Luận văn công nghệ sinh học Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh trên thế giới...24 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH ...26 3.1.. Một trong những tác

   KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN

ĐÔNG LẠNH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ VI SINH

MSSV: 0811110055 Lớp: 08CSH1

TP Hồ Chí Minh, 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình phát hiện

Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh” là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu sử dụng trong khóa luận là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của khóa luận

Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Bích Ngọc

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 3

2.1 Vai trò của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 3

2.1.1 Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người 3

2.1.2 Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 4

2.2 Giới thiệu về Vibrio spp 7

2.2.1 Lịch sử phát hiện Vibrio spp .7

2.2.2 Phân loại Vibrio spp và phân bố 9

2.2.2.1 Phân loại Vibrio spp 9

2.2.2.2 Phân bố 10

2.2.3 Đặc điểm hình thái Vibrio spp .10

2.2.3.1 Đặc điểm chung 10

2.2.3.2 Đặc điểm của từng loài 11

2.2.4 Cấu trúc Vibrio spp .14

2.2.5 Yếu tố độc lực 15

2.2.6 Cơ chế gây bệnh 18

2.2.7 Triệu chứng gây bệnh 21

2.2.7.1 Trên người 21

2.2.7.2 Trên động vật 23

2.2.8 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới 24

2.2.8.1 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam 24

2.2.8.2 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh

trên thế giới 24

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 26

3.1 Phương pháp truyền thống 26

3.1.1 Phương pháp định tính 26

3.1.1.1 Nguyên tắc .26

3.1.1.2 Thiết bị và dụng cụ 26

3.1.1.3 Môi trường và hóa chất 26

3.1.1.4 Quy trình phân tích .28

3.1.1.5 Thuyết minh quy trình 29

3.2 Phương pháp hiện đại 42

3.2.1 Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) 42

3.2.1.1 ELISA gián tiếp (indirect ELISA) 43

3.2.1.2 Sandwich ELISA 44

3.2.1.3 ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) 45

3.2.2 Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) 46

3.2.2.1 Nguyên tắc 47

3.2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR 47

3.2.3 Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) 51

3.2.4 Kỹ thuật DNA microarray 52

3.2.4.1 Vật liệu và phương pháp 53

3.2.4.2 Các bước thực hiện 54

3.2.5 Kỹ thuật RAPD 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADH: Antidiuretic hormone

APW :Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water

cDNA: Complementary Acid Deoxyribo Nucleic

DNA: Acid Deoxyribo Nucleic

ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays

EU: Liên minh Châu Âu

FDA: Food and Drug Administration

HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points

HLG :Canh Hugh Leifson Glucose

KCN:Khu công nghiệp

KI:Thạch Kligler Iron

KIA: : Klingler Iron Agar

KL: Khuẩn lạc

KNXK: Kiêm ngạch xuất khẩu

LDC: Linguistic Data Consortium

NAFIQAVED: Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng

NST: Nhiễm sắc thể

NTTS: Nuôi trồng thủy sản

OPNG: o-nitrophenyl-D-galactoside

ORF: Open reading frame

PCA: Polymerase Chain Reaction

TCBS :Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose

TSA: Thạch Tryptone Soya

TSI: Triple Sugar Iron agar

WHO: Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ 4

Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU 4

Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhóm vi khuẩn tả 19

Bảng 2.4: Các loài Vibrio bị cho là gây bệnh ở người 20

Bảng 3.1 Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus 31

Bảng 3.2 Phân biệt V cholerae O1 và V cholerae non - O1 41

Bảng 3.3 Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1 41

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1: Vibrio harvey 9

Hình 2.2: V.parahaemolyticus 12

Hình 2.3: V.cholerae 13

Hình 2 4: V vulnificus 13

Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae 19

Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người 21

Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả 22

Hình 2.8: Đuôi tôm sú bị mòn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio……… 23

Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tôm mềm và có màu xanh 23

Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar 29

Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên môi trường MacConkey 30

Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS……… 30

Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA 32

Hình 3.5: Vibrio cholerae 33

Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate 35

Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate 35

Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate 36

Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decarboxylase/dehydrolase 37

Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea 38

Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG……… 38

Hình 3.12: Hình thử nghiệm ONPG 39

Hình 3.13: ELISA gián tiếp 44

Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA 45

Hình 3.15: ELISA cạnh tranh 46

Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR 48

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng, các chất dinh dưỡng cần thiết để con người sống và phát triển Thế nhưng thực phẩm cũng là nguồn truyền bệnh nguy hiểm, nếu như không bảo đảm được vệ sinh và an toàn Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) là vấn đề xã hội đang được rất nhiều người quan tâm, bởi lẽ VSATTP tác động trực tiếp đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống con người và ảnh hưởng đến chất lượng phát triển của xã hội và nòi giống

Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có hơn 400 căn bệnh lây truyền qua thực phẩm không an toàn VSATTP đã được đặt lên hàng đầu nghị trình tại nhiều hội nghị y tế và sức khỏe cộng đồng toàn cầu, nhưng tình hình gần như không được cải thiện bao nhiêu, nhất là khi thế giới liên tiếp xảy ra thiên tai và nguồn nước sạch ngày càng hiếm Khi người dân không có đủ miếng ăn thì việc kiểm tra chất lượng những gì mà họ ăn đã trở thành điều khá xa vời Tiến sĩ Margaret Chan, Tổng Giám đốc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cho biết mỗi tháng Liên hiệp quốc nhận được khoảng 200 báo cáo từ 193 quốc gia về các trường hợp thực phẩm bị nhiễm độc

Chất lượng VSATTP hiện nay rất đáng lo ngại, đã được rất nhiều các phương tiện thông tin đại chúng phản ánh Việc sử dụng không an toàn về phân bón, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất trong chăn nuôi trồng trọt nông nghiệp, thủy hải sản hiện nay còn khá phổ biến

Có rất nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, nhưng chủ yếu là người bị ngộ độc đã hấp thu phải thực phẩm độc hại, ví dụ ăn thức ăn đã bị ôi thiu, thức ăn chế biến không hợp vệ sinh, không đạt yêu cầu hoặc do bảo quản không tốt Khi đó, các loại vi sinh vật (vi khuẩn, virus), nấm mốc và ký sinh vật có điều kiện hoành hành

