Khảo sát thành phần hóa học cây ngọt nghẹo Gloriosa Superba L. phần 6

Khảo sát thành phần hóa học cây ngọt nghẹo Gloriosa Superba L

3 NGHIÊN CỨU

3.1 Giới thiệu chung:

Trong để tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao cloroform va cao butanol cia ci cay ngot ngheo Gloriosa superba L thu hái

ở bãi biển Dốc Lếch, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa Sau đó, chúng tôi định lượng hợp chất colchicin và 3-đemetilcolchicin có trong bộ phận củ, hạt

Bảo quan cao để dùng cho thực nghiệm

3.2 Kết quá và biện luận:

3.2.1 Cao diclorometan:

Sắc ky cột (SCK) cao diclorometan (25 g) trên silica gel thu được 6 phan doan (FI-F6) SKC phân đoạn 2 Œ2) và phân đoạn 5 (F5) trén silica gel, RPqy với nhiều hệ dung ly khác nhau, chúng tôi đã cô lập được hợp chất

có mã số NNI (1) và NN2 (4) Dựa vào kết quá phân tích phổ NMR, chúng

tôi để nghị cấu trúc lần lượt là colchicin và 3-demetilcolchicin Ngoài ra,

trong cao điclorometan, chúng tôi cô lập được hễn hợp stigmasterol (13) vA

B-sitosterol (NN3) (14) (xem phổ IH-NMR phụ lục số 15), B-sitosterol-3-O- B-glucopyranosid (NN6) (15) (xem phé 'H-NMR phu luc si 16) Sau day Ja phần biện luận để xác định cấu tric.

3.2.1.1 Colchicin (1) (NN1):

Chat NNI thu được dưới dạng bột vô định hình mầu vàng, tan trong

CHCI; Sắc ký bản mỏng pha thường với hệ dụng môi giải ly CHCh : MeOH

(9:1), hiện hình bằng H;SO¿ cho vết tròn màu vàng Chất NNI1 có độ quay

riêng (năng lực triển quang) [aJp -212.5 (c= 0.024, CHCl)

Phổ 'H-NMR của hợp chất NN1 cho thấy các tín hiệu của các proton của nhân thơm ở [õu 7.58 (1H, s, H-8), ön 7.34 (1H, d, J=ll Hz, H-12),

dy 6.88 (1H, d, J=11 Hz, H-11), 6, 6.54 1H, s, H-4)], và tín hiệu profon của

hai nhóm metilen CHạ ở [ôu 2.53 (1H, dd, J,=13 Hz, ,=7 Hz, H-5a), 84 2.39 (1H, dd, ïị<13 Hz, 1ạ=7 Hz, H-5b), ðn 2.32 (1H, m, H-6a), ôn 1.90 (1H, m, H-

6b)] Ngoài ra, có các mũi cộng hưởng cho thấy sự hiện điện của nhóm

metoxil OCH, [3y 3.66 (3H, s), 54 3.91 (GH, s), 6y 3.95 GH, s), dp 4.01 (3H, s)], một nhóm metil của acelil H;C-CO [ấu 1.98 (4H, s)], một proton nằm

gần một nguyên tố âm điện [Šn 4.65 (1H, m, H-7)], và một nhóm NH

lồn 7.76 (TH, d, 1=6.5 H2))

Phổ C, DEPT 90 và DEPT 135- NMR cho các mũi cộng hưởng ứng với

sự hiện điện của 25 carbon, trong đó có 8 carbon tứ cấp vòng thơm

{Sc 151.2 (s, C-1), ốc 141.7 (s, C-2), Šc 152.3 (s, C-3), ốc 134.3 (s, C-4a),

äc 153.6 (s, C-7a), õc 164.1 (s, C-10), &c 136.9 (s, C-12a), õc 125.7 (s, C- 12b)], bốn nhóm CH hương phương [ốc (107.4, 112.5, 130.6, 135.5)] và một, nhóm metin CH [õu 4.65 (1H, m, H-7), ðc 52.6 (d, C-7)] gắn trên nguyên tố

