M ở đầ u
Khả năng tồn tại và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào các chất dinh dưỡng và yếu tố sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy Trong phòng thí nghiệm, các nhà khoa học sử dụng nhiều loại môi trường dinh dưỡng khác nhau để nuôi cấy và nghiên cứu vi sinh vật Bài thí nghiệm này giúp sinh viên được giới thiệu và thực hành các kỹ năng quan trọng trong lĩnh vực này.
- Chu ẩ n b ị các lo ại môi trườ ng và kh ử trùng môi trường để gieo c ấ y vi sinh v ậ t
Làm quen với các kỹ thuật thường quy trong phòng thí nghiệm vi sinh vật là rất quan trọng, bao gồm việc chuẩn bị môi trường và các phương pháp gieo cấy vi sinh vật từ nhiều loại canh trường khác nhau Điều này cũng bao gồm việc cấy chuyển vi sinh vật từ canh trường vi khuẩn và nấm men sang môi trường mới để đảm bảo sự phát triển và nghiên cứu hiệu quả.
V ậ t li ệu và phương pháp
V ậ t li ệ u
- Canh trườ ng ch ứ a vi sinh v ậ t
- Hoá ch ất pha môi trườ ng Czapek (xem ph ụ l ụ c thành ph ần môi trườ ng)
Phương pháp tiế n hành
Hình 1.1 Sơ đồ thí nghi ệ m a Pha chế môi trường dinh dưỡng
- Cân đong chính xác theo đơn ( tính thành ph ần cho 300 ml môi trườ ng Czapek)
- Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước các chất có khối lượng nhỏ hơn các chất có khối lượng lớn, hoà tan
Kiểm tra và điều chỉnh pH môi trường khi cần thiết là rất quan trọng Sử dụng lượng nước còn lại để rửa cỗ bình, phễu, và các dụng cụ khác Lưu ý rằng thể tích môi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể tích bình để đảm bảo độ chính xác trong quá trình kiểm tra.
Cân thành ph ầ n môi trường Hoà tan trong nước
Bổ sung chất đông tụ
Phân phối vào d ụ ng c ụ đự ng
Lọc, điều chỉnh pH n ế u c ầ n thi ế t Môi trườ ng l ỏ ng Môi trường đặ c Đun nóng làm tan chấ t đông tụ
Phân ph ố i vào d ụ ng c ụ đựng
Thanh trùng Để ngu ộ i Để nghiêng Đổ h ộ p petri
Môi trường lỏng Môi trường thạch đứng Môi trường thạch nghiêng
- M ộ t s ố thành ph ần môi trườ ng có thành ph ầ n nh ỏ nên pha t ạ o dung d ị ch có n ồ ng l ớn sau đó tính lượng thể tích cần sử dụng trong môi trường
Một số thành phần như vitamin và kháng sinh dễ bị phân huỷ bởi nhiệt, do đó không nên bổ sung trước quá trình thanh trùng Các thành phần này cần được pha thành dịch, lọc vô trùng và phối trộn vào môi trường sau khi đã hoàn tất quá trình thanh trùng.
- L ọ c b ằ ng lòng tr ắ ng tr ứ ng
- Dùng ph ễ u l ọ c nóng c B ổ sung ch ất đông dính
- Bổ sung chất đông dính 2% khối lượng theo thể tích môi trường
- Gia nhiệt cho tan chất đông dính, chú ý tránh để trào môi trường d Phân phối môi trường
- Môi trườ ng th ạ ch nghiêng: th ể tích ~ 1/4 th ể tích ố ng nghi ệ m (~ 5 -6 ml)
- Môi trườ ng th ạch đứ ng 1/3 th ể tích ố ng nghi ệ m (~ 10 ml)
- Môi trườ ng l ỏ ng: th ể tích ~ 1/4 th ể tích ố ng nghi ệ m
- Chú ý: Môi trường trong hộp petri được phân phối sau khi đã thanh trùng môi trường, thể tích d ị ch t ừ 15 -20 ml)
Hình 1.2 Phân ph ối môi trườ ng vào d ụ ng c ụ đự ng d Kh ử trùng môi trườ ng b ằng hơi nướ c bão hòa áp su ấ t
- Xem ph ần hướ ng d ẫ n s ử d ụ ng n ồ i thanh trùng e B ả o qu ả n và ki ểm tra môi trườ ng
- B ả o qu ản môi trườ ng: Gi ữ môi trườ ng ở nhi ệt độ th ấ p 0-5 o C tránh quá khô, nóng, nhi ề u ánh sáng
Để kiểm tra môi trường nuôi cấy vi sinh vật, hãy đặt nó vào tủ ấm với nhiệt độ 30-32 độ C trong vài ngày Nếu phát hiện môi trường bị vẩn đục hoặc có sự phát triển của khuẩn lạc, cần phải loại bỏ ngay lập tức.
- Khi gieo c ấ y c ần đả m b ả o vô trùng tuy ệt đố i b ằ ng cách thao tác xung quanh ng ọ n l ửa đèn cồ n hoặc trong các tủ cấy vô trùng
Ng ọ n l ửa đèn cồ n t ạo dòng không khí nóng vô trùng đối lưu trong phạ m vi kho ả ng 20 cm quanh ng ọ n l ửa đèn cồn như trong hình sau:
Hình 1.3 Ph ạ m vi làm vi ệ c bên ng ọ n l ửa đèn cồ n
V ậ t li ệ u : canh trườ ng ch ứ a vi sinh v ật, môi trường dinh dưỡ ng vô trùng
D ụ ng c ụ : Que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang
Khi gieo cấy vi sinh vật từ môi trường giống sang môi trường dinh dưỡng vô trùng, quy trình thực hiện sẽ khác nhau tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, loại môi trường giống (lỏng hoặc đặc), và loại dụng cụ chứa môi trường dinh dưỡng (như thạch đứng, thạch nghiêng, môi trường trong hộp Petri, môi trường lỏng trong ống nghiệm, hoặc môi trường lỏng trong bình tam giác) Các bước thực hiện quy trình này cần được tuân thủ nghiêm ngặt để đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của thí nghiệm.
+ V ệ sinh khu v ự c c ấ y, b ậ t ng ọ n l ửa đèn cồ n (ho ặc đèn khí nế u thao tác trong t ủ c ấ y)
+ Kh ử trùng que c ấ y b ằ ng cách đốt nóng đỏ đầ u que c ấy, lướ t nh ẹ ph ầ n thân que c ấ y qua ng ọ n l ử a đèn cồ n
Chờ que cấy nguội và đưa que cấy đã được vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống Chạm nhẹ đầu que cấy vào phần không chứa canh trường của ống giống để làm nguội que cấy Sau đó, lấy canh trường từ ống giống và chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng, thực hiện thao tác cấy như mô tả chi tiết ở phần dưới.
+ L ấ y que c ấ y ra, kh ử trùng que c ấ y trên ng ọ n l ửa đèn cồn và đặ t t ấ t c ả lên giá
Chú ý : sau khi mở ống nghiệm và trước khi đóng lại, hơ miệng ống trên ngọn lửa đèn cồn
Gieo c ấy vào môi trườ ng l ỏ ng :
Từ môi trường đặc, sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng để lấy một lượng nhỏ mẫu môi trường, sau đó chuyển sang môi trường dinh dưỡng lỏng Tiếp theo, lắc que cấy hoặc cọ vào thành ống nghiệm hoặc bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng lỏng để sinh khối từ que cấy đi vào môi trường.
- Từ canh trường l ỏ ng, sử dụng pipette (với đầu tip vô trùng) hút một lượng canh trường lỏng rồi bơm vào môi trườ ng l ỏ ng vô trùng
Gieo c ấ y trên m ặ t th ạ ch nghiêng :
Thạch nghiêng là phương pháp hiệu quả để bảo quản vi sinh vật lâu dài nhờ vào lớp thạch dày và bề mặt bay hơi thấp, giúp giảm thiểu sự thất thoát hơi nước trong quá trình bảo quản so với môi trường trong hộp Petri.
Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, có thể sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng để đưa sinh khối vi sinh vật từ canh trường giống xuống đáy thạch Que cấy cần được di chuyển dần trên mặt thạch đến khi cách phần thạch ở gần miệng ống nghiệm khoảng 0.5 – 1 cm Trong quá trình cấy, nên thực hiện theo đường zigzag dày để phủ kín mặt thạch, hoặc có thể cấy theo đường thẳng hoặc những đường song song Phương pháp này được gọi là cấy theo vết cấy cạn dày.
