Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của Lá Cây Trâm Bầu - Combretum quadrangulare kurz phần 5

Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của Lá Cây Trâm Bầu - Combretum quadrangulare kurz

BUMUE GE LLC @1 ANOA MOC Moa foc Nghiên Cứu Và Kết Quả

=

3 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUÁ 3.1 Nguyên vật Hiệu

Đối tượng nghiên cứu là lá cây trâm bầu

Mẫu lá cây tram bdu được thu hái từ các cây trâm bầu mọc hoang ở huyện Bến lức tính Long an vào tháng 1 Lá cây được để khô tự nhiên, sau đó sấy ở 50-60°C đến khi trọng lượng không đổi

4.2 Phương pháp nghiên cứu,

3.2.1.Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của lá cây tram bau

Chúng tôi nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của lá cây trâm bầu bằng các phan ứng định tính một số hợp chất hữu cơ thường có trong thực vật như : sterol, triterpen, tanin, flavonoid, alcaloid, glicosid, saponin theo các tài liệu tham khảo ghi trong phần thực nghiệm

3.2.2 Nghiên cứu định lugng flavonoid

Chúng tôi định lượng flavonoid theo phương pháp cân Š

3.2.3 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và cô lập các nhóm hợp chất

Năm 1998, các tác giả Arjun H.Banskota'” dùng dung môi metanol

chiết xuất các cấu tử hữu cơ từ lá cây trâm bầu, kế tiếp dùng sắc ký cột bình thường (gel, siic), sắc ký cột pha đáo (Cosmosil 75 C¡;-OPN, dung môi giải ly

là MeOH-H;O-MeCN 1:1:1) kết hợp với sắc ký bản mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography ) để cô lập các hợp chất flavonoid và triterpen

cycloartan

Trang 21

Luận án Thạc ðĩ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

butanol.””““”'?8?°, Các phương pháp sắc ký cột bình thường (gel, silicagel) sắc

ký cột pha đảo?!2230313253 (Sephadex, Cosmosill40 C;;) kết hợp sắc ký bản

mỏng điều chế được dùng để cô lập chúng

Dựa vào kết quả định tính, chúng tôi để nghị phương pháp chiết xuất các hợp chất hữu cơ có trong lá trâm bầu như sau : dùng hệ thống dung môi có độ phân cực tăng dần để chiết xuất các hợp chất hữu cơ Trước tiên khử chất béo, sterol, clorophyl trong bột lá thô cây tram bau bằng cách tận trích bột bột lá

thô với dung môi eter dầu hỏa (60-90°C), kế tiếp lần lượt chiết xuất bằng các dung môi cloroform, etyl acetat và metanol ( so dé 1)

Để tách chiết và cô lập các hợp chất hữu cơ, chúng tôi sử dụng các phương pháp như : sắc ký cột (chất hấp phụ silicagel ), sắc ký bản mỏng điều chế khai triển nhiều lần, phương pháp kết tỉnh phân đoạn

3.2.4 Nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ

Để xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ, chúng tôi dựa vào kết quả phân

tích phổ như : phổ hồng ngoại, khối phổ, phổ tử ngoại, phổ 'H-NMR, ''C-NMR,

'3C-DEPT NMR, phé HMBC ( hetero nuclear mutiple bond coherent ), HMQC (hetero nuclear mutiple- quatum coherent )

3.3 Kết quả nghiên cứu

3.3.1 Kết quả phân tích sơ bộ thành phân hóa học lá cây trâm bầu

Bột thô lá cây trâm bầu được tận trích lần lượt với các dung môi : Eter dầu hỏa 60-90°C, cloroform, etylacetat, metanol Thu hồi dung môi được các loại cao