Vi sinh vật là yếu tố cơ bản gây ra ô nhiễm, mất vệ sinh an toàn thực phẩm và có tới gần 50% trường hợp bị ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật Trong nhóm vi sinh

vật nguy hiểm thì các vi khuẩn chủng Salmonella, Staphylococcus aureus,

Clostridium botulinum, Vibrio spp, E Coli và Listeria là đáng sợ nhất

Một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đáng lo ngại nhất hiện nay đó

là ngộ độc do nhóm vi khuẩn tả Vibrio spp gây ra trong thực phẩm thủy hải sản

đông lạnh (tôm, cá, mực…) Chúng có thể nhiễm vào thực phẩm thủy hải sản bất

kỳ lúc nào và được xem là nguồn gốc gây ngộ độc nghiêm trọng trên thế giới

Vibrio spp gây bệnh dịch tả ở người, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng và

mất nước Bệnh tả do vi khuẩn này gây ra có khả năng bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rất rộng Dịch tả tấn công vào nước Anh vào năm 1848 – 1848 làm hơn 70.000 người chết, đại dịch năm 1854 đã cướp đi 1/8 dân số thành phố London.Dịch tả vào Peru vào năm 1991, lan truyền sang Ecuador, Colombia, Mexico và Nicaragua kết quả hơn12.000 người chết Nếu hiểu biết đúng

và kịp thời chúng ta có thể ngăn ngừa nguồn lây nhiễm để bảo vệ mình và cộng đồng xung quanh

Xuất phát từ thực trạng trên, được sự chấp nhận của Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, chúng tôi

xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh”

1.2 Mục đích

Nghiên cứu, đi sâu tìm hiểu về vi khuẩn Vibrio spp và đưa ra một số phương pháp xác định vi khuẩn Vibrio spp

1.3 Mục tiêu đề tài

• Khảo sát về cấu trúc của Vibrio spp

• Khảo sát về sự phân bố của Vibrio spp

• Tình hình nhiễm Vibrio spp trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam

hiện nay

• Một số phương pháp xác định Vibrio spp

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 Vai trò của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới

2.1.1 Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người

Trong những năm qua, ngành thủy sản luôn khẳng định là ngành kinh tế mũi nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự phát triển kinh tế - xã hội nước nhà Tạo công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, và đang phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao trên thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định và bền vững

Thực phẩm thuỷ hải sản còn giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia và góp phần xoá đói giảm nghèo Thực phẩm thuỷ hải sản được đánh giá là nguồn cung cấp chính đạm động vật cho người dân Việt Nam Năm 2001, mức tiêu thụ trung bình mặt hàng thuỷ sản của mỗi người dân Việt Nam là 19,4 kg, cao hơn mức tiêu thụ trung bình sản phẩm thịt heo (17,1 kg/người) và thịt gia cầm (3,9 kg/người) Số lao động của ngành thuỷ sản tăng liên tục từ 3,12 triệu người (năm 1996) lên khoảng 3,8 triệu người năm 2001 (kể cả lao động thời vụ), như vậy, mỗi năm tăng thêm hơn

Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ

(đơn vị: triệu USD)

Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản

Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU

Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản

2.1.2 Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới

Trong những năm qua, ngành thủy sản đã có những bước chuyển biến hết sức căn bản về công tác quản lý an toàn vệ sinh trong khu vực chế biến để đáp ứng các yêu cầu ngày càng cao về chất lượng sản phẩm thủy sản của các thị trường Số lượng nhà máy chế biến thuỷ sản được cấp chứng nhận HACCP cũng như số doanh nghiệp được phép xuất khẩu thuỷ sản sang các thị trường tăng lên Số lượng các lô hàng bị nhiễm hoá chất, dư lượng kháng sinh đã giảm đi rất nhiều so với các năm trước đây

• Ở Việt Nam

Trong 3 tháng đầu năm 2006, thuỷ sản xuất khẩu qua kiểm tra chất lượng đạt 84.800 tấn, tăng 15% so với cùng kì năm trước trong đó khối lượng hàng kiểm tra chứng nhận chất lượng các chỉ tiêu dư lượng kháng sinh, hoá chất là 54.400 tấn, chiếm 62,27% Hàng xuất khẩu qua kiểm tra chiếm tỷ trọng lớn vẫn là thị trường

EU (30%), Nhật Bản (17%), Mỹ (12%) Các trung tâm vùng cũng đã cấp 25 giấy chứng nhận xuất khẩu cho 337,35 tấn tôm xuất khẩu vào Mỹ, 17 giấy chứng nhận tôm không thu hoạch cho xuất khẩu tôm vào thị trường Oxtraylia Chất lượng hàng thuỷ sản qua kiểm tra chất lượng chứng nhận ổn định

Trong 6 tháng đầu năm 2006, tổng sản lượng đạt 1.697.300 tấn bằng 49,34% kế hoạch năm 2007 và 108,1% so với cùng kì năm trước, xuất khẩu đạt 1,409 tỷ USD, bằng 50,32% so với kế hoạch, và tăng 29,03% so với cùng kì năm trước trong đó thị trường Nhật Bản chiếm 23,31%; EU: 23,26%; Mỹ: 18,21%, hai sản phẩm chính là tôm và cá trong đó tôm chiếm 38,3% và cá chiếm 37,4% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ sản

Chất lượng hàng thuỷ sản Việt Nam đã được cải thiện rất nhiều và đang dần ngang tầm với các nước lớn trên thế giới Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đạt được của ngành thủy sản về sản lượng sản xuất, giá trị thủy sản, kim ngạch xuất khẩu thì hiện nay ngành thủy sản còn tồn tại những yếu kém chất lượng sản phẩm thủy sản

Chất lượng và an toàn vệ sinh nguyên liệu thủy sản vẫn chưa đáp ứng được các yêu cầu ngày càng cao của thị trường, công tác quản lý đối với khu vực sản xuất và thương mại ở khâu trước chế biến thể hiện nhiều bất cập Hậu quả là chất lượng sản phẩm thủy sản của Việt Nam chưa ngang tầm với thế giới, xuất khẩu tuy vẫn tăng hàng năm nhưng tỷ lệ tăng trưởng không ổn định và tiềm ần nhiều nguy cơ Hiện nay vấn đề lớn nhất đối với chất lượng sản phẩm thuỷ sản Việt Nam đó là nguyên liệu thuỷ sản có lẫn tạp chất hoá học và việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh trong nguyên liệu thuỷ sản

