nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong giấy và phụ liệu

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài: “Nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu”, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Th.S KHÚC THỊ AN, người đã tận tình giúp đỡ,

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan tất cả những số liệu trong đề tài: “Nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu” là số liệu thật và chƣa từng đƣợc

công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với số liệu nghiên cứu của mình

Sinh viên

Vũ Mạnh Tùng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài: “Nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong

Giấy và phụ liệu”, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Th.S KHÚC THỊ AN,

người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi từ buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học và trong suốt quá trình tiến hành hoàn thành đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học, cán bộ phòng thí nghiệm - Viện Công nghệ sinh học & Môi trường đã nhiệt tình truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian của khóa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh chị em trong gia đình, mọi người đã cho tôi những điều kiện tốt nhất về mặt tinh thần cũng như vật chất giúp tôi trong suốt khóa học

Cuối cùng tôi xin cảm ơn tập thể lớp 48sh và toàn thể đồng bạn đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian qua

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, tháng 07 năm 2010

Sinh viên

Vũ Mạnh Tùng

Mục lục

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

CHƯƠNG 1 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 2

1.3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3

1.4.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM TRÊN THẾ GIỚI 3

1.4.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM LINH CHI Ở TRONG NƯỚC 4

1.4.4.1 Đặc điểm sinh học của nấm linh chi 6

CHƯƠNG 2 8

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 8

2.1.3 Môi trường và hóa chất 8

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.2.1 Những nghiệm thức được thiết lập 9

2.2.2 Dự kiến quy trình thực nghiệm nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu 10

2.2.2.1 Phân lập giống nấm hoàng chi cấp 1 bằng phương pháp tách mô vô trùng 10

2.2.2.2 Nhân giống nấm hoàng chi trên môi trường hạt lúa cấp 2 11

2.2.2.3 Xử lý nguyên liệu rong Giấy và phụ liệu 12

2.2.2.4 Hấp vô trùng tạo bịch phôi và cấy từ môi trường hạt qua 12

2.2.2.5 Chăm sóc và đón hái nấm 12

2.2.3 Phương pháp thu nhận kết quả 13

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 13

CHƯƠNG 3 14

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

3.1 Kết quả nuôi trồng thực nghiệm 14

3.1.1 Kết quả phân lập giống cấp 1 bằng phương pháp tách mô vô trùng 14

3.1.2 Kết quả nhân giống trên môi trường hạt lúa 16

3.1.3 Kết quả trên môi trường ra quả thể 18

3.1.4 Kết quả phân tích hình thái giải phẫu quả thể nấm linh chi 22

3.1.5 Kết quả phân tích hình thái giải phẫu quả thể nấm hoàng chi 28

3.1.6 Kết quả phân tích thành phần hóa học trong quả thể 29

3.2 Đề xuất quy trình nuôi trồng nấm hoàng chi trên giá thể rong giấy và phụ liệu 31 CHƯƠNG 4 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 32

4.1 Kết luận 32

4.2 Đề xuất ý kiến 33

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.3 Thành phần sinh học của Rong Giấy 6

Bảng 2.1 Tỷ lệ thành phần cơ chất trong các nghiệm thức 9

Bảng 3.1 Kết quả số liệu của hệ sợi nấm linh chi ở các nghiệm thức 18

Bảng 3.2 Kết quả giải phẫu sinh học trong các nghiệm thức 28

Bảng 3.3 kết quả tính hiệu suất sinh học ở các nghiệm thức 29

Bảng 3.4 Kết quả phân tích thành phần hóa học 29

Bảng 3.5 Kết quả so sánh tổng hợp sự phát triển của nấm ở 2 môi trường 30

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Rong giấy tại bờ biển Nha Trang - Khánh Hòa 5

Hình 3.1 Nấm hoàng chi sau 5 ngày phân lập trên môi trường thạch 15

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn tốc độ lan tơ nấm trên môi trường thạch 15

