nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh của hai giống mía roc26 và bh1 bằng phương pháp nhân nhanh in vitro

Chất kích thích sinh trưởng là một yếu tố quyết định sự thành công của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.. mục đích: - Xác định được các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp và nồng

Lời cảm ơn

Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn

chân thành và sâu sắc tới TS Hà Thị Thuý Cô đ, tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận

tình hướng dẫn tôi trong toàn bộ khoá luận

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới chị Phan Thị Thanh Thúy Chị đ, chỉ bảo tôi

trong suốt quá trình thực tập khoá luận

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cô chú, các anh chị làm việc tại

Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di Truyền Nông

Nghiệp đ, giúp đỡ và tạo điều kiện tối đa cho tôi trong toàn bộ quá trình thực tập

Tôi xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể các thầy, cô

giảng dạy tại khoa CNSH - Viện Đại Học Mở Hà Nội đ, hướng dẫn, giảng dạy tôi

trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đ, động viên tạo điều kiện giúp tôi

hoàn thành khoá luận này

Hà Nội, ngày 13 tháng 06 năm 2010

Sinh viên: Phạm Thị Nguyệt

Mục lục

Mở đầu………6

1 Đặt vấn đề………6

2 ý nghĩa và mục tiêu của đề tài……….7

Phần 1: tổng quan tài liệu………8

1.1 Giới thiệu chung về cây mía……… 8

1.1.1 Phân loại thực vật……… 8

1.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trưởng……….8

1.1.3 Phân loại mía……….8

1.1.4 Gía trị của cây mía……… 10

1.1.5 Thực trạng việc trồng và sử dụng mía………11

1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào và ứng dụng……….13

1.2.1 Lịch sử phát triển………13

1.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật………15

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy in vitro……….16

1.2.4 Các phương pháp nhân giống in vitro……….19

1.2.5 ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật……….23

1.3 Giới thiệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật……… 24

1.3.1 Nguồn gốc lịch sử 24

1.3.2 Nhóm Auxin 25

1.3.3 Nhóm Cytokinin 26

1.3.4 Các nhóm khác 27

Phần 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu……….28

2.1 Vật liệu nghiên cứu……….28

2.2 Phương pháp nghiên cứu……….28

2.2.1: Chọn mẫu và xử lí mẫu……….28

2.2.2 Các bước thực hiện 29

a Nghiên cứu khả năng tạo chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 29

b Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1mg/l IBA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của hai giống mía

ROC26 và BH1 30

c Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2mg/l Kinetin lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía ROC26 và BH1 30

d Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa tới quá trình nhân chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 31

e Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường tới quá trình nhân chồi cảu hai giống mía ROC26 và BH1 31

f Nghiên cứu ảnh hưởng của dung tích môi trường tới quá trình nhân chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 32

g Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình kéo dài chồi của hai giống mía ROC26 và BH1 32

h Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thành rễ của hai giống mía ROC26 và BH1 33

i Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể lên tỷ lệ sống của cây trên vườn ươm.33 2.2.6 Thu thập và xử lí số liệu………33

Phần 3: kết quả và thảo luận 35

3.1 Tạo nguyên liệu vô trùng từ cây mía 35

3.2 Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ hai giống mía ROC26 và BH1 35

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,1mg/l IBA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của hai giống mía ROC26 và BH1 37

3.4 ảnh hưởng BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với 0,2mg/l Kinetin lên quá trình tái sinh chồi của 2 giống mía ROC26 và BH1 40

3.5 ảnh hưởng nước dừa tới sự hình thành chồi từ callus của 2 giống mía ROC26 và BH1 42

3.6 ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến quá trình nhân chồi của 2 giống mía ROC26 và BH1 43

3.7 : ảnh hưởng dung tích môi trường tới quá trình nhân nhanh chồi của 2

giống mía ROC26 và BH1 45

3.8 : ảnh hưởng BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình kéo dài chồi của 2 giống mía ROC26 và BH1 46

3.9 : ảnh hưởng nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của 2 giống mía ROC26 và BH1 48

3.10 : ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống của cây ngoài vườn ươm 51

Phần 4 : kết luận và kiến nghị 53

4.1 Kết luận 53

4.2 Kiến nghị 53

Tài liệu tham khảo 54

Phụ lục

Nh÷ng tõ viÕt t¾t

BAP 6-Benzyl Amino Purin

IAA Indol-3-Axetic Acid

IBA 3-Indol Butyric Acid

NAA α-Naphthyl Acetic Acid

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxy Acetic Acid

MS Mura Shige vµ Skoog

NSTB N¨ng xuÊt trung b×nh

CTMT C«ng thøc m«i tr−êng

Mở đầu

I Đặt vấn đề:

