kết quả nghiên cứu chuyển gen bt vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu noãn theo đường ống phấn

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN BT VÀO CÂY BÔNG BẰNGVI TIÊM VÀO BẦU NOÃN THEO ĐƯỜNG ỐNG PHẤN Chủ nhiệm đề tài: KS.. Xuất phát từ cơ sở trên, trong năm 2007 chúng tôi tiến hành đề tài “Ngh

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN BT VÀO CÂY BÔNG BẰNG

VI TIÊM VÀO BẦU NOÃN THEO ĐƯỜNG ỐNG PHẤN

Chủ nhiệm đề tài: KS Trịnh Minh Hợp Cán bộ thực hiện: KS Nguyễn Thị Nhã, KS Nguyễn Thị Dung,

KS Thái Thị Lệ Hằng

1 MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trên thế giới, bông là cây trồng kinh tế và lấy sợi tự nhiên quan trọng,được trồng ở hơn 70 quốc gia và đóng góp 20-30 tỷ USD/năm giá trị bông xơ(Bao-Hong Zhang và cs, 2001) Tuy nhiên, cây bông bị nhiều loại sâu gây hại,hàng năm, mức tổn thất do sâu gây ra chiếm 20-40% tổng sản lượng bông(Ahmad K.D., 1991) và tiêu tốn lượng thuốc sâu chiếm 24% tổng lượng thuốctrừ sâu sử dụng trong nông nghiệp (Colliot và Roux de Bretagne, 1993) Hiệnnay, để khắc phục các thiệt hại do sâu gây ra các nước trồng bông trên thế giới

đã tạo ra giống bông bông Bt kháng sâu

Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống, tuy nhiên, diện tích và sảnlượng của ta rất thấp, chỉ đáp ứng 10-15% nhu cầu may mặc trong nước(Nguyễn Hữu Bình, 2002) Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích

và tăng sản lượng của nước ta, nhưng quan trọng nhất vẫn là sâu hại (NguyễnHữu Bình, 1990; Nguyễn Thị Hai, 1996) Theo chương trình phát triển củaNgành Dệt-May, đến năm 2010, Việt Nam phải sản xuất được 300.000 tấnbông xơ Để thực hiện được chỉ tiêu này, bên cạnh việc áp dụng các chínhsách khuyến nông, biện pháp kỹ thuật canh tác mới, thì việc nghiên cứu tạogiống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết

Bông biến đổi gen được trồng thương mại trên thế giới vào năm 1996,với diện tích khoảng 0,8 triệu ha (Clive James, 1997) Từ đó đến nay, diện tíchtrồng bông biến đổi gen liên tục tăng nhanh, đến năm 2005, diện tích trồngbông biến đổi gen toàn cầu khoảng 10 triệu ha chiếm trên 30% trong tổng diệntích bông (Clive James, 2005) Các loại bông biến đổi gen đang được phổ biến

là bông kháng sâu, chịu thuốc trừ cỏ và bông vừa kháng sâu, vừa chịu thuốctrừ cỏ Các nước Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc đang trồng bông biến đổi gen nhiềunhất (Clive James, 2007) Trồng bông chuyển gen đem lại nhiều lợi ích nhưtăng năng suất, giảm chi phí bảo vệ thực vật và nguy cơ ô nhiễm môi trường

Để tạo bông chuyển gen, chủ yếu sử dụng hai hệ thống chuyển gen là

phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium và trực

tiếp bằng bắn gen (Hemphill J.K và cs, 1998) Tuy nhiên, nhược điểm của cảhai phương pháp là phải thông qua hệ thống tái sinh cây bông bằng nuôi cấy

mô tốn nhiều thời gian, tỷ lệ tái sinh thấp và bị giới hạn chỉ ở giống bôngCoker, vốn không có các đặc tính nông sinh học tốt (Trolinder N.L và cs,1989; Fioozabady E và cs, 1993; Koonce L và cs, 1996) Chuyển gen trựctiếp vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy hoa theo đường ống phấn làphương pháp chuyển gen mới phát triển gần đây, có ưu điểm là dễ thực hiện,