Dùng que c ấy đâm sâu vào thạch đứ ng :
Thạch đứng là môi trường lý tưởng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí tùy tiện và vi sinh vật hiếu khí Đối với vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, cần sử dụng các dụng cụ và kỹ thuật nuôi cấy đặc biệt Vi sinh vật kỵ khí thường phát triển ở đáy sâu của lớp thạch, trong khi vi sinh vật hiếu khí phát triển trên bề mặt thạch, nơi có nồng độ oxy cao hơn.
- Th ạch đứng cũng đượ c s ử d ụng để xác đị nh kh ả năng di chuyể n c ủ a vi sinh v ậ t c ầ n nghiên c ứ u
Vi sinh vật không di động thường phát triển theo hướng thẳng đứng, trong khi vi sinh vật có khả năng di chuyển nhờ tiên mao có xu hướng phát triển từ đường cấy thẳng đứng ra phía thành ống nghiêng.
Hình 1.4: C ấy đâm sâu vào môi trườ ng th ạch đứng theo dõi đặ c tính di chuy ể n c ủ a vi sinh v ậ t
Sử dụng que cấy thẳng, lấy mẫu môi trường và đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch đứng vô trùng, tại vị trí trung tâm của mặt thạch Sau đó, đâm sâu que cấy xuống đáy ống nghiệm bằng động tác dứt khoát và rút nhanh que cấy ra khỏi ống nghiệm.
Hộp Petri chứa một lớp mỏng môi trường dinh dưỡng (3 – 5 mm) và nhờ bề mặt nuôi cấy lớn, nó được sử dụng để phân lập vi sinh vật, một kỹ thuật tách biệt các vi sinh vật và phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt Tuy nhiên, do lớp môi trường mỏng và bề mặt bay hơi lớn, hộp Petri không thích hợp để bảo quản vi sinh vật trong thời gian dài như các canh trường trong thạch nghiêng.
Khi gieo c ấ y vi sinh v ậ t lên h ộ p Petri, có th ể s ử d ụ ng các cách sau :
Sử dụng que cấy vòng (không dùng que cấy thẳng vì có thể làm xước mặt thạch), cấy theo bốn đường zigzag ở bốn góc hộp hoặc theo các đường song song, nhằm giảm dần mật độ tế bào vi sinh vật từ góc cấy đầu tiên đến góc cấy cuối cùng Nếu cần thiết, có thể đốt nóng que cấy để diệt bớt vi sinh vật sau mỗi góc cấy, sau đó vô trùng que cấy trước khi kéo vi sinh vật từ góc cấy trước sang góc cấy tiếp theo theo phương pháp Streak.
Hình 1.5: Cách c ấ y trên h ộ p petri b ằng phương pháp vế t c ấ y c ạ n d ầ n
M ộ t s ố cách c ấy khác trên môi trườ ng h ộp petri như (các cách này sẽ đượ c th ự c hành ở các bài sau)
+ C ấ y ch ẩm điể m : s ử d ụ ng que c ấ y móc, l ấy canh trườ ng gi ố ng r ồ i c ấ y ch ấm điể m lên 3, 4 ho ặ c
5 điểm trên môi trườ ng trong h ộ p Petri thành 3 c ạ nh c ủa tam giác đều, 4 đỉ nh c ủ a hình vuông, ho ặ c
4 đỉ nh c ủ a hình vuông và m ột điể m tâm hình vuông
Khi chuyển mẫu từ môi trường lỏng sang môi trường thạch trong hộp Petri, hãy sử dụng pipette để hút một lượng môi trường (50 – 100 µl) và nhỏ lên mặt thạch Sau đó, dựng que trang vuông góc và dàn đều cho đến khi mặt thạch se lại.
Canh trường mới cần được cắt cẩn thận và nuôi trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ, độ ẩm và nồng độ oxy để vi sinh vật phát triển Trước khi cắt bảo quản ở nhiệt độ thấp từ 4-10 độ C, cần kiểm tra canh trường để đảm bảo chất lượng.
Báo cáo thí nghi ệ m
1 Mục đích của bài thí nghiệm:
2 Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu a D ụ ng c ụ thí nghi ệ m b Phương pháp nghiên cứ u
Quan sát các khuẩn lạc từ nhiều góc độ, bao gồm từ trên xuống và từ bên cạnh, để ghi nhận các đặc điểm quan trọng như kích thước, hình dạng, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, sự hiện diện của núm, độ trong suốt, và màu sắc Cần lưu ý xem khuẩn lạc có khuếch tán ra môi trường hay không.
Hình 1.6: Nh ận xét đặc điể m hình thái khu ẩ n l ạ c
PHÂN L Ậ P VI SINH V Ậ T- Phân l ậ p vi sinh v ậ t hi ế u khí có kh ả năng sinh tổ ng h ợ p amylase 12 1 M ở đầ u
Phương pháp
- Chu ẩ n b ị d ụ ng c ụ và môi trườ ng
+ 02 Bình tam giác ch ứa 99 mL nướ c mu ố i sinh lý
+ 01 Ống falcon 50 mL chứa 40 mL nước muối sinh lý
+ 120 mL Môi trường Czapek đặc thay đường saccharose bằng tinh bột tan
+ T ấ t c ả bình tam giác, ống falcon, môi trườ ng, h ộp đầ u côn, ố ng effendorf, que trang c ầ n thanh trùng t ạ i 110 o C, 30 phút
+ Sau thanh trùng, sinh viên chu ẩ n b ị 06 h ộ p petri ch ứa môi trườ ng Czapek-tinh b ộ t
+ Đố i v ớ i m ẫ u bánh men c ầ n nghi ề n nh ỏ trướ c khi th ự c hi ệ n
+ L ấy 1 lượ ng bánh men ho ặc tương bần cho vào bình tam giác đã chứ a s ẵn 99 mL nướ c đã vô trùng, lắc đề u
+ Pha loãng trong ống effendorf (nồng độ pha loãng thảo luận trên lớp) Pha loãng theo hệ số 10
+ S ử d ụ ng pipette hút 100 L ra h ộ p petri ch ứa môi trườ ng Czapek-tinh b ộ t, s ử d ụ ng que trang trang đề u
+ Nuôi c ấ y trên trong t ủ nuôi tĩnh tạ i 30 o C, 2 ngày, quan sát khu ẩ n l ạ c, nh ậ n xét
Hình 2.1 : Sơ đồ phân l ậ p vi sinh v ậ t hi ế u khí
Sau khi thực hiện các thao tác phân lập, sẽ thu được môi trường tập trung chứa các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột Để đạt được môi trường thuần khiết, cần tiến hành thêm bước cấy tách riêng từng khuẩn lạc vi sinh vật quan tâm trên môi trường riêng và kiểm tra độ thuần khiết của chúng.
Trong quá trình phân lập vi sinh vật, việc bổ sung kháng sinh là cần thiết để ức chế các loài không mong muốn Cụ thể, cycloheximide được sử dụng để ức chế nấm, trong khi tetracycline giúp ức chế vi khuẩn.
1 Mục đích của bài thí nghiệm
2 Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
- V ẽ hình/ch ụ p ảnh đĩa petri có chứ a các khu ẩ n l ạ c
Tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ nhiều góc độ, bao gồm từ trên xuống và từ bên cạnh, cần chú ý đến kích thước, hình dạng, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, sự hiện diện của núm, độ trong, màu sắc (trên và dưới) cũng như khả năng khuếch tán ra môi trường.
- K ế t lu ậ n rút ra t ừ bài thí nghi ệ m
PHÂN L Ậ P VI SINH V Ậ T- Phân l ậ p vi sinh v ậ t y ế m khí
- M ộ t trong nh ữ ng y ế u t ố quan tr ọ ng mà vi khu ẩ n và nhi ề u lo ạ i vi sinh v ậ t khá nh ạ y c ảm đó là sự có m ặ t c ủ a oxy
+ Những vi sinh vật chỉ phát triển khi có O 2 được gọi là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc
+ Vi sinh v ậ t k ỵ khí tu ỳ ti ệ n s ẽ phát tri ể n ngay c ả khi có O 2 nhưng chúng thườ ng phát tri ể n t ốt hơn khi không có khí này
+ Vi sinh vật kỵ khí nghiêm ngặt sẽ chỉ phát triển khí không có O 2
- Trong bài thí nghiệm này, sinh viên sẽ làm quen với việc phân lập vi sinh vật yếm khí tuỳ tiện; s ử d ụng phương pháp đổ th ạ ch hai l ớ p.