-14-âm điện, nhưng proton H-7 gan trén carbon C-7 cho mili cộng hưởng Ở trường thấp 54 4.65 chứng tổ nhóm metin CH này nằm gần một nhóm rit

điện tử, cụ thể là acetamid, hai nhóm metilen CH; [ốc (29.9, 36.6)], bến carbon sp mang oxigen OCH, [dc (56.2, 56.4, 61.4, 61.6)], mét nhém acetil

CH CO [3c 22.8 (q, -CH:CO), äc 170.0 ( s, -CH:CO)] và 1 nhém carbonil CO lốc 179.6 ()]

Khi so sánh những đặc tính cấu trúc của NN1 với những hợp chất đã được công bố từ cây ngọt nghẹo, chúng tôi nhận thấy cấu trúc của NN1 tương tự cấu trúc của colchicin, phổ của NN1 cũng hoàn toàn phù hợp với

phể của colchicin D6 quay riêng của NNI [øÏa -212.5 (c=0.024, CHG|), theo tài liệu tham khảo (2) cho thấy hợp chất NN1 là (-) colchicin, vậy

carbon thủ tính C-7 có cấu hình § trong cấu trúc của NNI1 Từ đây kết luận hợp chất NNI1 cô lập được là (-) colchicin

-15-Bang 1 Số liệu phổ !H (500MHz) và C_.NMR của NNI (pha trong

-16-

3.2.1.2, 3-Demetileolchicin (4) (NN2):

Chất NN2 thu được dưới dang bét vé dinh hinh mau vang, tan tốt trong

CHCH; Sắc ký bản mồng pha thường với hệ dung môi giải ly CHCH : MeOH

tỉ lệ 9:1, hiện hình bằng H;SOxa cho một vết tròn mầu vàng

Phổ 'H-NMR cúa hợp chất NN2 có các tín hiệu của các proton của

nhân thơm ở [õn 7.55 (1H, s, H-8), õu 7.31 (1H, đ, I=11 Hz, H-12), 5y 6.87

(1H, d, J=11 Hz, H-11), 5y 6.58 (1H, s, H-4)], và tín hiệu proton của hai

nhom metilen CH, [5, 2.47 (1H, dd, J,= 13 Hz, b= 7 Hz, H-5a4), 6, 2.32 GH,

dd, J,= 13 Hz, Js= 7 Hz, H-5b), va 54 2.29 (1H, m, H-6a), d4 1.89 (1H, m, H- 6b)], một nhóm metil acetil H,C-CO [6, 1.99 (3H, s)], mét proton nim gan nhóm acetamid [&, 4.64 (1H, m, H-7}] và một nhóm acetamid NHCOCH,

lõu 7.68 (1H, d, I=6.0 H2)] như của coichicm Tuy nhiên chỉ có sự biện diện

của ba nhóm raetoxil OCH; [öu 3.64 (3H, s), ên 4.00 (6H, S)]

Phổ !C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 của NN2 cho các mỗi cộng

hưởng ứng với sự hiện điện của 24 carbon, trong đó có 8 carbon tứ cấp vòng thom [8c 149.7 (s, C-1), ốc 139.1 (s, C-2), ốc 150.2 (s, C-3), dc 134.8 (s, C- 4a), õc 152.3 (s, C-7a), ốc 164.1 (s, C-10), 5c 136.9 (s, C-12a), ốc 125.0 (s, C-

12b)J Một nhóm amid NHCO [ỗc 179.1 @)], và một nhóm carbomil CO [Sc 179.6 (s, C-9)] Một carbon tam cấp sp” CH [ôc 52.7 (d, C-?7)]J, bốn

carbon tam c&p sp’ [8c 110.2 (d, C-4), äc 130.5 (d, C-8), Be 112.8 (d, C-1), 5¢ 135.3 (d, C-12)] Hai nhém metilen CH) [8c 29.5 (, C-5), Sc 36.4 (t, C-6)],

-17-ba nhém metoxil OCH; [&c¢ (56.4, 61.3, 61.5)], mét nhém acetil CH,CO

tốc 22.8 (q, -CH:CO), äc 176.1 (s, -CH;yCO)]

