nghiên cứu công nghệ nhân sinh khối chế phẩm nấm công trùng beauveria bassiana để phòng trừ rệp sáp hại cà phê

Trước thực trạng trên, chúng tôi thiết nghĩ cần phải tiến hành nghiên cứu thực hiện ñề tài: “ Nghiên cứu công nghệ nhân sinh khối chế phẩm nấm công trùng Beauveria bassiana ñể phòng trừ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này, lời ñầu tiên em xin gửi lời cảm

ơn chân thành và sâu sắc nhất ñến ThS Phạm Văn Nhạ - Trung tâm ñấu tranh Sinh học – Viện Bảo Vệ Thực Vật ñã tận tình dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn, ñộng viên và giúp

ñỡ em hoàn thành khóa luận này Em cũng xin ñồng cảm ơn tới toàn thể các bác, các cô, các anh và các chị ñã chia sẻ những kinh nghiệm trong công tác cũng như trong cuộc sống, tạo mọi ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ em suốt quá trình thực tập

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong ban giám hiệu Viện ðại Học Mở Hà Nội, ñặc biệt là các thầy cô trực tiếp giảng dạy tại khoa Công Nghê Sinh Học – Viện ðại Học Mở

Hà Nội ñã truyền ñạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt bốn năm học vừa qua

Con xin nói lên lòng biết ơn ñối với Ông bà, Cha mẹ cùng toàn thể gia ñình luôn là nguồn chăm sóc, ñộng viên trên mỗi bước ñường học vấn của con

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến các anh chị và bạn bè ñã luôn ủng hộ, giúp

ñỡ, khích lệ em trong thời gian học tập và nghiên cứu

Mặc dù em ñã cố gắng hoàn thành luận văn trong phạm vi và khả năng cho phép nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót Em kính mong nhận ñược sự cảm thông và tận tình chỉ bảo của quý Thầy Cô và các bạn

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2010 Sinh viên

Trần Thái Giang

MỞ ðẦU

1 ðặt vấn ñề

Cây cà phê thuộc họ Thiên thảo (Rubiaceae), là mặt hàng lớn thứ hai của các nước ñang phát triển, chỉ sau dầu mỏ và hiện ñang có mặt ở tất cả các châu lục Việt Nam còn là thành viên quan trọng của tổ chức Cà phê thế giới (ICO), nhưng lượng cà phê xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là ở dạng nguyên liệu, chưa qua chế biến sâu Vì vậy mà người tiêu dùng trên thế giới vẫn chưa biết nhiều ñến sản phẩm cà phê qua chế biến của Việt Nam Theo số liệu thống kê, tính ñến tháng 3/2010, lượng cà phê xuất khẩu của Việt Nam chỉ ñạt 345 nghìn tấn, giảm 22% so với cùng kì năm trước, trị giá là 483 triệu USD Như vậy, lượng và trị giá xuất khẩu cà phê của Việt Nam trong quý I/2010 ñạt mức thấp nhất so với cùng kì 3 năm trở lại ñây Nhận thấy ngành cà phê Việt Nam ñang ñứng trước các thử thách là suy giảm khả năng cạnh tranh trên thị trường quốc tế như: Chất lượng sản phẩm chế biến còn nhiều ñiểm bị khách hàng chê trách Một trong những lí do dẫn ñến yếu kém nêu trên là: Diện tích cà phê phát triển với tốc ñộ quá nhanh trong khi cơ sở phục vụ sản xuất chưa phát triển tương xứng Ngoài ra do mở rộng diện tích cà phê nhanh chóng ñã có nhiều các dịch hại cà phê phát triển nhanh, với nhiều chủng loài, mức ñộ và tỷ lệ gây hại ngày càng lớn ðể phòng trừ dịch hại, hạn chế những thiệt hại do dịch hại gây nên giúp làm tăng năng suất và chất lượng nông sản, người nông dân áp dụng nhiều biện pháp BVTV khác nhau như biện pháp thủ công, canh tác, vật lí, hóa học…chủ yếu vẫn dựa vào thuốc hóa học, liều lượng và số lần phun năm sau cao hơn năm trước, việc làm ñó ñã dẫn ñến nhiều vấn ñề mới nảy sinh, rất phức tạp và không thể giải quyết ñược, như nhiễm ñộc môi trường, nhiều loại sâu hại mới phát triển tái phát với mức ñộ trầm trọng hơn sau một khoảng thời gian sử dụng thuốc hóa học Chỉ tính riêng vùng cà phê ðắk Lắk hàng năm có hàng chục ngàn ha bị hại do rệp

sáp Rệp sáp hại tất cả các bộ phận trên mặt ñất và dưới mặt ñất của cây cà phê Nhiều diện tích cà phê khi nở hoa ñậu quả bị nhiễm rệp sáp làm rụng hết quả Bởi vậy việc áp dụng biện pháp phi hóa học ñể trừ dịch hại nói chung và nấm gây bệnh cây trồng nói riêng nhằm khắc phục các nhược ñiểm của biện pháp hóa học và ñáp ứng yêu cầu nông nghiệp sạch là một ñòi hỏi cấp thiết hiện nay Phòng trừ sâu hại bằng biện pháp tổng hợp ñã ñáp ứng ñược yêu cầu trên trong

ñó thuốc trừ sâu sinh học có ưu ñiểm ñó là:

- Không gây ñộc hại tới người, vật nuôi và môi trường

- Không làm mất ñi khu hệ sinh vật và kí sinh tự nhiên có lợi cho con người

- Thuốc trừ sâu sinh học có thể tích lũy và gây chết cho thế hệ sau hại ở lứa sau Với ñặc thù của vườn cà phê là cây trồng lâu năm, có tán lá xum xuê, ñây là ñiều kiện thuận lợi ñể nấm kí sinh côn trùng tồn tại và phát tán Trước thực trạng trên, chúng tôi thiết nghĩ cần phải tiến hành nghiên cứu thực hiện ñề tài:

“ Nghiên cứu công nghệ nhân sinh khối chế phẩm nấm công trùng Beauveria

bassiana ñể phòng trừ rệp sáp hại cà phê”

2 Mục ñích

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố ngoại cảnh ñến sự sinh trưởng

phát triển của nấm Beauveria bassiana trên môi trường nhân tạo

- Tìm hiểu khả năng phân giải cơ chất các enzym ngoại bào của nấm

Beauveria bassiana ñược nuôi cấy trên các môi trường khác nhau

- Hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana ñối với rệp sáp hại cà

phê trong nhà lưới

- đánh giá khả năng phân giải cơ chất của enzym ngoại bào của nấm

Beauveria bassiana

- đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana ựối với rệp sáp

hại cà phê trong phòng thắ nghiệm

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I.1 Những công trình nghiên cứu và ứng dụng vi nấm Beauveria bassiana ở

Beauveria bassiana

1 Khả năng ñồng hóa các nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, ñạm

Dinh dưỡng Cacbon: Beauveria bassiana sử dụng hầu hết các nguồn thức

ăn cacbon mà các vi nấm khác vẫn thường sử dụng Thức ăn Cacbon dùng làm nguồn năng lượng và vật liệu xây dựng tế bào ñối với nấm có thể sử dụng như các loại: monosacarit, olygisacarit, polysacarit…Nhiều loại nấm còn có khả năng ñồng hóa các hợp chất hữu cơ rất bền vững, thậm chí rất ñộc với nhiều sinh vật khác (các hợp chất n – ankal, ancaloit, phenol, sterin, nhiều chất kháng sinh, nhiều ñộc tố, nhiều hợp chất tactam, flavon…)