Hình 3.3 Giống nấm hoàng chi trên môi trường hạt sau 12 ngày cấy truyền từ môi trường thạch cấp 1 17

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tốc độ tơ nấm trên môi trường hạt lúa 17

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tốc độ lan tơ của tổ chức hệ sợi ở các nghiệm thức 19

Hình 3.6 Màu sắc và tốc độ lan tơ nấm hoàng chi sau 16 ngày nuôi ở môi trường truyền thống 20

Hình 3.7 Màu sắc và tốc độ lan tơ nấm hoàng chi sau 16 ngày ở môi trường bổ sung 80 % rong giấy 21

Hình 3.8 Sự khác nhau về màu sắc, tốc độ lan tơ nấm hoàng chi giữa môi trường truyền thống và môi trường rong giấy sau 16 ngày 21

Hình 3.9.Ụ nấm sau 10 ngày ở 22

Hình 3.10 Ụ nấm sau 10 ngày ở 22

Hình 3.11 Tai nấm ở MTTT 24

Hình 3.12 Tai nấm ở MT rong 24

Hình 3.13 Tác giả và sản phẩm nấm hoàng chi trên môi trường rong giấy 24

Hình 3.14 Sự khác nhau giữa quả thể nấm hoàng chi ở môi trường rong và môi trường truyền thống 25

Hình 3.15 Nấm hoàng chi thu trong đợt 2 ở môi trường 80% rong giấy 26

Hình 3.16 Loại nấm mốc (verticillum fungicola) ký sinh trên nấm hoàng chi 27

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MTTT: môi trường truyền thống NT : nghiệm thức RG : rong giấy

MT : môi trường

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Nấm linh chi (tên khoa học là Ganoderma lucidum) là một loại dược liệu quý đã

được dùng trong y học cổ truyền để trị bệnh và bảo vệ sức khỏe từ lâu đời Hiện nay

có 6 loại nấm linh chi phổ biến đã được con người nghiên cứu đầy đủ và đang được

sử dụng một cách rộng rãi, đó là: linh chi trắng (Bạch chi), linh chi vàng (Hoàng chi), linh chi xanh (Thanh chi), linh chi đỏ (Xích chi), linh chi tím (Tử chi), linh chi đen (Hắc chi) Nấm linh chi có tính bình, không độc, có tác dụng làm tăng trí nhớ, dưỡng tim, bổ gan khí, an thần, chữa trị tức ngực Với hệ hô hấp có tác dụng ích phổi, thông mũi, chữa ho nghịch hơi, an thần, ích tỳ khí Nấm Linh Chi còn có các tác dụng chữa trị chứng bí tiểu, bổ thận khí, chữa trị đau nhức khớp xương, gân cốt…Acid ganoderic cũng là một trong những thành phần chủ yếu của nấm linh chi nói chung và nấm hoàng chi nói riêng Chất này có hoạt tính dược lý rất mạnh, có tác dụng giảm đau, trấn tĩnh, ức chế sự phóng thích histamin tổ chức, giải độc, bảo

vệ tế bào gan, giảm lipid máu và tiêu diệt tế bào ung thư Theo Shiao và cộng sự

(1994), dùng nấm linh chi có thể tăng khả năng miễn dịch và chữa được nhiều bệnh như: hen phế quản, huyết áp cao, mỡ trong máu, chống lão hóa, co thắt tim, an thần, đau nhức xương, phòng ngừa bệnh ung thư, tốt cho hệ tiêu hóa, hệ bài tiết… Do đó

số lượng các loài nấm linh chi dùng trong công nghệ dược liệu ngày càng tăng

Ở Việt Nam có điều kiện tự nhiên, kinh tế và xã hội thuận lợi cho việc sản xuất nấm, tuy nhiên việc phát triển nấm dược liệu còn khá chậm so với các nước trong khu vực và trên thế giới và nghề trồng nấm cũng đang đứng trước một số khó khăn như: Trình độ công nghệ của người sản xuất ở quy mô nhỏ lẻ, còn nhiều hạn chế, nhà xưởng, trang thiết bị phục vụ cho sản xuất chưa được đầu tư một cách bài bản