Chúng tôi nhận thấy NN2 có khung sườn giống colichicin và ít hơn

colchicin một nhóm metil CH; Ty day có thể kết luận NN2 là dẫn xuất

dđemetilcolchiein của NN1

Phố HMBC, HSOC ding để xác định cấu trúc của NN2 cho thấy có'

tương quan gitfa hai nhém metoxil OCH; [6, 4.00 (6H, s)] với hai carbon

vòng thơm tứ cấp [ỗc 164.1 (s, C-10) và 139.1 (, C-2)], vì vậy hai nhóm

metoxil OCH; này gắn trên C-2 và C-10, Nhóm metoxil OCH; còn lại Ở

[Sy 3.64 (3H, s)] tương quan với carbon tứ cấp [ốc 149.7 (s, C-])], vì vậy

nhóm OCH; nay gắn trên C-1

Hình 1 Tương quan HMBC của NN2 (4)

Từ những thông tin trên, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, phổ 'H-

NMR, C-NMR của chất NN2 phù hợp với 3-demetilcolchicin, Do đó, kết

luận NN2 là hợp chất 3-demetilcolchicin

-19-

3.2.2 Cao butanol:

Sắc ký cét cao butanol (7.20 g) trén silica gel thu dude 5 phân đoạn (B1-5) SKC phân đoạn 4 (B4) trên silica gel với nhiều hệ dung ly khác

nhau, chúng tôi đã cô lập được hợp chất có mã số NN5 (10) Dựa vào kết quả

phân tích phố NMR, chúng tôi để nghị cấu trúc của NN§ là 3-Ó- demetilcoichicin-3-O-B-D-glucopyranosid, Sau đây là phân biện luận xác

định cấu trúc NNã

3-0-demetilcoichicin-3-0-6-D-giucopyranosid (10) (NNS5):

6 HOH¿C

OH|

Hợp chất NNã thu được là một chất bột vô định hình, mầu vàng, tan tốt

trong MeOH Sắc ký bản mỏng pha thường với hệ dung môi giải ly CHC|; : MeQH tỉ lệ 4:1, hiện hình HạSO; cho được vết tròn mầu vàng

Phổ !H-NMR của hợp chất NNã có nhiều điểm tương đồng với NN2,

như tín hiệu của các proton của nhân thơm ở lỗu 7.40 (1H, s, H-8), by 7.42 (1H, d, J=11 Hz, H-12), 64 7.21 CAH, d, J=11 Hz, H-11), 3y 6.93 (1H, s, H- 43], hai nhóm metilen CH) & (Sy 2.64 CAH, dd, J,=13.5 Hz, J;=6.5 H2, H-5a),

-20-phan cau trúc của 3-demetilcolchicin Sự xuất hiện thêm các mỗi ở vùng 3-5 ppm như mũi proion anomer 6 [5, 5.03 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1)], cdc proton

của bốn nhóm metin CH nằm 6 [5, 3.56 (1H, m, H-2'), 5, 3.49 (1H, m, H- 3’), dy 3.40 (1H, m, H-4’), 5, 3.50 (1H, m, H-5')], mot nhém metilen CH; có

tín hiệu ở [ồn 3.71 (1H, dd, 1= 12 Hz, lạ= 6.5 Hz, H-6’a), 5, 3.94 (1H, đá,

J,= 12 Hz, J,=2 Hz, H-6'b)] cho thấy có một nhóm đường trong cấu trúc của

Phổ °C-, DEPT 90 va DEPT 135-NMR cho các mỗi cộng hưởng ứng

với sự hiện điện của 30 carbon, trong đó có § carbon tứ cấp vòng thơm

lốc 152.3 (s, C-l), äc 143.4 (s, C-2), äc 152.7 (s, C-3), Sc 136.0 (s, C-4a),

Bc 154.2 (s, C-7a), äc 165.5 (s, C-10), äc 138.4 (s, C-12a), 5c 128.5 (s, C- 12b)1 Một nhóm amid NHCO [ậc 172.6 @)], một nhóm carboni CÔ [8c 180.9 (s)] Một carbon tam cấp sp CH [8¢ 53.7 (d, C-7)], bốn nhóm carbon tam cap sợi [Sc 112.9 (d, C-4), 5c 141.2 (đ, C-§), äc 115.0 (d, C-11),