Các loài nấm thường không có những ñòi hỏi khắt khe lắm ñối với một loại thức ăn cacbon nào ñấy Chúng thường có khả năng sử dụng nhiều loại hợp chất cacbon khác nhau, nhưng cũng có thể là loại hợp chất này ñược ñồng hóa tốt hơn loại hợp chất khác Có nhiều trường hợp là có mặt trong môi trường vài nguồn cacbon khác nhau, nấm sẽ phát triển mạnh mẽ hơn khi chỉ có riêng từng

loại một Các công trình nghiên cứu của Morhan, Hegedus và CS về Beauveria

bassiana ñã xác ñịnh môi trường tốt nhất ñể phân lập là môi trường chứa kitin

làm nguồn Cacbon

ðể thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau, nấm thường có những nhu cầu về các nguồn thức ăn Cacbon khác nhau Một loại ñường có thể thích hợp cho sự hình thành hệ sợi nhưng chưa chắc ñã thích hợp cho sự hình thành cơ quan sinh sản hay tích lũy các chất chuyển hóa nào ñó Sự sinh trưởng tối ña của

hệ sợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối ña các sản phẩm trao ñổi chất Trên nguồn thức ăn phức tạp như: tinh bột, xenllulo, kitin…trước tiên nấm sinh ra các enzym ñể phân hủy chúng thành hợp chất ñơn giản dễ ñồng hóa

Nhiều tác giả khẳng ñịnh rằng trong quá trình xâm nhập của nấm Beauveria

bassiana vào cơ thể côn trùng trước tiên phân hủy Cutin lớp da côn trùng, sau ñó

là sự phân hủy mô, ñồng thời phá hủy lipit

Mỗi loài nấm thường có quan hệ khác nhau ñối với nguồn thức ăn Cacbon

Khi cấy Beauveria bassiana trên các môi trường chứa nguồn cacbon khác nhau

cho thấy: chúng ñồng hóa tốt các loại ñường Glucoza, Maltoza, Saccaroza ðồng hóa yếu ớt ñường Rafinoza

Mối quan hệ giữa nguồn thức ăn cacbon với sự phát triển và hình thành

bào tử nấm Beauveria bassiana là ñề tài của nhiều tác giả Trong ñó công trình nghiên cứu của Horhan, Hegedus và CS ñã xác ñịnh lượng bào tử của Beauveria

bassiana sản sinh cao nhất sau 2 ngày nuôi cấy chìm trong môi trường chứa N -

acetyl – D – glucosamine ( GlucNAc ) là 8.9x10 BT/ml và môi trường kitin là nguồn cacbon duy nhất Thành phần kitin trong môi trường nuôi cấy rất cần thiết ñối với vi nấm diệt côn trùng Kitin giúp cho sự phát triển và hình thành bào tử

ñính (Conidiospore), bào tử chồi ( Blastospore) của nấm

Dinh dưỡng ñạm: quá trình nảy mầm, sinh trưởng và hình thành bào tử,

Beauveria bassiana sử dụng cả nirat và nitrogen ammonium Trong nguồn

nitrogen ñã thử, chỉ có cystein ức chế cả sinh trưởng và hình thành bào tử Các vitamin ñã thử cũng không thấy làm tăng sinh trưởng và hình thành bào tử của nấm này Nhìn chung vi nấm có thể sử dụng cả nguồn thức ăn Nitơ vô cơ lẫn hữu

cơ Nguồn thức ăn Nitơ mà vi nấm thường ñòi hỏi là protein ðặc biệt protein từ

cơ thể côn trùng là nền cơ chất giàu chất dinh dưỡng nhất cho chúng sinh trưởng

và phát triển Các loại pepton, cao nấm men, dịch thủy phân protein hoặc hỗn hợp ñầy ñủ các axit amin và vitamin cũng là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển thì Glutamic và Asparaginic là thích hợp nhất

Nguồn nitơ vô cơ mà vi nấm có khả năng sử dụng chủ yếu là muối amon

và nitrat

2 Một số yếu tố và ñiều kiện môi trường cơ bản ảnh hưởng ñến sự sinh

trưởng và phát triển của nấm Beauveria bassiana

Các ñiều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm là nhiệt ñộ, ñộ ẩm, pH môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy Quá trình xử lí ñất sử dụng phân bón hữu cơ thuốc trừ sâu hóa học ñều ảnh hưởng tới

sinh trưởng và phát triển của các chủng vi nấm trong ñất (Beauveria bassiana,

Metarhizium anisopliase…) Gần ñây Stathers và cộng sự ñã công bố những kết

quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên sự sinh trưởng và phát triển của

nấm gây bệnh côn trùng Các tác giả tập trung nghiên cứu các chủng Beauveria

bassiana , B.brongniartii, M.anisopliase, M flavoviridae, Verticillium lecanii và

P farinosus và P cicade ðể xác ñịnh ñiều kiện ẩm ñộ, hai tác giả Grafek và

Sobczak ñã theo dõi sự sinh trưởng và hình thành bào tử nấm Beauveria bassiana

trên môi trường rắn Czapek - Dox với bổ sung nước không ñồng ñều Rombach, Basto Cruz và CS, Hegedus và CS, Miao và CS, Jenking và Prior, Shimazu và

CS sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm (submerged) ñã thu ñược những kết quả khả quan Trong nuôi cấy chìm, người ta ñã xách ñịnh ñược khả năng sinh bào tử

chồi và lượng sinh khối ra từ hai chủng nấm Beauveria bassiana và Metarhizium

anisopliase

pH, ñộ ẩm, oxy cũng như các chất dinh dưỡng khác ñều rất cần thiết cho

quá trình nuôi cấy vi sinh vật Với vi nấm diệt côn trùng Beauveria bassiana ,

các yếu tố này không những ảnh hưởng rất lớn ñến quá trình sinh ñộc tố mà còn quyết ñịnh mức ñộ tử vong của côn trùng

Trong ñiều kiện phòng thí nghiệm ở Canada, Khachatourians cũng sử dụng

5 chủng Beauveria (B bassiana, B Brongniartii, B cylindrospora, B densa và

B nivea), 1 chủng Paecilomyces farinosus và 1 chủng Verticillium lecanii ñể thử

ñộc tính của chúng ñối với châu chấu Melanoplus sanguinipes, và cho kết quả về nồng ñộ dịch huyền phù bào tử các nấm này là 5.5x106 – 5.5x107 br/ml Kết quả

LT50 của các chủng B.bassiana là 4.13 ñến 4.15 ngày và LT50 của hai chủng B

brongniartii là 8.94 ñến 20.08 ngày

ðể kích thích sự nảy mầm, sinh trưởng, phát triển và hình thành bào tử (conidia) của vi nấm, còn phải kể ñến yếu tố vật lí Một số tác giả Trung Quốc

như Zhang và CS ñã dùng tia cực tím UV ñể gây ñột biến Beauveria bassiana và

B tenella( phân lập từ: Holotrichia porallena) ñã nhận thấy rằng khả năng hình

thành bào tử và khả năng lây nhiễm bệnh tăng lên

3 ðặc ñiểm sinh lí, sinh hóa của Beauveria bassiana (thuộc chi Beauveria

trong hệ thống vi nấm thuộc lớp nấm Bất toàn – Fungi Imperfecty – Deuteromycates)

a) Giới thiệu chung về lớp nấm Bất toàn

Nấm Bất toàn gồm những loại vi nấm có sợi nấm ngăn vách, sinh sản vô tính bằng BTT Hiện nay người ta xếp vi nấm có bào tử thực vào lớp nấm Bất toàn