có hệ thống Bên cạnh đó số giống nấm đang sử dụng bị thoái hóa, thiếu nguồn giống gốc thay thế, quá trình sản xuất nhiều năm trên một diện tích dễ bị sâu bệnh phá hoại, chi phí đầu vào khá cao Việc sử dụng nguồn giá thể để trồng loại nấm

dược liệu không được phổ biến, chủ yếu trên mạt cưa cao su, gỗ lim, vỏ hạt nhãn Tuy nhiên nguồn nguyên liệu này không phải vô tận và không phải địa phương nào cũng sẵn có Theo Thạc sĩ Cổ Đức Trọng Trung tâm Nghiên cứu linh chi và nấm dược liệu TP HCM, hiện nay lượng tiêu thụ nấm linh chi ở Việt Nam hàng năm là

70 tấn Trong đó, lượng linh chi nhập về từ Trung Quốc khoảng 36 tấn, từ Hàn Quốc khoảng 17 tấn, số còn lại do trong nước sản xuất

Tại khu vực Nha Trang - Khánh Hòa cho đến nay vẫn rất ít cơ sở nuôi trồng được nấm linh chi để cung cấp cho thị trường, do đó hàng năm thị trường này phải nhập một số lượng nấm linh chi khá lớn từ nơi khác về để phục vụ nhu cầu của người dân Qua nghiên cứu về những đặc tính sinh học và sinh thái của nấm linh chi, chúng tôi nhận thấy tại khu vực Nha Trang - Khánh Hòa có đủ những điều kiện đảm bảo cho loài nấm này sinh trưởng và phát triển tốt trong việc hình thành thể quả

Trong quá trình đa dạng hóa nguồn cơ chất để trồng nấm linh chi nhằm tạo ra được sản phẩm có hiệu suất sinh học và có giá trị dược liệu cao, các nhà khoa học

đã không ngừng nghiên cứu, tìm hiểu, nuôi trồng khảo nghiệm loài nấm linh chi trên những loại giá thể khác nhau như: mạt cưa, bã mía, vỏ hạt nhãn… Tuy nhiên ở mỗi loại môi trường khác nhau thì sẽ cho giá trị sinh học nấm khác nhau

1.2 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

 Xây dựng được quy trình kỹ thuật và tạo ra một công thức mới về nuôi trồng nấm linh chi với nguồn nguyên liệu từ rong biển

 Đóng góp vào bảo tàng nguồn cơ chất một loại giá thể mà nấm linh chi có thể sinh trưởng và phát triển

 Tạo cơ sở khoa học cho tiến trình nghiên cứu về sau

 Nâng cao giá trị tiềm năng kinh tế của biển

1.3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

 Tận dụng nguồn rong Giấy dồi dào làm giá thể trồng nấm linh chi, giải quyết

bài toán ô nhiễm môi trường do rong Giấy đang gây ra

 Ứng dụng quy trình kỹ thuật, tận dụng nguồn rong để tạo ra sản phẩm Nấm hoàng chi có chất lượng tốt phục vụ đời sống

 Chuyển giao quy trình công nghệ cho người dân địa phương

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM TRÊN THẾ GIỚI

Trong số trên 2000 loài nấm lớn đã được biết đến trên thế giới có khoảng 300 loài được xếp vào nhóm nấm được dùng để làm thuốc như nấm linh chi, nấm đầu khỉ, nấm ngân nhĩ, nấm phục linh nhĩ…

Hiện nay nấm linh chi được sản xuất tập trung ở khu vực Châu Á, trong đó các nước Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc là các nước sản xuất lớn nhất

Đặc điểm của nghiên cứu khoa học về nấm dược liệu ở Trung Quốc là có sự kết hợp chặt chẽ giữa các cơ quan nghiên cứu chuyên trách và cơ quan nghiên cứu dân lập, giữa nghiên cứu và đào tạo, nghiên cứu mau chóng chuyển thành sản xuất thương phẩm