Về thực trạng thuỷ sản nhiễm tạp chất vào nguyên liệu thuỷ sản Đã xuất hiện hoạt động gian lận thương mại nhằm kiếm lời bất chính từ năm 1983- 1995, bắt đầu

từ việc đưa đinh hoặc chì vào thân tôm tại 3 tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu Vào những năm 1996- 1997 tình trạng bơm các loại chất lỏng vào nguyên liệu tôm bắt đầu xuất hiện và lan nhanh đến mức trở thành phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

Đầu năm 2005, thị trường EU đã phát hiện 30 lô hàng bị nhiễm malachite green

và leucomalachite green, 2 lô hàng nhiễm fluoroquinolone; thị trường Canada phát hiện 48 lô hàng nhiễm malachite green và leucomalachite, 5 lô hàng nhiễm fluoroquinolone Tại thị trường Hoa Kì, qua kiểm tra của Cục quản lý Dược phẩm

và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho thấy hàng thuỷ sản nhập khẩu từ Việt Nam có tỷ

lệ nhiễm hoá chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng Đến tháng 11/2005 đã có 9

lô hàng nhiễm chloramphenicol, 7 lô hàng nhiễm malachite green và leuco malachite green, 7 lô hàng nhiễm fluoroquinolone

-Đến cuối năm 2005, chất lượng các lô hàng xuất khẩu đã được cải thiện Tuy nhiên, số lô hàng đi EU vẫn được duy trì kiểm soát dư lượng kháng sinh chloramphenicol (CAP), nitrfurans (NTRs) và malachite Green (MR), leucoma- lachite green (LMG) Tại thị trường Hoa Kì, thông qua hoạt dộng kiểm tra chứng nhận đối với các lô hàng thuỷ sản xuất khẩu vào Mỹ, NAFIQAVED đã thực hiện kiểm tra 995 lô hàng (14.473 tấn) phát hiện 12 lô không đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm xuất khẩu, chủ yếu do bị phát hiện dư lượng MG, LMG, CAP, trong đó

có 3 lô cá basa, 9 lô tôm đông lạnh Tại thị trường Canada, NAFIQAVED đã thực hiện kiểm tra và cấp giấy chứng nhận đẻ xuất khẩu vào Canada cho 191 lô hàng (2,739 tấn) và phát hiện 1 lô tôm đông lạnh có chứa dư lượng CAP

Qua thực trạng về chất lượng thuỷ sản nói trên có thể thấy chất lượng thuỷ sản Việt Nam nhìn chung chưa đáp ứng được các tiêu chuẩn về chất lượng của các thị trường tiêu thụ, thuỷ sản cung cấp chưa đem lại lòng tin với các nhà nhập khẩu Đó

là còn tồn tại nhiều lô hàng còn dư lượng kháng sinh, hoá chất… những chất được coi là ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng

• Trên thế giới

Theo dự báo của Trung tâm Thuỷ sản Thế giới, đến năm 2020, các nước đang phát triển sẽ chiếm tới 77% tổng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu và 79% tổng sản lượng thuỷ sản thế giới Như vậy là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỷ sản ở các nước đang phát triển sẽ tăng từ 62,7 triệu tấn lên 98,6 triệu tấn (57%), trong khi các nước phát triển sẽ chỉ tăng 4%, từ 28,1 triệu tấn lên 29,2 triệu tấn

Tại Canada, người dân sống ven sông và vùng duyên hải thường có thú đào vớt nghêu sò Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sản này đôi khi là mối đe dọa về sức khỏe Cũng như bất cứ loài thủy sản nào khác, sò ốc cũng có thể bị

nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus,

Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus

bệnh viêm gan A

Hiện nay, bệnh tả vẩn còn xuất hiện trên thế giới quanh năm với số bệnh nhân nhỏ hơn Năm 2005, có 131.943 trường hợp bệnh xãy ra trong 52 quốc gia trên thế giới được báo cáo với tổ chức Y Tế Quốc Tế 94% trường hợp bệnh xãy ra ở những quốc gia Phi Châu nghèo khổ Năm 1992, một trận dịch hoàn toàn bất ngờ của một

thể bệnh giống như dịch tả, gây bởi Vibrio cholerae nhóm O139 Bệnh khởi phát ở

Madras, Ấn Độ và lan ra theo vịnh Bengal thuộc Bengladesh Sau đó, dịch lan ra toàn Á Châu và vài trường hợp xâm nhập vào các quốc gia đã phát triển do người bệnh mang vào 75% nguyên do dịch tả do sự yếu kém về vệ sinh phòng dịch liên quan đến nguồn nước được người dân sử dụng và kiểm soát thực phẩm hải sản tươi sống, và 25% do thói quen xấu của người dân tại địa phương về cách ăn uống

2.2 Giới thiệu về Vibrio spp

2.2.1 Lịch sử phát hiện Vibrio spp

Người ta cho rằng bệnh tả xuất hiện tại châu Á từ 600 năm trước Công nguyên Bệnh tả được ghi nhận lần đầu tiên trong y văn vào năm 1563 tại Ấn Độ Trận “đại chiến” đầu tiên của dịch tả với con người vào năm 1817- 1821 nổ ra tại nơi này

Dịch tả lan rộng ra theo các tuyến vận tải vào nước Nga, tiếp theo là châu Âu và Bắc Mỹ Nó trở thành căn bệnh mang tính toàn cầu đầu tiên của nhân loại, hoành hành khắp nơi chỉ trừ Nam cực

Trận đại dịch tả tấn công nước Anh vào năm 1848-1849 đã làm 70.000 người tử vong Đại dịch năm 1854 đã cướp đi sinh mạng 1/8 dân số thành phố London chỉ trong một thời gian ngắn

Cũng trong khoảng thời gian này nước Pháp cũng hứng chịu những tổn thất nặng nề Năm 1832, gần 40.000 người dân Paris đã mắc dịch tả và phân nửa trong

số đó đã tử vong Năm 1848-1849, một số lượng người tương tự cũng đã chết vì dịch bệnh