Các ñặc ñiểm hình thái cấu tạo của sợi nấm, của bào tử và cơ quan sinh bào tử là những ñặc ñiểm phân loại quan trọng của nấm Bất toàn Ở nấm Bất toàn bào tử thực (sporum verum) là BTT (conidi) BTT và cơ quan sinh bào tử thực là một trong các ñặc ñiểm ñể sử dụng trong phân loại vi nấm

Hughes (1953) ñề nghị một hệ thống gồm 9 tip phát sinh BTT của nhóm Hyphomycetes Nhiều nhà nấm học ở các nước khác nhau ñã công nhận hệ thống này

Một ñặc ñiểm quan trọng nữa của nấm Bất toàn là cơ quan sinh BTT Cơ quan này là giá BTT – là các nhánh sợi nấm phân hóa hình thái ít hay nhiều, có khả năng trực tiếp sinh bào tử trần Về mặt hình thái người ta phân biệt hai loại giá BTT:

- Giá BTT không phân hóa hình thái ngắn và có ñường kính bằng hoặc nhỏ hơn ñường kính của sợi nấm

- Giá bào tử trần phân biệt về hình thái rõ rệt với sợi nấm, loại này có thể ngăn vách hoặc không ngăn vách Có tế bào sinh bào tử không phân hóa như

Cladosporium spp ,có tế bào phân hóa thành các dạng hình thái ñặc biệt như thể

bình ở Phialophora, Metarhizium…

Căn cứ vào kiểu tạo thành BTT của tế bào sinh BTT người ta phân biệt các kiểu tế bào phát sinh BTT là kiểu tản (thallic) và kiểu chồi (blastic) Nếu tế bào sinh BTT thuộc kiểu chồi trong nhưng BTT bị ñẩy ra ngoài qua một miệng nhỏ

và tạo thành chuỗi hướng gốc, người ta gọi kiểu chồi trong này là thể bình Một

số nhà nấm học ñã dùng các kiểu tế bào sinh BTT làm ñặc ñiểm phân loại cơ bản của nấm Bất toàn Theo hệ thống phân loại hình thái (cơ bản vẫn là hệ thống phân loại của Saccardo 1880,1886) Lớp nấm Bất toàn ñược chia làm 4 bộ, trong

ñó bộ nấm Bông (Moniliales, Hyphomycetes) có số loài ñông nhất (khoảng 7500 loài) và ñược chia làm 4 họ căn cứ vào màu sắc hệ sợi và BTT và ñặc ñiểm hình thái học của giá BTT

b) ðặc ñiểm chi Beauveria Vuill 1912

Như ñã trình bày ở trên chi Beauveria và loài Beauveria bassiana (Bals)

Vuill có nhiều tên khác nhau Nhưng từ 1912 trở lại ñây ñã ñược nhiều nhà nấm

học thống nhất công nhận và sử dụng tên Beauveria bassiana (Bals.) Vuill trong

khóa phân loại lớp nấm Bất toàn và nhóm Hyphomycetes

Chi Beauveria có khuẩn lạc phát triển chậm, nuôi cấy trên môi trường

Sabouraud – agar ở nhiệt ñộ 200C trong 10 ngày, ñường kính khuẩn lạc không vượt quá 2cm, có lông tơ dạng len, lúc ñầu trắng, dần dần trở nên hồng, hơi vàng

- Tế bào sinh BTT ñơn ñộc, trong vòng xoắn, phát sinh từ sợi sinh dưỡng hoặc mọc thành từng ñám có cuống phình ra Tế bào sinh BTT có hình dạng gần cầu, elip hoặc hình trụ và dạng chỉ dài

- Cuống tế bào sinh BTT có hình zic – zắc nhưng là mẩu dạng răng nhỏ, phát sinh, sự kéo dài của gốc ghép

- Bào tử dạng cầu hoặc elip trong suốt, không ngăn vách, có 3 loài trong số

ñó có 2 kí sinh trên côn trùng là B bassiana (Bals.) Vuill và B rongniartii

(Sacc.) Petch Các loài này ñều ñược ñiều tra thu thập phân lập từ côn trùng

c) ðặc ñiểm phân loại Beauveria bassiana (Bals.) Vuill 1912

- Khuẩn lạc trên môi trường Sabouraud trong 8 ngày ở nhiệt ñộ 200C có ñường kính 0.6x2.3 cm, dạng xốp như len, mọc thành khóm, thường sinh ra rất nhiều ñính bào tử

- Bó cuống ñính bào tử to tới 5mm ñầu tiên trắng, sau thường trở thành vàng hoặc hồng

- Tế bào sinh BTT dạng gần cầu tới hình chai, tế bào phía dưới phình to ra

ra 3 – 6 x 2.5 – 3.5 µm Khi kéo dài thời gian nuôi cấy trong môi trường, những

tế bào sinh BTT sẽ mảnh hơn và kết chặt hơn với nhau

- Bào tử hình cầu vách nhẵn, trong suốt, ñường kính 2 – 3µm gần giống

với bào tử của Codycep

B.bassiana rất dễ lẫn với Tolypocladium injlatum W.Gams ở trong ñất bởi

có hình thái khuẩn lạc và tế bào sinh BTT giống nhau Nhưng ở Tolypocladium

injlatum lại hình thành bào tử thể bình

Beauveria bassiana ñã ñược nhiều tác giả xác ñịnh là tác nhân gây bệnh

nấm trắng cho tằm và nhiều loại côn trùng khác trong các bộ Coleoptera, Lepidoptera, Diptera

d) ðặc ñiểm sinh lí, sinh hóa của Beauveria bassiana

Trong môi trường nuôi cấy thể dịch, người ta ñã xác ñịnh lipit trung tính

và lipit quay cực chứa các axit như palmitric, oleic và linoleic, linoleuic Shimizu

và CS ñã xác ñịnh hệ thống enzym của Beauveria bassiana có khả năng phân

hủy biểu bì và protein của côn trùng James và CS xác ñịnh bản chất của toxin sinh ra trong quá trình trao ñổi chất là vòng peptit Sắc tố vàng (tenellin, basianin) có thể là do hydroxylat progesterone và những phần nhỏ tách ra từ testoteron (C19H28O2) sinh ra

Trên môi trường thạch, bào tử bắt ñầu hình thành sau 6 ngày, trong khi ñó trên môi trường dịch thể, có lắc hay khuấy, chỉ sau 3 ngày sẽ sinh ra bào tử chồi (blastospores) phát triển với vách nhẵn rộng 3 – 5x2 – 3µm BTT nảy mầm ở nhiệt ñộ tối ưu là 25 – 280C, nhiệt ñộ thấp nhất là 100C và cao nhất là 320C Dưới

100C và trên 350 C, bào tử không thể này mầm ñược Bào tử có thể chết ở nhiệt

triển là 5.7 ÷ 5.9 pH phù hợp ñể hình thành bào tử là 7 – 8 Beauveria bassiana

phát triển tốt trên môi trường có maltose, sucrose và các ñường khác Nguồn nitơ

là axit glutamic và axit asparatic, muối oxalase, citrate hoặc tartrate McLeod và Hoong ñã giới thiệu một môi trường tốt nhất cho sinh trưởng của nấm có thành phần (%) : cao ngô – 2; glucose – 2.5, tinh bột – 2.5, NaCl – 05; CaCO3 – 0.2

Sản phẩm của nấm là lipaza, proteaza, ureaza, amylaza, chitinaza, cellulaza và 1.2 – β glucanaza

