Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của Lá Cây Trâm Bầu - Combretum quadrangulare kurz phần 6

Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của Lá Cây Trâm Bầu - Combretum quadrangulare kurz

Lugn an ‘hac &T Khoa Hoc Héa Hoc Thực Nghiệm

4 THỰC NGHIỆM

4.1 Xử lý mẫu

Mẫu lá cây trâm bầu sau khi thu hái được để khô tự nhiên, sau đó sấy ở

50-60°C đến khi trọng lượng không đổi và xay thành bột Đây là mẫu nguyên

liệu điều chế các loại cao

4.2 Xác định độ ẩm

Lấy 3 mẫu lá tươi, trọng lượng mỗi mẫu là 100g, sấy ở 105 °C đến khi

trọng lượng không đổi Cân mẫu khô

_— Trọng lượng mẫu tươi —- Trọng lượng mẫu khô x

Trọng lượng mẫu tươi

Trọng lượng

Độ ẩm của nguyên liệu: 87,5%

4.3 Điều chế các loại cao :

Cây cỏ thường chứa một số hợp chất hữu cơ như : sterol, flavon, tanin,

Chúng tôi lần lượt xác định sự hiện diện của các cấu tử trên bang phan ứng có màu hoặc bằng phản ứng tạo thành trầm hiện với các thuốc thử đặc

Sự khảo sát này được thực hiện trên bột khô, cao eter dầu hỏa(60-90°C ),

cao cloroform , cao etyl acetat, và cao metanol của lá cây trâm bầu

Các dạng cao trên được điều chế theo sơ đổ 1

Trang 44

Luận án Thạc &ï Khoa Học Hóa Học Thực Nghiệm

Sơ đồ 1 Điều chế bột lá khô, cao eter dầu hỗổa, cao cloroform, cao

etyl acetat, cao metanol

Mẫu lá cây tươi

ỶỲ Bột lá cây khô

Ỷ

Ỷ

v

Dich trich cloroform

-Để khô tự nhiên

- _ Để khô tự nhiên

- _ Sấy ở 50-60°C đến khi trọng lượng không đổi

- - Nghiễn thành bột

-Tận trích bằng eter dầu hỏa ( 60-90°C)

trong dụng cụ soxhlet

-Để nguội, lọc

Ỷ

-Tận trích bằng cloroform

trong dụng cụ soxhlet

-Lọc

Dịch trích eter dầu hỏa

-Cô cạn dưới áp suất kém ở 40°C

Ỷ

suất kém, 40°C

lan hồi dung môi dưới áp

v

-Để khô tự nhiên -Tận trích bằng metanol

trong dụng cu soxhlet

-Lọc

Ỷ

Bã

| -Để khô tự nhiên

-Tận trích bằng etyl acetat trong dụng cụ soxhlet

-Lọc

Ỷ

-Thu hổi dung môi dưới á

suất kém, 40°C

-Thu héi dung méi duéi 4p suất kém, 40°C

Trang 45

Luan an ‘hac &f Khoa Hoc Héa Hoc Thực Nghiện

Sơ đồ 2 Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá cây trâm bầu

Bột khô(10g)

-Trích kiệt bằng eter dầu

hda (60-90 °C) trong soxlet

-Trích kiệt bằng etanol 70°

-Thu hồi dung môi dưới áp suất kém ở 40°C

Vv

Dich nuéc

-Nhỏ dung dich gelatin 1% dén khi không còn tủa xuất hiện thêm -Tách

-Tận trích bằng etyl acetat | Rita bing bing etyl acetat dén hét flavonoid

Dich ety] acetat

-Thu hồi dung môi dưới áp suất kém

Cặn flavonoid

-Sấy khô ở 105° C đến khi

khối lượng không đổi

Flavonoid toan phan 1.19%

Trang 51

Luạn an thạc đỉ Khoa Học Hóa Học Thực Nghiệm

4.4.5 Alcaloid?$#ồ?ồ

Sự hiện diện của alcaloid được thực hiện bởi phản ứng trầm hiện với các

thuốc thử Bouchardat, Mayer, Hayer, Bertrand và Dragendorff

Điều chế dung dịch thử theo 2 phương pháp

Phương pháp Ì :

Trắch mẫu (5g) với dung dịch Prollius (eter etyl, cloroform, etanol 95% và dung dịch NHạ đậm đặc với tỉ lệ 25:8:8:1) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, khuấy thường xuyên, lọc, lấy dịch chiết, sau đó cô cạn được cặn Hòa tan cặn trong

dung dịch HCI 1% trong nước ở 80ồC trong 1 giờ, lọc, thu được dung dịch thử

Phương pháp 2 :

