bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro sa nhân tím (amomum longiligulare t.l.wu)

Năm 1960, Morel ñã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại ñịa lan Cymbidium, mở ñầu công nghiệp vi nhân giống thực vật

MỞ đẦU

Cây thuốc Việt Nam rất phong phú và ựa dạng Việc sử dụng nguồn tài nguyên quý giá này ựể phòng ngừa chữa bệnh và nâng cao sức khỏe cho con người ựã có một quá trình lịch sử hàng ngàn năm và ngày càng ựược chú ý quan tâm hơn trong xã hội hiện ựại

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ựang phát triển rất mạnh và dần trở thành một ngành sản xuất mang hiệu quả kinh tế cao Công nghệ này ựã giúp tạo ra ựược một số lượng lớn cây trồng ựồng nhất trong một thời gian ngắn, duy trì các tắnh trạng tốt từ thế hệ này sang thế hệ khác Thực chất, nuôi cấy mô tế bào thực vật là một bước tiến bộ vượt bậc về chất của các phương pháp nhân giống vô tắnh cổ ựiển như giâm cành, chiết, ghép, tách dòngẦ Nói cách khác, nuôi cấy mô ựã biến những phương pháp cổ ựiển ựó thành những phương thức hoàn toàn mới về chất mà phương pháp cổ ựiển không thể vượt qua [10]

Trong những năm gần ựây, nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô

ựã áp dụng thành công cho nhiều loại cây đối với những loại cây trồng có giá trị thương mại lớn, kỹ thuật nuôi cấy mô ựã ựem lại những hiệu quả kinh tế hết sức rõ rệt Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành khoa học có nhiều triển vọng, ựược ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực kinh tế

Sa nhân tắm (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc họ Gừng (Zinggiberaceae) chi Amomum, là một loại dược liệu rất quý, chuyên trị các

bệnh ựường ruột, kém tiêu hóa và dung làm gia vị, hương liệu Sa nhân ựược dùng nhiều trong nước và ựược xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới

Sa nhân là loại thuốc quý ựược sử dụng nhiều trong y học phương đông, bao gồm cả Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Triều tiên và một số quốc gia khác Hạt sa nhân còn ựược dùng làm gia vị, tinh dầu hạt sa nhân

cũng ñược dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm ñể sản xuất nước hoa, dầu gội ñầu và

xà phòng thơm

Sa nhân tím phân bố chủ yếu ở vùng Tây Nguyên và một số tỉnh thuộc khu vực duyên hải Nam Trung Bộ, là một loại cây ưa bóng và mọc xen giữa nhiều cây khác Sa nhân trong tự nhiên phát triển rất mạnh Mỗi năm cứ ñến

vụ người ta lại vào rừng hái quả sa nhân ñem di bán Với giá 8.000 – 10.000 ñ/kg quả sa nhân tươi, sau khi phơi là 150.000 – 200.000 ñ/kg quả khô thì sau trồng 2 năm ñã cho thu nhập 6 – 8 triệu ñồng/ha và những năm tiếp theo còn cao hơn [15]

Hiện nay, diện tích rừng tự nhiên ngày càng bị thu hẹp do nạn phá rừng, do triệt hạ rừng tự nhiên ñể mở rộng diện tích sản xuất nông nghiệp như: trồng rừng cao su, trồng rừng keo, trồng sắn ñã làm thu hẹp phân bố của cây sa nhân, làm giảm trầm trọng năng suất, sản lượng hằng năm, ảnh hưởng nghiêm trọng ñến kinh tế và ñời sống của hộ gia ñình vùng núi

Trước thực trạng ñó nếu chúng ta không kịp thời khoanh vùng, bảo vệ, trồng mới và có những biện pháp tích cực thì nguồn gen quý giá này cũng dần

bị mất ñi

Nhân giống sa nhân bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra ñược một sản lượng lớn cây giống sạch bệnh phục vụ cho sản xuất, khắc phục ñược những khó khăn trong việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp cây giống, giúp cho người dân chủ ñộng ñược mùa vụ không phải mất diện tích trồng cũng như chi phí lưu trữ giống Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hàh dề tài

: " Bước ñầu nghiên cứu nhân giống in vitro sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu)

Phần 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NHÂN GIỐNG INVITRO THỰC VẬT

1.1.1 Lược sử phát triển và tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.1.1.1 Lược sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi

và ñưa ra khái niệm "tế bào - Cell" Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann ñề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào:

+ Mọi cơ thể sống ñược cấu tạo bởi một hoặc nhiều tế bào

+ Tế bào là ñơn vị cấu trúc và chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ

nhất của sự sống

+ Tế bào chỉ ñược tạo ra từ tế bào tồn tại trước ñó [5]

Năm 1902, Haberlandt lần ñầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công Năm 1934, Kogl lần ñầu tiên xác ñịnh ñược vai trò của IAA, hoocmon thực vật ñầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White ñã ñồng thời nuôi cấy callus thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá, callus có khả năng sinh trưởng liên tục Năm 1941, Overbeek và cs ñã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non ở cây cà rốt Datura Năm 1955, Miller và cs ñã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin ñóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy ðến năm 1957, Skoog và Miller ñã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng ñộ các chất auxin/cytokinin trong môi trường ñối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng ñộ IAA/ nồng ñộ kinetin) nhỏ hơn 1

và càng nhỏ, mô có xu hướng tạo chồi Ngược lại khi tỷ lệ IAA/kinetin lớn

hơn 1 và càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ Tỷ lệ nồng ñộ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh [10], [18]

Năm 1949, Limmasets và Cornuet ñã phát hiện rằng virus phân bố không ñồng nhất trên cây và thường không thấy có virus ở vùng ñỉnh sinh trưởng Năm 1952, Morel và Martin ñã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6

giống khoai tây từ nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng Ngày nay, kỹ thuật này với

một số cải tiến ñã trở thành phương pháp loại trừ bệnh virus ñược dùng

rộng rãi ñối với nhiều loài cây trồng khác nhau Năm 1952, Morel và Martin

lần ñầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công Kỹ thuật vi ghép sau ñó ñã ñược ứng dụng rộng rãi trong tạo nguồn giống sạch bệnh virus và tương tự virus ở nhiều cây trồng nhân giống bằng

phương pháp vô tính khác nhau, ñặc biệt là tạo giống cây ăn quả sạch bệnh Năm 1960, Morel ñã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại ñịa lan Cymbidium, mở ñầu công nghiệp vi nhân giống thực vật [18]

Năm 1960, Cocking lần ñầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tế bào và ñã tạo ra số lượng lớn tế bào trần Kỹ thuật này sau ñó ñã ñược hoàn thiện ñể tách nuôi tế bào trần ở nhiều cây trồng khác nhau Năm 1971, Takebe và cs ñã tái sinh ñược cây từ tế bào trần mô thịt lá (mesophill cell) ở thuốc lá Năm 1972, Carlson và cs lần ñầu tiên thực hiện lai tế bào soma giữa các loài, tạo ñược cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá

Nicotiana glauca và N langsdorfii Năm 1978, Melchers và cs tạo ñược cây

lai soma "cà chua - thuốc lá" bằng lai xa tế bào trần của 2 cây này ðến nay, việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào trần hoặc từ lai tế bào trần ñã thành công ở nhiều loài thực vật [17]

Năm 1964, Guha và Maheshwari lần ñầu tiên thành công trong tạo ñược cây ñơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura Kỹ thuật này sau ñó ñã ñược nhiều tác giả phát triển và ứng dụng rộng rãi trong tạo dòng ñơn bội, dòng thuần nhị bội kép, cố ñịnh ưu thế lai (nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn của dòng lai F1 ñể tạo giống thuần mang tính trạng ưu thế lai) [18], [19]

Năm 1959, Tulecke và Nickell ñã thử nghiệm sản xuất sinh khối mô

thực vật quy mô lớn (134 lít) bằng nuôi cấy chìm Năm 1977, Noguchi và cs

ñã nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor dung tích lớn 20.000 lít Năm