Beauveria bassiana ñược phân lập chủ yếu từ côn trùng thuộc các bộ

Coleptera Lepidoptera và Diptera Ngoài ra B bassiana còn phân bố rộng rãi

trong tự nhiên từ vùng núi có tuyết phủ tới ñất bỏ hoang, ñất ñầm lầy, ñất ñồi

savan, ựất rừng, ựất trồng trọt B bassiana có thể phân lập từ rễ cây trong than bùn, rễ cỏ ba lá, ngay cả từ phân ựộng vật cũng gặp B bassiana Trong ựất 80C

có tới 90% bào tử sống sót (có khả năng nảy mầm) sau 365 ngày Trong ựất cát ở

200C bào tử cũng có khả năng nảy mầm cho tới 36 tháng Trong ựất thường xuyên chiếu tia X với cường ựộ 278 RH, bào tử nấm có thể sống với 7 năm do sự

phân bố rộng rãi với phổ tác dụng trên côn trùng khá phong phú, Beauveria

bassiana ựã ựược ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực phòng trừ sinh học ựối với côn

trùng có hại

I.1.2 Nghiên cứu về ựộc tố và cơ chế tác ựộng của nấm Beauveria bassiana

trên cơ thể côn trùng

1 Cơ chế gây bệnh nấm

Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là lây lan từ con ốm sang con khỏe thông qua va chạm trực tiếp với nhau hay qua thức ăn chứa mầm bệnh Việc truyền bệnh theo con ựường ựẻ trứng của kắ sinh hầu như không ựáng kể Bệnh nấm rất

dễ truyền bằng những va chạm ựơn giản mà một số bệnh khác không thực hiện ựược Khi lây lan bằng gió, các bệnh nấm tạo thành những ổ bệnh kéo dài theo chiều gió thường thổi

Những bào tử trên thân côn trùng nhờ gió bay ựi và rơi vào cơ thể côn trùng khác Từ ựó bào tử nấm nảy mầm, hệ sợi phát triển tới mức phủ kắn các lỗ thông hơi trên cơ thể côn trùng Quá trình sinh trường, phát triển của bào tử và hệ sợi nấm ăn sâu vào cơ thể côn trùng là quá trình trao ựổi chất của nấm đã có nhiều công trình nghiên cứu về những sản phẩm trao ựổi chất khi nuôi cấy

Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae trên môi trường nhân tạo Chắnh

trong quá trình bào tử nảy mầm ựã tiết ra một phức hệ enzyme ngoại bào phân giải kitin, protein và lipitẦ Tiếp theo giai ựoạn mô và tuyến mỡ bị hòa tan bởi protcaza là giai ựoạn nhiễm trùng máu của côn trùng ựó là hiện tượng limfo chứa

ñầy sợi nấm hoặc những giai ñoạn khác của nấm Chỉ ñến khi hồng cầu trong cơ thể côn trùng bị phá vỡ thì côn trùng mới chết Lúc này nấm vẫn tiếp tục phát triển và sinh trưởng trên xác côn trùng là nền cơ chất giàu chất dinh dưỡng ñể nấm tiếp tục phát triển sang pha hoại sinh và phát triển ra bề mặt cơ thể côn trùng

và sinh bào tử

2 ðộc tố của nấm Beauveria bassiana

Khả năng sinh ñộc tố là một ñặc tính sinh hóa quan trọng , cùng với khả năng phân giải các chất của hệ enym ngoại bào, nó là cơ sở của cơ chế lây nhiễm bệnh nấm côn trùng

ðộc tố của vi nấm là một trong những sản phẩm trao ñổi thứ cấp không ổn ñịnh Chúng ñược sinh ra nhờ quá trình chuyển hóa hoa sính ñặc biệt các chất trao ñổi sơ cấp và ñược tích lũy vào cuối giai ñoạn trưởng thành khi nguồn thức

ăn cũng như năng lượng cạn dần Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp

là ñặc tính sinh lí ổn ñịnh của từng loài

Trên thế giới ñã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh ñộc tố và

sản phẩm trao ñổi chất của nấm B bassiana trên môi trường nhân tạo Bằng

phương pháp phân tích, chiết rút McLeod và Hoog ñã xác ñịnh sản phẩm chuyển

hóa của B bassiana là lipaze, ureaze, proteaze, amylaze, chitinaze, cellulaze và

1,2 – B glucan ðộc tố sinh ra từ chúng là vòng peptit isarolid và beauveridin

ðộc tố của nấm B bassiana là Bovericin có công thức nguyên là C45H57O9N3 , ñây là vòng Depxipeptid có ñiểm sôi là 93 – 940C, nếu nuôi cấy trong 1lít môi

trường người ta sẽ thu ñược : 1.5 – 3.8g Brovericin Sản phẩm của B bassiana

còn là những axit hữu cơ ( axit oxalic và axit citric) khi nuôi cấy trên môi trường

có chứa kitin

3 Hệ enzym ngoại bào của Beauveria bassiana và cai trò của chúng trong cơ

chế diệt côn trùng

Các enzym trên mặt ngoài của thành tế bào và ở ngoài tế bào (xenlulaza, amylaza, lipaza và kitinnaza…) là một trong những hợp chất là thành phần cấu tạo hoặc những sản phẩm trao ñổi chất của tế bào vi nấm và xúc tác cho quá trình thủy phân các cơ chất hữu cơ (lớp biểu bì, lơp mô, mỡ, lymphô, ruột…) của côn

trùng Trong số các enzym ngoại bào ñó của B bassiana thì enzym phân giải

protein và kitin trong lớp da côn trùng ñược nghiên cứu nhiều hơn cả

Chaenley, Leger, Pinto, Vaistein, Bidochka và CS khẳng ñịnh sự xâm nhập của B bassiana qua lớp cutin côn trùng (lớp này chủ yếu là sợi kitin nhỏ gắn xen vào gian bào là protein) là yếu tố cần thiết cho sự nhiễm ñộc Mặt khác, quyết ñịnh kết quả của quá trình xâm nhập ñó lại là do enzym ngoại bào chủ yếu là

proteaza và kitinaza Việc sản sinh nhanh các enzym (trước 24 giờ nuôi cấy) tạo

ñiều kiện cho việc gây bệnh của nấm vì nấm có thể bắt ñầu quá trình phân hủy cutin trước khi sức ñề kháng của vật chủ trở nên có hiệu quả Quá trình phân hủy cutin cũng tạo ra các sản phẩm phân hủy chứa cacbon và nitơ là nguồn dinh dưỡng giúp cho nấm sinh trưởng và phát triển tốt

Leger và cộng sự cho rằng B bassiana xâm nhập dễ dàng vào côn trùng

là nhờ các proteaza giải phóng ra trong những bước ñầu của quá trình xâm nhập Sau ñó, kitinaza hoạt ñộng trong những bước tiếp theo của quá trình này ðiều này chỉ ra rằng: kitinaza có vai trò thứ yếu trong quá trình xâm nhập so với

proteaza Tuy nhiên, các nhà khoa học thấy rằng: khi gen mã hóa proteaza bị

ñột biến mất ñoạn thì bệnh của côn trùng giảm Chứng tỏ: proteaza là một trong

những yếu tố quyết ñịnh tính ñộc nhưng nó không phải là yếu tố chủ yếu của bệnh nguyên