Hoa tan 5g mau trong dung dich HCI 1%, dun nhe 6 80ồC trong 1 gis, lọc Các thuốc thử định tắnh alcaloid

Thuốc thử Bouchardat :

Nước cất 10ml

Phần ứng dương tắnh khi có trầm hiện màu nâu

Thuốc thử Mayer :

Nước cất 500ml

Phần ứng đương tắnh khi có trầm hiện màu vàng nâu

Thuốc thử Bertrand :

Phần ứng dương tắnh khi có trầm hiện màu trắng đục

Thuốc thử Hager :

Acid picric bão hòa trong nước

Trang 52

Luan an 'Thac &7 Khoa Hoe Héa Hoc Thực Nghiệm

Thuốc thử Dragendoff:

Khi sử dụng, trộn hai dung dịch A và B Lấy 20 mi dung dịch hỗn hợp (A+B) thêm vào 20ml CH;COOH và 100ml nước cất

Phản dương tính khi có trầm hiện màu đỏ

Định tính alcaloid theo các cách sau day :

từng giọt các thuốc thử trên vào ống nghiệm

Kết quả : Bột lá thô, cao eter dầu hỏa, cao cloroform, cao etyl acetat, cao metanol đều có phản ứng âm tính

Kết luận : Lá khô trâm bầu không chứa alcaloid

4.4.6.Glicosid™

Trích 5g mẫu với 20ml etanol 70” trong 24 giờ, lọc, chế hóa dịch lọc với dung

dịch chì acetat 20% (20ml) Lọc, chế hóa dịch lọc với dung dịch Na;SOx bão hòa

(10ml) Lọc, cô thu hổi dung môi dưới áp suất kém thu được cặn Hòa tan cặn

trong etanol 90° Lấy dịch lọc (sơ đồ 3)

Thuốc thử Tollen :

Thêm dung dịch NH; vừa đủ để trầm hiện tan

Phản ứng dương tính khi xuất hiện lớp tráng bạc

Thuốc thử Molish :

Thimol xanh 2% 1-2 giọt

H;SO¿ đậm đặc Iml

Phan ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ

Lấy 2 ống nghiệm , cho vào ống thứ nhất 2ml thuốc thử (làm đối chứng )

Cho 2ml dịch mẫu thử vào ống thứ nhì , cho thuốc thử vào

Kết quả: Mẫu bột khô, cao cloroform, cao etyl acetat, cao metanol cho:

Trang 53

Luan an ‘hac & Khoa Học Hóa Học Thực Nghiệm

Phản ứng tráng gương với thuốc thử Tollen

Mầu tím hồng chuyển sang màu đỏ với thuốc thử Molish

Sơ đồ 3 Ly trích glicosid

Nguyên liệu

- Chiết bằng etanol 70° trong soxhlex

- Để nguội, lọc

Ỳ

-Chế hóa với dung dịch chì acetat 20%, lọc

-Chế hóa với dung dịch Na;SO¿

-Lọc

-Cô cạn dưới áp suất kém,40°C

-Hòa tan cặn trong etanol 90°

Dung dịch alcol để định tính glicosid

Kết luận : Bột lá khô, cao cloroform , cao etyl acetat , và cao metanol

của lá cây trâm bầu chứa glicosid

4.4.7 Saponin.”

Trang 54

LuạTT 8ñ Thạc ðĩ Khoa Học Hóa Học Thực Nghiệm

mâu thử

'sôi trong 30 phút Lọc, để nguội, thêm nước cất cho đủ 100ml

; Lấy 10 ống nghiệm có kích thước 16x160mm Cho vào các ống nghiệm

lần lượt 1,2,3 10ml dich chiết Thêm nước cất vào mỗi ống nghiệm cho đủ 10ml

Lắc mỗi ống nghiệm theo chiểu dọc của ống trong 15 giây Để yên 15 phút rồi

đo chiều cao các cột bọt Nếu chiều cao cột bọt trong tất cả ống nghiệm dưới

lcm, chỉ số bọt dưới 100 nghĩa là không có saponin

Chỉ số bọt = 10x d/c d: chiều cao cột bọt (cm) c: lượng mẫu trong ống nghiệm (g) Kết quả thực nghiệm cho thấy lá cây trâm bầu không chứa saponin (chỉ số

bọt dưới 100)