1978, Tabata và cs ñã nuôi tế bào cây thuốc ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin Họ ñã chọn lọc ñược dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp (shikonin) cao hơn Năm 1985, Flores và Filner lần ñầu tiên

sản xuất chất trao ñổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở Hyoscyamus muticus

Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn cây tự nhiên Hiện nay, công nghệ nuôi cấy tế bào và mô (ví dụ, mô rễ của nhân sâm) trong các bioreactor dung tích lớn ñã ñược thương mại hoá ở mức công nghiệp ñể sản xuất sinh dược [18], [19]

Năm 1981, trên cơ sở quan sát các biến dị xảy ra rất phổ biến trong nuôi cấy mô và tế bào với phổ biến dị và tần số biến dị cao, Larkin và Scowcroft ñã ñưa ra thuật ngữ "biến dị dòng soma" (somaclonal variation)

ñể chỉ các thay ñổi di truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro Từ các dòng tế bào hoặc cây biến dị di truyền ổn ñịnh có thể nhân

nhanh, tạo ra các dòng và giống ñột biến có năng suất, hàm lượng hoạt chất hữu ích cao, kháng một số các ñiều kiện bất lợi như bệnh, mặn, hạn,… [18] ðến nay các nhà khoa học ñã khẳng ñịnh rằng mức ñộ thành công của chuyển gen vào cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào hệ thống nuôi cấy và tái

sinh tế bào thành cây in vitro sau chuyển gen Năm 1974, Zaenen và cs ñã

phát hiện plasmid Ti ñóng vai trò là yếu tố gây u (crown gall) ở cây trồng Năm 1977, Chilton và cs ñã chuyển thành công T- DNA vào thực vật Năm

1979, Marton và cs ñã xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng

ñồng nuôi cấy tế bào trần và Agrobacterium Năm 1982, Krens ñã chyển

thành công DNA vào tế bào trần Năm 1985, Fraley và cs thiết kế vector plasmid Ti ñã loại bỏ các gen ñộc gây hại ñể sử dụng cho việc thiết kế vector chuyển gen vào thực vật Cùng trong năm, Horsch và cs ñã chuyển gen vào

mảnh lá bằng Agrobacterium tumefaciens và tái sinh cây chuyển gen An và

cs (1985) ñã phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật Năm

1987, Klein và cs ñã sử dụng súng bắn gen (particle gun) mang vi ñạn trong chuyển gen và tái sinh ñược cây biểu hiện gen chuyển Năm 1994, thương mại hoá giống cà chua chuyển gen 'FlavrSavr' [19]

1.1.1.2 Tầm quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Trong nhiều thập kỉ qua, nuôi cấy mô tế bào thực vật ñã phát triển mạnh

mẽ ở nhiều quốc gia trên thế giới Có thể nói ñây là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học

Nhờ áp dụng các kĩ thuật nuôi cấy mô như: nuôi cấy mô phân sinh, callus, nuôi cấy phôi, nuôi cấy rễ tơ, nuôi cấy tế bào trần… con người ñã thúc ñẩy thực vật sinh sản nhanh hơn, gấp nhiều lần tốc ñộ vốn có trong tự nhiên ðiều này sẽ góp phần tạo ra hàng loạt các cá thể mới giữ nguyên các tính trạng di truyền của cơ thể mẹ và rút ngắn thời gian ñể ñưa một giống mới và sản xuất với quy mô lớn [11], [19]

Ngoài ra, dựa vào kĩ thuậ nuôi cấy, có thể duy trì và bảo quản ñược nhiều giống cây trồng quý hiếm, hoặc loại bỏ các mầm bệnh của những loài thực vật sinh sản sinh dưỡng Sử dụng kĩ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần có thể tạo ra những con lai về mặt di truyền mà phương pháp lai giống

cổ ñiển không thực hiện ñược Bên cạnh ñó, các nhà nghiên cứu ñã thu nhận các chất trao ñổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy, dẫn ñến sự ổn ñịnh và ñộc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên " mở ra triển vọng

sử dụng kĩ thuật này ñể nuôi cấy sinh khối lớn có khả năng tổng hợp những chất sinh học ñể thu nhận các hợp chất trên quy mô công nghiệp " [9]

Ưu ñiểm của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong ñiều kiện in vitro ñể

sản xuất các hợp chất thứ cấp:

+ Các tế bào thực vật có thể ñược nuôi cấy trong ñiều kiện nhân tạo

mà không phụ thuộc vào thời tiết và ñịa lý Không cần thiết ñể vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn các nguyên liệu thô

+ Có thể kiểm soát chất lượng và hiệu suất sản phẩm bằng cách loại bỏ những trở ngại trong quá trình sản xuất thực vật, như là chất lượng của

nguyên liệu thô, sự ñồng nhất giữa các lô sản xuất và sự hư hỏng trong quá trình vận chuyển và bảo quản

+ Một số sản phẩm trao ñổi chất ñược sản xuất từ nuôi cấy dịch huyền phù có chất lượng cao hơn trong cây hoàn chỉnh [11]

Một ý nghĩa không kém phần quan trọng của nuôi cấy mô tế bào thực vật là mở ra những hướng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế tổng hợp các chất, sinh lý phân tử, di truyền – ñột biến, sinh lý dinh dưỡng ở các tế bà thực vật và nhiều vấn ñề sinh học khác…[19]

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy

1.2.1.1 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng thực vật

Trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật, thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết ñịnh kết quả nuôi cấy là chất kích thích sinh trưởng Chất kích thích sinh trưởng thực vật là những chất ở nồng ñộ sinh lý có tác dụng kích thích các quá trình sinh trưởng của mô Tuy vậy, yêu cầu ñối với những chất này thay ñổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất ñiều hòa sinh trưởng nội sinh của chúng

* Auxin

Môi trường nuôi cấy ñược bổ sung các auxin khác nhau như: IAA, NAA, IBA, 2,4-D, NOA Trong ñó, IAA là auxin tự nhiên có trong mô thực vật; còn lại NAA, IBA, 2,4-D và NOA là các auxin nhân tạo, thường thì các auxin nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn vì do ñặc ñiểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxin oxydase) không có tác dụng [10]

Năm 1934, Kogl ñã tách ra một chất từ dịch chiết nấm men có hoạt tính tương tự chất sinh trưởng và năm 1935 Thiman cũng tách ñược chất này từ nấm rhyzopus Sau ñó người ta chiết tách ñược auxin từ các loại thực vật khác nhau (Hagen Sminth, 1941,1942, 1946 ) và ñã xác ñịnh bản chất hóa học của

nó là 1H- indole-3-acetic acid (IAA) Người ta ñã khẳng ñịnh rằng IAA là

dạng auxin chủ yếu, quan trọng nhất của tất cả các loại thực vật, kể cả thực vật bậc thấp và thực vật bậc cao [13]

ðặc ñiểm chung của các auxin là tính chất phân chia tế bào Các hormone thuộc nhóm này có các hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng (gióng), tính hướng (sáng, ñất), tính ưu thế ngọn, tạo rễ, và phân hóa mạch dẫn [5], [10]

Auxin là nhóm chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác của môi trường dinh dưỡng ñể kích thích sự tăng trưởng của

mô sẹo, huyền phù tế bào và ñiều hòa sự phát sinh hình thái, ñặc biệt là khi nó ñược phối hợp sử dụng với các cytokinin [5]

ðối với nuôi cấy mô, auxin ñã ñược sử dụng cho việc phân chia tế bào

và phân hóa rễ Những auxin ñược dùng rộng rãi trong nuôi cấy mô là IBA, IAA, NAA, 2,4-D và 2,4,5-T Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp với cytokinin sử dụng cho môi trường

ra chồi 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả ñối với môi trường tạo và phát triển callus Auxin thường hòa tan trong ethanol hoặc NaOH loãng