Phải đợi đến năm 1883, người ta mới biết được khuôn mặt của “kẻ giết người” nhờ công trình nghiên cứu của Robert Koch Heinrich Hermann Robert Koch (1843 – 1910) là một bác sĩ người Đức Ông là người đã tìm ra trực khuẩn bệnh than, trực khuẩn lao và vi khuẩn bệnh tả Trước đó (1854) nhà khoa học Ý Pacini đã nhắc đến

loại vi khuẩn gây bệnh tả Vibrio chorelae khi đại dịch tả tấn công thành Florence

Năm 1883 Robert Koch được cử tới Ai Cập làm Chủ tịch Ủy ban về bệnh tả của Đức, để điều tra về dịch tả đang bùng phát ở đó Ông đã phát hiện ra vi khuẩn

Vibrio chorela là nguyên nhân gây bệnh tả, ngoài ra ông cũng nghiên cứu vụ vi

khuẩn tả ở Ấn Độ Ông đã hệ thống hóa nguyên tắc để kiểm soát dịch tả (1893) và

nó đã trở thành nền móng cho việc kiểm soát dịch tả ngày nay

Ông đã phát hiện ra vi khuẩn tả gây ra dịch tả ở người có nhiều nhất ở trong phân của người bệnh, trong nước thải có chứa phân Ngoài ra cá, các thực phẩm khác từ nước nhiễm khuẩn nếu không được nấu chín cũng là nguồn gây bệnh

Vibrio parahaemolyticus : được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm

1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hào… Người ta đã

xác định đuợc 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus,

Vibrio alginolyticus

2.2.2 Phân loại Vibrio spp và phân bố

2.2.2.1 Phân loại Vibrio spp

a Phân loại theo khoa học

• Chi (genus): Vibrio

• Loài (species): Hiện nay có khoảng 28 loài Vibrio như Vibrio natriegens,

Vibrio harveyi , Vibrio fischeri , Vibrio parahaemolytycus…Trong đó, 3 loại Vibrio thường gây bệnh cho người nhất là Vibrio parahaemolytycus, Vibrio cholera, Vibrio vulnificus

Hình 2.1: Vibrio harvey

b Phân loại theo kháng nguyên

• Vibrio cholera nhóm 01 (gọi tắt là V.cholerae 01): gồm các vi khuẩn gây dịch tả

• Vibrio cholerae non O1/non-O139:

Gồm các vi khuẩn có tính chất sinh vật hoá học giống V.cholerae O1, nhưng

không ngưng kết với kháng huyết thanh O1 Có thể gây bệnh lẻ tẻ và nhẹ, không thành dịch

Đặc điểm chủ yếu của những chủng này là không sản xuất độc tố tả và không liên quan tới dịch tiêu chảy Những chủng này được phân lập tình cờ từ những trường hợp tiêu chảy do ăn tôm cua hoặc từ những trường hợp nhiễm trùng ngoài ruột khác như: vết thương, tai, đờm, nước tiểu, dịch não tuỷ Phẩy khuẩn thuộc nhóm này được tìm thấy ở cửa sông, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt nguồn từ ngoại cảnh

• Vibrio cholerae O139 (chủng Bengal):

Lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nó không ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và

giống tả Chủng Vibrio cholerae O139 được cho là chủng lai của chủng Vibrio

cholerae O1 và chủng non-O1

• Các Vibrio khác:

Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, các Vibrio nhóm F

2.2.2.2 Phân bố

Ngoại trừ V.cholerae có thể hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loại Vibrio

khác đều cần muối để tăng trưởng và thường phân bố rộng ở các khu vực nước mặn, vùng nước ven biển, cửa sông và các khu vực nuôi trồng thủy hải sản Chúng tồn tại với số lượng lớn trong cả nước và trầm tích của hồ nuôi tôm, đặc biệt là trong nội tạng các sinh vật nuôi trồng thủy hải sản

2.2.3.1 Đặc điểm chung

Vibrio có nguồn gốc từ “Vibrae” có nghĩa là dao động, gồm các vi khuẩn có

dạng que uốn cong, có dạng dấu phẩy, có một tiên mao Phần lớn các loài Vibrio sống hoại sinh chỉ một số ít có khả năng lây bệnh cho người Vibrio cholerae (phẩy

trùng tả) gây bệnh cho người, có khả năng sống trong nước đến 3 tuần

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que

thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6μm Chúng không sinh bào

tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn

Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi,

vi khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129

Một số chủng Vibrio có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc

Chúng sống trong nước ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nước lợ ven biển, vi khuẩn bám vào chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng

của tôm, cua… Đặc trưng của loài Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trường acid Vibrio chứa các loại

kháng nguyên O, K, H

2.2.3.2 Đặc điểm của từng loài

a V.parahaemolyticus: phát triển được ở môi trường có 1Æ 8% NaCl, tốt nhất

2Æ 4% NaCl và không sinh trưởng được trong môi trường không có muối (sẽ chết nếu đưa vào nước cất) Chúng không thể sống dưới 4oC nhưng phát triển tốt nhất ở 5Æ 9oC, pH tối ưu sống trong môi trường 7% NaCl

- V.parahaemolyticus: có phản ứng oxidase (+), phát triển được trong canh

trypton ở 24oC Phản ứng ADH (-), LDC (+), có khả năng khử nitrate thành nitrite nhưng không lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, tăng trưởng tốt trong môi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong môi trường chứa 10% muối

Hình 2.2: V.parahaemolyticus

b V.cholerae: có phản ứng oxidase (+), tăng trưởng được trong môi trường

canh trypton ở 42oC, arginine dehydrolase (-), lysine decarboxylase (+), lên men được sucrose (saccharose), khử nitrate thành nitrite, có thể tăng trưởng được trong môi trường chứ 0 – 3% NaCl, không phát triển được trong các môi trường chứa 6,

8, 10% muối

- V.cholerae: là loài vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên Chúng gây bệnh dịch tả ở

người (human cholerae) Bệnh gây ra do nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm bệnh

V.cholerae là những trực khuẩn ngắn mảnh, kích thước khoảng 0,5 x 3.10-6 m Khi mới phân lập, chúng có hình phẩy di động rất nhanh Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng dễ dàng phát triển trong môi trường bình thường mà không cần các yếu tố tăng trưởng Ở nồng độ 5 - 15 mmol/l sẽ kích thích vi khuẩn mọc tốt hơn Vi khuẩn này ưa pH 8 – 9,5 nhiệt độ tối ưu là 37oC Chúng có thể phát triển được trong môi trường có chứa hàm lượng muối cao (trên 6% NaCl)