Phúc Kiến - Trung Quốc đã bỏ ra hơn 30 triệu USD nhập các loại công nghệ, thiết bị: máy hàn, thái lát, rút chân không nắn nắp, đóng túi, sấy khô…Đồng thời đi tham quan, khảo sát học tập kinh nghiệm và kỹ thuật tiên tiến của nhiều nước trên thế giới

Viện Nghiên Cứu Nấm Tam Minh đã đi sâu vào nghiên cứu phân lập nhóm nấm dược liệu thuần chủng như nấm đầu khỉ, nấm linh chi, ngân nhĩ và kỹ thuật nuôi các đối tượng này Để nhằm giảm giá thành của sản phẩm họ đã không ngừng nghiên cứu cải tiến phương pháp nuôi trồng trên bình bằng nuôi trồng trên túi polime và đã nghiên cứu thành công phương pháp lai đơn bào nhóm nấm dược liệu

để chọn loại nấm có chất lượng cao, sau đó đã sáng tạo công nghệ nuôi cấy nấm trên túi polime thay cho gỗ khúc

Tại Hàn Quốc, nấm linh chi đã được nuôi trồng nhân tạo ở quy mô lớn Ngoài phương pháp nuôi trồng trên thân gỗ, trên các bịch phụ phẩm nông lâm nghiệp đã nghiền nhỏ, còn có thể nuôi cấy chìm để thu nhận sinh khối trong các nồi lên men

1.4.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT NẤM LINH CHI Ở TRONG NƯỚC

TS NGÔ ANH khoa sinh trường ĐH HUẾ là người đầu tiên ở nước ta nuôi trồng thành công nấm hoàng chi trên giá thể mạt cưa có bổ sung hàm lượng dưỡng chất

Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thực vật (Viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam) vừa nghiên cứu thành công trồng nấm linh chi trên

bã mía, nguồn nguyên liệu dư thừa ở nhiều địa phương Nấm linh chi trồng trên bã mía cho năng suất cao

Khoa Sinh học, ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội) vừa hoàn thiện công nghệ sản xuất nấm linh chi từ bột sinh khối dạng sợi Công nghệ này gồm các bước: Tuyển chọn giống, nhân giống, xử lý nguyên liệu, phối trộn nguyên liệu, thanh trùng, cấy giống, lên men, thu hồi, sấy…Có thể nói đây là công nghệ mang tính đột phá trong ngành sản xuất nấm linh chi

TS Trương Bình Nguyên, Viện Sinh Học Tây Nguyên (Lâm Đồng), vừa thành công trong việc trồng thử nghiệm giống nấm mới có nguồn gốc từ Nhật Bản mang tên Bunashimeji, còn gọi là nấm linh chi nâu Theo đề tài “Nghiên cứu nuôi trồng loài nấm Bunashimeji tại Đà Lạt - Lâm Đồng” của TS Nguyên, khí hậu Đà Lạt rất phù hợp để trồng loại nấm này quanh năm, trừ ba tháng 5, 6, 7 khi nhiệt độ phòng lên trên 20ºC; cho kết quả về hình dáng và hàm lượng các chất protein, xơ, lipid đều đạt chất lượng cao

Nghiên cứu của Viện cơ điện và nông nghiệp: “Trồng Nấm Linh Chi trên vỏ

và hạt nhãn trên qui mô lớn” được đánh giá là mô hình sản xuất thân thiện với môi trường và cho giá trị kinh tế rất cao