Kết quả định tính các loại cao được ghi ở bảng 4

Trang 22

Luận án Thac & Khoa Hoc Héa Hoe Nghiên Cứu Và Kết Quả

Bảng 4 Kết quả định tính các nhóm hợp chất hữu cơ

Phan ting vdi dung dich FeCl, 1% - - + +

Nhận xét : Lá cây trâm bầu chứa sterol, triterpen, flavonoid, tanin, glicosid

3.3.2 Kết quả định lượng flavonoid

Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo dược liệu khô là 1.19%

Trang 23

WH EH ENEC © ANOA Hoc Hdéa toc Nghiên Cứu Và Kết Quả

Ham lượng flavonoid toàn phần tính theo được liệu khô là 1.19%

3.3.3 Kết quá nghiên cứu tách chiết và cô lập hợp chất flavonoid và

triterpen

* Kết quả tiến trình sắc ký cột của cao cloroform

Thực hiện quá trình sắc ký cột của cao cloroform, chúng tôi thu được 31

phân đoạn

Phân đoạn 10, dung môi giải ly là eter đầu hỏa-etyl acetat (9:1) sau khi cô

cạn dung môi cho chất rấn chất màu vàng (50.2mg) Kết tính sản phẩm trong metanol thu được tỉnh thể hình kim màu vàng (36,4mg), ký hiệu là H¡, hiệu suất 0.054% tính trên trọng lượng bột lá thô Hị cho trắc nghiệm đương tính với thuốc thử Shibata và FeCl; 1% Sắc ký bản mỏng silicagel cho một vệt tròn mầu xanh nâu có Re= 0,64, hệ dung môi khai triển là cloroform —metanol (9:1) thuốc thử

là ctyl acetat — metanol 9:1, thuốc thử biện vết là acid phosphomolibdic 10%

trong EtOH 90° (hinh 3)

Phân đoạn 18, hệ dung mỗi giải ly cter dầu hỏa-etyl acetat1:1, sau khi cô

cạn dung môi cho cặn rắn màu trắng (25,2mg) Kết tỉnh lại sản phẩm trong metanol thu được cặn ran mau trắng (14,6mg).Sắc ký bản mồng thu được 2 vết

chính gần nhau (dung môi khai triển là etyl acetat ) (hình 4).Thực hiện sắc ký bán mỏng điều chế phân cặn này, khai triển 3 lần (dung môi khai triển là etyl

acetat) (hình 5, 6, 7), thu được một chất rấần mầu trắng (9,2 mg ), ký hiệu là Hạ,

hiệu suất là 0,014% tính trên trọng lượng bột lá thô H; cho trắc nghiệm dương

tính với thuốc thử Liebermann-Burchard, Salkowski và Noller ( thuốc thử đặc

trưng của triterpen), sắc ký bản mồng silicagel cho một vết tròn mầu xanh có Rị

=0,5; hệ dung môi khai triển là etyl acetat—~ metanol 19:1, thuốc thử hiện vết là

acid phosphomolibdic 10% trong EtOH 90° (hinh 4)

* Két qua tién trinh sic ky e6t cao etyl acetat

Trang 24

Hình 8 Kết quả sắc ký bản mỏng điều chế (khai

triển lần 1) cặn phân đoạn 17 của cao Cloroform.