Cây mía là một loại cỏ qua quá trình chọn lọc tự nhiên hàng nghìn năm đ, trở thành một loài cây trồng công nghiệp quan trọng của cả thế giới Cây mía chứa 80-90% nước dịch đường trong đó có khoảng 16-18% là đường nguyên chất Cây mía là cây cho sản lượng đường cao hơn tất cả các loại cây khác Hiện nay ở nước

ta cũng như nhiều nước khác trên thế giới cây mía là cây trồng được nhà nước và chính phủ ưu tiên chú trọng phát triển như một cây công nghiệp chính Niên vụ mía năm 2009 lượng nguyên liệu mía đưa vào sản xuất đường thiếu trầm trọng, hàng loạt nhà máy đường phải đóng cửa sớm Hậu quả là toàn nghành mía của nước ta thiếu khoảng 2000 tấn so với dự tính dẫn tới nhà nước phải nhập ngoại đường Đây

là nguyên nhân chính gây hiện tượng sốt giá đường trong năm nay Nhà nước dự tính vụ mía năm 2010 sẽ mở rộng diện tích trồng mía để đáp ứng đủ cho nghành sản xuất mía đường nhằm đảm bảo giá đường phù hợp cho nhân dân Ngoài ra, cây mía còn là một vị thuốc quý chữa rất nhiều bệnh đ, được các y bác sỹ chứng nhận

và sử dụng Bên cạnh đó đối với những vùng sâu, miền núi, vùng đồng bào dân tộc thiểu số thì cây mía còn là cây trồng chủ đạo góp phần xóa đói giảm nghèo làm giàu cho bà con

Diện tích trồng mía của nước ta hiện nay vào khoảng 325.800 ha, năng suất bình quân khoảng 54 tấn/ha, tổng sản lượng mía được 15,2 triệu tấn Có khoảng hơn 200 quốc gia đang trồng và sản xuất mía đường với sản lượng hàng năm lên tới 1.324,6 triệu tấn gấp khoảng 6 lần so với sản lượng của củ cải đường Nhu cầu về

đường cũng như tính cấp thiết của cây mía ngày càng đòi hỏi với số lượng lớn

Qua nhiều năm trải nghiệm của hầu hết các nước cho thấy vai trò của công nghệ nuôi cấy mô đối với nhân giống mía, cây mía qua nuôi cấy mô cho năng xuất cao hơn bình thường gấp 20-30% Nuôi cấy mô còn là một biện pháp an toàn trong công tác cung cấp giống sạch bệnh, giảm chi phí thuốc hóa học, giúp cho việc nhập nội giống và trao đổi nguồn gen Để tạo được các giống mía cho năng suất, tỷ lệ

đường cao và cây sạch bệnh thì công nghệ nuôi cấy mô là một đòi hỏi hết sức cấp bách

Chất kích thích sinh trưởng là một yếu tố quyết định sự thành công của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Vì vậy để có được những giống mía chất lượng cao ta phải tìm hiểu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên các giống mía Chỉ có như vậy ta mới có thể tạo được điều kiện môi trường tối ưu cho cây phát triển nhằm đạt được năng xuất cao nhất Hiện nay hai giống mía chính được

đưa vào trồng để sản xuất đường chủ yếu là giống mía ROC26 và giống BH1.Vì

đây là hai giống mía có hàm lượng đường cao hơn hẳn so với các giống mía nhập ngoại khác của nước ta Để phục vụ cho việc đưa hai giống mía ROC26 và BH1 ra trồng hàng loạt với diện tích lớn mang lại năng xuất cao, chúng tôi đ, tiến hành

nghiên cứu đề tài : “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nhân nhanh của hai giống mía ROC26 và BH1 bằng

phương pháp nhân nhanh IN VITRO”

II mục đích và yêu cầu của đề tài:

1.1 mục đích:

- Xác định được các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp và nồng độ cần bổ

sung vào môi trường nuôi cấy hai giống mía ROC26 và BH1 bằng in vitro để đạt hiệu quả nhân nhanh cao nhất

1.2 yêu cầu:

- Xác định được nồng độ của BAP, NAA, 2,4-D cần bổ sung vào môi trường

nuôi cấy

- Xác định được nồng độ % của nước dừa, hàm lượng agar (g/l) cần bổ sung

vào môi trường nuôi cấy

- Tìm được giá thể thích hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm trước khi đưa

cây ra ngoài đồng ruộng

Phần 1: tổng quan tài liệu

1.1 giới thiệu chung về cây mía:

1.1.1 Phân loại thực vật:

Tên Việt Nam: Cây mía

Tên khoa học : Succharum officinarum

Tông : Andoropogoneae

Họ : Hòa thảo (Poaceae)

Chi : Sachcharum

1.1.2 Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trưởng:

Cây mía là cây thuộc họ hòa thảo, sống ở các vùng có khí hậu nhiệt đới và

ôn đới ẩm Thân cây mía to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2-6 m Trên cây mía thường thì phần ngọn nhạt hơn phần gốc do phần ngọn chứa thêm một lượng nước lớn để cung cấp cho lá và ngọn Lá mía cứng, dài, có lông khi già lá chuyển mầu nâu Cây mía thuộc cây rễ chùm ăn trên bề mặt đất khoảng 0-60 cm Cây mía ưa sống ở vùng có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm Nhiệt độ thích hợp từ 15-26 0C, thời kỳ mía nảy mầm thì cần nhiệt độ tốt nhất là 26-33 0C Thời gian chiếu sáng phải đạt từ 1200-2000 giờ/ 1 ngày Độ ẩm cần 100-170 mm nước/1 tháng, khi mía sắp tới thời kỳ thu hoạch cần khô khoảng 2 tháng như vậy thì tỉ lệ