V ậ t li ệ u và phương pháp
Phương pháp thự c hi ệ n
Chu ẩ n b ị d ụ ng c ụ và môi trườ ng nuôi c ấ y
- Chu ẩ n b ị m ôi trườ ng MRS cho 6 h ộ p Petri (~120 ml), thanh trùng
- Môi trườ ng th ạ ch Agar 1.5% (~ 60 mL), sau thanh trùng và gi ữ ấ m t ạ i 45-50 0 C trong b ể ổ n nhi ệ t
- D ụ ng c ụ bao g ồm effendorf, đầ u côn, que trang, nước được thanh trùng trướ c khi ti ế n hành thí nghi ệ m
- 40 ml nướ c mu ố i sinh lý trong ố ng falcon 50 ml, thanh trùng
- Hút vào các ố ng effendorf, m ỗ i ống 0,9 mL nướ c mu ối sinh lý đã vô trùng
- Hút 0,1 mL s ữ a chua vào ống effendorf đã chứ a 0,9 mL nướ c mu ố i sinh lý vô trùng; ti ế n hành pha loãng t ớ i n ồng độ 10 -1 , 10 -2 ,10 -3
Hình 3.1 : Sơ đồ phân l ậ p vi sinh y ế m khí
- Sử dụng pipette để cấy 100 l dịch đã pha loãng lên bề mặt hộp petri, sử dụng que trang trang đều
- Đổ lên trên lớp thạch dinh dưỡng thứ nhất, lớp thứ hai thach agar, đợi thạch đông
- Nuôi cấy 37 o C trong vòng 2-4 ngày
1 Mục đích của bài thí nghiệm
2 Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
- V ẽ hình/ch ụ p ảnh đĩa petri có chứ a các khu ẩ n l ạ c
Tiến hành quan sát các khuẩn lạc từ nhiều góc độ khác nhau, bao gồm từ trên xuống và từ bên cạnh Cần chú ý đến các yếu tố như kích thước, hình dạng, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, sự hiện diện của núm, độ trong suốt, và màu sắc cả trên và dưới Ngoài ra, cần kiểm tra xem khuẩn lạc có khuếch tán ra môi trường xung quanh hay không.
- K ế t lu ậ n rút ra t ừ bài thí nghi ệ m
ĐỊNH LƯỢ NG VI SINH V ẬT: PHƯƠNG PHÁP CẤ Y TR ẢI TRÊN ĐĨA THẠ CH (SPREAD PLATE TECHNIQUE)
TRÊN ĐĨA THẠCH (SPREAD PLATE TECHNIQUE)
Phương pháp cấy trải trên đĩa thạch là kỹ thuật định lượng gián tiếp vi sinh vật thông qua sự phát triển của các khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng rắn Kỹ thuật này có hai hình thức: trải mẫu lên bề mặt môi trường (cấy trải) và trộn mẫu với môi trường dinh dưỡng lỏng trước khi đổ vào dụng cụ nuôi cấy (cấy đổ) Tuy nhiên, phương pháp này chỉ cho phép xác định mật độ vi sinh vật sống trong mẫu.
- Đơn vị của phép định lượng là số khuẩn lạc (CFU colony forming unit) /ml môi trường lỏng hoặc g môi trường rắn
Khi số lượng tế bào vi sinh vật trong mẫu phẩm đạt từ 10^5 đến 10^12 tế bào/ml, cần pha loãng mẫu trước khi tiến hành trải đĩa hoặc đổ đĩa Mục tiêu là điều chỉnh số khuẩn lạc trong khoảng từ 30 đến 300 trên mỗi đĩa petri có đường kính 90 mm.
Để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu không khí, phương pháp đơn giản dựa trên nguyên tắc ước tính của Omelianxki được sử dụng Cụ thể, khi mở một diện tích 100 cm² trong 5 phút, lượng vi sinh vật rơi xuống tương đương với mật độ vi sinh vật có trong 10 lít không khí.
V ậ t li ệu và phương pháp
Phương pháp
a Chu ẩ n b ị môi trường dinh dưỡ ng, vô trùng môi trườ ng và d ụ ng c ụ c ầ n thi ế t:
- Pha môi trường TSA và nước muối sinh lý để pha loãng như đã làm trong bài 2
- Các dụng cụ bao gồm ống Eppendorf, đầu tip, que trang đã được vô trùng trong nồi hấp áp lực và sấy khô
19 b Định lượ ng vi sinh v ậ t trong m ẫ u v ậ t r ắ n và l ỏ ng
Hút 900 uL nước muối sinh lý đã vô trùng vào mỗi ống Eppendorf 1.5 mL Số lượng ống Eppendorf cần chuẩn bị sẽ phụ thuộc vào sơ đồ pha loãng đã được thảo luận trong lớp học.
Cân 1 gram mẫu rắn hoặc hút 1 mL mẫu lỏng vào bình tam giác chứa 99 mL nước muối sinh lý vô trùng để pha loãng mẫu với tỷ lệ 1:100 Sau đó, lắc đều để trộn mẫu Đối với mẫu sinh vật kỵ khí, cần thực hiện bước pha loãng đầu tiên trong ống Eppendorf nhằm hạn chế vi sinh vật kỵ khí tiếp xúc với oxy Cuối cùng, lắc đều mẫu trong bình tam giác để đảm bảo vi sinh vật phân bố đồng đều trong dịch pha loãng.
Pha loãng mẫu theo hệ số 10 bằng cách hút 100 uL dịch pha loãng vào ống Eppendorf chứa nước muối sinh lý Sau đó, trộn đều mẫu ngay lập tức trên máy vortex để đảm bảo sự đồng nhất.
Hình 4.1 Sơ đồ pha loãng và c ấ y m ẫ u ph ẩ m r ắ n M ức độ pha loãng tùy thu ộ c vào m ẫ u c ụ th ể đượ c s ử d ụ ng trong bu ổ i thí nghi ệ m
- Kí hiệu tên mẫu, độ pha loãng, tên nhóm thí nghiệm, ngày cấy mẫu vào đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng
- Hút 100 uL mẫu pha loãng vào trung tâm của đĩa Petri
- Sử dụng que trang vô trùng trải đều mẫu lên toàn bộ bề mặt môi trường dinh dưỡng đến khi mặt thạch se lại
- Lật ngược đĩa Petri sao cho đáy hộp Petri hướng lên phía trên, đưa vào tủ ấm để nuôi trong 24 –48h để khuẩn lạc hình thành
Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên đĩa thạch là một bước quan trọng trong nghiên cứu vi sinh Cần lựa chọn những đĩa có số lượng khuẩn lạc từ 30 đến 300 để đảm bảo việc đếm chính xác Sau khi đếm, ghi lại số lượng khuẩn lạc tương ứng với độ pha loãng vào sổ thí nghiệm và sử dụng các giá trị này để tiến hành tính toán.
Để tính toán mật độ vi sinh vật trong mẫu ban đầu, cần dựa vào số lượng khuẩn lạc và sơ đồ pha loãng Đối với mẫu không khí, phương pháp lắng của Omelianxki được áp dụng để xác định sự hiện diện của vi sinh vật.
- Kí hiệu tên mẫu, tên nhóm, ngày thí nghiệm vào phần đáy của đĩa Petri chứa môi trường dinh dưỡng vô trùng
- Đặt hộp Petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗkhông khí định nghiên cứu Chú ý lựa chọn những khu vực có không khí tĩnh, không có gió.
- Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút)
- Đậy nắp hộp, nuôi trong tủ ấm trong khoảng thời gian 24 – 48 giờ
- Đếm số khuẩn lạc có được trên mỗi đĩa thạch
- Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (πD 2 /4) rồi suy ra lượng vi sinh vật trong 1 lít hay 1 m 3 không khí theo ước tính của Omelianxki
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
2 Vật liệu và phương pháp
3 Kết quả và thảo luận: Sinh viên nhận xét chung về các khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch, báo cáo số lượng khuẩn lạc thu được trên mỗi đĩa, tính toán mật độ vi sinh vật trong mỗi mẫu
ĐỊNH LƯỢ NG VI SINH V Ậ T – PHƯƠNG PHÁP MPN
(SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) (MPN – MOST PROBABLE NUMBER) Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên
Phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN) là một kỹ thuật định lượng vi sinh vật phổ biến trong lĩnh vực thực phẩm và phân tích chất lượng môi trường MPN xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu bằng cách nuôi cấy chúng trong môi trường lỏng qua các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau, thường là 3-5 ống với độ pha loãng cách nhau 10 lần Kết quả từ các ống dương tính giúp tính toán mật độ vi sinh vật trong mẫu Bài viết này trình bày cách sinh viên kiểm tra ô nhiễm phân trong nước tự nhiên bằng phương pháp MPN.
Nước tự nhiên như sông, hồ là nơi sinh sống của nhiều loại vi sinh vật, bao gồm tảo và vi khuẩn Tuy nhiên, nước này có thể bị ô nhiễm phân, đặc biệt khi tiếp nhận nước thải sinh hoạt chưa qua xử lý, gây nguy hiểm cho sức khỏe khi sử dụng cho sinh hoạt hoặc thể thao Để đánh giá ô nhiễm phân, việc xác định vi sinh vật chỉ thị là cần thiết, trong đó coliform được coi là chỉ thị chính Coliform thường không có mặt trong nước tự nhiên, sống trong đường ruột động vật máu nóng, có khả năng tồn tại lâu trong môi trường nước và hầu hết không gây bệnh Việc phát hiện coliform dễ dàng thông qua kỹ thuật nuôi cấy, với đặc điểm là vi khuẩn hiếu khí, Gram âm, hình que, không sinh bào tử và có khả năng lên men lactose.