Hình 9 Kết quá sắc ký bản mỏng điều

chế (khai triển lần 2) cặn phân đoạn

17 của cao Cloroform Dung môi: Etyl

acetat

Thuốc thử : Acid Phosphomolibdic

Hình 10 Kết quá sắc ký bản mồng điều chế (khai triển lần 3) cặn phân đoạn 17

của cao Cloroform Dung môi: Etyl acetat

Thuốc thử : Acid Phosphomolibdic

Luận an Thạc Sf Khoa Hoc Héa Hoe Nghiên Cứu Và Kết Quả

Phân đoạn 5, dung môi giải ly là eter dầu hỏa — etyl acetat 8 :2 Sau khi

cô cạn dung môi cho chất rắn màu vàng (30,3mg) Kết tinh sản phẩm trong

metanol thu được tỉnh thể hình kim màu vàng (20,2 mg) Sắc ký bản mỏng

silicagel cho 2 vết gần nhau Sắc ký lân 2 phần cặn này thu được một chất chính,

ký hiệu là Hạ Sản phẩm H¿ cho trắc nghiệm dương tính với thuốc thử Shibata và

FeCl; 1% Sắc ký bản mỏng silicagel cho một vệt tròn màu xanh nâu có R¿ =

0,46; hệ dung môi khai triển là cloroform —metanol (9:1) thuốc thử hiện vết là

b Sắc ký bản mỏng silicagel (hình 2 ) : Dung môi khai triển là CHCI;-

MeOH 9:1) thuốc thử hiện vết là FeCl; 1% Bản mỏng cho một vét tron xanh

nâu duy nhất, có R; = 0,64

c.Phổ IR (phụ lục 1 )

Phổ hồng ngoại của hợp chất H¡ có các mũi hấp thu đặc trưng như sau (bảng 5) :

Bảng 5 Phổ hông ngoại của hợp chất Hị

luda an 'thac Sf Khoa Hoc Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

_ Độ dịch chuyển hóa học Ä,oại nroton

3,86 6,35 2H của 2 proton trên vòng A vị trí

6,94 4H của proton trên vòng B

g Phé °C-NMR (phu luc 5a, 5b):

Phổ “C-NMR của hợp chất Hị có các mũi hấp thu đặc trưng như sau

922: 97,6; 105,1; 115,6; 120,4; € =C của nhân thơm

h Phổ !C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 6a, Ób ) : Cho biết là

phân tử H; có 17 carbon, gồm 8 carbon nhất cấp và tam cấp, 9 carbon tứ cấp

i PhO HMBC (hetero nuclear mutiple bond coherent) (phu fuc 7a, 7b, 7c ) và HMOC (hetero nuclear mutiple-quantum coherent) ( phu lục 8a,8b )

k PhO ROESY (rotating frame nuclear overhauser effect) ( phe lục 9)

Trang 26

uuu af ENaC St Anoa foc tida Hoc Nghiên Cứu Và Kết Quad

Phổ ROESY cho biết những proton nào ở gần nhau trong không gian (tương

tác không nối)

*Biện luận kết quả

Phổ tử ngoại cho biết H; thuộc nhóm flavonol ( hoặc dẫn xuất 3-metoxy của flavonol) có hai đỉnh hấp thu ở A„„(MeOH)=350nm và À„„ ,MeOH)=266nm,

Có thể dự đoán H, là dẫn xuất của 3-metoxy-flavonol vì có một đỉnh hấp

thu ^ mạ„ nhỏ hơn 271nm?Ì

Khung 3-metoxi flavonol

Khối phổ M” có cường độ mạnh bằng 314 ứng với công thức Cị;H,Ò¿

(phù hợp với đữ liệu phổ °C va phé °C-DEPT 1A c6 17 C) công thức phân tử

cho biết H; có 6 nguyên tử oxi, dẫn xuất 3-metoxy flavonol có một nguyên tử oxi

thuộc nhóm ceton, 1 nguyên tử oxi ở đị vòng C và một nguyên tử oxi ở nhóm thế 3-metoxy Ba nguyên tử oxi còn lại thuộc nhóm OH hoặc nhóm OCH¿ Khung flavonol gồm hai nhân benzen A và B nối với đị vòng C ( gồm 3 nguyên tử 'carbon) có 15C công thức phân tử H có 17C như vậy Hị có hai nhóm OCH; là

nhóm thế ở vòng A hoặc vòng B Điều này phù hợp với đữ liệu phổ ‘H-NMR IA

Hị có hai nhóm OCH; & 5=3,80ppm va 3,86ppm Suy ra H; có bai nhóm QH gắn với vòng bezen A hodc B