* Cytokinin

Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, ñây là những hormone liên quan chủ yếu ñến sự phân chia tế bào, sự thay ñổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin ñược sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc 6-benzyladenin (BA), 6-γ-γ-dimethyl-aminopurine (2-iP), N-(2-furfurylamino)-1-H-purine-6-amine (kinetin), và 6-(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butanylamino) purine (zeatin) Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung, chúng ñược hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng

Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa

chồi từ callus hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ

Kinetin ñược phân lập từ chế phẩm DNA cũ hoặc nucleic acid mới sau khi khử trùng ở nhiệt ñộ cao hay ñun sôi Kinetin không tồn tại trong cơ thể sống, sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồi của cây thuốc lá nuôi cấy, nhưng nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng ñộ thích hợp thì sẽ kích thích quá trình phân chia tế bào ở các mô không phân hóa

Hoạt lực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dưới tác ñộng của nhiệt ñộ cao BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao ñổi chất

Tỷ lệ auxin/cytokinin rất quan trọng ñối với sự phát sinh hình thái (morphogenesis) trong các hệ thống nuôi cấy ðối với sự phát sinh phôi (embryogenesis), ñể tạo callus và rễ cần có tỷ lệ auxin/cytokinin cao, trong khi ở trường hợp ngược lại sẽ dẫn ñến sự sinh sản chồi và chồi nách Vấn ñề quan trọng không kém là nồng ñộ của hai nhóm chất ñiều khiển sinh trưởng này Chẳng hạn 2,4-D cùng với BA ở nồng ñộ 5,0 ppm kích thích sự tạo thành

callus ở Agrostis nhưng nếu dùng ở nồng ñộ 0,1 ppm chúng sẽ kích thích tạo

chồi mặc dù trong cả 2 trường hợp tỷ lệ auxin/cytokinin là bằng 1 [10], [13]

1.2.1.2 Ảnh hưởng của than hoạt tính

Bổ sung than hoạt tính (AC) vào môi trường nuôi cấy ñã kích thích sinh trưởng và phân hóa ở các loài hoa lan, cà rốt, dây thường xuân và cà chua Ngược lại, nó gây ức chế ở thuốc lá, ñậu tương và các loài thuộc chi Camellia Nói chung AC ñược rửa acid và trung hòa trước khi bổ sung nó ở nồng ñộ 0,5-3% vào môi trường nuôi cấy AC cũng giúp làm giảm ñộc tố bằng cách ñào thải các hợp chất ñộc (ví dụ: phenol) ñược tạo ra trong quá trình nuôi cấy và cho phép tế bào sinh trưởng mà không bị trở ngại gì

Người ta cho rằng tác dụng cản sự tăng trưởng của mô cấy khi có sự hiện diện của than hoạt tắnh trong môi trường là do nó hút chất ựiều hòa sinh trưởng có trong môi trường NAA, kinetin, IAA, BAP, 2iP liên kết với than hoạt tắnh Khả năng kắch thắch sự tăng trưởng của than hoạt tắnh là do nó kết hợp với các hợp chất phenol ựộc tiết ra trong thời gian nuôi cấy [12]

1.2 VÀI NÉT VỀ SA NHÂN TÍM

1.2.1 đặc ựiểm thực vật

Sa nhân tắm hay sa nhân (Amomum Longgiligulare T L.Wu) còn có

tên ựịa phương là : Mắc néng, Mè tré bà, Dương xuân sa, Mắc nẻng, Sa ngần, Pa ựooc, La vêẦ

Lá mọc so le, xếp thành 2 dãy, mọc xiên hướng lên phắa trên Lá gần như không có cuống, mọc so le, xếp thành hai dãy Phiến lá hình elip dài 20 Ờ 40

cm, rộng 5 - 8 cm, gốc lá hình nêm, mặt trên màu lục ựậm, mặt dưới nhạt hơn, nhẵn, cuống lá dạng bẹ, dài 5 Ờ 10 cm hoặc hơn Lưỡi bẹ nhỏ, hình mác nhọn dài 1,5 Ờ 4,0 cm, màu nâu nhạt hoặc xám trắng, mỏng

Cụm hoa bông, mọc từ thân rễ và từ gốc; cuống cụm hoa dài 3 Ờ 6

cm, gồm nhiều ựốt, có vảy màu nâu Có 5 Ờ 8 hoa trên một cụm, màu trắng; cuống hoa rất ngắn Lá bắc ngoài hình bầu dục, màu nâu, dài 2,0 Ờ 2,5 cm, rộng 0,8 cm, mép nguyên; lá bắc trong dạng ống, màu nâu nhạt, dài 1,5cm, ựầu chia thành 2 thuỳ nông đài hoa dạng ống, dài 1,5 cm hoặc hơn, màu trắng hồng, ựầu xẻ 3 thuỳ Tràng hoa hình ống, dài 1,6 Ờ 1,7 cm, mặt

ngoài có lông thưa, gồm 3 thuỳ, thuỳ giữa dài 1,6 cm, rộng 0,4 cm, lớn hơn

2 thuỳ bên Cánh môi hình thìa, dài 1,7 - 1,8 cm, rộng 2,0 – 2,2 cm, ñầu cánh môi thường cuộn ra phía sau; vệt giữa cánh môi màu vàng, kéo dài lên ñến ñầu cánh môi, có 3 sọc tím hồng Bộ nhị dạng bản, dài 0,6 – 0,7 cm, rộng 0,3 cm, nhẵn; bao phấn 2 ô; trung ñới có mào, chia thành 3 thuỳ Bầu hình trứng thuôn, dài 0,4 – 0,5 cm; vòi nhuỵ mảnh (dạng chỉ) dài 2,0 – 2,5 cm; ñầu nhuỵ dạng phễu

Quả dạng quả nang, hình trứng hay gần hình cầu, dài 1,3 – 1,6 cm, ñường kính 1,2 – 1,3 cm; chia thành 3 múi nông; vỏ ngoài có gai ngắn, dày; màu tím nâu; khi già gai ngắn bớt và chuyển sang màu tím ñen Hạt nhiều gồm từ

13 – 28 hạt xếp thành 3 ô, có áo hạt màu trắng, vị hơi ngọt Hạt hình ña cạnh, màu nâu ñen, cắn vỡ có vị cay, mùi thơm của tinh dầu [3], [4]

1.1.1.2 Phân bố

Ở Việt Nam sa nhân chủ yếu mọc ở các tỉnh phía Nam: Quảng

Nam (huyện Trà My Tây); Quảng Ngãi (các huyện Sơn Hà, Sơn Tây, Ba Tơ); Bình ðịnh (các huyện Vĩnh Thạnh, Tây Sơn); Phú Yên (các huyện Sơn Hoà, Sông Hinh); Ninh Thuận (các huyện Ninh Sơn, Bắc Ái); Kon Tum (các huyện Ngọc Hồi, Sa Thày); Gia Lai (các huyện K’Bang, An Khê); ðắk Lắk (các huyện Krông Năng, Krông Ana, M' ðrắk, Krông Bông, Lắk) Ở miền Bắc mới chỉ phát hiện thấy mọc tự nhiên tại một ñiểm thuộc tỉnh Thanh Hoá và có thể có ở cả Phú Thọ và Hoà Bình

Trên thế giới sa nhân có ở Trung Quốc (Hải Nam) và Lào [2]

1.2.2 ðặc ñiểm sinh lý, sinh thái

1.2.2.1 Sinh thái

* ðặc ñiểm sinh thái chung của cây sa nhân tím: Cây ưa ẩm, hơi ưa sáng và chịu bóng Thường mọc tụ tập thành ñám dày ñặc trên ñất ẩm ở ven rừng kín thường xanh còn nguyên sinh hay ñã trở nên thứ sinh; ven bờ

các khe suối hay trên các nương rẫy thấp ñã bỏ hoang, liền kề với rừng

Sa nhân tím mọc tự nhiên trong các quần xã thứ sinh kể trên ở các tỉnh phía Nam, thường có ñộ tàn che từ 10 – 60%; ñộ cao dưới 600 m Thuộc vùng có khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm; nhiệt ñộ trung bình khoảng hơn 23oC; lượng mưa từ gần 1.600 ñến 3.300 mm/năm; ñộ ẩm không khí trung bình trên 80%