4.5 Tách chiết và cô lập flavonoid và triterpen

4.5.1 Tách chiết và cô lập hợp chất flavonoid H, , hai h¢p chất H; ,H; từ cao

cloroform của lá cây trâm bầu

a Sắc ký bản mỏng

Điều kiện :

Ding ban mong TLC plastic roll 0,2mm-silicagel 60F¿s¿; bản mồng

silicagel 60 F254c6 kích thước 30x120mm

Hệ dung môi khai triển 14 benzen-etyl acetat 1:1; cloroform : metanol 9:1; etyl acetat : metanol 9:1

Thuốc thử hiện vết là dung dich FeCl,1%; hoi Ib va acid phosphomolibdic 10%

Sản phẩm thô được hòa tan trong metanol

Thực hiện sắc ký bản mồng silicagel 60 F2s¿ trên cao cloroform, dùng các

hệ thống dung môi triển khai như sau” :

CHC];

CHC]; -MeOH (19:1)

CHCI, —MeOH (9:1)

CHC; —MeOH (8:2)

CHCl; —MeOH (7:3)

CHC]; -MeOH (1:1)

rang 55

luau au 1nac @t Knoa foc Moa Hoc Thực Nghiệm

C;Hạ-EtOAc (19:1)

CsH6-EtOAc (9:1)

Ca¿H;-EtOAc (8:2)

CsH6-EtOAc (7:3)

C¿Hạ-EtOAc (1:1)

C¿Hạ-EtOAc (3:7)

CaH;-EtOAc (2:8)

EtOAc

Eter dầu hỏa -EtOAc (19:1)

Eter dầu hỏa -EtOAc (9:1)

Eter dầu hỏa -EtOAc (8:2)

Eter dầu hỏa -EtOAc (7:3)

Eter dầu hỏa -EtOAc (1:1)

Eter dầu hỏa -EtOAc (3:7)

Eter dầu hỏa -EtOAc (2:8)

Kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy: Hệ dung khai triển benzen- etyl

\cetat có khả năng tách tốt nhất, hệ dung môi eter dâu hỏa-etyl acetat tách ương đối tốt

b Phương pháp sắc ký cột

Kết quả định tính cho thấy cao cloroform chứa flavonoid, triterpen va tlicosid

Kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy hệ dung môi giải ly benzen-etyl acetat :à eter dầu hỏa — etyl acetat tách tốt hơn cả

Dựa trên kết quả của sắc ký bản mỏng, để tách các hợp chất hữu cơ có

rong cao cloroform, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký trên cột, với chất hấp

shụ là silicagel, dung môi giải ly là eter dầu hỏa, etyl acetat, metanol và hỗn

Iợp của chúng

Thực hiện sắc ký cột với điều kiện như sau :

Kích thước cột 4x§0cm

Khối lượng silicagel sử dụng :350g (hoạt hóa ở 110 °C,1giờ)

Khối lượng cao cloroform để nạp cột :14g

Hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dẫn: eter dâu hỏa, eter

du héa—etyl acetat, etyl acetat va ety] acetat-metanol

Hòa tan 14g cao cloroform vào 1 lượng metanol vừa đủ, cho 7g silicagel đã oat hóa vào hỗn hợp trên, trộn đều, đuổi dung môi ở nhiệt độ phòng và đưới áp tất kém đến khô Nghiền hỗn hợp trên thành bột Đổ eter dầu hỏa vào cột, cho

Trang 56

Thực Nghiệm

từ từ silicagel vào Để cột chảy với hệ dung môi giải ly eter dầu hỏa khoảng 6

-giờ để ổn định cột Sau khi cột ổn định, cho vào đầu cột hỗn hợp cao ở trên

Hứng từng phân đoạn 100ml], cô cạn từng phân đoạn thu cặn

Thực hiện sắc ký bản mỏng silicagel trên mỗi phân đoạn, gộp chung các phân đoạn có kết quả sắc ký bản mỏng giống nhau

Kết quả tiến trình sắc ký trên cột silicagel thực hiện trên cao cloroform

được tóm tắt trong bảng 27

c Sắc ký bản mỏng điều chế

Thực hiện sắc ký bản mỏng điều chế !Ê với điểu kiện như sau:

Ban mong silicagel loai TLC glass Silica Gel (Merck); 0,25 mm (Hoạt hóa

1giờ, 110°C) Để nguội bản trong bình hút ẩm

Hòa tan cặn (14,6 mmg) trong metanol, đưa mẫu lên bản, khai triển 3 lần

bằng dung môi etyl acetat (hình 8,9,10)