Cũng ñể ñánh giá vai trò của hệ enzym thủy phân cutin trong quá trình

xâm nhập của nấm B bassiana, Charnley và cộng sự ñã tiến hành phân tích vai

trò của các enzym bằng cách nuôi cấy chúng trên môi trường lỏng có chứa cutin của châu chấu không hòa tan như là nguồn cacbon, nitơ duy nhất Kết quả cho

thấy: các chủng B bassiana ñều sinh trưởng tốt trên môi trường chứa 1% cutin châu chấu nghiền nhỏ B bassiana ñã sản sinh ra một loạt các enzym phân hủy cutin như proteaza, aminopeptidaza, kitinaza, lipaza, tương ứng với các thành

phần hóa học chính của côn trùng như protein, kitin, lipid Chứng tỏ, hệ enzym thủy phân lớp cutin (lớp da của côn trùng) là ngoại bào và thường là cảm ứng

I.1.3 Nghiên cứu về khả năng ứng dụng nấm Beauveria bassiana ñể phát triển các sản phẩm trừ sâu hại

Những phát hiện bệnh nấm côn trùng ra ñời cùng với sự xuất hiện khoa học nghiên cứu bệnh côn trùng Nhưng ñến thế kỷ 18 người ta mới ghi chép những kết quả theo dõi ñầu tiên về bệnh nấm côn trùng, và người ta còn thấy nấm là vi sinh vật gây bệnh ñầu tiên ñược chứng minh về khả năng lan truyền từ

kí chủ này sang kí chủ khác Và lần ñầu tiên vào những năm 1815, Agostino

Bassi (người Italia) ñã mô tả tỉ mỉ về bệnh nấm trắng Muscardin (nay xác ñịnh là nấm trắng Beauveria) Theo Oduen (1837), nấm trắng Muscardin không chỉ gây

bệnh cho tằm mà còn lây bệnh cho côn trùng khác Trước ñó Luis Pasteur (1885 – 1890) ñã phát hiện tằm bị bệnh (tằm vôi) do nấm Muscardin gây ra

Năm 1888, Snoi tiến hành một loạt thí nghiệm với nấm Muscardin trắng là

Beauveria gioburifera (ngày nay là Beauveria bassiana) ñối với bọ xít (Blisus

leucoterus Say) hại lúa mì

ðến thế kỉ 20 ñã có khá nhiều các công trình nghiên cứu tuyển chọn và phân lập các chủng vi nấm trong lớp nấm Bất Toàn có khả năng diệt côn trùng Các tác giả tập trung chủ yếu vào chọn lọc môi trường nhân tạo ñể phân lập tuyển chọn: Chase và CS sử dụng môi trường tinh bột (bột yến mạch) ñể phân

lập nấm B bassiana và M anisopliae, Arefre tuyển chọn bào tử nấm B bassiana

trên môi trường lúa ñại mạch…

Vào những năm 70 của thế kỉ này, Liên Xô (cũ) là nước có số lượng công trình lớn nhất về nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật diệt côn trùng Chế

phẩm nấm mang trên Boverin (từ B bassiana ) ñược sử dụng rộng rãi ñể phòng

trừ côn trùng cánh cứng (Colorado Beetle) ( Ferron) Ngay ở các nước châu Mỹ Latinh và Bắc Mỹ, cũng có các công trình nghiên cứu về vi nấm diệt côn trùng như Ramosca ở Trường ñại học Kansas tại Mỹ ñã thí nghiệm nhân tạo gây bệnh

cho loài muỗi Culex quiquefaciatus Say bằng vi khuẩn Bacillus thuringensis,

Isaraclensis và nấm Metarhizium anisopliae trừ mối Coptotemes formasanus

Tác giả Lai và CS ñã sử dụng 6 chủng vi nấm ñể thử khả năng diệt các loài mối

Coptotermes formosanus trong ñó có 1 chủng B bassiana, 2 chủng Beauveria

sp, 3 chủng M anisopliae Tác giả Krueger, Villani ñã thí nghiệm khả năng gây

bệnh của B bassiana ñối với nhóm Scarab sống trong ñất (Popilila japonica và Rhizotro pus majalis) Các nước châu Mỹ La tinh cũng có xu hướng sử dụng

nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana ñể phòng trừ côn trùng sống

trong ñất, như cá thể trưởng thành của sâu khoai lang (Cylas puncticollis) Loài mối Cormitermescommulans (Kollar,1832) cũng ñược phòng trừ bằng nấm

B bassiana (Fermandes et al, 1991)

Ở Nhật Bản người ta sử dụng nấm B bassiana ñể phòng trừ sâu (Ostrinia

furnacaclis) ñục hại quả táo

Ở Canada ñã nghiên cứu ứng dụng B bassiana ñể phòng trừ châu chấu hại

lúa (Melanopus sanguinipes), rệp (Hemiridae) và loài rệp vừng (Homoptera Aphididae)

Tại các nước châu Âu, bắc Âu như Thụy Sĩ, Hà Lan, Phần Lan, Trung

Quốc cũng sử dụng chế phẩm vi sinh B bassiana ñể phòng trừ dịch hại

Tại châu Úc, 2 tác giả Badilla, F.F và Ales, S.B (1991) cũng sử dụng các

chủng nấm Beauveria bassiana và Beauveria broganiratii ñể phòng trừ vòi voi

Sphenophrus levis Vauria hại mía

Những năm gần ñây nhất cũng vẫn có các công trình nghiên cứu về chủng nấm Beauveria và Metarhizium như Jeffrey C, Lord, 2009 ở Mỹ ñã nghiên cứu

khả năng lây nhiễm của B bassiana ñối với ấu trùng bọ cánh cứng

I.2 Những công trình nghiên cứu và ứng dụng vi nấm Beauveria bassiana

trong nước

Vấn ñề nghiên cứu các chủng vi nấm gây bệnh cho côn trùng ñã ñược các nhà khoa học ở một số trường ðại học và Viện nghiên cứu bắt ñầu thực hiện từ những năm 70 của thế kỉ 20 Năm 1975, Tạ Kim Chỉnh và các CS thuộc Bộ môn Bảo vệ thực vật (Viện lâm nghiệp – Bộ Lâm nghiệp trước ñây, nay là viện KH Lâm nghiệp Việt Nam, Bộ NN & PTNT) ñã có báo cáo khoa học ( tư liệu KH của cơ quan ): “Nghiên cứu phương pháp ñiều chế chế phẩm vi sinh vật diệt sâu róm thông bằng các phế liệu sẵn có trong nước” ðây cũng là dẫn liệu khoa học ñầu tiên ở Việt Nam về nghiên cứu vi sinh vật diệt côn trùng Tác giả ñã thu thập mẫu bệnh sâu róm thông (Dendrolimus ponctatus) chết do nấm và xác ñịnh là

loài nấm trắng Beauveria Từ các mẫu bệnh này, tác giả ñã phân lập, thuần khiết

và ñã ñịnh loại ñược các chủng B bassiana (Bb1, Bb2, Bb4, Bb5, BbKC và

BbYD) và ñiều chế dạng bột ñể thử nghiệm phòng trừ sâu róm thông ở lâm trường Yên Dũng – Bắc Giang (ñề tài cấp cơ sở của Viện, 1970 – 1975) Tuy là kết quả ban ñầu nhưng là dẫn liệu khoa học ñầu tiên về lĩnh vực nghiên cứu vi nấm diệt côn trùng ở Việt Nam và cũng là cũng là khoa học ñầu tiên về chủng

nấm Beauveria bassiana

Các công trình nghiên cứu cơ bản khá sâu sắc về chủng nấm B bassiana,

ñó là những nghiên cứu về ñiều tra (Tạ Kim Chỉnh và CS, 1994), phân lập và

tuyển chọn các chủng nấm có khả năng diệt côn trùng (Tạ Kim Chỉnh,2006) ñến

những nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của chủng nâm B.bassiana Từ năm 2003