Cây sinh trưởng phát triển gần như quanh năm, nhưng mạnh nhất vào mùa mưa ẩm Sa nhân tím ra hoa quả ñều hàng năm Tái sinh tự nhiên chủ yếu bằng hạt và bằng cách mọc chồi từ thân rễ

Sa nhân tím là cây có biên ñộ sinh thái rộng, dễ trồng và có thể trồng ñược ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, từ vùng núi thấp ñến trung du và cả

ở ñồng bằng

* ðiều kiện sinh thái

- Khí hậu: Nhìn chung các loài sa nhân (trong ñó có sa nhân tím) chỉ

thấy ở vùng có khí hậu nhiệt ñới, chủ yếu ở Châu Á

Theo cách phân chia tiểu vùng khí hậu theo quan ñiểm ñịa lý thực vật thì sa nhân tím mọc tự nhiên ở Việt Nam (chủ yếu ở các tỉnh phía Nam) nằm trong khu vực nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm, với hai mùa mưa và khô khá rõ rệt Mùa mưa tập trung vào vụ hè hay vụ hè – thu, mùa khô ở các ñiểm có sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía Nam thường trùng với các tháng là mùa ñông và xuân ngoài miền Bắc Trong tổng số 4 –

5 tháng mùa khô ñó, có 2 – 3 tháng hoàn toàn không có mưa, nhưng do sống trong môi trường rừng ẩm, Sa nhân tím vẫn sinh trưởng phát triển tốt ðặc biệt là vụ hoa cuối tháng 3 ñầu tháng 4, do không bị mưa, trời luôn có nắng nên tỷ lệ ñậu quả của cây khá cao

Từ năm 1992 ñến nay, sa nhân tím ñã ñược thu thập ñưa ra trồng ở một số ñịa phương ở các tỉnh phía Bắc (Tân Lạc – Hoà Bình, Chân Mộng

- ðoan Hùng – Phú Thọ, huyện Bảo Thắng và thị xã Lào Cai – Lào Cai, ðại Từ – Thái Nguyên) Mặc dù cây ñược trồng ở môi trường khí hậu –

thời tiết hơi khác với nơi mọc tự nhiên, nhưng sa nhân tím vẫn sinh trưởng phát triển tốt và ra hoa kết quả nhiều

ðặc trưng khí hậu ở những ñịa ñiểm trồng sa nhân tím kể trên là: Khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng ẩm, có mùa ñông lạnh, mưa tập trung vào mùa hè – thu và mỗi năm cũng có 1 – 2 tháng ñược coi là khô hạn Tuy nhiên mức ñộ khô hạn ở ñây không ñến mức cực ñoan như ở các tỉnh phía Nam

Tóm lại, ñặc ñiểm cơ bản về khí hậu ñối với sa nhân tím là nền khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm, nhiệt ñộ trung bình năm vào khoảng trên 23oC Cây ñem trồng ở các tỉnh phía Bắc mặc dù có mùa ñông lạnh trương ñối kéo dài, nhưng vẫn sinh trưởng phát triển tốt ðiều ñó chứng tỏ, sa nhân tím có khả năng thích nghi khá cao với ñiều kiện thời tiết ở các vùng tiểu khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng và ẩm tại Việt Nam

* Thổ nhưỡng ñất ñai: Sa nhân tím mọc tự nhiên ở các tỉnh phía

Nam nhìn chung là ở trên loại ñất nâu - ñỏ phát triển trên bazan hoặc nâu

ñỏ phát triển trên bazan có mùn tích tụ ở chân núi (K’Bang – Gia Lai, Vĩnh Thạch – Bình ðịnh, Sơn Hoà - Phú Yên…) ðặc ñiểm chung của loại ñất này là có tầng ñất mặt sâu, tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước Tuy nhiên, sa nhân tím là cây thường mọc ở chỗ ñất thấp (ven rừng, thung lũng, gần hành lang ven suối), nên ở ñây loại ñất nâu - ñỏ bazan kể trên ít nhiều ñã có sự thay ñổi, do quá trình thường xuyên ñược tích luỹ thêm bởi lớp thảm mục nên ở tầng ñất mặt có màu nâu xám và nâu ñen Hàm lượng mùn và lân tổng số khá cao, nhưng kali lại thấp

Sa nhân tím trồng ở Tân Lạc – Hoà Bình; Chân Mộng – ðoan Hùng – Phú Thọ; Quân Chu - ðại Từ – Thái Nguyên; ngoại ô thị xã Lào Cai – Lào Cai… loại ñất ở ñây thuộc nhóm feralit vàng – ñỏ hay ñỏ – vàng Về cấu tượngcơ bản cũng có tỷ lệ hạt sét cao, tơi xốp, dễ thấm nước, dễ bị rửa trôi như loại ñất ñỏ – nâu hay nâu - ñỏ trên bazan Song ñiểm khác biệt cơ bản của các loại ñất ở các ñiểm kể trên thường nghèo về mặt dinh dưỡng, với

hàm lượng mùn, kali và lân tổng số thấp hơn (khoảng 30%) so với ñất nâu -

ñỏ hay ñỏ – nâu trên bazan

Ngoài ra, sa nhân tím ñem trồng thí nghiệm trên ñất phù sa sông Hồng (Vườn Trung tâm NC Lâm ðặc Sản và Trung tâm Cây thuốc Hà Nội ở Thanh Trì - thuộc Viện Dược liệu), cây vẫn sinh trưởng phát triển bình thường và ra hoa kết quả nhiều ðiều ñó chứng minh, sa nhân tím cũng có khả năng thích nghi cao ñối với một số loại ñất có quá trình lập ñịa khác nhau [16], [2]

1.2.2.2 Sinh lý

* Nhu cầu nước và ñộ ẩm: Nước và ñộ ẩm không khí là một nhân tố

sinh thái quan trọng ñối với quá trình sinh trưởng phát triển của cây sa nhân tím Nhờ có nước, rễ sa nhân tím mới hấp thụ ñược các chất hữu cơ và chất khoáng hoà tan trong nước ñể thực hiện quá trình ñồng hoá Trong những tháng mùa khô ở các tỉnh phía Nam, cây sa nhân mọc tự nhiên ở rừng vẫn thực hiện thoát hơi nước ñể mát lá và sinh trưởng phát triển tốt là

do nước ngầm và ñộ ẩm trong không khí từ quần xã rừng cung cấp

Nhu cầu nước ñối với cây sa nhân khi mới trồng là rất quan trọng Nước tưới sẽ làm cho ñất ở gốc ñược lèn chặt hơn (so với không tưới) Mặt khác, nước làm cho ñất ẩm, duy trì cho các nhánh Sa nhân tím luôn ñược tươi, tạo ñiều kiện ra rễ và mọc chồi Sau khi cây sa nhân tím ñã mọc và cho ñến suốt quá trình sinh trưởng về sau, mặc dù không cần tưới, nhưng do có

hệ thống rễ chùm phát triển rất mạnh nên có khả năng hút ñược nhiều nước ngầm trong ñất ðặc biệt khi sa nhân tím ñã phát triển thành thảm dày ñặc (sau 2 năm tuổi), chúng còn có khả năng giữ nước cho ñất

Tuy nhiên, cây sa nhân tím không chịu ñược ngập úng lâu ngày Vào thời kỳ ra hoa, nếu gặp trời mưa sẽ ảnh hưởng tới khả năng thụ phấn và

tỷ lệ kết quả ðiều ñó có thể giải thích một phần tại sao vụ hoa tháng 4 – 5 thu ñược nhiều quả gấp 4 lần so với vụ hoa tháng 7 – 8 có mưa nhiều (cây trồng ở các tỉnh miền Bắc)