Để xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước, cần thực hiện ba bước xét nghiệm: (1) thí nghiệm giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hoàn thành.
Thí nghiệm giả định (presumed test) là phương pháp cấy mẫu nước vào môi trường lactose nhằm xác định sự hiện diện của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose, sinh acid và khí sau 48±2 giờ ở nhiệt độ 35°C.
Thí nghiệm xác nhận (confirmed test) là quá trình chuyển mẫu từ môi trường trong ống dương tính sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm, chẳng hạn như môi trường thạch Eosin Methylene Blue (EMB), nhằm xác định chính xác khả năng lên men sinh khí không phải do vi khuẩn Gram dương, những loài cũng có khả năng lên men sinh khí.
Trong thí nghiệm hoàn thành, các khuẩn lạc phát triển trên môi trường sẽ được kiểm tra kỹ lưỡng về đặc tính hình thái Mục tiêu là xác định xem chúng có phải là vi khuẩn Gram âm, hình que và không sinh bào tử, đặc trưng cho vi khuẩn coliform hay không.
Trong bài thí nghiệm này, chúng tôi thực hiện một thí nghiệm giả định nhằm định lượng vi khuẩn lên men lactose sinh khí bằng phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN - Most Probable Number) Phương pháp này cho phép xác định số lượng vi khuẩn có khả năng sinh khí trong mẫu một cách chính xác và hiệu quả.
Phương pháp MPN (Most Probable Number) xác định sự hiện diện của vi khuẩn lên men lactose thông qua việc cấy mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng lactose Số lượng ống cho kết quả dương tính được so sánh với bảng tính thống kê tiêu chuẩn Ngoài ra, MPN còn có thể được áp dụng để định lượng các loại vi sinh vật khác trong các mẫu môi trường khác nhau Phương pháp này có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp hoặc đo quang, vì các thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởng đến kết quả định lượng.
2 Vật liệu và phương pháp
- Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL
- Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL
- Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí sinh ra trong quá trình lên men lactose
Môi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công thức sau
B ả ng 5-1 Thành phần môi trường
Thành phần Nồng độ kép Nồng độđơn
Nước 1000 mL 1000 mL pH được điều chỉnh đến 6.8 ± 0.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp ngược theo hướng dẫn trong bảng sau:
B ả ng 5-2 Phân phối môi trường vào các ống nghiệm
Tổ hợp ống Môi trường Thể tích phân phối Sốlượng ống
Các ống chứa môi trường được đóng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 115°C trong 40 phút
Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN được thu thập theo tiêu chuẩn của Việt Nam hoặc WHO Nước được chứa trong các bình đã được khử trùng và có nắp kín, sau đó được vận chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ lạnh cho đến khi phân tích Tùy thuộc vào loại nước và mức độ ô nhiễm dự đoán, các mẫu nước sẽ được pha loãng khác nhau trước khi cấy vào môi trường nuôi cấy.
Trước khi cấy vào môi trường vô trùng, bình chứa mẫu nước được lắc đều đểđảm bảo vi sinh vật phân bố đồng đều
Dùng pipette 10 mL cấy 10 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F1
Dùng micropipette cấy 1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F2
Dùng micropipette cấy 0.1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp 3 ống F3
Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35 o C
Hình 5.1 Sơ đồ pha loãng và c ấ y m ẫu nướ c vào các t ổ h ợ p ố ng ch ứa môi trườ ng lactose
Ki ể m tra k ế t qu ả và xác đị nh m ật độ vi khu ẩ n coliform trong m ẫu nướ c:
Sau 48 ± 2 giờ, kiểm tra số lượng ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống, với tiêu chí là ít nhất 3 mm khí quan sát được trong ống Durham Ghi lại số lượng ống dương tính, ta sẽ có bộ ba số đại diện cho các tổ hợp, ví dụ: 3-2-2 cho các tổ hợp F1, F2 và F3 Bộ số này sẽ được đối chiếu với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn để xác định giá trị MPN trên 100 mL nước Nếu mẫu nước được pha loãng trước khi cấy, giá trị MPN sẽ được tính toán dựa trên hệ số pha loãng ban đầu.
B ả ng 5-3 Giá tr ị MPN trên 100 mL nướ c và gi ớ i h ạn độ tin c ậ y 95% khi b ộ ba ống đượ c c ấ y v ớ i 10 mL, 1 mL, và 0.1 mL m ẫu nướ c
Sốlượng ống cho kết quảdương tính
Giới hạn MPN ởđộ tin cậy 95%
Báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
2 Vật liệu và phương pháp
Trong phần kết quả và thảo luận, sinh viên đã báo cáo số ống dương tính cho từng tổ hợp, từ đó suy ra giá trị MPN của nhóm vi khuẩn có khả năng lên men lactose sinh khí trong mẫu nước Đồng thời, sinh viên cũng đã nhận xét về mật độ của nhóm vi khuẩn này trong mẫu nước.
World Health Organization (1997) Annex 6: Multiple-tube method for thermotolerant (faecal) coliforms, In Guidelines for drinking-water quality, 2 nd Edition
Madigan MT, Martinko JM, Stahl DA & Clark DP (eds) (2011) Brock Biology of Microorganisms, 12 th edition Benjamin Cummings
Benson, T (2001) Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology 8th Edition, The McGraw-Hill, New York
ĐỊNH LƯỢ NG TR Ự C TI Ế P VI SINH V Ậ T - PHƯƠNG PHÁP BUỒNG ĐẾ M H Ồ NG C Ầ U
(Xác định chỉ tiêu chất lượng của canh trường nấm nem: mật độ tế bào nấm men)
- Định lượng trực tiếp là phương pháp đếm trực tiếp sốlượng tế bào vi sinh vật có trong tiêu bản chuẩn bị từ vật phẩm nghiên cứu
Phương pháp định lượng trực tiếp mang lại kết quả nhanh chóng, tuy nhiên, nó không thể cung cấp số lượng chính xác các vi sinh vật sống trong mẫu trước khi chuẩn bị tiêu bản.
- Trong bài này, mật độ tế bào nấm men được xác định bằng phương pháp trực tiếp sử dụng buồng đếm hồng cầu
- Buồng đếm hồng cầu là một phiến kính thủy tinh dày có kích thước 30 x 70 mm và dày
Buồng đếm hồng cầu có kích thước 4 mm, được chia thành ba khu vực, với khu vực trung tâm chứa hai lưới đếm (lưới trên và lưới dưới) có độ sâu 0.1 mm Mẫu được đưa vào hai lưới này một cách độc lập Lưới đếm Neubauer, sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh, có kích thước 3 x 3 mm, chia thành 9 hình vuông 1 mm mỗi cạnh Hình vuông trung tâm được chia thành 25 hình vuông 0.2 mm mỗi cạnh, và mỗi hình vuông này lại chia thành 16 hình vuông nhỏ 0.05 mm mỗi cạnh Kích thước lưới đếm được thể hiện trong hình 1b Hai thông số quan trọng của buồng đếm hồng cầu là chiều sâu lưới đếm (0.1 mm) và diện tích ô nhỏ nhất (0.0025 mm²) được thể hiện ở khu vực bên trái của buồng đếm.
Hình 6.1 C ấ u t ạo và kích thướ c c ủ a bu ồng đế m h ồ ng c ầ u Neubauer
Hình 6.2 trình bày vị trí của lưới đế m và hình ảnh của lưới đế m được quan sát từ góc nhìn thông thường cũng như qua các vật kính với độ phóng đại khác nhau (nguồn: insilico.ehu.eus).
- Buồng đếm hồng cầu thường sử dụng để đếm tế bào máu, các vi sinh vật có kích thước tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc
2 Vật liệu và phương pháp
- Dung dịch H2SO4 10% hoặc NaOH 10%
- Buồng đếm hồng cầu, pipette thủy tinh, que cấy vòng, máy đếm cầm tay
Lắc đều canh trường nấm men cho đến khi không còn cặn sinh khối ở đáy ống Có thể sử dụng vortex, nhưng cần chú ý không để canh trường bắn lên nút bông.