tỷ lệ chuyển gen khá cao, khắc phục được khó khăn về tái sinh cây bông và có

thể chuyển gen vào bất kỳ giống bông nào (Hemphill J.K và cs, 1998) Mặc

dù còn nhiều bàn cãi về cơ chế chuyển gen, nhưng hiện nay, phương phápđang được sử dụng rộng rãi và rất có hiệu quả ở Trung Quốc và một số nướctrên thế giới để chuyển gen vào các cây trồng như lúa nước, lúa mỳ, đậutương và đặc biệt là cây bông (Li Fuguang và Cui Jinje, 2001) Xuất phát từ

cơ sở trên, trong năm 2007 chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen

Bt vào cây bông bằng vi tiêm trực tiếp vào bầu noãn theo đường ống phấn”.

1.2 Mục tiêu của đề tài

1- Xác định các giống bông thích hợp cho vi tiêm;

2- Xây dựng quy trình chuyển gen Bt cho cây bông bằng phương pháp

vi tiêm vào bầu noãn thông qua đường ống phấn;

3- Tạo ra các dòng bông mang gen chuyển Bt phục vụ cho nghiên cứu

và sản xuất bông hàng hóa trong nước

1.3 Nội dung nghiên cứu

1.3.1 Nội dung nghiên cứu tổng quát của đề tài

1- Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid để cung cấp cho vi tiêm;

2- Nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa bông phục vụ cho vi tiêm;3- Vi tiêm để tạo hạt bông mang gen chuyển Bt;

4- Sàng lọc cây mang gen chuyển sau vi tiêm;

5- Đánh giá các dòng bông mang gen ở mức phân tử

1.3.2 Nội dung nghiên cứu cụ thể trong năm 2007

1- Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid để cung cấp cho vi tiêm;

2- Nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa cho 3 giống C118, LRA5166

và TM1 phục vụ cho vi tiêm;

3- Vi tiêm cho 3 giống C118, LRA5166 và TM1 để tạo hạt bông manggen chuyển Bt;

4- Sàng lọc cây bông mang gen chuyển bằng kháng sinh kanamycin

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

2.1.1 Tình hình sản xuất cây bông biến đổi gen

Bông chuyển gen được nghiên cứu thử nghiệm vào năm 1987, thànhcông đầu tiên thuộc về công ty Miorogene của mỹ Công ty này đã được côngnhận bằng sáng chế về gen Bt kháng sâu Sau đó, công ty Monsanto của Mỹmua lại bản quyền sử dụng gen Bt Từ đó, Monsanto tổng hợp và chuyển vàocây bông năm 1988; tạo được giống bông chuyển gen Deltapine năm 1990,thí nghiệm và trồng thử nghiệm trên đồng ruộng năm 1992; bắt đầu đưa đitrồng diện rộng trong sản xuất năm 1993-1994; và chính thức được công nhậnvào năm 1995 Cây bông biến đổi gen được trồng đầu tiên trên thế giới vào

năm 1996, chủ yếu ở Mỹ, với diện tích khoảng 0,8 triệu ha (Clive James,1997) Từ đó đến nay, diện tích trồng bông biến đổi gen liên tục tăng nhanh.Đến năm 2005, diện tích trồng bông biến đổi gen toàn cầu khoảng 10 triệu hachiếm trên 30% trong tổng diện tích 32 triệu ha trồng bông toàn thế giới(Clive James, 2005) Các loại bông biến đổi gen đang được phổ biến là bôngkháng sâu, chịu thuốc trừ cỏ và bông vừa kháng sâu, vừa chịu thuốc trừ cỏ.Các nước Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc đang trồng bông biến đổi gen nhiều nhấtthế giới (Clive James, 2007).