đường trong cây sẽ cao Mía là loại cây công nghiệp khỏe, không kén đất có thể trồng mía trên nhiều loại đất khác nhau, từ 70% sét đến 70% cát Đất thích hợp nhất cho mía là những loại đất xốp, tầng canh tác sâu, có độ phì cao, giữ ẩm tôt và

dễ thoát nước Tuy nhiên ph của đất phải giới hạn từ 4-9, ph thích hợp nhất cho cây mía phát triển từ 5,5 đến 7,5

1.1.3 Phân loại giống mía ở Việt Nam:

Trên thực tế hiện nay ở Việt Nam, cây mía được chia thành hai loại chính: Mía ăn và mía ép công nghiệp

- Mía ăn: Nhóm này chiếm diện tích rất ít, chỉ một phần nhỏ và tập trung chủ

yếu ở các tỉnh như: Hà Tây, Hưng Yên, Hòa Bình Đây là nhóm mía nhiệt đới,

thân mềm, nhỏ, hàm lượng đường glucose và fructoza cao hơn các nhóm khác nên mát và bổ Nhóm mía này hoàn toàn là nhóm mía nguyên thủy chưa trải qua công nghệ chuyển gen hiện đại Nhóm mía này có thể trồng quanh năm không theo mùa

vụ chính, không chịu ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh, tuy nhiên thì yêu cầu

về chế độ phân bón cao không thích hợp để trồng cây công nghiệp Một số giống tiêu biểu như mía tím, mía chân gà

- Mía ép công nghiệp: Đây là các giống mía dùng để phục vụ cho công

nghiệp chế biến đường, phần lớn các giống mía này được nhập từ Đài Loan, ấn Độ, Trung Quốc Căn cứ vào thời điểm chín công nghiệp của mía người ta chia mía ép công nghiệp thành các nhóm chính như sau:

+ Nhóm mía chín sớm: Nhóm này chiếm khoảng 20-30% diện tích của vụ, thu hoạch vào đầu tháng 10 Nhóm này gồm:

Giống Việt đường 54-143 đây là giống mía được nhập của Trung Quốc và

được trồng ở Việt Nam từ rất lâu, thân cây thẳng để nhánh ít, mầu đỏ, chín sớm, chiếm 50-60% của nhóm

Giống Neo 320 là giống của ấn Độ được trồng nhiều ở miền Nam, diện tích chiếm 10% của cả nhóm

Giống Ja 60-5 chiếm khoảng 40% của cả nhóm, có khả năng cho năng xuất

từ 80-100 tấn/ha, giống này nảy mầm chậm nhưng để tập chung, chín sớm, thân to hình chóp cụt, vỏ màu xanh sáng, ẩn tím, thân có phủ lớp sáp dày

+ Nhóm mía chín trung bình: Đây là nhóm mía trồng chính của nghành trồng mía, diện tích trồng chiếm 40-50% diện tích của cả vụ Nhóm mía này gồm các giống như:

Giống F156 là giống mía gốc ở Đài Loan mới được nhập vào nước ta cho năng suất 70-100 tấn/ha, hàm lượng đường cao, thân thẳng, vỏ màu xanh vàng ẩn tím hay bị nứt, thân có lớp sáp phủ dày, giống này trồng chiếm 50% diện tích của nhóm

Giống Co 715 là giống mía nhập từ ấn Độ có khả năng thích ứng rộng trên nhiều loại đất khác nhau kể cả đất chua, phèn, năng xuất đạt 80-110 tấn/ha, thân cây thẳng, đường kính lớn, vỏ xanh vàng ẩn tím, có lớp sáp phủ dày

Gống F 134 là giống mía nhập từ Đài Loan trồng chủ yếu ở miền Bắc, giống này có thân to, vỏ xanh vàng ẩn tím, có lớp sáp phủ dày, khả năng nảy mầm và để nhánh khá

+ Nhóm mía chín muộn: Nhóm này chiếm tỉ lệ 20-30% diện tích của mía ép công nghiệp, gồm giống:

Giống My-514 là giống mía gốc Cu Ba hiện nay được trồng chủ yếu ở Đông Nam Bộ và miền Nam Giống này chín muộn, có khả năng thích ứng trồng trên mọi loại đất, năng xuất đạt 80-1000 tấn/ha

1.1.4 Giá trị của cây mía:

a) Gía trị kinh tế:

Đường là một loại thực phẩm có trong cơ cấu bữa ăn của mỗi con người chúng ta đồng thời là một loại nguyên liệu quan trọng của rất nhiều nghành sản xuất công nghiệp trên thế giới và Việt Nam như: Công ngệ sản xuất bánh kẹo, công nghệ sản xuất thực phẩm đồ uống

Cây mía là cây trồng chính phục vụ nghành công nghệ sản xuất đường Khi cô đặc dịch nươc mía chúng ta thu được 16-18 % đường nguyên chất Bên cạnh đó thì b, mía và các phụ phẩm của mía đều được tái sử dụng trong các nghành công nghiệp khác như: B, mía dùng làm nguyên liệu đốt lò, làm bột giấy Mật gỉ đường cho lên men chưng cất rượu, sản xuất axit và một số chất hữu cơ khác Nghành công nghệ mới được sản xuất từ cây mía là sử dụng mía kết hợp với sắn dây tạo thành xăng có thể dùng thay thế cho xăng dầu hiện nay đây là hướng công nghệ