* Nhu cầu ánh sáng: Ánh sáng ñối với sa nhân tím cũng là một

nhân tố sinh thái cần và ñủ Có ánh sáng cây mới thực hiện ñược quá trình quang hợp và ñồng hoá Trong môi trường tự nhiên, sa nhân tím thường mọc xen dưới tán những cây bụi và cây gỗ, với ñộ tàn che từ 10 – 60%; thậm chí có chỗ tới 70% Tuy nhiên, ở ñộ tàn che trên 40% cây sinh trưởng mạnh về chiều cao

Ánh sáng là nhân tố cần thiết của cây Song với ñộ tán che từ 10 – 20% (hoặc 30%) có lẽ là thích hợp nhất cho sa nhân tím sinh trưởng phát triển mạnh Trong trường hợp có những ñám sa nhân tím mọc dày ñặc, không có cây che bóng trực tiếp mà vẫn sinh trưởng phát triển tốt là do ở xung quanh ñó (ở ñường biên) có những cây gỗ hay cây bụi Vấn ñề quan trọng nhất ở ñây chính là môi trường ñất còn ñủ ẩm Vì thế chưa bao giờ thấy sa nhân tím xuất hiện ở những nơi ñất khô cằn

* Nhu cầu về dinh dưỡng khoáng: Cây sa nhân tím mọc tự nhiên

cũng như trồng ñều cần các chất hữu cơ và chất khoáng ñể cho cây sinh trưởng và phát triển Những chất này là do lớp thảm mục và các sản phẩm thứ cấp từ ñộng vật rừng cung cấp

Vấn ñề này còn phụ thuộc vào các nhân tố khác, nhưng chắc chắn nhu cầu lân (P2 O5) là quan trọng ñối với quá trình ñậu quả và cho quả có hạt chắc Sa nhân là cây trồng lấy quả, bởi vậy trong quá trình chăm sóc cần chú ý cung cấp thêm các chất hữu cơ, chất khoáng trong ñó không thể thiếu phân lân [16], [2]

1.2.3 Bộ phận dùng và giá trị

1.2.3.1 Bộ phận dùng và tiêu chuẩn chất lượng

* Bộ phận dùng: Là quả già ñã phơi hay sấy khô, bóc ra lấy nguyên

khối hạt Hạt rời ra cũng ñược sử dụng

* Tiêu chuẩn chất lượng: Theo Qui ñịnh của Dược ðiển Việt

Nam (2002):

- Hạt khô còn nguyên cả khối, hình trứng hay hình gần tròn, màu nâu

ựen Tỷ lệ hạt rời ra dưới 10% độ ẩm còn lại dưới 14%

- Quan sát từng hạt rời riêng rẽ thấy bề mặt hạt nhẵn (nếu hạt lấy từ quả non sẽ có bề mặt nhăn nheo), màu nâu ựen; có vị cay, mùi thơm của tinh dầu

- Hàm lượng tinh dầu trong hạt ựạt tỷ lệ trên 1,5%

* Thành phần hoá học: Trong hạt sa nhân tắm có thành phần

chủ yếu là tinh dầu, với hàm lượng trên 1,9% Phân tắch tinh dầu ựã xác ựịnh ựược 13 hợp chất khác nhau đó là: camphor (37,4% trong tinh dầu), bonyl acetat (36,1%), camphen (7,4%), borneol (6,4%), limonen (6,3%), α - pinen (2,3%), β - myrcen (1,6%), linalool (0,7%), α -phellandren (0,3%), p-cymen (0,2%), β - pinen (0,1%), α -thujene (vết), β -caryophylen (vết) [14]

1.2.3.2 Giá trị

* Giá trị kinh tế: Sa nhân là loại dược liệu có giá trị sử dụng trong

nước và xuất khẩu cao Hàng năm, từ nguồn sa nhân mọc tự nhiên ở Việt Nam ựã khai thác thu mua ựược khoảng 100-300 tấn (quả khô) sử dụng trong nước và vài trăm tấn xuất khẩu

Giá thu mua sa nhân tại chỗ trung bình từ 30.000 ự ựến 40.000 ự/kg quả khô (cả vỏ) Giá xuất khẩu 90.000 ự ựến 120.000 ự/ kg khô ( 7/năm 2006) [16]

* Tác dụng dược lý: Tinh dầu sa nhân (các loài trên) có tác dụng ức

chế hoạt ựộng của các loại vi khuẩn: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Dipcoccus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Protues vulgaris, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi; diệt amắp trên Entamoeba moshkowskii với nồng ựộ ức chế thấp Ngoài ra, sa nhân còn có tác dụng

làm hạ sốt

Theo quan niệm của y học cổ truyền (Lắnh nam bản thảo của Hải Thượng Lãn Ông thế kỷ 18), sa nhân có vị cay, mùi thơm, tắnh ấm; tác dụng vào 3 kinh thận, tỳ, vị; tác dụng ôn trung, hành khắ, chỉ thống, khai

vị, tiêu thực, an thai

* Công dụng làm thuốc: Sa nhân ñược sử dụng nhiều ñể làm thuốc

trong y học cổ truyền, nhằm kích thích tiêu hoá; chữa ăn uống không tiêu, bị nôn mửa, ñau dạ dày, ñau bụng do lạnh, ỉa chảy, kiết lỵ, sẩy thai, bệnh cao huyết áp, cao cholesterol máu…

Lượng dùng 3 – 6 gam một ngày và thường phối hợp với các vị thuốc khác Hiện ñã thống kê ñược khoảng 60 bài thuốc khác nhau có sử dụng sa nhân

Ngoài ra, hạt sa nhân còn ñược dùng làm gia vị Tinh dầu sa nhân dùng trong kỹ nghệ mỹ phẩm [3], [4]

1.3 NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ CÂY HỌ GỪNG

1.3.1 Chi Amomum

Chi Amomum là một chi có số lượng loài lớn trong họ Gừng Chi này

có rất nhiều loài có giá trị kinh tế cao, cũng như giá trị chữa bệnh Vì vậy, ñây là ñối tượng ñược nhiều nhà khoa học quan tâm

Kỹ thuật vi nhân giống có thể ñược sử dụng như một phương tiện có thể ñể khắc phục những vấn ñề của tình trạng thiếu nguyên liệu trồng

Chồi nách ñã ñược Wondyifraw Tefera và Surawit Wannakrairoj (2004

) sử dụng trong vi nhân giống Amomum krervanh Pierre ex Gagnep Chồi

nách ñược tách ra và khử trùng bề mặt sau ñó cấy trên môi trường MS cơ bản không có chất ñiều hòa sinh trưởng trước khi cấy trên MS, 1/2 MS, MS với 1/2 nitrogen Từ kết quả nghiên cứu của mình, Wondyifraw Tefera và Surawit Wannakrairoj kết luận rằng: hệ số nhân chồi cao nhất ñã thu ñược trên môi trường MS Khi bổ sung 0, 5, 10, 15 và 20% v/v dừa nước (CW), nhận thấy rằng 5% CW là tốt nhất cho sự tăng trưởng và phát triển chồi, về số lượng chồi, cũng như trọng lượng tươi và khô Tác ñộng của 0, 2 và 4 mg / l imazalil (IMA) ñã ñược nghiên cứu ñồng thời kết trong hợp với 0,0.1, và 0.5 mg l / 6-benzyladenine (BA) hoặc thidiazuron (TDZ) Môi trường tốt nhất ñể chồi sinh trưởng và phát triển là với 2 mg/l IMA và 0,5 mg/l TDZ Rễ ñược hình thành

tương ñối dễ khi sử dụng môi trường MS không có chất ñiều hòa sinh trưởng

Cây con in vitro có ñầy ñủ rễ ñược huấn luyện thích nghi trên ñất với tỷ lệ

thành công hơn 90% [26]