Theo tác giả Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Văn Tựu, '* nếu vòng B có nhóm thế 4-OH (hoặc 4-OR nói chung, R là 1 nhóm thế bất kỳ), trong phổ 'H -NMR, các proton C-2’, C-3’, C-5’ va C-6’ xuất hiện từng đôi thành pic đôiQJ=8,5Hz) ở

vùng 6,5-7,9ppm Pic đôi của hai proton H-3' và H-5' luôn Ở trường cao hơn pic

đôi của H-2' và H-6 ' Phổ !H-NMR của H; cho thấy vòng B mang Ì nhóm thế

(có thể là OH hoặc OCHg) ở vị trí 4` ( 2 mũi đôi 2H của 2 cặp proton ortho ở 7,97 và 6,94 ppm, hằng số ghép 8,8§Hz) Vòng A có hai nhóm thế ở vị trí meta

Trang 27

Luận ân Thạc đĩ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cửu Và Kết Quả

với nhau (2 mỗi đôi 1H của 2 proion meta ở 6,71 và 6,35ppm, hằng số ghép J=2Hz)

Dựa vào phổ HMQC, HMBC có thể xác định được 6 mũi của 6 carbon

trên vòng Á : 2 mỗi của C-6 và C-§ ở 97,6 và 92,2ppm, cũng là 2 mũi CH trên pho DEPT, 4 mỗi còn lại ở :105,1; 156,2; 160,9 và 165,0 ppm Trong đó, mỗi Ở

105,1 và 165,0 có cùng crosspeak với cả 2 proton 6 và § trên phổ HMBC nên sẽ

là mũi của C-7 và C-10, C-7 gắn với Oxi nên sẽ là mũi ở 165,0ppm vậy C-10 ở 105,1 ppm Đồng thời C-7 còn có crosspeak với 1 mối đơn metyl ở 3,86ppm nên nhóm thế ở C-7 là OMe Từ đó thấy được nhóm thế ở C-5 và C-4' là OH Hai

mili carbon còn lại của vòng A ở 165,2 và 160,9ppm sẽ là của C-5 và C-9, Mũi ở 160,9ppm có crosspeak với H-6 ở 6,35ppm nên là mũi C-5, mỗi ở 156,2ppm có

'crosspeak với H-§ ở 6,71ppm nên là mũi của C-9 Tương tự, có thể có thể xác định các mỗi carbon trên vòng B và vòng C dựa vào phổ HMBC và HMQC Mũi

của C-2' và C-6' cùng ở 130,1ppm; mũi có C-3' và C-%” cùng ở 115,6ppm, mũi ở

120,4ppm có crosspeak với H-3' và H-5° nên là mũi của C-1'°, mỗi ở 160,2ppm

là của C-4', mũi ở 178,0ppm là mũi C-4, mỗi ở 137,7ppm là mũi của C-4

Ngoài ra, phổ ROESY còn cho biết 1 nhóm -OMe ở trên vòng À và nhóm OMe con laid trên vòng C

Vậy hợp chất H; là 5,4`-dihydroxy-3,7-dimetoxyflavon, còn có tên là

Luận ân Thạc đỉ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

Bảng 8 So sánh phổ 'H-NMR của H; và kumatakenin

Proton Hợp chất H; (DMSO-d,) Kumatakenin (DMSO-d,)

Bảng 9 So sánh phổ '?C-NMR của H¡ với keaempferol và 5,7-dihydroxy-

3-metoxy-4 (3-metoxy-but-2-enyloxy) flavon

Trang 29

Luận án Thạc đi Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

Dung môi khai triển là etyl acetat -metanol 9:1, thuốc thử hiện vết là

dụng dịch acid phosphomolibdic 10% Bản mỏng cho Í vệt tròn mầu xanh duy

uudu a LAC OL ANCA NEC Moa Hoc Nghiên Cứu Và Kết Quả

Luạn an Lhạc đỉ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

72,6; 70,7; 37,7; 48,2;