-2006, Tạ Kim Chỉnh và các CS ở Trung tâm Nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học – Liên hiệp các Hội KH&KT Việt Nam ñã thực hiện ñề tài :“ Nghiên

cứu sản xuất và ứng dụng chủng vi nấm Metarhizium anisopliae & Beauveria

bassiana ñể phòng trừ côn tùng trong ñất hại cây trồng cạn ” ðề tài ñạt dược

nhiều kết quả ñáng khích lệ, trong ñó quan trọng nhất là các kết quả khảo nghiệm chế phẩm MATP và BBTP phòng trừ một số sâu hại cây trồng cạn: Mối Odontotermes orientalis (Capriter mes), hại rễ cây thông con (Trung tâm bảo vệ rừng số 2 Hàm Rồng Thanh Hóa, 2003) và mới hại cây lạc (TT giống cây trồng thi xã Hòa Bình, tỉnh Hòa Bình, tháng 10 năm 2005)…Kết quả cho thấy chế

phẩm MATP & BBTP (lên men từ các chủng nấm M anisopliae Ma5 và B

bassiana Bb1 ñều có hiệu lực phòng trừ côn trùng trong ñất ñạt từ 0% ñến

87,5% Tháng 7 năm 2007, hai loại thuốc sâu sinh học mang tên thương phẩm Vimetarzimm 95DP& Biobauve5DP ñã ñược Bộ NN& PTNT cấp giấy phép cho

sử dụng ở Việt Nam (Số giấy phép:1168/07 ECR và 1169/07 ECR, ngày 2/8/2007 – Cục Bảo Vệ Thực Vật) Chế phẩm mang tên thương phẩm của thuốc trừ sâu sinh học: B5DP, ñây là loại thuốc trừ sâu dạng bột, sản xuất bằng công nghệ lên men chủng nấm Bb1 trên môi trường xốp có thành phần là tinh bột, nguồn nghiên liệu có sẵn trong nước Một gam sản phẩm chứa 1011 – 1012 bào tử nấm Sản phẩm này có thể sử dụng bằng 2 cách: bón lót cho cây trồng cạn ñể phòng trừ sâu ñất (các loài mối ấu trùng bọ hung ñen hại múa, sâu ñục thân, sâu xám, tuyến trùng hại rau, mầu, rệp sáp hại cà phê, bọ hà…), sâu hại các loại cây

ăn quả (cam, xoài, vải, nhãn, dừa…), cây công nghiệp (mía, chè, cà phê, hồ tiêu, ñiều, măng tre…), cây lấy củ (khoai tây, lạc, rau củ cải…) và cây rừng (cây thông, cây bạch ñàn, cây sao ñen…) Ngoài ra B5DP còn ñược phun trực tiếp trên lá ñể trừ sâu ăn lá, bọ nhẩy hại các loại ra, hoa màu (ngô, ñỗ, lạc…), rầy

nâu, châu chấu hại lúa B5DP ựã khảo nghiệm và áp dụng thành công trong lĩnh vực phòng trừ côn trùng trong ựất: mối hại cây vải thiều ở Nam Thanh Ờ Thanh

Hà Ờ Hải Dương (1994, 1995, 1997), mối hại cây thông ở cố ựô Huế (1995), mối hại cây chè (Công ty chè Yên Bái 1998, 1999), mối hại cây cảnh, cây bóng mát (Lăng Chủ Tịch Hồ Chắ Minh 1998 Ờ 1999) Năm 2004, thuốc còn ựược khảo nghiệm diệt rầy nâu hại lúa (lúa ựặc sản) ở Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long

Từ năm 2006 ựến nay, B5DP cũng ựược khảo nghiệm phòng trừ mối hại chè (Chè Shal tuyết Ờ Mai Châu, Hòa Bình, năm 2005 Ờ 2007), rệp sáp hại rễ cà phê (đắk Lắk Ờ Buôn Ma Thuột Ờ 2005) và ấu trùng bọ hung ựen hại (Gia Lai Ờ 2005), sâu xám hại cây ựậu tương, cây lạc (xã Hoàng Hoa Thám tỉnh Hải Dương Ờ 2005), sâu ựục thân và mối hại cây keo lai (trạm khuyến nông, khuyến lâm Kỳ Sơn, Hòa Bình Ờ 2004)ẦVới tắnh chất tồn lưu trong ựất nên thuốc trừ sâu sinh học B5DP có khả năng diệt sâu kéo dài trong nhiều thời gian tiếp theo Do vậy chỉ xử lý thuốc một lần trong thời vụ của cây trồng (phải xử lý lại nếu sau 24 giờ

xử lý bị trời mưa) Thuốc trừ sâu B5DP không gây ựộc hại cho ựộng vật máu nóng, an toàn ựối với cây trồng, thiên ựịch (sâu có ắch) và môi trường

Nghiên cứu gần ựây nhất của tác giả PGS Ờ TS Nguyễn Văn Tuất và các thành viên thực hiện ựề tài KC 04 Ờ 12 với ựề tài ỘNghiên cứu sản xuất sử dụng

7 loại thuốc sâu sinh học ựa chức năng cho một số loại cây trồng bằng kỹ thuật công nghệ sinh họcỢ ựã ựạt giải thưởng VIFOTEC, giải thưởng Sáng tạo KHCN Việt Nam lĩnh vực Sinh học phục vụ sản xuất và ựời sống Trong ựó có chế

phẩm nấm côn trùng Beauveria & Metahzium trừ sâu hại Thu thập, phân lập và tuyển chọn ựược 28 chủng (10 chủng Beauveria và 18 chủng Metahizium) trên

các loại sâu hại khác nhau tại các tỉnh phắa Bắc và phắa Nam đã chọn ựược 4 chủng có hoạt lực diệt côn trùng rất cao và hiện ựang sử dụng ựể sản xuất chế

phẩm là 2 chủng Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae ở phắa Bắc, 2 chủng Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae ở phắa Nam Các khâu kỹ

thuật của quy trình công nghệ ñã ñược cải tiến ñể nâng cao chất lượng chế phẩm Cải tiến quy trình bảo quản giống gốc Nâng cao hoạt tính diệt côn trùng của các chủng nấm ñã có từ trước ñây bằng cách truyền qua côn trùng rồi phân lập và

thuần hoá lại ñể nâng cao hoạt tính diệt côn trùng của các chủng nấm Beauveria

& Metahizium Công nghệ mới bỏ qua giai ñoạn nhân sinh khối cấp II, từ giống

gốc cấp I nhân thẳng ra môi trường thứ cấp là môi trường trực tiếp tạo thành chế phẩm, rút ngắn ñược công ñoạn sản xuất

I.3 ðại cương về rệp sáp (Planococcus sp) hại cà phê

Một trong những trở ngại lớn cho sản xuất cà phê là vấn ñề sâu bệnh hại, trong tất cả các công trình nghiên cứu về cà phê, nhất là về sâu bệnh hại cà phê ñều cho biết trong các năm gần ñây, rệp sáp là những ñối tượng gây hại rất quan trọng trên cây cà phê cả trên cà phê chè và cà phê vối Khi bị rệp sáp hại với mật