- V.cholerae dễ chết trong môi trường acid, bị tiêu diệt bới chất tẩy rửa, không

chịu được độ ẩm thấp Chúng có thể tồn tại ở 55oC trong 10 phút Thậm chí chúng

có thể sống trong môi trường nước ngọt có hàm lượng Na+ thấp

- V.chlolerae có kháng nguyên H (trong tiên mao) Kháng nguyên này dễ bị tiêu

hủy Ngoài ra chúng còn có kháng nguyên O (phần lipopolysaccharide ở màng vi khuẩn), rất bền nhiệt Kháng nguyên O (tế bào) là lipopolysaccharit, trong đó phần polysaccharit quy định tính đặc hiệu của kháng nguyên

- V.cholera có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme Trong đó có enzyme

mucinase Enzyme này làm tróc vãy biểu bì mô ruột Neuraminidase thủy phân ganglioside GD1 và GT1 thành GM1 Vì thế số lượng thụ thể độc tố ruột tăng lên

c V.vulnificus: không tăng trưởng được trong môi trường có muối và bị ức

chế trong môi trường có 8 Æ 10% NaCl Chúng được tìm thấy trong nước biển và hải sản, phần lớn chúng không phát triển được ở nhiệt độ lạnh nên vào mùa đông rất khó phát hiện ra chúng Chúng có khả năng sinh tổng hợp nội độc tố cytotoxin với trọng lượng phân tử là 56Kda, hemolysin - 36Kda và cytoysin Nước biển vùng nào cũng có vi khuẩn này, nhưng có nhiều nhất là vào tháng 5 và tháng 10 Chúng là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng máu Các bệnh nhân thường mắc phải ở lứa tuổi 40 (sức đề kháng của cơ thể giảm) và tỉ lệ tử vong là rất cao ( 60% )

Hình2 4: V Vulnificus

2.2.4 Cấu trúc Vibrio spp

Cấu trúc genome của V cholerae

Khác với hầu hết các loài thuộc chi Vibrio, genome của V cholerae gồm 2

nhiễm sắc thể (NST) dạng vòng với kích thước tương ứng là 2961146 bp (NST I) và

1072314 (NST II)

Cả 2 NST này chứa 3885 khung đọc mở (open reading frame, ORF) với hàm lượng G + C trung bình trên mỗi NST chiếm khoảng 41% Heidelbeg cho rằng hai NST này có nguồn gốc tiến hóa khác hẳn nhau NST lớn (NST I) chứa nhiều gen cần thiết cho việc thực hiện chức năng tế bào hơn NST nhỏ (NST II) Ví dụ như sự nhân đôi ADN, sự phân chia tế bào, sự phiên mã, dịch mã và sinh tổng hợp thành tế bào NST I cũng mang hầu hết các locus gen liên quan đến tính gây độc, rất nhiều trong số đó là do thu nhận từ những loài khác Ví dụ yếu tố chính quyết định tính gây độc của tác nhân gây bệnh là độc tố tả (cholerae enterotoxin) được mã hóa bởi

gen của một virut và đã được gắn vào bên trong genome của V cholerae trên NST

I Hay một nhân tố cần thiết cho sự xâm lấn ruột non là những vi lông điều hòa độc

tố (Toxin coregulated pili- TCP) đã được mã hóa bởi những gen nằm trên vùng VPI

(Vibrio Pathogenicity Island) quy định tính gây bệnh của Vibrio thuộc NST I Vùng này được tìm thấy ở những chủng V cholerae có khả năng gây dịch Sự biểu hiện

của các gen liên quan đến tính gây độc được điều khiển bởi các protein giống ToxR và ToxT cùng với nhiều chất điều hòa khác được mã hóa bởi những gen nằm trên NST I

Trên cơ sở nghiên cứu ở E.coli người ta thấy rằng ở mỗi tế bào vi khuẩn chứa một NST dạng vòng Nhưng ở V cholerae thấy có sự thay đổi về số NST dạng

thẳng hoặc dạng vòng Sự có mặt của các gen đặc trưng được xem như là một đặc điểm quan trọng nhận dạng các NST (ví dụ như gen mã hóa cho các protein riboxom L20 và L35) đã có mặt trên NST II

Vì vậy các gen này cho phép xác nhận NST II như là một NST thật Sự tồn tại của những gen này chỉ ra rằng đây là trạng thái di truyền ổn định chứ không phải là

những chức năng cần thiết nhất thời được thực hiện từ một bản sao không ổn định trong xu thế tiến hóa

Mặc dù tất cả các gen nằm trên NST II được xếp vào 16 nhóm theo sự phân chia nhỏ các chức năng của tế bào, nhưng 8 nhóm trong số đó chứa những gen ít quan trọng hơn những gen trên NST I Những gen quan trọng trên NST II là những gen liên quan đến sự vận chuyển đường và năng lượng, sự truyền tín hiệu và sửa chữa ADN

2.2.5 Yếu tố độc lực

Vibrio cholerae sản xuất nhiều loại độc tố tác động với adenylate cyclase trong

tế bào ruột và với nhiều thành phần của hệ thống điều hành ruột, bao gồm những tế bào thần kinh ruột và những tế bào Enterochromaffin (EC), để tạo ra tình trạng bài

tiết và tiêu chảy với lượng lớn Bên cạnh độc tố dịch tả (cholera toxin), vi khuẩn tả

còn sản xuất zonula occludens toxin (ZOT), độc tố này làm tăng sự thẫm thấu qua chỗ nối chặt chẽ giữa 2 tế bào ruột, và độc tố phụ (ACE: assessor cholera enterotoxin), chưa có rõ phận sự trên những tế bào ruột

Độc tố cholerae toxin là một phức hợp protein do phẩy khuẩn Vibrio cholerae tiết ra Độc tố cholerae toxin được tạo thành từ 6 tiểu đơn vị protein được gọi là

oligomeric

Độc tố cholerae toxin hoạt hoá enzyme adenylate cyclase trong các tế bào

niêm mạc ruột dẫn hình thành cAMP và tiết nước, các ion Na+, K+, Cl-, HCO3- vào trong lòng ruột Ảnh hưởng của độc tố phụ thuộc vào một thụ quan đặc biệt có tên monosialosyl ganglioside (GM1 ganglioside) có trên bề mặt các tế bào niêm mạc Phẩy khuẩn sản xuất men tan nhầy và chất giúp nó xâm nhập vào tế bào đồng thời tác động làm ganglioside chuyển thành monosialosyl có thể nhận độc tố