1.4.3 TỔNG QUAN VỀ RONG GIẤY

Hình 1.1 Rong giấy tại bờ biển Nha Trang - Khánh Hòa

Rong Giấy (Ulva retieulata) là loài thực vật thủy sinh, có đời sống gắn liền với

nước Rong Giấy sống ở biển, hấp thụ một lượng thức ăn phong phú chảy trôi dạt từ lục địa ra, rong có nhiều tính chất không giống thực vật sống trên cạn Do đó trong rong Giấy chứa khá nhiều hàm lượng khoáng chất phù hợp cho hệ enzyme có trong nấm linh chi phân giải, chuyển hóa thành phần dinh dưỡng nuôi tơ nấm và hình thành hệ sợi cho ra quả thể Vì vậy nếu ứng dụng được nguồn nguyên liệu này làm

cơ chất cho việc trồng nấm thì sẽ không phải bổ sung một số thành phần dinh dưỡng như cám gạo, phân NPK, cám bắp Đồng thời sẽ làm sạch được bờ biển, giảm thiểu

ô nhiễm môi trường do loài rong này đang trực tiếp gây ra

Qua phân tích chúng tôi thấy thành phần hóa học của rong Giấy khá cao Kết quả thể hiện ở bảng sau:

Bảng 1.3 Thành phần sinh học của Rong Giấy

(Phân tích mẫu tại Viện CNSH & MT-Trường ĐH Nha Trang)

Tên mẫu

Chỉ tiêu phân tích Protein (%) Gluxit (%) Khoáng Ca (mg/kg)

1.4.4 TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI

1.4.4.1 Đặc điểm sinh học của nấm linh chi

* Hình dạng và màu sắc quả thể:

Nấm linh chi (quả thể) gồm 2 phần cuống nấm và mũ nấm (phần phiến đối điện với

mũ nấm)

- Cuống nấm dài hoặc ngắn, đính bên có hình trụ đường kính 0,5-3 cm

- Cuống nấm ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo Lớp vỏ cuống màu

đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm

- Mũ nấm khi non có hình trứng, màu trắng đục, lớn dần có hình quạt Trên mặt

mũ có vân gạch đồng tâm màu sắc từ vàng chanh - vàng nghệ - vàng nâu - vàng cam - đỏ nâu - nâu tím nhẵn bóng như láng vecni Mũ nấm có đường kính 2-15 cm, dày 0,8-1,2 cm, phần đính cuống thường gồ lên hoặc hơi lõm Khi nấm đến tuổi trưởng thành thì phát tán bào tử từ phiến có màu nâu sẫm

Dinh dưỡng: Sử dụng trực tiếp nguồn cellulose

* Điều kiện nuôi trồng:

- Độ thông thoáng: Trong suốt quá trình nuôi sợi và phát triển quả thể, nấm hoàng chi đều cần có độ thông thoáng tốt, nhà xưởng phải sạch sẽ, thoáng Nấm cần có oxy để phát triển vì vậy nhà trồng cần có độ thông thoáng vừa phải, nhưng phải

tránh gió lùa trực tiếp

- Ánh sáng: yếu tố này chỉ cần thiết trong giai đoạn ra quả thể nhằm kích thích nụ nấm phát triển Nhà nuôi trồng nấm cần có ánh sáng khoảng 200 – 300 lux (ánh sáng khuếch tán – ánh sáng phòng) Quá trình hình thành quả thể, nấm hoàng chi không được tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời

- Độ ẩm: độ ẩm rất quan trọng đối với sự phát triển tơ và quả thể của nấm Trong giai đoạn tăng trưởng tơ, độ ẩm nguyên liệu yêu cầu từ 50 – 60%, còn độ ẩm không khí không được nhỏ hơn 70% Ở giai đoạn tưới đón nấm ra quả thể, độ ẩm không khí tốt nhất là 80 – 95% Ở độ ẩm không khí 50%, nấm ngừng phát triển và có thể chết, tai nấm sẽ bị khô mặt và cháy vàng bìa mũ nấm Nhưng nếu độ ẩm cao trên 95%, tai nấm dễ bị nhũn và rũ xuống

- Nhiệt độ thích hợp:

Giai đoạn ủ tơ: 200

-300C Giai đoạn ra quả thể: 220

-280C

- Độ pH: Nấm linh chi chỉ thích nghi trong môi trường trung tính đến axit hơi yếu (5,5-7)