ñộ cao ñã gây nên hiện tượng cây cói cọc, bị hại ở giai ñoạn nở hoa ñậu quả ñã gây nên hiện tượng rụng hoa quả non ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất và

chất lượng quả

Khi nghiên cứu về rệp sáp (Pseudococcus citri Risso) hại quả cà phê tác

giả Vũ Văn Tố có một số nhận xét sau: ñây là loài rệp phổ biến nhất ở hai tỉnh ðắk Lắk và Gia Lai Rệp hại nặng làm quả bị rụng, cây bị nặng năng suất giảm

từ 20-40% Khi mật ñộ rệp cao thì ở vườn giao tán bị nặng hơn vườn không giao tán, vườn ñược tưới nước phun mưa thì tỉ lệ rệp và mức ñộ rệp giảm ñi Vũ Quang Khải (2001) khi nghiên cứu về rệp sáp nâu Parasaissetia niga (Nietner) hại cà phê cho biết loài này có mặt thường xuyên trên cà phê chè tại Sơn La, hại các bộ phận như thân cành, chồi vượt, cuống lá, ñặc biệt ở các bộ phận ñang sinh trưởng như cành bánh tẻ cành non, chồi vượt Khả năng ñẻ của chúng từ 91-331 trứng, vòng ñời từ 53-78 ngày Theo Nguyễn Thị Chắt (2003) ñã ghi nhận có 10 loại rệp sáp hại cà phê tại các tỉnh phía Nam Tỷ lệ cây cà phê tại Lâm ðồng và

Bình Phước bị hại do rệp sáp hại là 11-17% Rệp sáp giả không chỉ hại cành, lá

mà còn hại cả gốc cà phê

Biến ñộng số lượng của rệp sáp: Tại Gia Lai, rệp sáp phát triển mạnh từ tháng 2 ñến tháng 7, từ tháng 8-10 do mưa liên tục nên rệp sáp ít ñẻ và ñẻ ít trứng Nhiệt ñộ thích hợp cho rệp sinh sản và phát triển là 20-250C và có nắng mưa xen kẽ Theo Nguyễn Thị Chắt thì rệp sáp ưa ñộ ẩm, vào mùa khô mật ñộ rệp sáp trên các ñọt non, lá quả giảm nhiều và di chuyển xuống dưới gốc, mưa

ẩm chúng lại di chuyển lên Các loại rệp sáp giả và rệp sáp nâu mềm thường phát sinh mạnh vào các tháng 7 – 9 hàng năm tại các tỉnh phía Bắc khi có nắng mưa xen kẽ (Phạm Thị Vượng và CTV, 2004)

Tình hình gây hại của rệp sáp: Rệp sáp hại tất cả các bộ phận trên mặt ñất

và dưới mặt ñất của cây cà phê Chỉ riêng vùng cà phê của ðắk Lắk năm 2004 có 14.717 ha bị nhiễm rệp sáp trong ñó có 2000 ha bị hại nặng Nhiều diện tích cà phê sau khi nở hoa ñậu quả bị nhiễm rệp sáp làm rụng hết quả Các diện tích cà phê bị hại ñã làm giảm năng suất cà phê nghiêm trọng Rệp sáp gây hại không chỉ ảnh hưởng ñến sinh trưởng phát triển, năng suất của cây cà phê trong thời ñiểm bị hại trong năm ñó mà còn gây ảnh hưởng cho vườn cà phê vào các năm sau, nếu cà phê không ñược chăm sóc phục hồi tốt Khi rệp sáp hại cà phê ở cấp

4 (tức là trên 75% bộ phận của cây có rệp) thì thiệt hại là 66% năng suất cà phê nhân (Phạm Thị Vượng và CTV, 2004)

Có rất nhiều biện pháp phòng trừ rệp sáp hại cà phê như: phòng chống rệp sáp bằng biện pháp sử dụng tưới nước, phòng chống rệp sáp bằng biện pháp sinh học (sử dụng các loài ký sinh thiên ñịch, sử dụng các chế phẩm sinh học), phòng trừ bằng biện pháp hóa học Người dân ñã phun thuốc trừ rệp với nhiều loại thuốc hóa học có ñộc tố và nồng ñộ cao, nhưng hiệu quả vẫn thấp Vì khi cây cà phê héo hoa, các chùn hoa cũng héo che lấp toàn bộ rệp sáp bên trong ðể giải quyết tồn tại ñó, Viện BVTV ñã tiến hành phun nước với áp suất cao (3at 1) rửa

trôi các chùm hoa héo và ñạt hiệu quả rửa trôi rệp là 41, 95, 55, 52 và 58,37% sau khi phun nước 13,7 ngày Nếu phun nước với áp suất cao loại bỏ chùm hoa khô, sau ñó phun thuốc hóa học Supracide 40EC 0.2% thi kết quả trừ rệp rất cao, ñạt 69, 97, 83,33 cà 97,18% sau 13,7 ngày Cao hơn rất nhiều (17 – 18%) so với phương pháp của nông dân thường xử lí Qua nghiên cứu các loại hóa chất trừ rệp ñã cho thấy tất cả các loại thuốc ñều có khả năng trừ rệp nhưng hiệu lực cao nhất vẫn là Supracide 40EC sau 3 ngày trừ rệp 61,36% và sau 7 ngày là 80,88% Thấp nhất là dầu khoáng ñơn lẻ sau 7 ngày ñạt 37,67% sau 14 ngày chỉ còn 29,54% Trong ñó sử dụng biện pháp sinh học tuy không có hiệu quả nhanh, kịp thời nhưng có nhiều ưu ñiểm: Không gây ñộc hại tới người, vật nuôi và môi trường Không làm mất ñi khu hệ vi sinh vật và kí sinh tự nhiên có lợi cho con người Có thể tích lũy và lây lan rộng trên ñồng ruộng, có khả năng duy trì nguồn bệnh và gây chết cho thế hệ sâu hại lứa sau

Có 7 loài rệp sáp thuộc 3 họ chính của bộ cánh ñều là họ rệp sáp giả Pseudococcidae (4 loài), họ rệp sáp mềm Coccidae (2 loài) và họ rệp sáp vẩy Disapidae (1 loài)

Nguyễn Thị Thủy, Phạm Thị Vượng, Lê Xuân Vị (2006) ñã nêu ra một số

ñặc ñiểm sinh học, sinh thái của rệp sáp Plococcus sp hại cà phê ở Việt Nam như

sau:

Rệp cái hình bầu dục, không cánh, dài 2,5-5 mm, thân có phủ lớp sáp trắng, quanh thân có các tua sáp Rệp ñực dài khoảng 1mm, màu xám nhạt, có một ñôi cánh Rệp non mới nở màu hồng, hình bầu dục, chưa có sáp, di chuyển tìm nơi sống thích hợp, sau 2-3 ngày thì cố ñịnh nơi sống

Khi nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh học của rệp sáp trong ñiều kiện bình

thường của phòng thí nghiệm, rệp ñực và rệp cái Planococcus sp có biến thái

khác nhau Rệp cái thuộc biến thái không hoàn toàn gồm các pha trứng, sâu non

(3 tuổi) và trưởng thành Trong khi ñó rệp ñực thuộc dạng hình biến thái hoàn toàn gồm các pha trứng, sâu non (2 tuổi), nhộng và trưởng thành

Rệp trưởng thành cái thường nằm yên ở một chỗ, ñẻ trứng thành ổ có lớp

sáp bọc bên ngoài Rệp sáp Planococcus sp có khả năng sinh sản cao Trong ñiều

kiện nhiệt ñộ nuôi trung bình là 27,80C, ẩm ñộ trung bình 79,43 % một rệp cái có thể ñẻ trung bình là 144,75 trứng Trong ñiều kiện nhiệt ñộ nuôi trung bình là 28,760C, ñộ ẩm trung bình là 80,94 % một rệp mẹ có thể ñẻ trung bình là 150,4 trứng thời gian ñẻ từ 10 - 12 ngày

