, mà còn kích thước, đánh giá màu sắc, mật độ, ranh giới, diện cắt, Bác sĩ Giải phẫu bệnh ghi lại tất cả các tính chất đại thể như: kích thước, độ bám dính, trọng lượng, tương tự như ghi lại các tính chất ở vi thể [13], [19]

1.1.7.2 Xác minh nhãn mác mẫu bệnh phẩm và xác định bệnh phẩm

Là công đoạn quan trọng để tránh khỏi những sai sót Việc đối chiếu bệnh phẩm và chỉ định phải thực hiện đầu tiên và ngay lập tức khi tiếp nhận bệnh phẩm Sự đối chiếu có mặt cả bộ phận giao bệnh phẩm và nhân viên labo Giải phẫu bệnh về tên tuổi, vị trí, số mảnh,

1.1.7.3 Kiểm tra thông tin lâm sàng

Chẩn đoán cuối cùng phải được dựa trên sự tổng hợp tất cả các thông tin lâm sàng, đại thể và vi thể Bác sĩ Giải phẫu bệnh sẽ đưa ra kết luận tự tin khi

cố đầy đủ cả 3 yếu tố trên ủng hộ cho chẩn đoán Ngược lại, khi lâm sàng và tình hình quan sát đại thể có sự không tương đồng cần được xem xét lại cẩn thận và tiến hành thận trọng, đặc biệt là chẩn đoán xác định phải dựa trên đặc điểm mô bệnh học

1.1.7.4 Quan sát và đánh giá đại thể

Điều này yêu cầu người thực hiện phải nắm chắc các đặc điểm giải phẫu của bệnh phẩm Kiểm tra tất cả các cơ quan có chỉ định ghi trên nhãn Tiến hành quan sát, đo kích thước bệnh phẩm, phân tích diện cắt, nhận xét về màu sắc, ranh giới, mật độ, tính chất bệnh phẩm

19

1.1.7.5 Xác định diện cắt

Diện cắt của mẫu mô với bệnh phẩm kích thước (> 0.5 cm) là nơi diễn

tả chính xác bề mặt cắt cuối cùng của mô bị loại bỏ tại ca mổ Khi diện cắt còn thấy hiện diện của khối u khi quan sát dưới kính hiển vi, có nghĩa là khối u đã không được cắt bỏ hoàn toàn ở vị trí đó và (nếu có thể) thì cần thiết phải mở rộng diện cắt Đánh giá diện cắt là một yếu tố không thể thiếu trong việc xác định khối u của bệnh nhân, đặc biệt trong các u đường tiêu hóa [9], [13], [20]

Độ chính xác của đánh giá diện cắt này là rất quan trọng đối với kết quả điều trị của bệnh nhân và việc lập kế hoạch điều trị Bất cứ vấn đề nào liên quan đến định hướng bệnh phẩm và xác định diện cắt, cần có sự phối hợp giữa bác sĩ Giải phẫu bệnh và phẫu thuật viên

gá mẫu bệnh phẩm của máy cắt lạnh, thông thường kích thước 1 cm x 1 cm x 0,2 cm Số lượng mảnh cắt tuỳ từng trường hợp và mục đích xét nghiệm [1]

1.1.7.7 Lấy lát cắt cho cắt lạnh

Nhiều bệnh phẩm là những mảnh mô nhỏ, bệnh phẩm được cắt lạnh không qua phẫu tích, không có định hướng rõ ràng Các mô gây nhiều khó khăn cho định hướng mảnh cắt và chỉ có thể thấy được trên tiêu bản cắt hoàn thiện Đối với các tổn thương dạng nang cần được chú ý việc các chất dịch sẽ có thể bất ngờ phun ra khỏi mô, khi lưỡi dao cắt vào những u nang đang căng phồng

do áp lực Do vậy khi phẫu tích cần lưu ý tránh để chất dịch bắn vào người

20

1.1.7.8 Vùi mô bệnh phẩm trong Gel cắt lạnh

Bước tiếp theo là nhấn chìm (dìm, vùi) mô vào chất nền để cắt Trong kỹ thuật cắt lạnh, công việc cố định mô được thực trên mô tươi với trợ giúp của Gel cắt lạnh (Optimal cutting temperature compoud) [7] Việc dìm mô cho cắt lạnh gồm đóng băng và cố định các mô ở vị trí chính xác bên trong khối Gel, gắn các mô vào vị trí cắt

Các mảnh mô được đặt lên mặt trên thiết bị giữ mẫu và phủ bằng Gel cắt lạnh Thiết bị này được đặt trên thanh đóng băng trong khu vực làm lạnh Sau một thời gian khoảng 1-2 phút, phần Gel dính và mô đóng băng một phần, thiết

bị rút nhiệt nặng được đặt trên đỉnh khối mô để làm phẳng bề mặt mô và hoàn tất quá trình đông lạnh

Nếu các mô không đồng đều về độ dày, bề mặt dìm sẽ không ở mặt phẳng song song với thiết bị giữ mô Thiết bị rút nhiệt là vật nặng có thể dùng để làm phẳng và đẩy mô tiến gần hơn tới mặt phẳng mong muốn Quá trình cắt phá sẽ loại bỏ một phần mô trước khi đạt đến mặt mô mong muốn Hết sức lưu ý khi đặt mẫu mô, phải cố gắng tạo ra bề mặt phẳng và cân bằng, đúng chiều của cấu trúc mô học cần khảo sát

Vật rút nhiệt để ở vị trí thẳng đứng kết hợp với Gel giúp tạo ra một lớp phẳng đồng dạng hơn so với mặt khay ban đầu, đặc biệt hữu ích khi xử lý sinh thiết nhỏ

Hình 1.9 Bệnh phẩm sau phẫu tích chuẩn bị cho cắt lạnh

21

Trong trường hợp các mô sinh thiết nhỏ, cần dùng Gel tạo một mặt phẳng đóng băng bên dưới bệnh phẩm (Hình 1.10 và 1.11)

(a) Mô được đặt trên một lớp Gel

(b) Phủ một lớp Gel lên trên bề mặt mô

(c) Đặt khối mô vào trong máy cắt lạnh

(d) Vật rút nhiệt đặt trên khối mô làm phẳng bề mặt thành mặt phẳng (e) Khối mô hoàn chỉnh sẵn sàng cho cắt mô

Hình 1.10 Dìm mô bệnh phẩm