52,6; 18,4; 36,4; 18,6; C nhất cấp và tam cấp

34,1; 22,1; 22,2; 9,8; 19,8

Biện luận kết quả :

Phổ IR của hợp chất H; cho thấy có sự hiện diện của nhóm hydroxyl

(3460 cm! ), nhóm cyclopropyl (2925 cmÌ ), nhóm carbonyl (1964 cmỢ ), nhóm

metylen cuối dây ( 881 cmỖ )

Phé 'H-NMR cho thay mii d6i 6 8 (ppm) =0,54 va 0,84 (J = 3,84 ) 1A cha

2 proton nhém cyclopropyl metylen (dac trưng cho các cycloartan ) Mũi đôi tại

5 (ppm) = 4,58 (J=7,2) là của proton metylen cuối dây Mũi tại ỗ (ppm) = 3,90 và

5,51 có thể là của proton nhóm >CH - O ~

Phổ !'C - NMR và phổ DEPT cho thấy hợp chất Hạ có 31 carbon gồm 6

nhóm CHƯ, 11 nhóm CH;, 7 nhóm CH và 7 carbon tứ cấp Phổ 'ồC - NMR cho thấy Hạ có một nối đôi đầu dây ở ngoài vòng với ồ (ppm) = 156,7 và 106,7

Ngoài ra còn có mũi của nhóm carbonyl, ồ (ppm) =180,0 có thể là nhóm COOH hoặc ester, tuy nhiên không thấy có mũi của bất kỳ nhóm alkoxy nào trên phổ proton và carbon nên chỉ có thể là nhóm COOH

Các số liệu phổ của hợp chất H; trùng hợp với các số liệu phổ của acid deoxojessic !3 nên chúng tôi dùng số liệu của hợp chất deoxojessic làm chuẩn để

Luạn an Thạc đỉ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

Bảng 13 So sánh kết quả phổ hồng ngoại của acid 23-deoxojessic và Hạ

Luận an Thac &7 Khoa Hoc Héa Hoc Nghiên Cứu Và Kết Quả

30 1,02 Mũi đơn (s) 1,0 Mai don (s}

Luéa én Thac & Khoa Hoc Hoa Hoc Nghiên Cứu Và Kết Quả

Luận án Thạc đỉ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

Dung môi khai triển là etyl acetat -metanol 19:1, thuốc thử hiện vết là

dung dich acid phosphomolibdic 10%

Luận ân Thạc đĩ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

Bảng 18 Kết quả phổ '“C-NMR và phổ DEPT của sản phẩm H;

30,3; 28,6; 26,5: 24,6; 23,5 141; 37,0; 42,6 C tứ cấp

Biện luận kết quả

Phổ IR của sản phẩm H; cho thấy sự hiện diện của nhóm hydroxyl ( 348cm, nhóm carbonyl (1706 cm’), nhém cyclopropyl (2945 cm" )

Phổ proton của sản phẩm H; cho thấy tín hiệu của 2 proton metylen của

vòng cyclopropyl là 6 (ppm) = 0,72; J = 4,4 va 8 (ppm) = 0,44; J = 4,2 Các mũi cộng hưởng có 8 (ppm) = 1,03; 1,10; 1,85 là mũi cộng hưởng của CH: Các mũi cộng hưởng có 8 (ppm) = 3,77 va 5,31 có thể là mũi cộng hưởng các proton của

nhóm >CH-O-

Phé °C - NMR và phổ DEPT cho thấy hợp chất H; có 31 carbon, gồm 5

nhóm CH;, 11 nhóm CH¿ạ, 9 nhóm CH và 6 carbon tứ cấp Phổ 'C ~ NMR cho

thấy Hạ có nhóm =CH;, ö (ppm) = 109,9

Khi so sánh các số liệu phổ của hợp chất Hạ với các số liệu phổ của hợp

chất metylquadrangularat O thấy có sự trùng hợp, nên chúng tôi dùng số liệu của metylquadrangularat O làm chuẩn để so sánh