đang được nghiên cứu và có nhiều xu thế trong tương lai Bùn lọc là sản phẩm cặn

b, còn lại sau khi chế biến đường từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa xêrin làm sơn, xi đánh giầy Sau khi lấy sáp bùn lọc dùng làm phân bón rất tốt

b) Gía trị sinh thái và xã hội:

Mía là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt Mía thường trồng từ tháng 10

đến tháng 2 hàng năm Vào tháng 2 là lúc lượng mưa thấp nhất trong năm Đến mùa mưa, mía được 4-5 tháng tuổi, bộ lá đ, giao nhau thành thảm lá xanh dày, diện tích lá gấp 4-5 lần diện tích đất làm cho mưa không thể trực tiếp rơi xuống mặt đất tránh được sói mòn cho các vùng đồi núi Hơn nữa mía là cây rễ chùm và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0-60 cm Một ha mía có thể có 13-15 tấn rễ, sau khi thu

hoạch bộ rễ để lại trong đất cùng với bộ lá là chất hữu cơ quý báu giúp đất trở nên phì nhiêu màu mỡ

Vào những ngày tết truyền trống ở nước ta cây mía là một phần không thể thiếu cùng với mâm mũ quả đ, góp phần tạo nên nét đẹp riêng của người Việt Nam

Cây mía được mệnh danh là “ phục mạch thang ” tự nhiên

1.1.5 Thực trạng về trồng và sử dụng cây mía:

a Trên thế giới:

Trên thế giới hiện nay có khoảng hơn 200 quốc gia và các vùng l,nh thổ

khác đang trồng mía và sản xuất hơn 1.4050,5 triệu tấn đường/1 năm Lượng đường

được sản xuất từ mía chiếm hơn 70% so với tổng sản lượng đường sản xuất từ các nguồn vật liệu khác nhau.Mía được trồng hầu hết trên khắp thế giới từ 350 Vĩ Bắc

đến 350 Vĩ Nam thuộc Châu á, Châu Mĩ, Châu Phi và Châu úc Theo tài liệu của

tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) mỗi năm trên thế giới sản xuất trên gần 2.000 triệu tấn đường Trong đó đường mía chiếm hơn 70% Hiên nay Châu Mĩ La Tinh là nơi có diện tích sản lượng mía cao nhất thế giới, tiếp đến

là Châu á, Châu Phi, Châu úc và Châu Âu

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, ngoài việc nghiên cứu cải tiến kĩ thuật canh tác trong nghề trồng mía như cơ giới hóa, hóa học hóa, thủy lợi hóa Người ta còn lai tạo ra các giống mía cao sản có hàm lượng đường cao đưa vào sản xuất nhằm đáp ứng nhu cầu đường của nhân loại ngày càng tăng Mức tiêu thụ đường của nhân dân các nước trên thế giới cũng khác nhau Riêng các nước Châu Âu sử dụng đường nhiều nhất khoảng 70kg/người/năm Các nước khác

khoảng 30kg/người/năm Dưới đây là bảng thể hiện 10 nước trồng mía nhiều nhất trên thế giới trong đó sản lượng trồng mía nhiều nhất là Brasil với tổng sản lượng 733.025 nghìn tấn/năm

b Tình hình trồng mía ở Việt Nam:

ở nước ta, tính cho tới năm 2009 thì tổng diện tích trồng mía của cả nước

là 306.600 ha, có thể chia thành năm vùng trồng mía lớn:

- Vùng trồng mía ở các tỉnh phía Bắc: Chiếm diện tích khoảng 30.000 ha bao gồm vùng núi đồng bằng thuộc nhà máy đường Vạn Điểm, vùng mía thuộc nhà máy đường Lam Sơn, vùng núi thuộc nhà máy đường sông Lam (Nghệ An,

Hà Tĩnh), nhà máy đường Việt Trì (Phú Thọ)

- Vùng trồng mía ở các tỉnh miền Trung: Diện tích trên 55.000 ha bao gồm vùng mía thuộc nhà máy đường Quảng Ng,i, Phú Yên, Tháp Chàm-Phan Giang và một số vùng khác

10 nước sản xuất mía đường hàng đầu thế giới-năm 2009

- Vùng mía Tây Nguyên: Diện tích khoảng 12.600 ha gồm các tỉnh Gia Lai, Komtum, Đắc Lắc, Lâm Đồng

- Vùng trồng mía miền Đông Nam Bộ: Gồm các tỉnh Tây Ninh, Sông Bé,

Đồng Nai và thành phố Hồ Chí Minh

- Vùng miền Tây Nam Bộ được xem là vùng trồng mía lớn nhất của cả nước với diện tích là 120.000 ha Trải đều trên 9 tỉnh của đồng bằng sông Cửu Long

Diện tích trồng mía hiện nay của các tỉnh nước ta được thể hiện trong bảng dưới đây:

Vùng mía Diện tích

(1000 ha)

Năng xuất (Tấn/ha) Sản lượng

- Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schawann và Schleiden đ, đề

xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là học thuyết tế bào có nêu:

+ Mọi cơ thể được cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào

+ Tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức

nhỏ nhất của sự sống

+ Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào trước đó

Người dầu tiên là Haberlandt năm 1898 đ, đề xuất ra lý thuyết về tính toàn

năng của tế bào, ông cũng là người đầu tiên đưa ra các giả thuyết Schleiden và

Schwann vào thực nghiệm Ông đ, đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào Theo ông, mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào đều có đủ vật liệu để hình thành nên tế bào mới Vì vậy, khi gặp