Mỹ là nước đầu tiên trên thế giới cho phép trồng thử nghiệm câychuyển gen vào năm 1995 Cây bông bông Bt được cho phép trồng thươngmại ở Mỹ vào năm 1996 với diện tích ban đầu 0,73 triệu ha, chiếm 14% diệntích Đến năm 2001, diện tích trồng bông Bt của Mỹ lên tới 2,08 triệu hachiếm 34% diện tích trồng bông toàn đất nước (Edge và cs, 2001) Ở TrungQuốc, cây bông chuyển gen bắt đầu được trồng thương mại vào năm 1997 vớidiện tích rất ít (<0,1 triệu ha), chiếm khoảng dưới 1% diện tích Tuy nhiên,sau đó diện tích trồng bông Bt kháng sâu của Trung Quốc tăng lên rất nhanh

và đến năm 2004 diện tích này đã là 3,7 triệu ha chiếm 66% trong tổng diệntích trồng bông 5,6 triệu ha (Clive James, 2004) và đến nay diện tích trồngbông Bt là 3,8 triệu ha (Clive James, 2007) Ấn Độ trồng bông Bt sau TrungQuốc 6 năm, nhưng đến năm 2007, diện tích trồng tăng lên 6,2 triệu ha, vượtTrung Quốc 2,4 triệu ha (Clive James, 2007) Tại Úc, cây bông biến đổi gencũng được cho phép trồng khá sớm Đến năm 2004, có tới 80 % diện tíchtrồng của Úc, tương đương 250.000 ha là bông biến đổi gen (Clive James,2004) và năm 2007 đã tăng lên 100.000 ha (Clive James, 2007)

2.1.2 Ý nghĩa của trồng cây bông Bt

Có thể nói việc tạo ra giống bông Bt là thành tựu khoa học có ý nghĩarất lớn cho sản xuất bông của thể giới, góp phần rất lớn trong việc tăng năngsuất và sản lượng bông, giảm chi phí (chủ yếu là chi phí bảo vệ thực vật), hạgiá thành sản phẩm, tăng hiệu quả kinh tế, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường

và tăng sức khỏe con người

Chẳng hạn như việc trồng bông Bt đã làm tăng năng suất bông hạt 38% so với trồng bông thường, trong đó, Ấn Độ, Achentina, Indonesia vàNam Phi có năng suất bông Bt tăng rất cao (24-38%) Việc sử dụng bông Btcũng góp phần giảm chi phí bảo vệ thực vật, như đã giảm được số lần phunthuốc 3-14 lần, trong đó Trung Quốc (14 lần), Indonesia (8 lần), Nam Phi, Úc

10-và Ấn Độ (7 lần) có số lần phun thuốc giảm khá nhiều Do sự giảm về số lầnphun thuốc, nên cũng đã giảm được số lượng thuốc trừ sâu sử dụng trung bình13% tổng số lượng thuốc trừ sâu sử dụng cho bông Ở một số nước đã có sựgiảm rất lớn về lượng thuốc trừ sâu sử dụng như Trung Quốc (61%), Mỹ(31%) và Úc (27%) (Clive James, 2002) Bông Bt liên tục mang lại lợi nhuậncho người nông dân Ấn Độ, so với các giống bông thường thì bông Bt làmtăng 50% sản lượng cũng như giúp giảm một nửa số thuốc trừ sâu cần sửdụng, đem lại tác động tích cực về môi trường và sức khỏe cho người trồngbông Tính trên góc độ quốc gia, ước tính thu nhập của nông dân trồng bông

Bt tăng từ 840 triệu đô la Mỹ (năm 2006) lên đến 1,7 tỷ đô la (năm 2007), và

Ấn Độ từ một nước có sản lượng bông thấp nhất thế giới, từ một nước nhậpkhẩu bông giờ đã trở thành 1 nước xuất khẩu bông (Clive James, 2007)

Tại Mỹ, trồng giống bông Bt cho năng suất bông xơ cao hơn giốngbông không Bt 14,7-20,5% (Benedict và Altman, 2001) và đem lại lợinhuận do việc tăng năng suất và giảm chi phí bảo vệ thực vật tính riêngtrong năm 2001 là 2,08 tỷ USD (Carpenter và Gianessi, 2001; Gianessi và

cs, 2002) Tại Trung Quốc, nhờ có sử dụng bông Bt mà đã giảm được 2/3 lượng thuốc trừ sâu sử dụng so với trồng bông thường trong các năm1999-2001 và tổng lợi nhuận thu được do trồng bông Bt kháng sâu trong 3năm (1999-2001) gần 1,5 tỉ USD (Pray và cs, 2002) Năm 2007, bông Btđược 7,1 triệu người Trung Quốc trồng trên diện tích 3,8 triệu ha (tăng sovới 3,5 triệu ha năm 2006), đây là chỉ số quan trọng phản ánh niềm tin củanông dân vào công nghệ mới (Clive James, 2007)