Độc tố cholerae toxin có trọng lượng phân tử 84 kDa, bao gồm tiểu phần A và

B Hai tiểu đơn vị A và B liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide Tiểu phần B được kết hợp bởi 5 chuỗi polypeptide giống nhau và liên kết ở điểm thụ quan

Gs hoặc Ns Protein này sẽ điều khiển hệ thống adenylate cyclase có mặt ở phía trong màng tế bào Adenylate cyclase là một enzyme liên kết với màng tế bào và có khả năng chuyển ATP (adenosine triphosphate) thành dạng AMP vòng (cyclic adenosine monophosphate) Hình thành cAMP là một trong những bước đầu tiên để bất cứ một tín hiệu hoá học nào tác động kích thích hay ức chế adenylate cyclase

Độc tố zonula occludens (ZOT) là một enterotoxin do vi khuẩn Vibrio

cholera tiết ra, nó làm tăng tính thấm của tế bào niêm mạc ruột bằng cách gắn vào

các thụ thể nằm trên tế bào cùa thành ruột

Một yếu tố độc hại chính thứ 2 của vi khuẩn tả giúp chúng sinh sôi nẩy nở trong ruột của chúng ta là toxin coregulated pilus (TCP) Một mảnh di truyền (operon) TCP có chứa một số nhân di truyền, gồm tcpA là nhân di truyền mã hóa cơ cấu chính (main structural gene) liên quan đến việc cấu tạo pilus TCP không những liên quan tới khả năng giúp cho vi khuẩn tả sinh sôi nảy nở trong ruột con người nhưng

nó cũng là nơi tiếp nhận (receptor) cho CTXφ

Độc tố đường ruột của vi khuẩn là sản phẩn của ctx gene ctxA mã hoá cấu phần

A, ctxB mã hoá cấu phần B Thông tin của các gene này được chuyển về cùng một

mRNA sau khi sao mã (chúng là thành phần của một operon) mRNA này có hai vị trí kết hợp với ribosome ở phía đầu 5' các đoạn gene tương ứng Vị trí kết hợp ribosome của cấu phần B có khả năng hoạt động mạnh hơn ít nhất 7 lần so với vị trí kết hợp ribosom của A chính vì thế mà lượng sản phẩm của quá trình dịch mã (các protein) của B sẽ gấp vài lần potein của A Tỷ lệ protein A và B đảm bảo độc lực của vi khuẩn là 1A:5B Sau khi được tổng hợp, protein A và B kết hợp với nhau tại

vị trí giữa màng tế bào và màng ngoài của ribosom Lượng protein B còn dư sẽ được tiết ra khỏi tế bào Tuy nhiên thành phần A phải được kết hợp với 5B để được vận chuyển ra ngoài tế bào Thành phần A nguyên vẹn (chưa kết hợp với B) sẽ ở trạng thái bất hoạt và được giữ lại bằng cách hình thành hai phần A1 và A2 nối với nhau bằng liên kết disulfide Khi độc tố vi khuẩn kết hợp với GM1 receptor của tế bào vật chủ, thành phần A1 được giải phóng (bằng cách cắt liên kết disulfide) và xâm nhập vào tế bào Cơ chế xâm nhập của A1 chưa được biết rõ Có giả thiết cho

rằng 5 đơn vị cấu phần B (5B) tạo thành một khe trên màng tế bào để giúp A1 xâm

nhập Quá trình sao mã của ctxAB được điều hoà bởi nhiểu yếu tố bao gồm cả các

tín hiệu môi trường trong đó vi khuẩn đang tồn tại như nhiệt độ, pH, tính thẩm thấu, các amino acid Một số gene khác của phẩy khuẩn cũng được điều hoàtheo cơ chế

tương tự như các gene trong tcp operon tcp được cho là quyết định quá trình tổng

hợp "roi" hay "lông" của vi khuẩn Chính vì vậy mà cả ctx và tcp đều chịu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường

Các protein đã được xác định liên quan đến quá trình điều hoà các gene nói trên bao gồm ToxR, ToxS và ToxT ToxR là một protein màng với 2/3 amino acid nằm trong tế bào chất Tổ hợp hai protein ToxR (ToxR dimer) kết hợp với vùng khởi sự

của ctxAB và hoạt hoá quá trình sao mã ToxS protein được cho là có chức năng

đáp ứng với các tín hiệu môi trường, làm thay đổi hình thái và có thể thay đổi quá trình bắt cặp của ToxR qua đó xúc tiến sao mã ToxS đóng vai tró như bộ phận cảm biến, phosphoryl hoá và chuyển ToxR sang trạng thái kết hợp với DNA ToxT là protein trong tế bào chất có chức năng hoạt hoá tcp opeon dẫn đến tổng hợ thành phần của tcp pili Biểu hiện của ToxT chịu ảnh hưởng của ToxR

Vì vậy, ToxR là một protein điều hoà thực hiện chức năng "khơi mào" hệ thống điều khiển ToxR cũng được cho là tương tác với ToxS để thực hiện chức năng nhận biết các thay đổi của yếu tố môi trường và chuyển các tín hiệu (ở mức phân tử) đến nhiễm sắc thể dẫn đến quá trình sao mã của các gene giúp vi khuẩn gắn kết với màng tế bào và sản xuất độc tố Hoàn toàn có lý do để cho rằng môi trường dạ dày-ruột (nhiệt độ 37 độ, pH thấp, tính thấm cao v.v.) không tương tự như các điều kiện trong môi trường tồn tại tự nhiên của phẩy khuẩn (môi trường nước) có thể trở thành yếu tố tác động, kích kích sản sinh độc tố và gây nhiễm

2.2.6 Cơ chế gây bệnh

Trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tả chỉ gây bệnh cho người Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường ăn uống Để xuống được ruột non, vi khuẩn phải vượt qua dạ dày, vi khuẩn chịu tác động của dịch dạ dày có độ pH thấp (môi trường acid) Bình thường, pH của dạ dày đủ để gây chết cho vi khuẩn Những vi khuẩn sống sót sẽ tiếp tục xuống ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn có khả năng tồn tại rất lâu Phẩy khuẩn có khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp màng nhầy trên niêm mạc ruột Tuy nhiên, ở những người giảm tiết dịch vị acid hoặc uống NaHCO3 (hoặc các chất kiềm tính có khả năng trung hòa dịch vị) thì có thể mắc tả nếu trong thức ăn, nước uống có vi khuẩn tả