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Nấm hoàng chi

Loài nấm linh chi hiện nay có tên khoa học là: Ganoderma lucidum

Trong đề tài này chúng tôi chọn loài: Nấm hoàng chi (có tên khoa học là

Ganoderma colossum), quả thể được tuyển chọn tại bảo tàng Vườn Quốc Gia Cát

Tiên - Đồng Nai làm đối tượng nghiên cứu chính Có đặc tính sinh học khá phù hợp điều kiện ở Nha Trang - Khánh Hòa và các địa phương có khí hậu nóng ẩm

 Môi trường hạt lúa (môi trường nhân giống cấp 2): Thóc, cám gạo, CaCO3.

 Môi trường nuôi trồng ra quả thể: Rong Giấy, mùn cưa cao su, cám gạo, vôi bột Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí Nghiệm Công nghệ Sinh học (Viện Công nghệ sinh học & Môi trường – Trường ĐH Nha Trang)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Những nghiệm thức được thiết lập

Bảng 2.1 Tỷ lệ thành phần cơ chất trong các nghiệm thức

Tỷ lệ thành phần cơ chất ở các nghiệm thức (%) Nước

sạch Mạt cưa Bột đậu

tương

Cám gạo

2.2.2 Dự kiến quy trình thực nghiệm nghiên cứu trồng nấm linh chi trên giá thể rong Giấy và phụ liệu

2.2.2.1 Phân lập giống nấm hoàng chi cấp 1 bằng phương pháp tách mô vô trùng

Môi trường thạch là môi trường dùng để nhân giống cấp 1 trong sản xuất và cũng là

môi trường dùng để giữ giống, ở đây là môi trường PGA cải tiến

Công thức môi trường PGA cải tiến:

- Nước chiết (*) 1 lít

- Glucose 20 g

- Cao nấm men 1g, Agar 20g (*) Nước chiết gồm có: 100g giá đỗ, 200g khoai tây, 100g cà rốt

Môi trường PGA cải tiến được thực hiện như sau: Khoai tây, cà rốt, giá đỗ được gọt

vỏ, rửa, cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nước, đun sôi khoảng 20 phút, lọc lấy nước chiết và bổ sung nước cất cho đủ 1 lít Sau đó bổ sung thêm agar và cao nấm men, đun cho các chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng

500C (áp vào má có thể chịu được) đem rót vào trong các ống nghiệm, và bình tam giác, dùng để phân lập, cấy chuyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm Với ống nghiệm rót 1/3 ống chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác thì đổ dày khoảng 1 cm Không đổ môi trường vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi nước sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ướt bề mặt thạch Cũng không đổ môi trường khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trường đã bị đông vón lại Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1oC (2500F), 1atm trong 25 phút sau đó để nguội

Để nhân giống đối tượng nghiên cứu trên môi truờng thạch chúng tôi tiến hành làm như sau:

- Cấy các giống đã phân lập được từ ống giống thuần chủng sang các bình tam giác và ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn

- Ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 26 – 30oC, quá trình

ủ tiến hành trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ (ánh sáng phòng đọc)

- Sau 2 ngày tơ nấm bắt đầu bung ra có màu trắng yếu, trong 2-4 ngày tơ nấm còn yếu nhưng sau khoảng 1 tuần lễ thì tơ bắt đầu bung mạnh, 15 ngày sau ta có thể cấy truyền sang môi trường cấp 2

2.2.2.2 Nhân giống nấm hoàng chi trên môi trường hạt lúa cấp 2

Môi trường hạt lúa có bổ sung cám gạo là môi trường chúng tôi chọn để nhân giống cấp 2 đối với đối tượng trên

- Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng, sau khoảng 3 tuần lễ thì tơ nấm lan kín đáy bình và có thể chuyển sang môi trường ra quả thể