1/2-2.1.3 Các loại bông Bt kháng sâu

Hiện nay, trên thế giới đang tồn tại các loại bông Bt kháng sâu:Bollgard , bông Bt Trung Quốc ( Chinese Bt Fusion Gene Cotton), Bollgard

II và một số giống bông kháng sâu khác

Bollgard là các giống bông Bt do công ty Monsanto của Mỹ tạo ra đầutiên và thương mại hoá vào năm 1995-1996, nó chỉ chứa một gen CryIAc, hiệnnay nó đang được trồng rộng rãi ở 9 nước trồng bông lớn trên thế giới với diệntích khoảng 10 triệu ha Khả năng kháng các loại sâu bông của giống bông chothấy, có khả năng kháng ở mức cao với sâu hồng, sâu xanh, kháng yếu với sâuxanh da láng (20%) và kháng khá cao với các loại sâu còn lại (70-85%)

Giống bông Bt hỗn hợp là các giống bông do Viện Hàn lâm Khoa họcNông nghiệp Trung Quốc (CAAS) tạo ra đầu tiên, nó chứa 2 gen CryIAb vàCryIAc được trồng chủ yếu ở Trung Quốc Ngoài ra thuộc nhóm bông Bt khángsâu này của Trung Quốc còn có loại bông Bt kháng sâu chứa 2 gen là Bt và CpTi

Giống bông BollgardII là thế hệ bông Bt thứ 2 của Monsanto, nóchứa đồng thời 2 gen CryIAc và CryIIAb, nó là loại bông Bt có phổ diệtsâu rộng hơn và khả năng diệt sâu cao hơn thế hệ bông Bollgard Sốliệu cho thấy, tỷ lệ diệt sâu của bông Bollgard II (92,2-100%) cao hơnhẳn bông Bollgard (1,2-84,4%) Ngoài ra, theo các kết quả nghiên cứukhác, thì với bông BollgardII, sâu hại bông sẽ ít phát sinh tính khánghơn so với bông Bollgard vì nó có chứa nhiều loại độc tố hơn BôngBollgardII được cho phép trồng lần đầu tiên tại Úc năm 2003 với diệntích 5.000 ha, sau đó nó được cho phép trồng tại Mỹ và nhiều nước trồngbông lớn khác trên thế giới

Ngoài các giống bông nêu trên, năm 2002, công ty Dow AgroSciencecũng đã đưa ra giống bông Bt có phổ diệt sâu rộng chứa 2 gen CryIA(c) vàCryIF Gần đây nhất công ty Sygenta đã đưa ra sản xuất lần đầu tiên tại Mỹ,năm 2004 giống bông VIP (VIP Cotton) có chứa gen kháng sâu Vip

(Vegetative Insecticidal Protein), đây là loại bông có phổ diệt sâu rất rộng và

có tỷ lệ diệt sâu rất cao và sâu rất khó phát sinh tính kháng

2.1.4 Nghiên cứu chuyển gen vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm

Chuyển gen bằng con đường ống phấn là phương pháp chuyển gen trựctiếp vào các tế bào mầm Nó là sự kết hợp giữa kỹ thuật di truyền hiện đại với

kỹ thuật chọn giống thông thường để cải tiến cây trồng bằng việc tạo ra cácbiến dị và chọn lọc các đặc tính nông học quý Đây là tiến bộ khoa học lớn

mà Trung Quốc đạt được trong những năm gần đây và bằng phương pháp nàymột số lượng lớn các dòng/giống bông biến đổi gen đã được tạo ra và hiệnnay đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất bông