Quá trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan nhầy và các men phân cắt protein thành các peptide Do khả năng “tự bơi”, vi khuẩn có thể chuyển động ngược chiều với nhu động ruột để tiếp cận với niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hoá hướng động của chúng

Tại ruột non, chúng tiết ra nội độc tố “choleraetoxin” có trọng lượng phân tử khoảng 84.000 gồm 2 tiểu đơn vị là A và B (do gen có sẵn nằm trong DNA của vi khuẩn tổng hợp) Tiểu đơn vị B sẽ gắn vào thụ quan Ganglioside GM1 Việc gắn kết này sẽ hỗ trợ tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào ruột non Chúng không xâm nhập vào biểu mô ruột mà bám vào niêm mạc ruột

Tiểu đơn vị A có chức năng enzyme chuyên biệt và hoạt động khi vào bên trong

tế bào Khi tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào, chúng sẽ kích hoạt adenylate cyclase liên tục để gia tăng sản sinh hàm lượng cAMP (Adenosine monophosphate vòng) nội bào bên trong tế bào, khiến cho ruột non không còn chức năng hấp thu mà chuyển sang chức năng thải tiết dịch – làm phóng thích hàng loạt ion, chất điện giải từ trong tế bào ra ngoài dịch ruột Chính vì thế, tế bào sẽ mất rất nhiều điện giải ( K+, Cl-, Na+ ) Ngoài ra, chúng cũng tạo thành môi trường ưu trương trong lòng ruột dẫn đến việc nước trong tế bào sẽ ra ồ ạt, gây tiêu chảy trầm trọng Phẩy khuẩn còn có thể sở hữu protein bề mặt gây ngưng kết hồng cầu và nhóm protein do gen acf mã hoá Nhóm gen này quy định yếu tố hỗ trợ gắn kết của vi

khuẩn (accessory colonization factor) Đột biến gen acf dẫn đến giảm khả năng cố định của vi khuẩn vào niêm mạc ruột Người nhiễm có thể bị tiêu chảy ồ ạt, gây mất dịch nặng, người bệnh bị sốc do thể tích tuần hoàn giảm, khả năng tử vong cao nếu không được xử lý kịp thời và đúng mức

Chúng chỉ xâm nhập vào đường ruột, không truyền nhiễm qua đường máu

Để phát bệnh, hàm lượng tế bào vi khuẩn tả trong ruột phải đạt nồng độ cao

khoảng 108-1010 tb/ml Trong khi đó bệnh do khuẩn Samonella hay Shigella chỉ

cần nồng độ thấp cỡ 105-106 tb/ml là đã phát bệnh Do đó, nếu người nào bị rối loạn tiêu hóa, pH acid ở dạ dày không đủ kiềm hãm số lượng tế bào vi khuẩn thì chúng sẽ sống sót để di chuyển đến ruột non để gây bệnh

Sau khi xâm nhập được qua dạ dày và xuống ruột non, vi khuẩn tả bám vào niêm mạc nhưng không xâm nhập sâu vào mô ruột, không gây tổn thương niêm mạc ruột Chúng tiết độc tố ruột LT (thermolabile toxin) gắn vào niêm mạc ruột làm tế bào niêm mạc ruột giảm hấp thu Na+, tăng tiết nước và Cl- gây tiêu chảy cấp tính Nếu không điều kịp thời trị, bệnh nhân sẽ tử vong vì mất nước và điện giải

Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae

Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhóm vi khuẩn tả

Nhóm vi khuẩn tả Khả năng gây bệnh

V.cholerae serotype 01 Gây bệnh tiêu chảy nghiêm trọng, có thể

thành đại dịch

V.cholerae serotype non-01 Gây tiêu chảy nhẹ, chỉ xâm nhiễm

ngoài ruột non

Một số loài khác: V mimicus, V

vulnificus, V hollisae, V damsela…

Không phổ biến, thường xâm nhiễm vết

Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người

2.2.7 Triệu chứng gây bệnh

2.2.7.1 Trên người

- Thời kỳ đầu: Người bị bệnh sẽ thấy sôi bụng, đầy bụng, tiêu chảy vài lần

- Thời kỳ toàn phát: triệu chứng lâm sàng

Người bệnh tiêu chảy liên tục rất nhiều lần với khối lượng lớn, có khi hàng chục lít một ngày (đi ngoài >3 lần/ngày) Phân tả điển hình toàn nước, màu trắng lờ đục như nước vo gạo, không có nhầy máu, bệnh nhân nôn rất dễ dàng, lúc đầu ra thức

ăn, sau toàn nước, ít khi đau bụng Bệnh nhân không sốt Mệt mỏi, khát, nhịp tim

Phân ra liên miên chứa rất nhiều các chất muối sodium, potassium, chloride và bicarbonate; tình trạng mất những chất điện giải quan trọng này có thể đưa đến các biến chứng nguy hiểm như tim loạn nhịp, kinh giật, đường trong máu cũng có thể xuống thấp, và khi đường máu thấp quá, óc chúng ta sẽ mất sáng suốt, rồi chúng ta

có thể lên cơn kinh giật, vào hôn mê

Không chữa trị, tử vong bệnh lên đến 50-70%, nhất là ở trẻ em và phụ nữ mang thai; phụ nữ mang thai cũng rất dễ hư thai khi bị tả Người bệnh có thể chết trong vòng 2-3 tiếng đồng hồ sau khi bệnh phát ra

Hiện bệnh tả có 4 thể:

• Thể không có triệu chứng;

• Thể nhẹ giống tiêu chảy thường;

• Điển hình nhất là thể cấp tính như miêu tả ở trên;

• Thể tối cấp (diễn biến nhanh chóng, bí tiểu, suy kiệt nhanh chóng sau vài giờ

và tử vong)

Cận lâm sàng: Hematocrit tăng ở bệnh nhân không bị thiếu máu (do cô đặc máu), pH máu động mạch giảm nhẹ, giảm mạnh mức bicarbonate, tăng urea máu, tăng nhẹ số lượng bạch cầu đa nhân trung tính