Giải ly chất bằng hỗn hợp etyl acetat — metanol thu được 9,2 mmg một chất chính (hình 4)

4.5.2 Tách chiết và cô lập flavonoid từ cao etyl acetat của lá cây trâm bầu

a.Sắc ký bản mỏng

Điều kiện :

Ding ban méng TLC plastic roll 0,2mm-silicagel 60F¿s¿; bản mỏng silicagel có kích thước 30x120mm

Hệ dung môi khai triển (giống sắc ký bản mồng cao cloroform})

Thuốc thử hiện vết là dung dịch FeCl;1%; hơi lạ và acid phosphomolibdic

10%

Sản phẩm thô được hòa tan trong metanol

b Sắc ký cột silicagel trên cao etyÌ acetat

Sắc ký cột lần 1 :

Kích thước cột: 4x80 cm

Khối lượng silicagel sử dụng :350g (hoạt hóa 6 110°C, trong 1 gid)

Khối lượng cao để nạp cột: 14g

Hệ thống dung môi giải ly: eter dầu hỏa-etyl acetat, etyl acetat, etyl acetat-metanol

Cách nạp cao etyl acetat vào cột tương tự như cao cloroform

Sắc ký cột lần 2 :

Kích thước cột: 0,5x20 cm

Khối lượng silicagel sử dụng: 4g (hoạt hóa ở 110°C, trong 1 giờ)

Khối lượng sản phẩm thô :20,2mg

Trang 57

Thực Nghiệm

Hệ dung môi giải ly là benzen -etyl acetat 8:2

Hứng mỗi phân đoạn : 5ml

Kết quả tiến trình sắc ký cột lần 1 được tóm tắt trong bảng 28; sắc ký cột lần 2 được tóm tắt trong bảng 29

4.6 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Dung môi trong quá trình chiết xuất và sắc ký là: Eter dầu hỏa (60-90°C), benzen, cloroform, etyl acetat, metanol

Chất hấp phụ dùng trong quá trình sắc ký là Silicagel (Merk)

Hóa chất dùng trong quá trình sắc ký bản mỏng: Bản mỏng silicagel loại TLC glass Silica Gel, loại TC plastic roll 0,2mm Silicagel 60 F¿z¿, bản mỏng

silicagel 60 Fasa

*Tinh chế và xử lý hóa chất trước khi làm thí nghiệm “2

Eter dầu hỏa (60-90°C): Chưng cất phân đoạn xăng napta Hứng phân

đoạn eter dầu hỏa ở 60-90°C, lắc dung môi với H;SO¿ đậm đặc đến khi dung dịch acid không còn màu vàng Rửa dung với nước cất đến pH=7 Lắc với

KMnO, 10% đến khi dung dịch KMnO¿ không đổi màu, rửa với nước cất và làm

khan sơ bộ bằng Naz;SO¿ khoảng 24 giờ Chưng cất dung môi, lấy phân đoạn sôi

ở 60°C đến 90°C Làm khan dung môi bằng sợi Natri

Benzen: Lắc benzen thương mại với HạSO¿ đậm đặc đến khi dung dich

acid không còn màu vàng Rửa dung môi với nước cất đến pH=7.Làm khan sơ bộ

bằng Na;SO¿ Lọc, chưng cất phân đoạn và hứng phần dung mdi 6 80°C Lam 'khan dung môi bằng sợi Natri

Cloroform : Lắc cloroform thương mại với nước cất để loại etanol (Khoảng 5 lần) Dùng bình lóng tách bổ phần nước, làm khan sơ bộ bằng NazSO¿„, sau đó lọc và chưng cất phân đoạn Lấy sản phẩm ở phân đoạn 61°C,

Làm khan bằng CaCl; Bảo quản dung môi trong bóng tối

Etyl acetat: Lắc etyl acetat thương mại với nước cất để loại etanol (Thực

hiện khoảng 5 lần), Tách bổ phần nước, làm khan sơ bộ bằng Na;SO¿ ( khoảng

24 giờ ).Lọc, chưng cất phân đoạn Lấy sản phẩm ở phân đoạn 77°C làm khan dung môi bằng MgSÓ¿

Metanol : Đun hoàn lưu metanol (khoảng 2 giờ) thương mại với sợi Mg trên bếp cách thủy để loại nước Chưng cất phân đoạn, lấy sản phẩm ở phân

đoạn 64 đến 65°C

Trang 58