Thời gian sống của trưởng thành ñực rất ngắn chỉ từ 3,32 ngày ñến 3,72 ngày Khác với rệp ñực, rệp sáp cái có thời gian sống tương ñối dài, thời gian trước ñẻ từ 10,46 ngày ñến 13,6 ngày

Rệp sáp xuất hiện với mật ñộ cao và gây hại nặng từ ñầu tháng 3 ñến ñầu tháng 5 trùng với giai ñoạn ra hoa và ñậu quả của cây cà phê

Theo Nguyễn Thị Thuỷ (2006) cho rằng rệp sáp có hai loài ñó là rệp sáp hại quả và rệp sáp hại rễ khác với những nghiên cứu trước ñây cho rằng vào mùa khô chúng di chuyển xuống dưới gốc còn mùa mưa ẩm ướt chúng lại di chuyển lên

PHẦN II ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

ðề tài nghiên cứu ñược thực hiện từ tháng 12/2009 ñến tháng 5/2010 Tại phòng thí nghiệm Trung tâm sinh học - Viện Bảo Vệ Thực Vật

II.2 ðối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

II.2.1 ðối tượng nghiên cứu

- Nấm Beauveria bassiana, ñược phân lập từ rệp sáp thu thập từ ðắk Lắk, Nghệ An và Sơn La

- Rệp sáp hại cà phê ñược nuôi tại phòng thử sinh học của Trung sinh học

II.2.2.2 Hóa chất dùng trong thí nghiệm

II.2.2.3 Các môi trường dùng ñể nuôi cấy

* Môi trường rắn ñược thử nghiệm với 4 loại môi trường là:

1 Môi trường PDA

* Môi trường N2-1/2: Hàm lượng dinh dưỡng bằng ½ môi trường N2

1 Môi trường Czapek-Dox

* Môi trường sản xuất

Môi trường Gạo: 5kg

Môi trường Ngô: 5kg

Môi trường Gạo + Ngô : tỉ lệ 2:1

Môi trường Gạo + Bã mía (0.5%)

II.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

II.3.1 Nội dung nghiên cứu

1 Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học sinh thái nấm Beauveria bassiana trªn m«i tr−êng r¾n

- ðặc ñiểm sinh học hình thái các chủng nấm B bassiana trên cùng môi

trường N1

.- Ảnh hưởng của ñiều kiện nhiệt ñộ tới sự sinh trưởng và phát triển của

nấm Beauveria bassiana

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy nhân tạo ñến sự sinh trưởng phát triển

của nấm Beauveria bassiana

2 Nghiên cứu công nghệ lên men dịch thể

- Nghiên cứu thành phần môi trường tối thích cho khả năng tạo sinh khối

của nấm Beauveria bassiana

- Xác ñịnh khả năng phân giải cơ chất của các enzym ngoại bào ñược sinh

ra từ nấm Beauveria bassiana trên các môi trường nuôi cấy khác nhau

3 Nghiên cứu công nghệ nhân sinh khối trên môi trường sản xuất

- Nghiên cứu thành phần môi trường sản xuất tối thích cho khả năng tạo

sinh khối của nấm Beauveria bassiana

- Xác ñịnh thời gian nuôi cấy nấm ñể thu ñược sản phẩm cho chất lượng tốt

nhất, tiến hành thu sinh khối nấm Beauveria bassiana trên môi trường sản xuất

sau khi qua nhiều môi trường nuôi cấy ñể thu sinh khối nấm trên quy mô lớn

4 Xác ñịnh hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana ñối với rệp sáp hại cà phê trong nhà lưới

Xác ñịnh hiệu lực của nấm Bb trên rệp sáp hại quả (Planococcus citri) và rệp sáp hại rễ (Planococcus minor)

II.3.2 Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp chọn chủng giống thuần tốt nhất

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy 5 chủng nấm Beauveria bassiana ñó là : BR1,

BR2, BR3, BR4, BR5 trên môi trường N1 có công thức như sau: Khoai tây, Glucose, KH2PO4, Pepton, MgSO4, Agar, H2O

1.1 Phương pháp tiến hành:

Cân các thành phần môi trường như phần vật liệu ñã nêu, sau ñó ñun sôi môi trường trên bếp ñiện Môi trường ñã ñược ñun sôi sẽ ñược ñổ vào bình tam giác 250 ml cho vào nồi khử trùng Tùy vào thành phần môi trường mà các môi trường khác nhau ñược khử trùng ở nhiệt ñộ khác nhau ðối với môi trường N1 ñược khử trùng ở 121○C, 1at trong 30 phút Cùng khoảng thời gian ñó ta cắm ñèn cực tím ñể khử trùng buồng cấy

Môi trường sau khi khử trùng ñược ñể nguội tới 60○C trong buồng cấy sạch rồi ñổ ra ñĩa petri sạch ñã ñược sấy khử trùng (ít nhất 3 giờ), ñể yên 1 - 1.5h ñể

cố ñịnh bề mặt thạch Khi bề mặt thạch ñã cứng ta tiến hành úp ngược ñĩa petri

ñể nước ko hấp hơi lên nắp ñĩa

Sau ñó tiến hành cấy giống theo phương pháp cấy ñiểm Hé mở ñĩa petri ñựng môi trường, que cấy ñược vô trùng trên ngọn lửa ñèn cồn ñến khi nóng ñỏ, gạt que cấy trên nắp ñĩa petri cho nguội bớt mới cho que cấy vào ống giống lấy một lượng ít bào tử rồi cấy một ñiểm duy nhất ở tâm ñĩa Cấy xong ñặt ngược ñĩa petri và gói lại bằng giấy báo sạch rồi ñể trong buồng cấy

1.2 Chỉ tiêu theo dõi:

+ Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc bằng mắt thường ðo ñường kính

khuẩn lạc của nấm Beauveria bassiana sau 3, 5, 7, 10, 14 ngày nuôi cấy (ño

bằng thước ño cm ở mặt sau ñĩa petri)

+ ðếm số lượng bào tử/ cm2 sau 7, 10, 14 ngày nuôi cấy ñể xác ñịnh chủng nấm sinh lượng bào tử nhiều nhất và xác ñịnh ñược thời gian thu sản phẩm tốt nhất

ðể ñếm bào tử, chúng tôi ñã dùng buồng ñếm hồng cầu và ñược tiến hành như sau:

Nghiền 1 cm2 khuẩn lạc nấm vào 10 ml nước cất và lắc ñều, lấy 1 ml dịch bào tử vừa pha cho vào 9 ml nước cất, cứ hòa như vậy với tỷ lệ 1 ml dịch bào tử với 9 ml nước cất cho ñến khi ñếm ñược bào tử

Sơ ñồ kiểm tra số lượng bào tử Sau khi pha mẫu với nồng ñộ thích hợp, dùng pipet loại 1cc nhỏ một giọt dịch vào chỗ khoảng phân ô, sau ñó ñặt lamen lên và tiến hành ñếm dưới kính hiển vi Cấu tạo của buồng ñếm hồng cầu gồm hai loại: Một loại có 25 ô lớn, mỗi ô có 16 ô nhỏ, còn một loại có 16 ô lớn, mỗi ô lớn có 25 ô nhỏ Cả hai loại ñều có tổng cộng là 400 ô nhỏ Chúng tôi sử dụng loại 1 tức là loại có 25 ô lớn