- Làm việc trong điều kiện vô trùng, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường với
H2SO4 10% hoặc NaOH 10%, tùy canh trường mà mức độ pha loãng nhiều hay ít
- Vệ sinh buồng đếm hồng cầu và lá kính bằng cồn 70 o , để cồn bay hơi trước khi tiến hành thao tác tiếp theo
Để chuẩn bị buồng đếm, bạn cần sử dụng bông thấm nước đã tẩm nước cất, nhẹ nhàng phết lên hai khoang bên của buồng Sau đó, đặt lá kính lên và ấn nhẹ bằng ngón tay để lá kính dính chặt vào phiến kính Lưu ý, lá kính nên được để cách mép buồng đếm khoảng 1-2 mm để tạo không gian cho việc đưa canh trường vào lưới đếm.
- Đặt buồng đếm trên một mặt phẳng nằm ngang
Sử dụng pipet hoặc que cấy vòng để lấy canh trường đã pha loãng, sau đó chạm vào mép lá kính đã chuẩn bị trước đó, cho canh trường chảy từ từ vào lưới đếm Nếu dùng pipet, nên loại bỏ những canh trường đầu tiên.
Lưu ý rằng lượng canh trường cần được cho vào vừa đủ, tránh tình trạng canh trường tràn ra ngoài và rơi xuống các rãnh, đồng thời hạn chế sự hình thành bọt khí trong lưới đếm.
- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút
- Sử dụng vật kính 10X để tìm khu vực có lưới đếm
- Xoay vật kính 40X vào vị trí sử dụng, chỉnh khay kính sao cho một ô có kích thước 0.2 x 0.2 mm nằm trọn trong kính trường
- Đếm số tế bào trong 5 ô chéo nhau, mỗi ô có kích thước 0.2 x 0.2 mm Hoặc có thể đếm 4 ô ở góc và 1 ô ở trung tâm
Chú ý: Nếu số lượng tế bào nấm men trong mỗi ô có kích thước 0.2 x 0.2 mm nằm ngoài khoảng giá trị 25 – 250 thì cần pha loãng lại canh trường
Với những tế bào nằm trên đường gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong ô đang đếm
- Tính giá trị trung bình và sai số của số lượng tế bào nấm men trong mỗi ô Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô
- Tính mật độ tế bào nấm men trong canh trường theo công thức 𝑎×1000×𝐷𝑓
𝑆×ℎ (tế bào/mL) Trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô
Df là hệ số pha loãng của canh trường h là bề sâu của lưới đếm
S là diện tích của ô tương ứng với số lượng tế bào trung bình đếm được
1000 là hệ số chuyển đổi 1mL = 1000 mm 3
Báo cáo thí nghi ệ m g ồ m các ph ầ n:
2 V ậ t li ệu và phương pháp
Kết quả và thảo luận cho thấy sinh viên cần mô tả tổng quát về tế bào nấm men đã quan sát, ghi lại số lượng tế bào đếm được và tính toán mật độ tế bào trong môi trường, bao gồm cả việc tính toán sai số Qua đó, sinh viên sẽ nhận xét về mật độ tế bào trong môi trường đã nghiên cứu.
M ục đích
Ti ế n hành
a Nuôi canh trường nấm men
Pha chế môi trường Crapek lỏng và phân phối 10 mL vào mỗi ống nghiệm Tiến hành thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 110 độ C trong 30 phút, sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Sử dụng que cấy, cấy nấm men vào trong ống nghiệm, nuôi 24-48 h tại 30 o C, lắc 150 rpm
32 b Tiêu bản giọt ép - đánh giá tỉ lệ tế bào sống chết của canh trường nấm men
Hình 7.1: quá trình làm tiêu b ả n gi ọ t ép
Chuẩn bị phiến kính và lá kính sạch, khô là bước quan trọng Nếu cần thiết, hãy sử dụng bông tẩm cồn để làm sạch chúng trước khi sử dụng.
- Cho vài giọt canh trường nấm men (đã chuẩn bị ở trên) lên trên phiến kính, thêm một giọt thuốc nhuộm lên phiến kính (Hình 7.1 -a)
- Sử dụng que cấy nhẹ nhàng trộn đều canh trường và thuốc nhuộm,
Đặt lá kính lên phiến kính với góc 45 độ và đậy từ từ để tránh tạo bọt khí Để yên trong 2-3 phút trước khi quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 40x.
- Quan sát tế bào nấm men sống và tế bào nấm men chế: tế bào chết bắt màu của thuốc nhuộm còn tế bào sống không màu
- Đếm lượng tế bào nấm men sống và tế bào nấm men chết ở 5 kính trường
+ Tỉ lệ tế bào nấm men chết
+ Tỉ lệ nấm men sống: c Tiêu bản giọt ép - đánh giá tỉ lệ tế bào nấm men nảy chồi
Trước khi sử dụng, hãy chuẩn bị phiến kính và lá kính sạch, khô Nếu cần thiết, có thể sử dụng bông tẩm cồn để làm sạch chúng.
- Cho vài giọt canh trường nấm men lên trên phiến kính và một giọt NaOH 10 % hoặc
- Sử dụng que cấy nhẹ nhàng trộn đều
- Lấy lá kính đặt lên phiến kính một góc 45 o , đậy nhẹ lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40 x
Tế bào nấm men nảy chồi được xác định khi tế bào con có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng một nửa so với tế bào mẹ.
- Đếm lượng tế bào nấm men nảy chồi và tổng số tế bào nấm men ở 5 kính trường
+ Tỉ lệ tế bào nấm men nảy chồi: d Tiêu bản giọt ép - đánh giá khả năng nhiễm tạp của canh trường nấm men
Để chuẩn bị cho việc sử dụng, hãy đảm bảo phiến kính và lá kính được sạch sẽ và khô ráo Nếu cần thiết, bạn có thể sử dụng bông thấm cồn để làm sạch chúng trước khi tiến hành.
- Cho vài giọt canh trường nấm men lên trên phiến kính (a)
- Lấy lá kính đặt lên phiến kính một góc 45o, đậy nhẹ lá kính lại, để yên trong 2 - 3 phút rồi đem quan sát dưới kính hiển vi vật kính 40 x
- Quan sát nếu thấy tất cả các tế bào trong canh trường có cùng đặc tính hình thái thì có thểsơ bộ kết luận độ sạch của canh trường
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần kết quả và thảo luận, sinh viên cần đánh giá khả năng nhiễm tạp của các canh trường nấm men đã sử dụng Họ cần ghi nhận đặc điểm hình thái tế bào nấm men, tính toán tỉ lệ tế bào sống, tỉ lệ tế bào chết và tỉ lệ tế bào nảy chồi của các canh trường này Dữ liệu thu thập cần được xử lý thống kê để đảm bảo độ chính xác Cuối cùng, cần thảo luận về chất lượng của các canh trường nấm men đã quan sát.
M ụ c tiêu
- Thực hành cách thức làm tiêu bản vi sinh vật cốđịnh và nhuộm màu đơn giản tiêu bản vi sinh vật để quan sát đặc điểm hình thái
- Quan sát đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn của một số canh trường
2 Vật liệu và phương pháp
- Vi khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus sp., Lactobacillus sp
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: môi trường TSA
- Thuốc nhuộm: xanh methylen 1% hoặc fusin 1%
- Ống nghiệm, bông, que cấy
- Kính hiển vi vật kính 40x, 100x, dầu soi vật kính, toluen
2.2 Phương pháp tiến hành a Nuôi canh trường vi khuẩn
Pha chế môi trường lỏng và phân phối vào từng ống nghiệm với dung tích 10 mL Tiến hành thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 110 độ C trong 30 phút Sau đó, để nguội môi trường về nhiệt độ phòng.
- Sử dụng que cấy, cấy vi khuẩn vào trong ống nghiệm, nuôi 24-48 h tại 37 o C, lắc 120 rpm
35 b Làm tiêu bảo cố định vi sinh vật
Hình 8.1 Cách th ứ c làm v ế t bôi tiêu b ả n c ố đị nh vi sinh v ậ t
- Chuẩn bị một phiến kính sạch và khô
- Lấy canh trường vi sinh vật: thao tác tương tự như cách lấy giống vi sinh vật (hình 1)
- Nghiêng que cấy 10 - 15 độ, nhẹ nhàng dàn giọt canh trường ra phiến kính; Làm xong, sát trùng que cấy để lên giá
- Lượng vi sinh vật lấy vừa phải
- Vết bôi tròn, gọn và thật mỏng
- Các tế bào vi sinh vật được dàn đều
Bước 2 Làm khô vết bôi
Để vết bôi khô tự nhiên, bạn có thể hơ nhẹ trên phần không khí nóng của đèn cồn để rút ngắn thời gian Tuy nhiên, cần tránh đốt nóng trực tiếp vì điều này có thể làm tế bào mất nước, dẫn đến sự thay đổi cấu trúc của nó Đảm bảo rằng vết bôi hoàn toàn khô trước khi tiếp tục thực hiện các bước tiếp theo.