1.3.2 Chi Alpinia

Khi nghiên cứu về cây riềng (Alpinia galanga Willd) M Borthakur, J

Hazarika & R.S Singh (1999) nhận thấy chồi mới nảy của thân rễ tạo ra các chồi và rễ ñồng thời khi nuôi cấy trong môi trường MS bổ sung kinetin 3,0

mg / l Mỗi chồi thí nghiệm tạo ra trung bình 8 chồi và rễ ñồng thời trong vòng 8 tuần Cây con tái sinh chuyển ra ñất thành công, chúng phát triển tốt trong vòng 10-12 tuần với tỷ lệ sống sót 80% [21]

Chinnasamy Selvakkumar và cs (2007) ñã nghiên cứu sự nhân chồi

chồi in vitro cây riềng tía (Alpinia purpurata) Những chồi có nguồn gốc từ

thân rễ khi ñược cấy trên Murashige và Skoog bổ sung riêng lẽ hay kết hợp chất kích thích sinh trưởng Cụm chồi lớn nhất ñã ñược quan sát thấy trên môi trường MS có chứa 3% (w/v) sucrose và 3,0 mg/l kinetin và 1,0 mg/l NAA Mỗi thân rễ hình thành trung bình 11 chồi/mẫu Chồi ñược cảm ứng rễ trên môi trường 1/2 MS Kết quả cho thấy rằng 0,5 mg/l IBA là phù hợp hơn cho

cảm ứng rễ so với IAA và NAA Cây con in vitro khỏe mạnh ñược chuyển ra

cho chậu có chứa một hỗn hợp khoáng và ñất (1: 1) huấn luyện thích nghi với khí hậu trong thời gian 3 - 4 tuần, kết quả 93% cây non sống sót trong ñiều kiện thường [27]

ñường trong ñiều kiện tần số và số lượng thân rễ Khoảng 4 thân rễ với trọng lượng trung bình 2.5g ñược thu hoạch sau 11-12 tuần Thân rễ dễ dàng nảy mầm trong môi trường MS không có chất ñiều hòa sinh trưởng [20]

M A Islam, K Kloppstech và H -J Jacobsen (2004) ñã nghiên cứu cảm ứng thân rễ trong ống nghiệmở Curcuma longa L Chồi nách từ thân rễ

ñã ñược sử dụng làm mô ban ñầu và nhân nhanh in vitro Cụm chồi ñược cắt

và cấy lên môi trường không bổ sung chất kích thích sinh trưởng trong bốn tuần ñể tạo ra thân rễ Ảnh hưởng của ánh sáng, ñường và chất kích thích sinh

trưởng trong cảm ứng tạo thân rễ in vitro ñã ñược nghiên cứu Kết quả cho

thấy 9% ñường ñã ñược tìm thấy là thích hợp nhất cho tạo thân rễ, trong ñiều kiện bóng tối Nồng ñộ khác nhau của BA, Kin, và NAA ñược khảo sát BA (12,0 µm) và NAA (0,3 µm) cho thấy phù hợp nhất với cảm ứng của thân rễ Thân rễ lớndễ dàng phát triển chồi , khi ñược chuyển trực tiếp từ trong ống nghiệm trồng vào ñất mà không qua huấn luyện thích nghi khí hậu Thân rễ

tạo ra trong ñiều kiện in vitro có thể ñược cất và dễ dàng vận chuyển, thuận lợi cho nhân chồi in vitro [24]

Khi nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật Piyamat Srirat kết luận, chồi từ

thân rễ của Curcuma longa L ñã ñược sử dụng và cấy trên môi trường MS có

chứa 30 và 60 g/l sucrose, bổ sung riêng lẻ hoặc kết hợp 5 mg/l thidiazuron (TDZ) và 5 mg/l của 6-benzyl-amino-purine (BA) Các thí nghiệm nghiên cứu ở ñiều kiện nhiệt ñộ 25 ± 10C, 16 chiếu sáng Kết quả cho thấy các ñiều

kiện thích hợp cho nuôi cấy in vitro là môi trường MS có chứa 60 g/l sucrose

và 5 mg/l của TDZ Trong ñiều kiện này, số chồi trung bình là 6,65 ± 1,98 sau 8 tuần nuôi cấy Hơn nữa, sự phát sinh rễ ñã ñạt ñược sau 6 nuôi cấy với tất cả các nghiệm thức sử dụng môi trường MS có chứa 60 g/l sucrose [29]

S K Shukla (2007) nghiên cứu sự tái sinh in vitro của cây nghệ Curcuma angustifolia Roxb từ nuôi cấy mô phân sinh chồi Các chồi từ thân

rễ (2 - 3 cm) ñược cấy trên môi truờng MS có bổ sung 3,0 mg/l BAP ñể thăm

dò sự nảy chồi và kéo dài chồi Kết quả thu ñược 1,87 ± 0,28 chồi/mẫu Chồi

in vitro ñược chuyển lên môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/l BAP và 25 mg/l

adenine sulfate ñể nhân chồi Khoảng 6,9 ± 0,69 vi chồi/mẫu ñược tạo ra

trong 6 tuần Chồi tạo rễ ngay trên môi trường nhân chồi Cây in vitro hoàn

chỉnh có rễ ñược chuyển ra chậu cho thấy 83% sống sót trong ñiều kiện bình thường [28]

- Giống Bari ada-1 cho thấy 62,64% cảm ứng callus, 63,98% cảm ứng chồi và 68,76% cảm ứng rễ Mẫu cấy lá ñã cho kết quả tốt nhất hơn cả cấy ñỉnh chồi và rễ Kết quả cấy lá ñã cho 67,07% mô sẹo, 67,77% chồi và 66,93% rễ Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg / l Dicamba là tốt nhất (70,20%) cho tạo callus, MS + 1,0 mg / l Kn + 1,0 mg / l BAP tốt nhất (72,03%) ñể tạo chồi và MS + 1 mg / l IBA cho kết quả tốt nhất tạo rễ ( 66,43%) hơn các môi trường khác

- Sự cảm ứng callus cao nhất (73,60%) ñã ñược tìm thấy từ lá của giống Suruchi Lá của giống Suruchi ñã cho ñược 74% chồi và 74,13% rễ Phần trăm cảm ứng mô sẹo tối ña (76,47%) với giống Suruchi 0,5 mg/l Dicamba Phần trăm cảm ứng chồi ñược cao nhất (76,33%) ñạt ñược trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l Kin và 1,0 mg/l BAP Tỷ lệ phần trăm cao nhất (76,87%) cảm ứng rễ trên môi trường 1 mg/l IBA Tỷ lệ phần trăm cao nhất của cảm ứng mô sẹo (87,60%) thu ñược từ cấy lá của giống Suruchi bởi 0,5 mg/l Dicamba Lá cấy lên môi trường có 1,0 mg/l Kin + 1,0 mg/l BAP tạo ra chồi với tỷ lệ phần trăm cao

nhất (87,60%) Cảm ứng rễ tốt nhất (85,40%) từ lá trên môi trường MS + 1 mg/l IBA Các cây non tái sinh thành công ñược chuyển ra ngoài [30]

Ping-Lung Huang and Chi-Chu Tsai ñã nghiên cứu năm 2004 nhân

giống in vitro cây Zingiber spectabile, một loài có giá trị kinh tế, trang trí làm ñẹp Mục ñích của thử nghiệm này không chỉ nhân giống in vitro cây Zingiber spectabile, dự kiến sẽ ñược sử dụng làm các vật liệu của cây chuyển gen Kết

quả cho thấy khi bổ sung 0,05 ~ 0,1 mg/l ABA thúc ñẩy bình thường sinh cơ quan và tăng trưởng chồi Vỏ và rễ ñược cấy trên môi trường vw có chứa 5mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l BA, 3% sucrose và 200ml/l nước dừa, cảm ứng callus Tuy nhiên, chỉ có rễ phát sinh từ mô sẹo có thể sản xuất nhiều phôi soma từ bề mặt [25]