điều kiện thích hợp mỗi tế bào có thể phát triển thành cơ thể hoàn chinh

Haberlandt đ, nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng chưa thành công

Đến năm 1922, Robbinsd đ, thành công trong nuôi cấy đầu rễ cây hòa thảo

kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose

Năm1934 White người Mỹ đ, nuôi cấy thành công trong thời gian đầu rễ cà

chua với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men Sau

đó ít lâu ông đ, chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng ba loại vitamin nhóm B: Thiamin(B1), Piridixin(B6) và Nicotinic axit Cùng năm này,

Gautheret thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ tượng tầng của cây Salix

apraea và cây Populus nigra Mô nuôi cấy đ, phân chia liên tục trong môi trường

Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride

Went và Thimann năm 1937 đ, phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật đầu tiên

là axit α-indolacetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ

Năm 1983 Gautheret đ, thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng với thời

gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch bằng cách cấy chuyển đều đặn

6 tuần 1 lần

Năm 1941, Overbeck người Mỹ đ, chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng

của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà Trong thời gian này, nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm Auxin đ, được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công như: α-Naphylacetic (NAA) và 2,4 Dichlorphenolacetic (2,4-D) Nhiều tác giả đ, nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đ, giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy

Năm 1954, Skoog đ, phát hiện ra Kinetin (Furfuryl-Amino-Purine) là chất

điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi Sau này người ta cũng thấy Zeatin tách từ mầm ngô có hoạt tính tương tự Kinetin Cả hai chất này đều thuộc nhóm Cytokinin

Năm 1960, Bergman đ, phát triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên một bước

mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kỹ thuật gieo cấy tế bào thực

vật trên đĩa thạch như gieo trải vi sinh vật Cũng năm 1960, Cooking đ, dùng men

Cellulase để phân hủy Xenllulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào trần (Protoplas)

Guha và Maheswari năm 1964 đ, công bố tạo thành cây đơn bội từ nuôi cấy

túi phấn cây cà độc dược

Bourgin và Nitsch năm 1967, Nakata năm 1968 tạo thành công cây đơn bội từ

bao phấn thuốc lá mở ra triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội vào công tác giống và

di truyền

Đến năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ Protoplast

thuốc lá giống xanthi

Melchers năm 1977 đ, lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây

Năm 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố

Năm 1994 là năm đánh dấu cây cà chua trồng đầu tiên (cà chua Flav’r Sav’r)

có mặt trên thị trường thực phẩm ở Hoa Kỳ Cùng năm đó giống củ cải đường mang gen kháng virus biến nạp được công bố

Đến nay đ, có hàng trăm loài cây đ, được nuôi cấy mô thành công với nhiều

mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn…Đặc

biệt nhờ nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đ, được tạo ra như cà chua, lúa, ngô,

đậu tương, khoai tây, đu đủ, lúa, mía…

1.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vât :

Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế

bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902 Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì

tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rễ đó phân hóa để mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thuận lợi thì mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Để thể hiện

tính toàn năng tế bào phải trải qua 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn 1 : Là giai đoạn tế bào phản phân hóa với sự phát sinh của tế bào

khả biến

+ Giai đoan 2 : Tế bào trải qua sự định hướng phân hóa

+ Giai đoạn 3 : Sự phát sinh hình thái và phát triển cơ quan

Qúa trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả của

quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Như vậy kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách định hướng Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở đơn vị mô tế bào các nhà sinh học thực hiện các kĩ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng

Qúa trình phân hóa và phản phân hóa được biểu diễn dưới sơ đồ sau:

Trong đó:

+ Tế bào hợp tử là tế bào ban đầu

+ Tế bào phôi sinh là tế bào chưa có chức năng riêng biệt

+ Tế bào chuyên hóa là các tế bào đ, mang chức năng riêng biệt 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật:

a Môi trường nuôi cấy:

*Môi trường vật lý:

- ánh sáng:

Sự phát sinh hình thái của mô cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, với đa số các loài cây thời gian chiếu sáng thích hợp là từ 12-18h/ngày Cường độ ánh sáng cũng

là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy,

Tế bào hợp tử

Phân hóa tế bào

Phản phân hóa

tế bào

Tế bào phôi sinh

Tế bào chuyên hóa

cường độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong khi cường độ ánh sáng thấp sẽ hình thành mô sẹo Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000 lux Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của

mô thực vật in vitro ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng

trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo

- Nhiệt độ:

Nhiệt độ phòng nuôi cấy mô tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu mô nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ phù hợp Thường cây nhiệt đới đòi hỏi nhu cầu nhiệt độ cao hơn so với cây ôn đới

* Môi trường hóa học:

Môi trường hóa học là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng trưởng phát sinh mô trong suốt quá trình sinh hóa của cây Cơ sở của việc xây dựng các môi trường nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của cây Hầu hết các loại môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm:

- Các nguyên tố đa lượng và vi lượng:

• Nguyên tố đa lượng: Sử dụng ở nồng độ > 30 ppm Những nguyên tố N,

S, P, K, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tượng

Nitơ: Dùng ở dạng muối NO3- và NH4+ riêng rễ hoặc phối hợp với nhau Photpho: Là nguyên tố mà mô tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu cao và thường được đưa vào môi trường ở dạng đường Photpho

Lưu huỳnh: Được sử dụng ở dạng muối SO42- nồng độ thấp còn dạng SO3

2-và SO22- kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trường nuôi cấy

Na+ và Cl-: Cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng với muối khoáng khi điều chỉnh ph môi trường

• Các nguyên tố vi lượng:

Là những nguyên tố được sử dụng ở nồng độ < 30 ppm (< 30mg/l) Các nguyên

tố vi lượng như Fe, Cu, Zn, Bo, Co, I2 Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng

trong các hoạt động của Enzyme Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng

Fe: Thiếu Fe làm giảm ARN, Protein nhưng lại làm tăng ADN và các axit amin

tự do làm cho các tế bào không phân chia

Mn: Thiếu Mn làm cho ADN và các axit amin tự do tăng lên nhưng lượng mARN và sự sinh tổng hợp protein bị giảm làm giảm sự phân bào

Bo: Thiếu Bo trong môi trường nuôi cấy thường gây lên biểu hiện thừa Auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế Auxin oxydase trong tế bào phát triển Mô nuôi cấy có biểu hiện tạo mô sẹo hóa mạnh nhưng thường là mô xốp, mọng nước, kém tái sinh

• Nguồn Cacbon:

Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức dị dưỡng (hoàn toàn sử dụng

các chất dinh dưỡng của môi trường) Để sử dụng được thì nhờ nguồn Cacbon

từ môi trường đưa vào thông qua các loại đường khác nhau như: Saccarose, Mantose, Fructose Hàm lượng đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy tùy thuộc vào mô nuôi cấy

• Vitamin:

Nuôi cấy in vitro khi chồi tái sinh chồi vẫn tự tổng hợp được vitamin nhưng

không đủ do vậy phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy đặc biệt là vitamin nhóm B Tùy thuộc vào các loại mô nuôi cấy và giai đoạn nuôi cấy mà hàm lượng vitamin bổ sung vào khác nhau

Dịch chiết nấm mem: Thành phần chủ yếu chứa đường, axit nucleic, axit amin, vitamin, auxin, muối khoáng

Dịch thủy phân Casein: Làm nguồn bổ sung axit amin

Agar: Đây là thành phần polisaccharit của tảo có tác dụng làm đông môi trường ở nhiệt độ < 40 0C Thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ 5g/l

đến 6g/l

• Các chất điều hòa sinh trưởng:

Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Bằng cách cung cấp các chất ở một mức độ hợp

lý thì chúng ta có thể điều khiển được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy Auxin và Cytokinin là hai chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay

Auxin cần bổ sung vào giai đoạn tạo callus, kéo dài chồi và nhân nhanh

in vitro.

Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn ra rễ, nhân chồi

Tỷ lệ kết hợp giữa Auxin và Cytokinin phù hợp sẽ định hướng cho cây tạo rễ hay tạo chồi:

b Vật liệu nuôi cấy:

Về nguyên tắc thì mọi loại tế bào (tế bào của mô rễ, thân, lá, cành ) của một cơ thể thực vật đều có tính toàn năng nghĩa là vẫn có khả năng nuôi cấy thành công Tuy nhiên các loại tế bào, các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau

c Điều kiện vô trùng:

Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô tế bào Môi trường và các thiết bị sử dụng cấy phải được vô trùng tuyệt đối Nếu điều kiện, thiết bị cấy không đảm bảo thì môi trường sẽ bị nhiễm, mô cấy sẽ bị chết

1.2.4 Các phương pháp nhân giống invitro:

Phương pháp nhân giống in vitro là một phương pháp nhân giống hiện đại so

với cách nhân giống cổ điển như ghép, chiết, giâm cành Nhân giống in vitro hay vi

nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng của công nghệ

nuôi cấy mô tế bào thực vật Từ thực tế cho thấy thì phương pháp nhân nhanh in

vitro đ, đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất trong các phương pháp nuôi cấy mô Có

ba phương thức để tạo cây invitro

a Hoạt hóa chồi nách :

Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các

đỉnh chồi hay đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:

- Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi nách hoặc chồi đỉnh hiện tượng

này xảy ra khi cây nuôi cấy là loài cây hai lá mầm như khoai tây, hoa cúc

- Cách 2: Tạo cụm chồi: Hiện tượng này xảy ra với các cây có một lá mầm

như cây mía, cây lúa

b Phương pháp tạo chồi bất định:

Chồi bất định là chồi được hình thành từ các cơ quan, các bộ phận khác nhau của cây mà không phải là hợp tử như chồi hình thành từ callus

Tạo chồi bất định sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh tế bào để bắt tế bào sôma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo

c Phương pháp tạo phôi vô tính:

Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào soma

gọi là phôi vô tính Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện quá trình phản phân hóa và tái sinh

tế bào để tách các tế bào sôma, hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô seo Sự hình thành phôi trải qua hai bước chính:

Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi Trong quá trình

này cần môi trường giàu Auxin vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi, đồng thời Auxin giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là

các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm

đặc, giàu protein, ARN thông tin

Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành Môi trường nuôi cấy của giai

đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, nếu nồng độ của Auxin cao kích thích

sự tạo thành phôi nhưng lại ức chế cho quá trình phân hóa và phát triển tiếp theo của phôi này Như vậy nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lí rất quan trọng để

có các phản hồi thích hợp Nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nồng độ cao

có thể gây ức chế hoặc gây độc

d Các bước chính trong nhân giống in vitro:

Theo George (1993), quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm năm

bước sau:

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ: Trước khi tiến hành nhân giống in

vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ vì đây là cây cho nguồn mẫu nuôi cấy Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt phải sạch virut và đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện thích hợp với chế độ chăm sóc

và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm,

tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

Bước 2: Nuôi cấy khởi động: Là giai đoạn khử trùng đa mẫu cấy in vitro

Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỉ lệ nhiễm thấp, tỉ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách được sử dụng để nhân nhanh một số cây như mía, măng tây, khoai tây, hoa cúc

Bước 3: Nhân nhanh: Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình

thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định, tạo phôi vô tính Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất Theo nguyên tắc chung, môi trường

có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi Chế độ nuôi cấy thường là 25-27 0C và 16h chiếu sáng/1 ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ nuôi cấy khác nhau

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh: Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển

chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường

được bổ sung một lượng nhỏ Auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi

chuyển sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng

Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm: Để cây đưa ra ngoài vườn ươm được phát

triển tốt cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau:

+ Cây phải đảm bảo về chiều cao của rễ, lá

+ Giá thể dùng để trồng cây phải tơi, xốp, thoát nước tốt

+ Phải điều chỉnh độ ẩm, cường độ chiếu sáng, chế độ dinh dưỡng phù hợp

Quy trình nhân nhanh của các giống mía được thể hiện trong sơ đồ dưới đây:

Chọn mẫu và xử

lý mẫu Chọn cây ưu việt từ giống ưu việt Chọn mẫu và xử lý mẫu

Nuôi cấy chồi

đỉnh (chồi nách)

Tạo callus từ lát cắt lá non

Tạo cụm chồi

Kéo dài chồi Tái sinh chồi

Đưa cây ra ngoài

đồng ruộng

Đưa cây ra vườn ươm

Ra rễ tạo cây hoàn

chỉnh

1.2.6 ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm hàng loạt các kĩ thuật khác nhau đ, đem lại khả năng ứng dụng hết sức rộng r,i trong nhiều lĩnh vực, bao gồm:

- Tạo mô sẹo và cây đơn bội

- Tạo đột biến ở mức đơn bội

- Tạo đột biến ở mức độ tế bào

- Tạo tế bào trần để lai vô tính

- Nghiên cứu sinh lý phát triển

- Là đường hướng tái sinh chủ ứng dụng:

Phân hóa phôi

vô tính

+ Nhân nhanh + Sản xuất hạt nhân tạo

- Cung cấp vật liệu để tạo các Protoplat có khả năng sinh phôi

- Cho phép cơ khí hóa quá trình nuôi cấy và sử dụng bioreactor

- Tạo các biến dị di truyền thông qua lai hữu tính ở các dòng ưu

Tên “Auxin” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp Auxein, có nghĩa là tăng trưởng Auxin là nhóm chất kích thích sinh trưởng đầu tiên được con người khám

phá ra Charles Darwin là một trong các nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về

Auxin Auxin được hình thành liên tục trên đỉnh chồi và rễ của cây Auxin điều chỉnh tốc độ mở rộng của tế bào trong vùng sinh trưởng của đỉnh thân cây và liên quan đến phản ứng uốn cong trong tính hướng ánh sáng, hướng đất của cây Năm

1880 Saclo Đacuyn(Darwin) đ, phát hiện ra rằng ở các bao lá mầm của cây họ

hòa thảo rất nhạy cảm với ánh áng Nếu chiếu một chiều thì gây quang hướng động nhưng nếu che tối hoặc cắt chồi ngọn thì không xảy ra hiện tượng trên Năm 1934

giáo sư khoa học Hà Lan Koc (Kogl) đ, tách ra một chất từ dịch chiết nấm men có hoạt tính tương tự chất kích thích sinh trưởng Năm 1935 Thiman cũng tách được

chất này từ nấm Rhyzopus Sau đó người ta tách chiết được Auxin từ nhiều loại thực

vật khác nhau Việc phát hiện ra Cytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào

thực vật Năm 1955 Miller và Skoog đ, phát hiện và chiết xuất từ tinh dịch cá thu

một hợp chất có khả năng kích thích sự phân chia tế bào rất mạnh mẽ trong nuôi

cấy mô gọi là Kinetin Năm 1963 Letham và Miller lần đầu tiên tách được

Cytokinin tự nhiên ở dạng kết tinh từ hạt ngô gọi là Zeatin và có hoạt tính tương tự Sau đó người ta phát hiện Cytokinin có ở trong tất cả các loại thực vật khác nhau và

là một nhóm Phytohormone quan trọng ở trong cây

Trong nuôi đề tài này chúng tôi sử dụng hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng chính là Auxin và Cytokinin

1.3.2 Nhóm Auxin:

- Auxin là nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó được kết hợp với