dc 137.7 (d, C-12)] Hai nhóm metilen CH¿ [ễc 30.4 ( C-5), äc 37.1 á, C-Ó)],

ba nhóm metoxil OCH; [äc 61.9 (q), 62.1 (q), 57.0 (g)], một nhóm aceil

[ỗc 22.4 (q -CH;CO), ốc 172.6 (s, -CH;:CO)]J Ngoài ra, còn có các mũi đặc

trưng của nhóm đường ở lỗc 102.3 (đ, C-L'), ốc 75.0 (d, C-2’), 5c 78.2 (d, C-

3°), ốc 71.6 (d, C-4), ốc 78.4 (d, C-5), 5c 62.7 (, C-69] DG dich chuyển hóa học của sáu tín hiệu này cùng với hằng số ghép của proton anomer cho thấy

né 14 B-pyranosil Vay NNS ia dẫn xuất glycosid của colchicin

Phổ HMBC cho thấy có sự tương tác giữa prolon anomer 6 [5, 5.03

GH, d, J=7.5 Hz, H-1)] va tin higu carbon ving thdm 6 [8¢ 152.7 @, C-3)]

Do dé, NNS chinh [a 3-O-demetilcolchicin-3-O-B-D-glucopyranosid.

OCH,

Hình 2 Tung quan HMBC của nhóm đường và nhân benzen

-22-Bang 3 SO Héu phé 'H (500 MHz) va °C ~NMR (125 MHø) và tưởng quan HMBC của NNS (pha

1 7.21 (AH, d, J=11 Hz) 115.0 (4) Cio C, Của

12 7.42 (1H, 4, I<11 Hà 137.7 (4 Cras Cros Crap

3.2.3 Dinh lugng colchicin (1) (NN1) va 3-demetilcolchicin (2) (NN2)

có trong bộ phận hạt, củ và lá cây ngọt nghẹo:

Các mẫu hạt, củ, lá cây ngọt nghẹo tươi đem phơi khô và sấy đến khi khối lượng không đổi Ly trích các mẫu với dung môi MeOH, diclorometan

thu được các cao MeOH và cao diclorometan Cao diclorometan được dùng làm thực nghiệm, Colchicin (NNI) và 3-demetilcolchicin (NN2) sau khi được

cô lập từ củ cây ngọt nghẹo dùng làm chất chuẩn

Xác định hàm lượng colchicin và 3-demetilcolchicin có trong cây ngọt

nghẹo bằng phương pháp sắc ký hiệu năng cao (HPLC) với đầu dò UV Kết

quả định lượng được trình bày theo bảng sau:

Từ kết quả phân tích định lượng colchicin và 3-demetilcolchicin, chúng

tôi nhận thấy rằng hàm lượng colchicin có trong mẫu hạt khô là nhiều nhất

với hàm lượng 0.29%, trong lá thấp nhất với hàm lượng 0.049%, 3-demetil- colchicin có trong củ nhiều so với hạt, không tìm thấy ở lá ngọt nghẹo Dựa vào kết quả trên, chúng tôi thấy rằng colchicin có hàm lượng nhiều nhất trong hạt ngọt nghẹo nên có thể dùng hạt làm nguồn nguyên liệu dược

-24-3.3 Thực nghiệm;

3.3.1 Điều kiện thực nghiệm:

Sắc ký bắn mỏng trên bản silica gel tráng sẵn (Merck, Kieiselgel 6g Fy54, 250 Hm) hay sắc ký bản mồng pha đáo RPạ; Sắc ký cột được thực hiện

trên siica gel (40 um, Merck), RP;, (40 ttm, Merck), SPE Cys

Các cấu tử trên bản mồng được phát hiện bằng đèn tử ngoại hoặc dùng

thuốc hiện hình là acid sulfuric đậm đặc, nóng

Các phân đoạn cho sắc ký bản móng với vệt rõ đưới đèn tử ngoại mới

được tiếp tục khảo sát,

Sắc ký cột silica gel với hệ dung môi chạy cột là các hệ eter dâu hỏa : cloroform, cloroform : acetat etil, cloroform : metanol, cloroform : aceton, aceton : metanol, metanol : nước

Dung môi thực nghiệm là dung môi chưng cất: aceton (55-56°C)

diclorometan (41-42°C), cloroform (61-62°C), acetat etil (76-77°C) va

metanol (64-65°C),

Độ quay riêng (năng lực triển quang) của chất được đo trên máy ADP

220 Polarimeter,

Hàm lượng các chất có trong các mẫu được xác định trên máy sắc ký

hiệu năng cao (HPLC) Perkin Eimer với đầu dò Sectra series UV 150

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ghi trên máy Bruker AV500 [500 MH¿ CH)

và 125 MHz CC] với TMS là chất nội chuẩn CDCI; là dung môi cho mẫu

NNI1, NN2, NN3, MeOD là dung môi cho mẫu NN5, CDC] và MeOD là

dụng môi cho mẫu NNó

3.3.2 Xử lý mẫu:

Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát thành phần hóa học của

củ cây ngọt nghẹo 3.50 kg củ cây ngọt nghẹo tươi hái ở Dốc Lếch, huyện

Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa Cú thu được xắt lát mông đem phơi khô, sau đó

-25-

sấy ở 70°C đến khối lượng không đối được 1.20 kg cú khô Bảo quần nguyên

liệu nơi khô ráo để dùng cho thực nghiệm

3.3.3 Quá trình trích ly cao thô:

1.20 kg cú khô được trích nóng 3 lần với dung môi metanol bằng phương pháp đun hoàn lưu Sau đó cô quay đuổi đụng môi ta thu được cao,

3.3.4 Khao sát cao diclorometan:

Thực hiện sắc ký cội cao diclororaetan (25 g) trên sHica gel với hệ dung

ly CHCl: MeOH cé d6 phân cực tăng dẫn từ 0%-25đ thu được 6 phân đoạn

(F1-F6) Kết quá được trình bày theo sơ đề 2

Sơ đồ 2 Quy trình xử lý cao điclorometan của củ cây ngọt nghẹo

Cao diclorometan (25 ø)

SKC, silica gel, CHCI, : MeOH (0%-25%) => 6 phan doan (F1-F6)

“ Khảo sát phan dean F2:

Lấy phân đoạn F2 (11.60 g) thực hiện sắc ký cột trên silica gel (CHC|; : MEeOH với độ phân cực tăng dân) thu được 4 phân đoạn (F2i-F24) Sắc ký

cột pha đáo C-18 (với hệ dung môi HạÔ : MeOH tỉ lệ 1:2) phân đoạn F23

(1.78 g) thu được 2 phân đoạn F231-F232 Lay F232 (60 mg) thực hiện sắc

ký cột nhanh với hệ dung môi aceton : metanol (98:2) ta cô lập được hợp

chất tinh khiết NNI (40 mg)

-27-

Sơ đồ 3 Quy trình khảo sát phân đoạn F2

Cao diclorometan (25 g)

SKC, silica gel, CHCL : MeOH (0%-25%)

=> 4 phần đoạn (F21-F24)

¥ E23 (6.97 g)

-28-

v Khảo sát phân đoạn FS:

Sắc ký cột trên phân đoạn F5 (0.80 g) với hệ dung môi cloroform :

aceton (1:4) sau đó tăng dẫn nồng độ aceton từ §0%-100% thu được 3 phân

đoạn F51- F53 Lấy phân đoạn F53 thực hiện sắc ký cột trên silica gel với hệ

dung môi aceton : metanol (95:5) ta cô lập được hợp chất tình khiết NN2 (20

SKC, silica gel, aceton : melanol (95:5)