M Chithra và cs nghiên cứu năm 2005 về việc nhân giống và bước ñầu

chuyển cây con ra môi trường ngoài của Kaempferia galanga L Nguyên liệu

ban ñầu là protocol Môi trường MS với sự kết hợp của 8.87 mM benzyladenine (BA) và 2.46 mM indole-3-butyric acid (IBA) tạo ra số chồi trung bình mỗi mẫu là 6,2 Bổ sung 11.7 mM nitrat bạc vào 8.87 mM BA và 2.46 mM IBA cho môi trường tạo ñiều kiện phát triển số lượng chồi cũng như

N6-rễ cao nhất trong vòng 60 ngày (8,3 chồi) Những chồi riêng lẽ ñược cấy trên môi trường với tổ hợp BA, IBA và nitrat bạc làm tăng số lượng chồi là 12,1 Nitrat bạc làm giàu sự phát triển của thân rễ tại mỗi gốc chồi Tăng nồng ñộ ñường (6-8%) trong môi trường có BA, IBA và nitrat bạc làm thân rễ phát triển tốt nhất Kết quả cho thấy 95% chồi sống sót trong ñiều kiện ñó [22]

Christin (2007) ñã nghiên cứu nhân giống in vitro Curcuma zedoaria và Zingiber zerumbet, các chồi ñược khử trùng bề mặt với 100 mg/L thủy ngân

Clorua (HgCl2) trong năm phút, tiếp theo là 20% (v/v) Clorox với vài giọt Tween 20 trong 10 phút ở giai ñoạn ñầu tiên và 10% (v/v) Clorox 10 phút ở giai ñoạn thứ hai Thí nghiệm này cho phép khử trùng tạo 87% chồi vô trùng và sống

sót ở C zedoaria và 80% cho Z zerumbet Môi trường tối ưu cho sự phát triển

của chồi ở cả hai loài là MS (Murashige và Skoog, 1962) vừa bổ sung 0,5 mg/L

và BA 0,5 mg/L IBA Chồi ñược cấy của cả hai loài nuôi trong môi trường lỏng tăng nhanh hơn gấp hai lần số lượng so với môi trường ñặc [23]

Phần 2

ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

ðối tượng nghiên cứu của chúng tôi ở ñây là sa nhân tím (Amomum longiligulare T.L.Wu) thuộc:

Vật liệu nghiên cứu là ñoạn thân mang chồi ngủ của cây sa nhân tím

và hạt sa nhân tím ngoài tự nhiên [6]

2.2 THỜI GIAN VÀ ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU

Các thí nghiệm ñược tiến hành trong khoảng 4 tháng (từ 1/2010 – 5/2010) tại phòng Sinh lý ðộng vật – Tế bào – Di truyền, khoa Sinh học, trường ðại học Khoa học Huế

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị mẫu và khử trùng mẫu

* Hạt ñược rửa sạch bằng nước cất Sau ñó chuyển vào tủ cấy Tiếp theo khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút, HgCl2 0,1% trong khoảng 3 phút , khử trùng liên tiếp với thời gian là 2 phút : 1 phút và cuối cùng rửa lại bằng nước cất

* ðỉnh sinh trưởng và ñoạn thân của cây sa nhân tím ñược chọn từ những cây khỏe mạnh Mẫu ñược ngâm trong nước xà phòng loãng khoảng

15 phút, sau ñó lắc khoảng 15 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy, lặp lại 3 lần Tiếp ñến ngâm trong nước javen 50% trong khoảng 10-15 phút, lắc mẫu khoảng 10-15 phút rồi rửa sạch javen dưới vòi nước chảy Tiếp ñến, ngâm trong thuốc diệt nấm VIBEN-C 50BTN theo tỉ lệ 1,25g/500ml nước máy trong khoảng 30 phút rồi rửa sạch dưới vòi nước chảy Mẫu ñược rửa lại bằng nước cất và chuyển vào tủ cấy Sau khi khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, khử trùng trong HgCl2 0,1% từ 10 ñến 20 phút liên tục hoặc gián ñoạn, rửa lại bằng nước cất tiệt trùng 5-7 lần Mẫu cấy lên môi trường nuôi cấy ban ñầu Khả năng khử trùng mẫu ñược ñánh giá thông qua theo dõi tỷ lệ mẫu chết, mẫu nhiễm và mẫu sống không nhiễm sau 4 tuần theo dõi

2.3.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường cơ bản dùng ñể nuôi cấy là môi trường MS Skoog 1962) có bổ sung các chất ñiều hòa sinh trưởng khác nhau tuỳ theo mục ñích của từng thí nghiệm Nguồn carbon là ñường saccharose Môi trường ñược làm ñặc bằng agar, pH của môi trường ñược ñiều chỉnh ñến 5,8 trước khi ñược khử trùng ở 121oC trong 15 phút

(Murashige-2.3.3 Nuôi cấy ban ñầu

Mẫu sau khi khử trùng ñược ñặt lên giấy thấm vô trùng Dùng dụng cụ cấy vô trùng cắt mẫu thành các mẫu nhỏ có kích thước khoảng 2 -3 cm Mẫu ñược cấy lên môi trường dinh dưỡng cơ bản MS có 3,0% ñường, 0,8% agar,1,0 g/l than hoạt tính và bổ sung riêng lẻ BAP; Kin ; tổ hợp BAP và Kin; tổ hợp Kin

và NAA với nồng ñộ khác nhau ñể thăm dò khả năng tái sinh của mẫu

2.3.4 Nhân nhanh

Các chồi in vitro có kích thước từ 2,0 – 3,0 cm ñược cấy lên môi trường

cơ bản MS có 3,0% ñường, 0,8% agar, 1,0 g/l than hoạt tính và bổ sung BAP (1 - 3mg/l) kết hợp với NAA (0,3 – 1 mg/l) ñể thăm dò khả năng nhân chồi

2.3.5 Tạo rễ

Các chồi in vitro có chiều cao từ 2,0 – 3,0 cm ñược cấy chuyển sang

môi trường MS bổ sung 1,0 g/l than hoạt tính và NAA từ 0,3 – 1,5 mg/l ñể thăm dò khả năng tạo rễ của chồi

Cây Sa nhân tím in vitro hoàn chỉnh có chiều cao từ 3 - 5 cm, có bộ rễ khoẻ

ñược huấn luyện và chuyển ra giá thể, chuẩn bị chuyển ra ñất tạo cây giống

Trước hết, các bình thủy tinh chứa cây in vitro hoàn chỉnh (ñạt yêu cầu)

ñược ñưa ra khỏi phòng nuôi 7 ngày ñể cây thích nghi dần với ñiều kiện tự nhiên Sau ñó, lấy cây ra khỏi bình, rửa sạch agar rồi ñặt trên giấy thấm ñể làm ráo nước cho rễ

Mẫu ñược trồng trên giá thể: Cát + trấu hun theo tỷ lệ 1:1

2.3.6 ðiều kiện nuôi cấy

Mẫu vật ñược nuôi cấy trong chai thủy tinh loại 100ml, ñặt trong phòng nuôi cấy ở nhiệt ñộ 25 ± 10C, cường ñộ ánh sáng 2000-3000 lux và thời gian chiếu sáng 8 - 10 giờ/ngày

Phần 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 NUÔI CẤY BAN ðẦU

+ Lô 1: ðỉnh sinh trưởng

+ Lô 2: ðoạn thân mang chồi bên

Mẫu ñược cấy lên môi trường MS Các chỉ tiêu theo dõi như tỷ lệ sống,

tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chết ở các thời gian khử trùng khác nhau ñược quan sát sau

30 ngày nuôi cấy Kết quả nghiên cứu ñược trình bày ở bảng 3.1, bảng 3.2, bảng 3.3

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng ñến khả năng tái sinh ñỉnh sinh trưởng