Bước 3 Cố định vết bôi
M ục đích: Việc cố định vết bôi nhằm các mục đích sau:
- Giết chết vi sinh vật để chúng dễ bắt màu và an toàn khi tiếp xúc (nếu là loại vi sinh vật gây bệnh)
- Gắn chặt vi sinh vật và phiến kính để lúc nhuộm, rửa chúng không bị trôi
+ Phương pháp dùng nhiệt: Là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất
Kẹp phiến kính giữa hai ngón tay các và trỏ, hơ mặt dưới của phiến kính qua lại trên ngọn đèn cồn, tránh không để tiêu bản nóng quá
Hình 8.2: C ố đị nh vi sinh v ậ t s ử d ụ ng ng ọ n l ửa đèn cồ n
Phương pháp sử dụng hóa chất để cố định tế bào là cần thiết, vì việc hơ nóng có thể gây biến dạng và làm đứt các tiên mao Mặc dù phương pháp hóa học phức tạp hơn, nhưng nó đảm bảo giữ nguyên cấu trúc tế bào Các loại hóa chất thường được sử dụng bao gồm rượu và axeton.
Rượu etylic có thể được sử dụng bằng cách nhỏ trực tiếp lên vết bôi hoặc nhúng vết bôi vào rượu Rượu tuyệt đối mang lại hiệu quả tức thì, trong khi rượu 95 độ cần ngâm trong khoảng 5 đến 15 phút, và thời gian ngâm sẽ kéo dài hơn nếu sử dụng rượu loãng.
- Ngâm vết bôi vào dung dịch axeton trong 5 phút
Bước 4: Nhuộm màu đơn giản tiêu bản vi sinh vật cốđịnh
Hình 8.3: Nhu ộ m màu và r ử a màu tiêu b ả n vi sinh v ậ t c ố đị nh
Để nhuộm màu hiệu quả, bạn cần nhỏ thuốc nhuộm đều lên vùng cần bôi, chú ý không để thuốc nhuộm quá nhiều Trong suốt quá trình nhuộm, hãy đảm bảo rằng luôn có một lớp thuốc nhuộm phủ đều trên vết bôi.
Trong điều kiện nhiệt độ phòng, thời gian ngâm tiêu bản với thuốc nhuộm Fuchsin Ziehl là 1-2 phút, trong khi với xanh metylen thì cần 3 phút Việc lựa chọn thuốc nhuộm phù hợp với tính chất của tiêu bản là rất quan trọng.
Sau khi nhuộm, hãy đổ bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm và rửa sạch bằng cách nghiêng phiến kính, cho nước chảy nhẹ qua để cuốn trôi thuốc nhuộm Lưu ý không xối nước trực tiếp lên vết bôi để tránh làm trôi vi sinh vật.
- Vẩy nước, dùng giấy thấm khô hoặc hơ nhẹ trên đèn cồn
- Quan sát tiêu bản ử vật kính (x40) rồi chuyển sang vật kính (x100) soi dầu
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
+ Kết quả - thảo luận: trong phần này sinh viên cần ghi nhận lại đặc điểm hình thái tế bào của vi khuẩn
V ậ t li ệu và phươn g pháp
Phương pháp tiế n hành
a Nuôi canh trường vi khuẩn
- Pha chế môi trường lỏng, phân phối vào ống nghiệm mỗi ống nghiệm chứa 10 mL Thanh trùng môi trường tại 110 o C trong 30 phút Làm nguội môi trường
- Sử dụng que cấy, cấy vi khuẩn vào trong ống nghiệm, nuôi 24 h tại 37 o C, lắc 120 rpm b Làm tiêu bảo cố định vi sinh vật c Nhuộm màu Gram 1
- Nhỏ dung dịch tím tinh thể phủ kín vết bôi đã khô, để trong thời gian 1 phút (Hình 1a)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất (Hình 1b)
1 D ự a theo Gram stain protocols – American society for microbiology
- Nhỏ dung dịch lugol phủ kín vết bôi, để trong thời gian 1 phút (Hình 1c)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất (Hình 1d)
- Ngâm trong dung dịch tẩy màu 15 s, hoặc nhỏ từng giọt dung dịch tẩy màu lên vết bôi đến khi dịch rửa có màu sáng (Hình 1e)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất (Hình 1f)
-Nhỏ dung dịch màu thứ hai (fusin) phủ kín vết bôi, để từ 30-60 s (Hình 1g)
- Rửa nhẹ vết bôi bằng nước cất, sử dụng giấy thấm làm khô vết bôi (Hình 1h)
- Quan sát dưới kinh hiển vi bằng vật kính dầu (90x hoặc 100x) (Hình 1k)
Hình 9.1: Quy trình nhu ộ m Gram
- https://www.youtube.com/watch?v=AZS2wb7pMo4
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần kết quả và thảo luận, sinh viên cần ghi nhận các đặc điểm hình thái của tế bào vi khuẩn, bao gồm màu sắc của tế bào sau khi thực hiện nhuộm Gram Đồng thời, cần đưa ra kết luận về loại Gram của canh trường vi khuẩn.
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG LÊN MEN – PHƯƠNG PHÁP SỬ D Ụ NG Ố NG DUHAM 41 1 M ở đầ u
Quá trình lên men rượu sử dụng nấm men tạo ra hai sản phẩm chính là rượu ethylic và khí CO 2
Để xác định hoạt động lên men của nấm men, nghiên cứu có thể dựa vào khả năng thoát khí CO2 trong quá trình lên men Ống Durham, một dụng cụ thuỷ tinh nhỏ, được sử dụng để thu khí CO2 tạo ra trong quá trình lên men rượu Các chủng nấm men khác nhau có cường độ lên men khác nhau, vì vậy, phương pháp đo chiều cao cột khí CO2 bằng ống Durham là cơ sở quan trọng để tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rượu cao.
Trong bài thí nghi ệ m này, sinh viên s ẽ th ự c hành:
- Chu ẩ n b ị môi trường lên men rượ u ch ứa đườ ng saccharose
So sánh và đánh giá định tính khả năng lên men của các chủng nấm men dựa trên khả năng tạo khí CO2 trong môi trường chứa đường saccharose.
- Lượng khí CO 2 sinh ra được so sánh thông qua chiều cao cột khí trong ống Duham
Hình 10.1: Ố ng Duham (a), khí tích t ụ trong ố ng Duham (b)
2 V ậ t li ệu và phương pháp
- Môi trường nuôi cấy tế bào nấm men: môi trường Crapek
- Ống nghiệm, ống nghiệm Duham
- Pipet và đầu côn, hộp đầu côn 1000 L; 100 L
2.2 Phương pháp tiến hành a Chế tạo canh trường nấm men
Để pha chế môi trường Crapek lỏng, bạn cần phân phối 10 mL vào mỗi ống nghiệm Sau đó, thanh trùng môi trường ở nhiệt độ 110 độ C trong 30 phút Cuối cùng, làm nguội môi trường đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Sử dụng que cấy, mỗi mỗi ống nghiệm 01 chủng nấm men, nuôi cấy trong tủ lắc tại nhiệt độ 30 o C trong vòng 24-36 h b Chế tạo môi trường lên men
Pha chế môi trường lên men lỏng và phân phối vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 10 mL và có 01 ống Duham úp ngược (Hình 10.1 (a)) Tiến hành thanh trùng môi trường để đảm bảo độ sạch và an toàn cho quá trình lên men.
110 o C trong 30 phút Làm nguội môi trường
Sử dụng pipette để lấy 5-10% v/v thể tích môi trường nuôi cấy nấm men và chuyển vào ống nghiệm có ống Duham Tiến hành nuôi cấy tĩnh tại nhiệt độ 30ºC trong khoảng 24-48 giờ, sau đó sử dụng thước đo để xác định độ cao của cột khí trong ống Duham.
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần thảo luận, sinh viên cần ghi nhận chiều cao của cột khí trong ống Duham và so sánh chiều cao của các cột khí này để đưa ra kết luận về khả năng lên men của các chủng nấm men khác nhau.
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔ NG H Ợ P ENZYME AMYLASES
Các phân tử tinh bột có kích thước lớn, khó thâm nhập qua màng tế bào vi sinh vật Chỉ những vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme α-amylase ngoại bào mới có thể thủy phân tinh bột thành các hợp chất nhỏ hơn như dextrin, maltose hoặc glucose.
- So sánh, đánh giá khả năng sinh enzyme - amylase của các chủng vi sinh vật sử dụng môi trường chọn lọc chứa tinh bột
Khả năng sinh tổ hợp enzyme được đánh giá bằng cách xác định đường kính vòng tròn thủy phân hình thành trên môi trường tinh bột, thông qua phản ứng màu giữa tinh bột và iot.