Các nhà khoa học ở Viện Nghiên cứu Cây trồng kinh tế (ICC), ViệnHàn lâm Khoa học Nông nghiệp Jiangsu (JAAS) đã hợp tác chặt chẽ với các

cơ quan khác, tạo giống bông khởi đầu bằng vi tiêm ADN tổng số vào các câybông nhận Các kết quả đã chỉ ra rằng sự chuyển ADN tổng số giữa các giống

và các loài đã thành công dựa theo đường ống phấn, trong đó phần lớn cáccon cháu đã biểu hiện biến dị Sau 3-4 thế hệ chọn lọc một loạt các dòng ổnđịnh di truyền đã được chọn lọc (Zhang, 1992)

Năm 1992, nhóm của Gou ở Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học(BRI), Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc (CAAS) đã thiết

kế và tổng hợp nhân tạo gen Bt GFM CryIA dựa theo mã sử dụng phù hợpcho cây trồng (Gou và cs, 1995) Từ năm 1993, Ni và cs ở ICC và JAAS

đã chuyển các gen mã hóa cho Bt, Bt + CpTI, Chitinase, -glucanase,glucose oxidase, anti-fungal protein (APF) bằng con đường ống phấn vàocác giống bông Trung Quốc như Zhongmiansuo 12 & 19, Zhongzhi 372,Simian 3, Sumian 8 & 12, Siyang 167 & 168, Shiyuan 321, Xinluzao 4, 7

& 8, Liaomian 15, 3517, 541, 916, C6524, Q010, Suyin A, B & C vàgiống bông ít gossypol W8 Kết quả đã thu được một loạt các dòng/giốngbông chuyển gen kháng cao với cả sâu đục quả và các bệnh nấm (Ni và

cs, 1996, Gou và cs, 1999) Các phân tích về phân tử, sinh học và ditruyền cây chuyển gen đã xác nhận sự gắn vào genom và biểu hiện củagen mục tiêu Điều này chỉ ra rằng, chuyển gen thông qua đường ốngphấn là một hệ thống chuyển gen hiệu quả

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong lĩnh vực chuyển gen vào cây trồng, Việt Nam lạc hậu so với thếgiới hàng chục năm Vào những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ XX, khi nhữngcây chuyển gen đầu tiên đang được thương mại trên thế giới, lúc đó ở ViệtNam, mới bắt đầu nghiên cứu tiếp cận kỹ thuật này Một số công trình nghiêncứu chuyển gen chọn lọc (kháng kanamycin, hygromycin và gen Bar) và genchỉ thị (gen GUS) vào một số cây trồng (lúa, cải bắp và thuốc lá) được tiếnhành ở một số phòng thí nghiệm của các Viện Công nghệ Sinh học, Viện Ditruyền Nông nghiệp, Viện Sinh học Nhiệt đới và Viện Nghiên cứu Lúa đồngbằng sông Cửu Long (Lê Huy Hàm, 2003) Những nghiên cứu này nhằm mục

đích hoàn thiện các quy trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng, làm

cơ sở cho các bước nghiên cứu kế tiếp

Những năm gần đây, một số gen kháng sâu bệnh và chất diệt cỏnhư các gen CryIAb, CryIAc, CryIC kháng sâu; gen GNA kháng rầy; genchitinase và gen glucanase kháng nấm; gen Xa21 kháng bệnh bạc lá; vàgen bar chịu thuốc diệt cỏ được chuyển vào một số cây trồng quan trọngnhư lúa, khoai, cà chua, cải bắp, cải dầu, thuốc lá, đu đủ Kết quả, chúng

ta đã thu được những cây chuyển gen và lưu giữ chúng trong điều kiện vitro và nhà kính Tuy nhiên, tất cả những cây trồng chuyển gen được tạo

in-ra ở Việt Nam mới chỉ tồn tại ở quy mô thí nghiệm (Bộ Nông nghiệp vàPhát triển Nông thôn, 2002)