2.2.2.3 Xử lý nguyên liệu rong Giấy và phụ liệu

- Rong giấy thu từ bờ biển Nha Trang – Khánh Hòa được xử lý sơ bộ bằng nước ngọt

- Mạt cưa sàng qua bằng rây lỗ nhỏ để loại bỏ các mảnh gỗ vụn, mang ủ trong 3-5 ngày

2.2.2.4 Hấp vô trùng tạo bịch phôi và cấy từ môi trường hạt qua

Nguyên liệu sau khi đã được phối trộn và tạo độ ẩm thích hợp, ta cho vào túi nilon chịu nhiệt, nghiệm thức truyền thống có trọng lượng 900 (g), nghiệm thức bổ sung rong có trọng lượng 600 (g) dùng nút cao su chịu nhiệt làm cổ túi và lấy bông gòn không thấm nước làm nút bông Bịch nguyên liệu phải được đóng căng các góc Sau đó mang những bịch môi trường hấp ở nồi Autoclave trong 40 phút, hấp làm 2 lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ Bịch hấp xong, để nơi sạch sẽ trong 12-24 giờ, chờ nguội rồi mới cấy Chúng tôi đã tiến hành đo nồng độ pH của bịch phôi, kết quả cho thấy pH là 6 - 6,5 Chúng tôi tiến hành cấy giống trong tủ cấy vi sinh vô trùng

 Bịch đem ủ có thể xếp trên kệ và treo lên giàn, tuyệt đối không chồng chất lên nhau thành nhiều lớp, thời gian ươm kéo dài khoảng 25- 40 ngày, sợi nấm phát triển, ăn dần vào bịch nguyên liệu tạo nên màu trắng đồng nhất, bịch rắn chắc nhìn rất đẹp

 Tưới nước: khi nấm bắt đầu nhú ra khỏi miệng cổ nút bông, tiến hành tưới nước bên ngoài bịch nấm, về nguyên tắc tưới nấm ở dạng phun sương, trung bình mỗi ngày tưới 2-3 lần tùy theo độ ẩm môi trường

 Thu hái nấm: nấm linh chi ra ở dạng 1 tai xòe ra ở đầu cổ bông, hái nấm đúng tuổi sẽ cho năng suất cao, chất lượng tốt

2.2.3 Phương pháp thu nhận kết quả

Mẫu được lấy theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

Tất cả số liệu thực nghiệm được đo 3 lần bằng thước, đơn vị cm Lấy giá trị trung bình Hiệu suất sinh học của nấm hoàng chi trên giá thể là tỷ lệ giữa lượng thể quả thu hoạch/trọng lượng cơ chất

Khi nấm ra và đạt kích thước tối đa, bắt đầu có biểu hiện già ta tiến hành thu hái Quan sát hình thái bên ngoài, cắt ngang quả thể, đo chiều dài của tai nấm, chiều dài phi cuống nấm và tiến hành cân

Phân tích thành phần khoáng Ca, K của nghiệm thức chính

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng bảng tính Microsoft Excel 2003

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả nuôi trồng thực nghiệm

Để bước đầu khảo sát quy trình nuôi trồng, so sánh sự phát triển của tơ nấm trên môi trường truyền thống và môi trường mới, chúng tôi tiến hành trồng thử nghiệm nấm hoàng chi với các nghiệm thức trên môi trường mới như đã nêu trong phần phương pháp

3.1.1 Kết quả phân lập giống cấp 1 bằng phương pháp tách mô vô trùng

Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, nấm hoàng chi (Ganoderma colossum) được phân lập

trên môi trường thạch PGA cải tiến, các mẫu không bị nhiễm bắt đầu có sợi nấm phát triển bao phủ xung quanh bề mặt mẫu sau 3-4 ngày cấy Thu được giống cấp 1 Phương pháp phân lập giống như sau:

Từ tán nấm tươi thu hái, dùng nước cất rửa 2 - 3 lần cho sạch, dùng bông thấm cồn 70 độ lau nhanh qua mặt ngoài tán nấm