Hình 1.1: Hình ả nh khu ẩ n l ạ c và vòng tròn phân gi ả i sau khi nhu ộ m màu
2 Vật liệu và phương pháp
- Các chủng vi sinh vật cần đánh gía khả năng sinh tổng hợp amylase
- Môi trường đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase môi trường Czapek, thay nguồn saccharose bằng tinh bột
- Dung dịch iot (1 g I2, 2 g KI, 300 mL nước cất)
2.2 Phương pháp tiến hành a Chế tạo canh trường đánh giá hoạt tính emzyme amylase trong hộp petri
Môi trường Czapek được pha chế bằng cách thay thế đường saccharose bằng tinh bột và được thanh trùng ở nhiệt độ 110 oC trong 30 phút Sau đó, môi trường được đổ vào hộp petri để đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme α-amylase.
- Sử dụng que cấy đầu móc cấy chấm điểm các chủng vi sinh vật cần đánh giá hoạt tính sinh -amylase
- Nuôi cấy trong tủ nuôi tĩnh 2 ngày tại nhiệt độ 30 o C
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật trên hộp petri bằng cách sử dụng dịch Lugol hoặc iot 1% Đổ dung dịch này vào hộp petri để bao phủ toàn bộ bề mặt, để yên trong 3-5 phút, sau đó loại bỏ dung dịch dư và rửa lại bằng nước.
Quan sát và ghi nhận đường kính của vòng tròn phân giải cùng với đường kính khuẩn lạc, sau đó so sánh tỷ lệ giữa đường kính vòng tròn thủy phân và đường kính khuẩn lạc.
- Bài báo cáo thí nghiệm gồm các phần:
+ Cách tiến hành thí nghiệm
Trong phần thảo luận, sinh viên cần ghi nhận đường kính của khuẩn lạc và đường kính vòng tròn phân giải, sau đó so sánh tỷ lệ giữa hai đường kính này Qua đó, có thể rút ra kết luận về khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của các chủng vi sinh vật.
MỘT SỐ THIẾT BỊ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VI SINH VÀ
N ồ i h ấ p thanh trùng
Nguyên tắc gia nhiệt các vật liệu bằng hơi nước bão hòa dưới áp suất lớn hơn áp suất khí quyển giúp tăng cường hiệu quả nhiệt Khi áp suất hơi nước tăng, nhiệt độ cũng sẽ tăng theo, tạo điều kiện lý tưởng cho quá trình gia nhiệt.
Nồi hấp áp lực là thiết bị hai vỏ có khả năng chịu áp suất cao, trong đó nước được chứa trong khoang riêng và được đun nóng trực tiếp bởi sợi đốt Hơi nước tạo ra sẽ di chuyển vào buồng hấp, tiếp xúc với bề mặt vật liệu cần khử trùng, truyền nhiệt và ngưng tụ lại Cuối cùng, nước ngưng được xả qua van xả nước ngưng nằm ở đáy nồi.
Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của nồi hấp áp lực:
Các giai đoạn hoạt động trong quá trình khử trùng bằng nồi hấp áp lực:
Hình 0.2 : Các giai đoạ n ho ạt độ ng trong quá trình kh ử trùng b ằ ng n ồ i h ấ p áp l ự c
Gi ớ i thi ệ u cách v ậ n hành n ồ i h ấ p áp l ự c:
Để khử trùng hiệu quả, hãy đưa các vật liệu và môi trường cần khử trùng vào nồi hấp, đảm bảo rằng chúng được bao gói hợp lý Phương pháp này chỉ áp dụng cho những vật liệu và môi trường có khả năng chịu được áp lực và nhiệt độ cao.
+ Kiểm tra mực nước trong nồi, bổ sung nước cất hoặc nước mềm nếu cần thiết
+ Đặt điều kiện khử trùng (áp suất, thời gian, v.v.)
+Đóng nắp nồi hấp, mở van xảđáy
+ Khi hơi nước thoát ra nhiều từ van xảđáy khoảng 1-2 phút thì để đóng van xảđáy lại Lúc này, khí không ngưng thoát hết khỏi không gian buồng hấp
Khi van xả đáy đóng, hơi nước vào buồng hấp được giữ lại, dẫn đến áp suất tăng cao đến mức đã định Thời gian khử trùng bắt đầu được tính khi áp suất đạt yêu cầu Trong suốt quá trình khử trùng, áp suất hơi nước bão hòa được duy trì ổn định ở mức đã đặt trước.
Sau khi kết thúc quá trình khử trùng, hãy tắt nồi hấp và chờ áp suất trong buồng hấp giảm xuống 0 Tiếp theo, mở van xả đáy và đợi nhiệt độ giảm còn 70 – 80 độ C (nếu nồi hấp có đồng hồ chỉ nhiệt độ) Cuối cùng, mở nắp nồi hấp để lấy dụng cụ và môi trường cần khử trùng ra.
Khi chuẩn bị môi trường trong hộp Petri, cần pha và chứa môi trường trong bình tam giác đã được khử trùng, sau đó mới đổ môi trường lỏng vào các hộp Petri.
T ủ vô trùng d ạ ng th ổi đứ ng – clean bench
Hình 0.3: T ủ vô trùng dòng khí th ổi đứ ng và chi ề u dòng khí Đặc điểm:
- Dòng không khí được làm sạch thông qua bộ lọc HEPA đặt phía trên cùng của tủ, đi từ trên xuống và vềphía người làm việc
Tủ vô trùng cung cấp khí sạch nhằm bảo vệ sản phẩm, và chỉ được sử dụng khi thao tác với vi sinh vật an toàn, không sinh bào tử, cũng như trong các quy trình phản ứng PCR.
Nâng kính chắn lên vị trí an toàn, máy sẽ tự động khởi động chế độ thổi khí để làm sạch tủ trong 3 phút Sau khi thời gian này kết thúc, đèn sẽ tự động bật lên để bắt đầu quá trình vệ sinh bằng cồn.
- Cho mẫu và dụng cụ thực hành vào (nếu cần vô trùng mẫu và dụng cụ, hạ kính bật đèn
- Thực hành các thao tác cấy vi sinh vật Trong quá trình làm việc:
Có thể bật/tắt đèn chiếu sáng bằng phím
Có thể cấp điện cho các thiết bị dùng trong tủ cấy (cân, vortex, ) bằng phím
- Sau khi kết thúc dọn đề, vệ sinh tủ bằng cồn 70 o , sau đó hạ kính xuống, bật UV để vệ sinh tủ
- Vệ sinh khu vực xung quanh chỗ làm và ghi nhật ký sử dụng
- Nếu trong quá trình làm có sử dụng đèn gaz thì cần khoá bình gaz sau khi sử dụng
Chỉ nên đốt đèn cồn khi cần thiết để nung nóng que cấy, que trang, miệng ống nghiệm và miệng bình nuôi, đồng thời sử dụng đèn inoc để tránh nứt vỡ và gây cháy Lưu ý không được đốt đèn cồn rồi đóng cửa tủ cấy Đèn UV sẽ tự động tắt sau 30 phút hoạt động.
Không được tắt quạt khi đang sử dụng đèn cồn hoặc đèn gas
Khi đóng cửa buồng cấy hoàn toàn, quạt sẽ tự động tắt
Trong thời gian khởi động đếm ngược 3 phút, không kéo cửa buồng cấy xuống
T ủ c ấ y an toàn sinh h ọ c c ấ p 2 – Biosafety Cabinet
Hình 0.4 T ủ an toàn sinh h ọ c c ấ p 2 và chi ề u dòng khí Đặc điểm:
- Dòng không khí được làm sạch thông qua bộ lọc HEPA đặt phía trên cùng của tủ, đi từ trên xuống và hút vào phía sau của tủ
Tủ an toàn sinh học cao 2 không chỉ bảo vệ sản phẩm mà còn đảm bảo an toàn cho người làm việc Thiết bị này cho phép sử dụng các chủng vi sinh vật có bào tử, bao gồm vi khuẩn sinh bào tử và nấm, mang lại hiệu quả cao trong nghiên cứu và ứng dụng.
Kéo cửa kính lên vị trí "SASH HEIGHT" (chấm đen) để quạt tự động hoạt động Trên màn hình sẽ hiển thị đếm ngược 3 phút, sau thời gian này bạn có thể bắt đầu làm việc với tủ.
Để vệ sinh tủ, sử dụng cồn 70 độ và thực hiện các bước cần thiết để vô trùng mẫu và dụng cụ Nếu cần, hãy hạ kính và bật đèn UV Trong suốt quá trình làm việc, đảm bảo tuân thủ các quy trình an toàn và vệ sinh.