Trong Chương trình Công nghệ Sinh học KHCN-02 giai đoạn

1996-2000 có một đề tài đăng ký thực hiện công nghệ chuyển gen ở cây trồng,trong đó gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vi khuẩn ở lúa và nhóm gen Crykháng sâu được chuyển vào cây lúa (Lê Thị Muội và cs 2000) Trước đócũng đã có những nghiên cứu phân lập gen chịu lạnh ở cây lúa (Lê TrầnBình và Lê Thị Muội, 1998) Trong chương trình Nghiên cứu Khoa học vàPhát triển Công nghệ Sinh học KC-04 giai đoạn 2001-2005 có đề tài

“Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi” Thông qua đề tài, các

gen kháng bệnh đạo ôn lúa (gen Pi-1/Pi-2t), gen kháng sâu (gen Cry vàVIP), gen giữ hoa lâu tàn (gen ACO antisense), gen kháng nấm (genChitinase và OXDC), gen kháng bệnh bạc lá vi khuẩn (gen Xa21), genkháng thuốc trừ cỏ (gen Bar), gen tăng tính chịu hạn, mặn (gen P5CS), genkháng rầy (gen GNA), gen tăng protein dự trữ (gen AmA1) và gen chín sớm(gen FPF1) được thu thập, phân lập và thiết kế gen để chuyển cho một sốloại cây hoa (cúc, cẩm chướng, hồng và lan), cây lâm nghiệp (hông, tếch,bạch đàn lai và keo lai), cây lương thực và thực phẩm (lúa, ngô và đậutương) và cây bông Đối với cây bông, sẽ chuyển các các gen Cry khángsâu, gen Bar kháng thuốc trừ cỏ và gen P5CS tăng tính chịu hạn vào câybông để tạo các giống bông kháng sâu, chống chịu thuốc trừ cỏ và chịu hạn(Lê Trần Bình, 2001) Tuy nhiên, các kết quả đạt được mới dừng lại ở thửnghiệm trong phòng thí nghiệm và nhà kính

3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Tách chiết và tinh sạch plasmid

* Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

- Nuôi 1-5ml dịch khuẩn (lấy 1 khuẩn lạc cho vào môi trường LB hoặcLBG) qua đêm hoặc 16 h hoặc 10-12 OD (nếu vượt quá sẽ nhiễm RNA, DNAcủa khuẩn)

- Chuyển dịch khuẩn sang ống 2ml Ly tâm 1 phút, thu lấy cặn

- Thêm 250µl dung dịch resuspension, vortex hoặc dùng pippet hút lên,xuống cho đến khi cặn tan hoàn toàn

- Thêm 250µl dung dịch lysis, đảo 6-8 lần cho đồng nhất (không được vortexhoặc shake để tránh nhiễm ADN của vi khuẩn), để 5 phút ở nhiệt độ phòng

- Thêm 350µl dịch neutralization, đảo 6-8 lần (không được vortex hoặc shake)

- Ly tâm 5 phút cho lắng cặn màu trắng (dịch nổi-phần chứa ADN plasmid)

* Tinh sạch ADN plasmid

- Chuyển dịch nổi sang cột spin (chèn cột lênn ống loại 2ml-có cung

cấp theo kit)

- Ly tâm 1 phút để đẩy ADN plasmid gắn chặt vào màng cột tinh sạch

- Thêm 750µl dịch rửa 1X (thêm 4 vol cồn tuyệt đối vào dịch rửa cónồng độ 5X trước khi dùng) và ly tâm 1 phút

- Ly ly tâm 1 phút để loại bỏ hết dịch rửa, thay cột sang ống rửa mới

Ly ly tâm 1 phút loại bỏ hoàn toàn dịch rửa

* Thu thập mẫu tinh sạch

- Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorft mới (loại 1,5-2,0ml)

- Bổ sung 50µl dịch hòa tan ADN plasmid lên màng cột, cố định 1 phút

để nó hàa tan và tách khỏi màng Ly tâm 1 phút thu lấy dịch plasmid

- Loại bỏ cột, ADN plasmid tinh sạch có thể được dùng ngay hoặcđược giữ ở 40C (kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%)