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu không nhiễm có tái sinh (%)

Từ kết quả nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng ñến khả năng tái

sinh ñỉnh sinh trưởng ở bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy ở các khoảng thời gian

khử trùng khác nhau thì tỷ lệ mẫu sống, chết và mẫu không nhiễm có tái sinh

hoàn toàn khác nhau

Mẫu ñược khử trùng ở 10 phút có tỷ lệ nhiễm cao nhất, tuy nhiên tỷ lệ

mẫu chết thấp Khi tăng thời gian khử trùng từ 10 phút ñến 15 phút, tỷ lệ

nhiễm giảm xuống ñáng kể (từ 78,57% xuống còn 23,08%), nhưng tỷ lệ chết

lại tăng lên (từ 7,14 lên 61,54%) Kết quả chúng tôi thu ñược ở thời gian khử

trùng 15 phút, tỷ lệ mẫu không nhiễm có tái sinh ñạt 15,38% ðiều này có thể

do khi tăng thời gian khử trùng HgCl2 lên ñã làm cho hóa chất này thấm sâu

vào bên trong mô, ảnh hưởng xấu ñến sức sống của mẫu

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi chia thời gian khử trùng làm hai lần

Sau mỗi lần khử trùng, mẫu ñược rửa lại bằng nước cất 5 -7 lần Như vậy vẫn

duy trì ñược tổng thời gian khử trùng lớn nhưng hạn chế tác ñộng xấu của hóa

chất khử trùng ñến khả năng tái sinh mẫu

Ở thời gian khử trùng: lần 1: 7 phút, lần 2: 7 thì tỷ lệ mẫu sống tăng lên

(47%), tỷ lệ nhiễm tăng lên (43,66%), tỷ lệ chết giảm (9,29%), kết quả này tốt

hơn so với khử trùng liên tục trong 15 phút Khi tăng thời gian khử trùng mẫu

lên (10 : 7 phút) thì tỷ lệ nhiễm giảm, tỷ lệ sống tăng Kết quả khử trùng từ

ñỉnh sinh trưởng có tỷ lệ mẫu sống và không nhiễm cao nhất (70,46%) ở thời

gian khử trùng gián ñoạn lần 1:10 phút, lần 2: 10 phút, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp

nhất (18,18%) và tỷ lệ chết chỉ 11,36%

Kết quả chúng tôi tương tự kết quả của tác giả Huỳnh Văn Kiệt (2005)

khi nghiên cứu chế ñộ khử trùng ở cây cà gai leo (Solanum hainanense

Hance), cho thấy thời gian khử trùng gián ñoạn thì cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu không nhiễm có tái sinh (%)

Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng ñến khả

năng tái sinh của ñoạn thân ñược trình bày ở bảng 3.2 cho thấy thời gian khử

trùng của mẫu cấy ñoạn thân tương tự như mẫu ñỉnh sinh trưởng Thời gian

khử trùng thích hợp là 20 phút với 2 lần khử trùng, mỗi lần 10 phút cho tỷ lệ

nhiễm 28,43%, tỷ lệ chết là 13,04%, tỷ lệ không nhiễm có tái sinh 58,53%

Biểu ñồ 1 So sánh hiệu quả khử trùng giữa ñỉnh sinh trưởng và ñoạn thân

Qua biểu ñồ ta thấy với cùng một thời gian khử trùng thì ñỉnh sinh trưởng

có tỷ lệ mẫu tái sinh cao hơn ñoạn thân Kết quả này có thể do mẫu ñoạn thân và ñỉnh sinh trưởng nằm sát mặt ñất tiếp xúc nhiều với nấm và vi khuẩn xâm Tuy nhiên ñỉnh sinh trưởng có thời gian tiếp xúc với môi trường bụi bẩn bên ngoài ngắn hơn nên tỷ lệ nhiễm của mẫu ñỉnh sinh trưởng thấp hơn

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng ñến hạt

Thời gian khử trùng

(phút)

Tỷ lệ mẫu không nhiễm

(%) STT

Tỷ lệ mẫu nảy mầm

(%)

Tỷ lệ mẫu chưa nảy mầm (%)

ðối với trường hợp chia thời gian khử trùng HgCl2 làm 2 lần : lần 1 2 phút, lần 2 1 phút thì tỷ lệ nảy mầm tăng lên (8,17%), tỷ lệ nhiễm giảm (7,04%) Kết quả này tốt hơn khi khử trùng liên tục trong 3 phút

3.1.2 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, sự thành công hay thất bại phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nuôi cấy ðể tìm môi trường cấy gây và môi trường nhân nhanh thích hợp, chúng tôi ñã thăm dò nhiều tổ hợp chất kích thích sinh trưởng có nồng ñộ khác nhau Nhiều tác giả ñã chứng minh vai trò quan trọng của các chất kích thích sinh trưởng trong việc phân hóa cơ quan

mô và tế bào nuôi cấy [5,15]

Mẫu ñỉnh sinh trưởng sau khi khử trùng ñược cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung BAP nồng ñộ từ 0,0 - 5,0 mg/l và 1,0 g/l than hoạt tính ñể thăm dò khả năng tái sinh chồi

Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy ở tất cả các môi trường ñều có sự phân hóa chồi, sau 2 tuần nuôi cấy, tất cả các môi trường ñều có sự thay ñổi về số lượng chồi và số rễ Môi trường có nồng ñộ BAP khác nhau thì khả năng tạo chồi là khác nhau

Kết quả sau 2 tuần theo dõi ñược trình bày ở bảng 3.4 và biểu ñồ 2

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng

0 0,5 1 1,5 2 2,5

số chồi/mẫu

Biểu ñồ 2 Ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng

Trên môi trường bổ sung nồng ñộ BAP từ 0,0 – 2,0 mg/l,chúng tôi nhận thấy khả năng phân hóa chồi tăng Khả năng nảy chồi và tốc ñộ phát triển của chồi ở môi trường có bổ sung BAP 2,0 mg/l là tốt nhất với số lượng chồi ñạt 2,20 chồi/mẫu; chiều cao chồi là 2,72 cm; số rễ là 1,40 rễ/chồi với chiều dài là 3,21 cm Chồi to, xanh và tốt Kết quả cao hơn hẳn so với ñối chứng chỉ ñạt 1,00 chồi/mẫu; chiều cao chồi là 2,5 cm

Tiếp tục tăng nồng ñộ BAP từ 2,0 – 5,0 mg/l thì khả năng phân hóa chồi giảm xuống Kết quả thấp nhất chỉ ñạt 1,33 chồi/mẫu ở môi trường có BAP 5,0 mg/l

Nhìn chung ñường kính chồi có tăng lên nhưng không ñáng kể, chồi có màu xanh hơn so với ở môi trường không bổ sung chất kích thích sinh trưởng Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP lên khả năng phân hóa chồi cho thấy chồi tạo rễ ngay trên môi trường này ðiều này tượng tự kết quả của

S K Shukla khi nghiên cứu sự tái sinh in vitro của cây Curcuma angustifolia

3.1.3 Ảnh hưởng của Kin lên khả năng tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng

Cytokinin, ñặc biệt là kinetin, có ảnh hưởng rõ rệt ñến quá trình tổng hợp acid nucleic do kinetin là nguyên liệu tham gia trực tiếp vào quá trình tổng hợp acid nucleic ðồng thời kinetin còn có tác dụng kích thích hoạt tính các enzyme tham gia tổng hợp acid nucleic [12]

Mẫu ñỉnh sinh trưởng ñược cấy lên môi trường cơ bản MS bổ sung kinetin nồng ñộ từ 0,0 - 2,0 mg/l và 1,0 g/l than hoạt tính ñể thăm dò khả năng tái sinh chồi

Kết quả thu sau 2 tuần quan sát ñược trình bày ở bảng 3.5 và biểu ñồ 3

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của Kin lên khả năng tái sinh chồi từ ñỉnh sinh trưởng