Cytokinin

- Axin có tác dụng nhiều mặt lên quá trình sinh lý của tế bào, hoạt động của

tầng phát sinh, quả Tác dụng sinh lý của Auxin chủ yếu làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm h,m sự sinh trưởng của chồi bên, kìm h,m sự rụng hoa, rụng quả Auxin hoạt hóa các hợp chất cao phân tử (Protein, Cellulose, Pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng Auxin được xem là hormone thực vật quan trọng nhất vì chúng có vai trò rất cơ bản trong quá trình phối hợp sinh trưởng và biệt hóa tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thường của thực vật Auxin cùng với một số chất điều hòa khác đảm bảo cho sự tạo thành khối các tế bào đang phân chia thành cơ quan thực vật hoàn chỉnh

- Có bốn yếu tố ảnh hưởng tới sự lựa chọn loại Auxin:

+ Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu của mẫu cấy

+ Hàm lượng Auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy

+ Khả năng tổng hợp Auxin nội sinh của mẫu cấy

+ Sự tác dụng qua lại giữa Auxin nội sinh và Auxin ngoại sinh

- Vai trò chính của Auxin:

+ Kích thích sự phân chia tế bào và kéo dài tế bào

+ Kích thích sự hình thành callus

+ Kích thích tạo rễ bất định

+ Gây hiện tượng ưu thế ngọn

- Một số Auxin thường sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:

+ IAA : β-Indol Acetic Acid

+ IBA : β-Indol Butyric Acetic Acid

+ NAA : α-Naphthyl Acetic Acid

+ 2,4-D : Dichlophenolxy Acetic Acid

1.3.3 Nhóm Cytokinin:

- Cytokinin là dẫn xuất của Adenin đây là những hormon liên quan chủ yếu tới sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong mô nuôi

cấy

- Cytokinin có tác dụng kích thích dự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy mô và

làm tăng tốc độ phân bào Khi ở nồng độ cao, nó có tác dụng kích thích sự tạo chồi,

đồng thời ức chế sự phân hóa rễ của mô cấy Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia của tế bào, trong quá tình này cytokinin cần thiết nhưng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin

- Vai trò chính của nhóm Cytokinin:

+ Kích thích sự phân chia tế bào

+ Kích thích sự phát triển chồi nách, kìm h,m ảnh hưởng của ưu thế ngọn + Tăng diện tích phiến lá

+ Tạo và nhân callus

+ ức chế sự hình thành rễ, sự kéo dài chồi và quá trình già lá

- Một số Cytokinin thường dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:

+ BAP: Benzyl Adenin Phenol

+ Kinetin

+ Zeatin

Chất điều hòa sinh trưởng là yếu tố quyết định sự thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Tuy nhiên phải hết sức lưu ý về nồng độ và thời kỳ bổ sung các

chất này vào môi trường Vì nếu ta bổ sung không đúng nồng độ, không đúng thời

kỳ thì các chất này sẽ ức chế sự phát triển của cây gây thiệt hại lớn cho nuôi cấy

1.3.4 Các nhóm điều hòa sinh trưởng khác:

Absisic Acid và nhóm Etylen:

Ngoài ba nhóm chất trên còn có các chất kích thích sinh trưởng khác như Etylen, Absisic Các chất này cũng gây ảnh hưởng khá rõ đến sự phát sinh hình

thái của một số loài cây trồng nuôi cấy in vitro Tuy nhiên thì nhóm hai nhóm chất

điều hòa sinh trưởng này ít được sử dụng

PHầN 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1: Vật liệu nghiên cứu:

- Vật liệu: Sử dụng trong các thí nghiệm là hai giống mía ROC26 và BH1

nhập ngoại từ Đài Loan có năng xuất và trữ lượng đường cao

- Các thiết bị nghiên cứu: Panh, kéo, dao cắt, box cấy vô trùng, đền UV,

cân kĩ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo

pH, máy khuấy từ, bếp từ…

- Hóa chất: Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là môi trường MS cơ bản

gồm các muối đa, vi lượng, các hợp chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và

Skoog (1962) (xem Phụ lục) Đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như: BAP, NAA, IAA, IBA, kinetin được bổ sung vào môi trường cơ bản theo từng giai đoạn nuôi cấy

- Điều kiện nuôi cấy: Phòng nuôi cấy được trang bị đảm bảo nhiệt độ nuôi

từ 25-27 0 C và chế độ chiếu sáng 12h/24h với cường độ chiếu sáng là 2600 lux

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm-viện Di Truyền Nông

Nghiệp - km 2 đường Phạm Văn Đồng- Từ Liêm- Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 6/2009 đến tháng 6/2010

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

- Các nhân tố nghiên cứu là chỉ tiêu nghiên cứu được chia thành các công

thức thí nghiệm khác nhau, có công thức đối chứng

- Số mẫu đưa vào của mỗi công thức thí nghiệm đủ lớn

-Thí nghiệm được lặp lại ít nhất ba lần

2.2.1 Chọn mẫu và xử lí mẫu:

a Chọn mẫu: Chọn đúng giống mía cần nghiên cứu ROC26 và BH1, chọn

những khóm mía to, khẻo, không bị sâu bệnh để lấy phần ngọn.Chọn những cây mía còn non có sức nảy mầm và khả năng tái sinh cao, ít hoạt chất thứ cấp làm đen môi trường hơn so với ngọn già Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá, bóc tất cả phần bẹ