* Bảo quản ADN plasmid

ADN plasmid sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được pha loãng bằngnước khử ion thành dung dịch mẹ có nồng độ 100g/ml và bảo quản ở tủ -200C

3.3.2 Nghiên cứu thời điểm nở hoa và kích thước bầu nhụy

- Xác định thời gian nở rộ hoa trong ngày: khi cây bông bắt đầu nở hoa, tiếnhành đếm số hoa nở ở 3 khoảng thời gian (1): trước 6h ; (2): 7-9h; và (3): sau 10h

- Xác định kích thước của bầu nhụy và chiều dài của trụ noãn: chọn cáchoa nở bình thường ở vị trí thứ nhất và 2 trên các cành quả từ 1 đến 6, ở giaiđoạn sau nở hoa 24 tiếng để đo đến các chỉ tiêu chiều dài, rộng của bầu Cắtđôi bầu nhụy để xác định chiều dài của trụ noãn

nở hoa và thụ phấn 20-24 tiếng, tức từ 6 đến 9 h buổi sáng ngày thứ 3.

- Chuẩn bị trước khi vi tiêm

+ Chuẩn bị vi kim tiêm: sử dụng vi kim tiêm loại dung tích 10µl Trướckhi vi tiêm cần lau chùi sạch sẽ bằng cồn tuyệt đối, sau đó ngâm vào nước cấtkhử trùng trước và sau khi sử dụng

+ Chuẩn bị dung dịch ADN plasmid: trước khi vi tiêm, lấy dung dịch

mẹ (nồng độ 100µg/ml) pha loãng bằng nước khử ion thành các dung dịchlàm việc có nồng độ 10, 20 và 30µg/ml Thể tích dịch mỗi lần vi tiêm là 10µl

+ Lấy dung dịch vi tiêm: Dùng 3 ngón giữa, áp út và út của tay phải giữchặt thân xi lanh, dùng ngón trỏ và cái điều khiển pít tông Trước khi hútdung dịch, cần đảm bảo pít tông khít với đáy xi lanh Rút pít tông chậm vàđều cho đến khi thể tích dung dịch đã vào xi lanh đủ (10µl) Chú ý, không để

có bọt khí trong dịch hút

3.3.4 Tiến hành vi tiêm

- Cắt bỏ cánh hoa hoặc đè bẹp chúng ra các bên Cắt bỏ vòi nhụy đếnsát với bầu hoa (chú ý tránh làm tổn thương các tế bào nhu mô của bầu nhụykhi cắt bỏ cánh hoa, các hoa chấm sơn bị bung ra phải bỏ đi)

- Dùng 2 ngón áp út và út của tay trái kẹp lấy cuống hoa, dùng 3 ngóncòn lại giữ bầu nhụy thẳng đứng vuông góc với mặt đất Dùng 3 ngón cái, trỏ

và giữa của tay phải giữ xi lanh Ấn thẳng đứng mũi kim tiêm vào điểm giữacủa vòi nhụy, đẩy từ từ đến 2/3 chiều dài bầu nhụy, sau đó kéo lùi lại 1/3 đểtạo khoảng trống, dùng ngón cái bơm nhẹ nhàng dịch tiêm vào bầu và cuốicùng rút từ từ kim tiêm ra

- Sau khi rút kim ra, để giảm sự rụng quả, cần bôi lên vết tiêm dungdịch khử trùng và đầu cuối cuống hoa dung dịch gibberellin nồng độ 40ppm

- Đeo thẻ để đánh dấu quả vi tiêm

- Chăm sóc sau vi tiêm: chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh triệt để chocây sinh trưởng phát triển tốt Cần cắt ngọn của cành quả để tập trung dinhdưỡng nuôi quả và hạt bông quả vi tiêm

- Thu hoạch: các quả bông vi tiêm được thu hoạch và tách lấy hạt đểphục vụ cho sàng lọc cây chuyển gen sau này

3.3.5 Phương pháp sàng lọc cây chuyển gen bằng kanamycin

Gieo hạt bông vi tiêm trong nhà lưới, pha kanamycin với nước cất ởnồng thích hợp (nồng độ giống bông mẫn cảm), phun ướt toàn bộ lá cây bông