Đưa vào tủ cấy vô trùng dùng dao gọt bỏ toàn bộ phần bên ngoài của nấm, tách lấy phần mô vô trùng bên trong, cắt thành miếng mẫu bằng hạt gạo, chuyển vào môi trường đã chuẩn bị ở trên, đem ủ trong tối ở nhiệt độ 270

C

Đối với loài nấm linh chi thì việc phân lập trên môi trường thuần khiết khá dễ dàng, chỉ sau 2 ngày thì tơ đã bắt đầu bung sợi Khảo sát khả năng trưởng hệ sợi nấm trên môi trường PGA cải tiến ở nhiệt độ phòng (27±20C) Đây là môi trường tối ưu cho việc nhân giống cấp 1, bởi lẽ đây là môi trường có chứa nhiều dinh dưỡng và cũng là môi trường được thuần khiết nhất

Hình 3.1 Nấm hoàng chi sau 5 ngày phân lập trên môi trường thạch

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn tốc độ lan tơ nấm trên môi trường thạch

0 2 4 6 8 10

Nhận xét: Sau 2 ngày phân lập, tơ nấm bắt đầu bung ra và phủ kín toàn bộ mô cấy,

tuy nhiên các sợi tơ nấm còn mỏng nên chưa bám vào bề mặt môi trường Nhưng từ ngày thứ 3, sợi tơ nấm bắt đầu phát triển và tơ ăn lan xuống bề mặt của môi trường thạch khá nhanh, sợi tơ nấm mọc ra có màu trắng như bông Các ngày tiếp theo tơ nấm phát triển khá nhanh và sau 7 ngày hệ tơ nấm đã phát triển gần kín bề mặt thạch Thời gian phát triển mạnh nhất của hệ tơ nấm vào ngày thứ 5 và thứ 6, sau ngày thứ 9 thì tổ chức của hệ sợi đã bệt lại khá chặt chẽ và có xu hướng lan chậm, trong khoảng thời gian này hệ sợi đã ăn sâu xuống bề mặt thạch Như vậy, trong giai đoạn này chúng ta có thể cấy truyền sang môi trường hạt lúa cấp 2 hoặc giữ trong tủ lạnh để làm giống gốc

Cần chú ý là nấm hoàng chi phát triển trong pha sợi rất kỵ ánh sáng, và tính chất này thể hiện rõ ở hầu hết các loài Linh chi, khi đặt các ống nghiệm có sợi nấm đang phát triển ra ngoài ánh sáng nhất là ánh sáng trực tiếp từ mặt trời thì sợi nấm ngả vàng rất nhanh, có lẽ đây là một hình thức tự bảo vệ của sợi nấm trước các tia bức xạ nói chung và của ánh sáng mặt trời nói riêng Do đó chúng tôi đề nghị là khi phân lập, nhân giống nấm hoàng chi trên môi trường thạch thì tuyệt đối không đưa

ra ngoài ánh sáng nhất là ánh sáng mặt trời

3.1.2 Kết quả nhân giống trên môi trường hạt lúa

Sau khi phân lập thành công giống cấp 1 trên môi trường thạch, chúng tôi tiếp tục cấy truyền để tạo giống cấp 2 trên môi trường hạt lúa để làm meo giống cấy trên môi trường ra quả thể Đây là môi trường dễ kiếm, dễ thực hiện và cũng là môi trường có thể cung cấp số lượng nhiều mà tiết kiệm được chi phí

Để nghiên cứu tốc độ lan của tơ nấm trên môi trường, chúng tôi tiến hành cấy giống nấm đã phân lập được trên môi trường thạch vào các chai có chứa môi trường hạt lúa và cơ chất bổ sung (công thức môi trường xem phụ lục 2) Tiến hành theo dõi và thu nhận kết quả

Hình 3.3 Giống nấm hoàng chi trên môi trường hạt sau 12 ngày cấy

truyền từ môi trường thạch cấp 1

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tốc độ tơ nấm trên môi trường hạt lúa

0 2 4 6 8 10