- Thời kỳ hồi phục: Bệnh diễn biến từ 1-3 ngày nếu được bù đủ nước và điều

trị khángsinh

Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả

2.2.7.2 Trên động vật

• Trên tôm

Tôm bị nhiễm Vibrio spp ở trạng thái không bình thường, hôn mê, lờ đờ, kém ăn

hoặc bỏ ăn Tôm có thể nổi lên mặt ao, dạt bờ hay kéo đang bơi lòng vòng Vỏ tôm

bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và các phần phụ

Hình 2.8: Đuôi tôm sú bị mòn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio

Khi vi khuẩn này cảm nhiễm trên vỏ kitin và mang có thể gây ra các vết thương tổn màu nâu đen do kitin đã bị ăn mòn và viêm nhiễm Hội chứng này gọi là bệnh

vỏ hay bệnh nhiễm nâu Vỏ tôm có sự biến đổi thành màu đỏ hay màu xanh

• Trên cá

Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn Cơ thể có màu đen đặc biệt ở vùng lưng

và trên các vết thương tổn; da, vây có thể sưng lên và bị lở loét Cơ nổi hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục

Lớp cơ dưới da có nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, có hiện tượng lở loét của lớp biểu bì Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan

nó, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen

2.2.8 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam và trên thế giới

2.2.8.1 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở Việt Nam

Tại Việt Nam, tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản là rất

đáng báo động Dịch tiêu chảy cấp năm 2007 xảy ra với diễn biến phức tạp và tốc

độ lây lan nhanh chóng: Đợt 1 (từ 23/10/2007-6/12/2007): xảy ra tại 14 tỉnh với 259 trường hợp (+) với phẩy khuẩn tả, đợt 2 (24/12/2007-5/2/2008): tại thành phố Hà Nội với 32 trường hợp (+) Dịch tiêu chảy cấp xuất hiện do yếu tố môi trường bị ô nhiễm, nguồn nước bị nhiễm khuẩn, bên cạnh đó còn một yếu tố nguy cơ gây gia

tăng tỷ lệ nhanh đó chính là việc nhiễm các lọai vi sinh: E.coli, V.chloera,

Clostridium perfringens…của một số loại thức phẩm nguy cơ: các loại mắm, rau

sống, thức ăn đường phố ăn liền, các loại thực phẩm hải sản tươi sống đông lạnh Trong năm 2009, cả nước đã xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó có 5.026 người mắc, 3.938 người đi viện, 33 người tử vong Vào năm 2010 các vụ ngộ độc thực phẩm thường xuyên xảy ra ở tập thể như: trong quý III/2010 cả nước đã

có 48 vụ ngộ độc thực phẩm trong đó có 1.627 người mắc, 12 người tử vong, 75 công nhân của Xí nghiệp may Global (KCN Tiền Hải, huyện Tiền Hải) bị ngộ độc thực phẩm, Bình thuận 11/6/2010 có 127 du khách bị ngộ độc thực phẩm

2.2.8.2 Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh trên thế giới

Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70% tổng

số ca ngộ độc thực phẩm Tại các nước châu Á Vibrio spp là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc và các vụ nhiễm Vibrio spp chủ yếu ở các nước Nhật Bản,

Trung Quốc và trong khu vực Đông Nam Á

Theo thống kê ở Nhật Bản năm 1997 có 1.960 vụ ngộ độc thực phẩm với 39.989 người mắc, ở Úc mỗi ngày có 11.500 người mắc các bệnh cấp tính do ăn uống gây

ra, ở Mỹ hàng năm có đến con số hàng triệu trường hợp ngộ độc thực phẩm

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Quốc Tế (WHO) cho biết có 184.311 trường hợp bệnh tả được báo cáo từ 58 quốc gia (95% các quốc gia này thuộc Phi Châu) và có

2.728 người chết do tiêu thụ thức ăn nhiễm Vibrio spp

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY

HẢI SẢN ĐÔNG LẠNH 3.1 Phương pháp truyền thống

3.1.1.1 Nguyên tắc

Một lượng mẫu xác định (10g hoặc 25g) được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng đỉnh bằng các phản ứng sinh hóa và huyết thanh học Môi trường tăng sinh chọn lọc cho

V cholerae, V alginolytycus và V vulnificus là nước peptone kiềm Trong khi đó

môi trường Colistine Polymicine Borth thường được dùng để tăng sinh V

parahaemolyticus Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS

(Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Agar) Các vi sinh vật len men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hóa môi trường bên dưới khuẩn lạc Nếu vi sinh vật không len men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh

3.1.1.3 Môi trường và hóa chất

• Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water (APW)

• Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine)

• Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar)

• Canh Tryptone

• Thạch Kligler Iron (KI)

• Canh Hugh Leifson Glucose (HLG)

• Canh Carbohydrate tím

• Môi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller)

• Dung dịch oxidase

• Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%)

• Kháng huyết thanh polyvalent O dùng cho V.cholerae

3.1.1.4 Quy trình phân tích

Dùng que cấy vòng lấy mẫu, cấy ria lên mặt đĩa môi trường thạch TCBS để

phân lập khuẩn lạc đơn Ủ trong 18 – 22 giờ. 

Khuẩn lạc đặc trưng của Vibrio có hình dạng: KL V.cholerae và V

alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm,láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục,

có quầng trắng đục xung quanh Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V

vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương

25g mẫu + 225ml canh tăng sinh chọn lọc (APW) € đồng nhất trong 30

giây € độ pha loãng 10-1

Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang môi trường không chọn lọc T1N1 (3% NaCl) hoặc TSA bổ sung 3% NaCl Đem ủ 37 oC trong 18- 24h. 

Thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng huyết thanh

Kết luận

Phát hiện hay không phát hiện Vibrio trong 25g (10g) mẫu

Ủ ở 37oC trong 6 – 8 giờ

3.1.1.5 Thuyết minh quy trình

Ö Chuẩn bị mẫu

Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêm 225ml (90ml) dung dịch pha loãng mẫu APW Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu Thời gian dập mẫu là 30 giây Tất cả các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vô trùng

Ö Tăng sinh chọn lọc

Dùng nước peptone kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V.cholerae và V

alginolyticus, V vulnificus

Dùng canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus

Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ

màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, có quầng trắng đục xung quanh Khuẩn lạc

V.parahaemolyticus và V vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh

dương