ở giai đoạn cây 15-20 ngày tuổi Loại bỏ các cây dương tính, các cây âm tínhcòn lại được chăm sóc, tự thụ và thu riêng quả cho từng cây để cung cấp hạtcho nghiên cứu sàng lọc tiếp sau

3.4 Chỉ tiêu theo dõi

1- Nồng độ, số lượng và chất lượng ADN plasmid tách chiết

2- Thời điểm nở hoa, kích thước bầu nhụy và chiều dài trụ noãn

3- Số hoa tiêm, quả đậu, quả dị dạng, số hạt

4- Tỷ lệ cây và triệu trứng lá cây bông mẫn cảm với kanamycin

5- Số lượng, tỷ lệ cây âm tính ở mỗi công thức

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid cung cấp cho vi tiêm

Chất lượng ADN plasmid tốt là thông số rất quan trọng trong chuyểngen bằng kỹ thuật vi tiêm Để tách chiết và tinh sạch được ADN plasmid có

chất lượng cao, chúng tôi đã tiến hành nuôi vi khuẩn E.coli chủng DH5

mang 2 vectơ chuyển gen pBI121 và pIBT (C;P) (ảnh 1), sau đó, tách chiết

và tinh sạch ADN plasmid theo kít (Arrunium mini kit) của Công ty Biorad.Kết quả thu được trong bảng 1 cho thấy, sau 6 đợt tách chiết, thu được tổngcộng 39ml dung dịch ADN plasmid, với nồng độ bình quân 953,7µg/ml.Kết kiểm tra OD cho thấy, ADN plasmid tách chiết được có chất lượng rấttốt, các thông số OD260/OD280 và OD260/OD230 đều nằm trong phạm

vi cho phép (đều đạt và tương tự với nghiên cứu của Song và cs., 2006, độsạch của ADN phải đạt OD260/OD280 > 1,8 và OD260/OD230 > 2) Kếtquả điện di để kiểm tra cũng cho thấy, ADN plasmid có 3 vạch sắc nét,điều đó chứng tỏ ADN có chất lượng tốt, không lẫn tạp, đủ tiêu chuẩn cho

vi tiêm Bên cạnh đó, chúng tôi còn nhận thấy, nồng độ và chất lượng ADN

Ảnh 1 Các vector chuyển gen

A

B

plasmid thu được giữa các đợt tách không chênh lệch đáng kể, chứng tỏ sửdụng kít của hãng Biorad để tách chiết là phù hợp.

Bảng 1 Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid

(ml)

Nồng độ(µg/ml)

OD260/

OD280

OD260/OD230

4.2 Kết quả nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa bông phục vụ cho vi tiêm

4.2.1 Xác định thời điểm nở hoa trong ngày

Các nghiên cứu cho thấy, thời gian vi tiêm tốt nhất khoảng 20-24 giờsau khi bông nở hoa và tung phấn Vì vậy, thời điểm hoa bông nở trong ngày

là chỉ tiêu rất quan trọng cho vi tiêm, bởi vì thời điểm này được sử dụng đểlàm căn cứ để xác định thời điểm vi tiêm trong ngày

Bảng 2 Tỷ lệ (%) hoa nở ở các thời điểm trong ngày của 3 giống bông

Từ kết quả này, chúng tôi đi đến kết luận, thời điểm vi tiêm thích hợp nhấtcho 3 giống bông này là từ 6-8 giờ vào ngày thứ 2 sau khi hoa nở

4.2.2 Kích thước bầu nhụy

Kích thước bầu nhụy, đặc biệt là chiều dài trụ noãn của hoa bông tạithời điểm vi tiêm cũng là chỉ tiêu rất quan trọng cho vi tiêm, bởi vì người tacăn cứ vào các chỉ tiêu này để xác định độ sâu kim tiêm và chọn giống bôngthích hợp cho vi tiêm

Bảng 3 Kích thước (cm) bầu nhụy và chiều dài trụ noãn của 3 giống bông