Có thể bật/tắt đèn chiếu sáng bằng phím ( )
Có thể cấp điện cho các thiết bị dùng trong tủ cấy (cân, vortex, ) bằng phím ( )
- Sau khi kết thúc dọn đề, vệ sinh tủ bằng cồn 70 o , sau đó hạ kính xuống, bật UV để vệ sinh tủ
- Vệ sinh khu vực xung quanh chỗ làm và ghi nhật ký sử dụng
- Chú ý: nếu trong quá trình làm có sử dụng đèn gaz thì cần khoá bình gaz sau khi sử dụng
Chỉ nên sử dụng đèn cồn khi cần thiết để nung nóng các dụng cụ như que cấy, que trang, miệng ống nghiệm và miệng bình nuôi, và cần tránh việc đốt đèn cồn rồi đóng cửa tủ cấy Đèn UV sẽ tự động tắt sau 30 phút kể từ khi bật.
Không được tắt quạt khi đang sử dụng đèn cồn hoặc đèn gas
Khi đóng cửa buồng cấy hoàn toàn, quạt sẽ tựđộng tắt
Trong thời gian khởi động đếm ngược 3 phút, không kéo cửa buồng cấy xuống
T ủ nuôi tĩnh
Hình 0.5 T ủ nuôi tĩnh FOC215E Đặc điểm:
- Tủ nuôi tĩnh có nhiệt độ làm việc từ 3-50 o C
- Sử dụng để nuôi tĩnh các vi sinh vật trong dải nhiệt độ làm việc của tủ
- Bật máy, cài đặt nhiệt độ mong muốn
- Ghi nhật ký sử dụng thiết bị
T ủ nuôi l ắ c Labtech LSI-3016R
Hình 0.6T ủ nuôi l ắ c LSI-3016R Đặc điểm:
- Tủ nuôi có lắc, tốc độ lắc 0-300 v/phút, nhiệt độ nuôi từ 10 o C-60 o C
- Sử dụng tủ nuôi để nuôi các vi sinh vật hiếu khí
- Bật máy bằng công tắc, đặt vị trí an toàn 70 (Safely)
- Mở cửa tủ lên và đưa bình mẫu vào tủ, chú ý đối với thí nghiệm nuôi lắc, cần sắp xếp mẫu ở trạng thái cân bằng, đối xứng nhau
Để thiết lập điều kiện nuôi cấy, hãy chọn nhiệt độ và tốc độ lắc bằng cách nhấn nút Set, sau đó sử dụng biểu tượng Temp, PRM, Time để điều chỉnh các thông số bằng các mũi tên ► ◄.
- Nếu muốn nhiệt độ thí nghiệm nhỏhơn nhiệt độmôi trường nhấn nút Cool
- Sau đó xác nhận chế độ chọn bằng cách ấn lại nút Set
- Chọn nhiệt độ và tốc độ lắc phải phù hợp với công suất của thiết bị và mục đích thí nghiệm
- Đóng kín tủ khi sử dụng, bật đèn trong điều kiện cần thiết, ghi nhật ký sử dụng vào sổ thiết bị.
Kính hi ể n vi
C ấ u t ạ o kính hi ể n vi
Kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận chức năng: cơ học và quang học
Hình 0.7:C ấ u t ạ o kính hi ể n vi quang h ọ c a Bộ phận cơ học: có cấu tạo khá đơn giản gồm giá kính, ống kính và khay kính
- Giá kính: có cấu tạo vững chắc để trên đó lắp các bộ phận khác của kính Nó gồm đế kính và thân kính
Giá đỡ mẫu hình tròn hoặc hình vuông là nơi lý tưởng để đặt tiêu bản, với thiết kế bao gồm hai bên có ốc giúp di chuyển theo hai chiều khác nhau Đặc biệt, giá đỡ này còn được trang bị hai kẹp bằng thép chắc chắn để giữ tiêu bản một cách an toàn và ổn định.
Ống kính là một thiết bị quang học hình tròn, có thể là một ống cho kính một mắt hoặc hai ống cho kính hai mắt Nhờ vào ốc cố định bên cạnh, người dùng có thể dễ dàng xoay ống kính để quan sát Phần trên của ống kính được lắp thị kính, trong khi phần dưới kết nối với bàn xoay chứa nhiều vật kính khác nhau, cho phép xoay quanh trục của giá kính Ống kính có khả năng di chuyển lên và xuống nhờ các ốc điều chỉnh, với ốc di chuyển nhanh (ốc điều chỉnh thô) giúp tìm ảnh của vật, còn ốc di chuyển chậm (ốc điều chỉnh tinh) dùng để làm rõ ảnh của vật.
Bộ phận quang học là bộ phận quan trọng nhất của kính hiển vi gồm: vật kính, thị kính, kính tụ quang và nguồn sáng
- V ậ t kính: gồm nhiều thấu kính ghép lại Mỗi vật kính đèu có ghi số phóng đại bên cạnh
Vật kính trong kính hiển vi được phân loại theo độ phóng đại, bao gồm các loại 8x, 20x, 40x, 90x và 100x Các vật kính có độ phóng đại nhỏ và vừa (8x, 20x, 40x) không sử dụng dầu, được gọi là vật kính khô Ngược lại, những vật kính có độ phóng đại lớn (90x, 100x) yêu cầu sử dụng dầu để tăng cường độ sáng và độ tương phản, do đó được gọi là vật kính dầu Dầu sử dụng phải trong suốt, trung tính và có chỉ số chiết suất tương đương với chiết suất của kính.
Thủy tinh có chỉ số khúc xạ 1,52, tạo ra môi trường đồng nhất giữa thủy tinh và dầu, giúp ánh sáng đi qua không bị khúc xạ và chiếu thẳng vào vật kính Mỗi vật kính có khoảng làm việc (WD) riêng, cho phép quan sát rõ nhất hình ảnh của mẫu vật, cụ thể: vật kính 8x có khoảng làm việc 8,53 mm, 40x là 0,4 mm, và 90x là 0,1 mm.
Hình 0.8: (a) Các lo ạ i v ậ t kính, (b) V ị trí c ủ a v ậ t kính trong kính hi ể n vi
- Th ị kính: lắp ở đầu ống kính, cấu tạo từ hai thấu kính Mỗi loại thị kính cũng có độ phóng đại khác nhau và ghi ở mặt ngoài thị kính (7x, 10x, 15x)
- Độ phón g đạ i c ủ a kính hi ể n vi
Khi quan sát qua kính hiển vi, ta thấy một ảnh ảo ngược với vật và có độ phóng đại được tính bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính và thị kính Ngoài ra, một số bộ phận truyền quang giữa vật kính và thị kính cũng có hệ số phóng đại Do đó, công thức tính độ phóng đại của kính hiển vi là: Độ phóng đại kính = độ phóng đại vật kính x độ phóng đại thị kính x độ phóng đại của bộ phận truyền quang.
Kính tụ quang là một thiết bị được lắp đặt dưới khay kính, bao gồm một hệ thống thấu kính ghép lại với nhau, có chức năng tập trung ánh sáng để chiếu vào tiêu bản Thiết bị này có khả năng di chuyển lên xuống nhờ vào ốc điều chỉnh bên cạnh, giúp tối ưu hóa quá trình quan sát.
Dưới kính tụ quang là hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng đi vào nhiều hay ít
Nguồn sáng lắp dưới kính tụ quang cung cấp ánh sáng cho kính hiển vi với cường độ chiếu sáng có thể điều chỉnh Để sử dụng hiệu quả, cần điều chỉnh ánh sáng sao cho phù hợp với nhu cầu quan sát.
- Bật công tắc nguồn sáng, điều chỉnh cường độ ánh sáng sao cho không chói hoặc tối quá
Để điều chỉnh ánh sáng cho phù hợp, bạn cần hạ kính tụ quang và mở chắn sáng vừa phải nếu muốn chiếu sáng ít hoặc vừa Ngược lại, nếu cần chiếu sáng nhiều, hãy nâng kính tụ quang lên và mở rộng chắn sáng.
- Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính
- Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa Đặt tiêu bản lên khay kính, chỉnh vị trí cần quan sát thẳng với vật kính
- Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản
- Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính
Nhìn qua thị kính, hãy sử dụng ốc để di chuyển nhanh chóng đến khoảng làm việc tương ứng Khi thấy ảnh của vật, dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm để điều chỉnh cho ảnh rõ nét Để bảo quản thiết bị, cần tuân thủ các quy tắc sử dụng và bảo trì đúng cách.
Bảo quản sau khi sử dụng kính
- Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ
- Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau nhẹ đầu vật kính cho thật sạch
- Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu
- Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục Xếp khăn lại, đặt lên khay kính rồi hạ vật kính chạm sát khăn
- Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon Chuyển kính vào tủ lớ có hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn
Bảo quản thông thường và định kỳ
- Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo
- Trong thời gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính
- Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông
- Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính
- Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay cầm thân kính, một tay đỡđế kính.
