Nghiên cứu điều kiện ổn định đồng thời hba1c, glucose và các chỉ số lipid trong mẫu máu toàn phần và huyết tương ứng dụng thiết kế các mẫu nội kiểm cho xét nghiệm glucose huyết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ VÂN DUNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH ĐỒNG THỜI HbA1c, GLUCOSE VÀ CÁC CHỈ SỐ LIPID TRONG MẪU MÁU TOÀN PHẦN V

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ VÂN DUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH ĐỒNG THỜI HbA1c, GLUCOSE VÀ CÁC CHỈ SỐ LIPID TRONG MẪU MÁU TOÀN PHẦN VÀ HUYẾT TƯƠNG - ỨNG DỤNG THIẾT KẾ CÁC MẪU NỘI KIỂM CHO XÉT NGHIỆM GLUCOSE

HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THỊ VÂN DUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH ĐỒNG THỜI HbA1c, GLUCOSE VÀ CÁC CHỈ SỐ LIPID TRONG MẪU MÁU TOÀN PHẦN VÀ HUYẾT TƯƠNG - ỨNG DỤNG THIẾT KẾ CÁC MẪU NỘI KIỂM CHO XÉT NGHIỆM GLUCOSE

HUYẾT

NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ : 8720210 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN THỊ MINH THUẬN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi Các số liệu, kết quảtrong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan này

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Vân Dung

LỜI CẢM ƠN

Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Minh Thuận là người thầy đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ của tập thể nhân viên y tế tại Trung tâm xét nghiệm Buôn Ma Thuột trong thời gian nghiên cứu tại đây.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới lãnh đạo Trường đại học Tây Nguyên, khoa Y – Dược và cán bộ bộ môn Xét nghiệm đã tạo điều kiện và giúp đỡ trong thời gian tôi học tập và công tác.

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ và hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

TP Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 12 năm 2022

Học viên

Nguyễn Thị Vân Dung

Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2020 – 2022

Ngành: Kiểm nghiệm Thuốc - Độc chất – Mã số: 8720210

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN ỔN ĐỊNH ĐỒNG THỜI HbA1c, GLUCOSE VÀ CÁC CHỈ SỐ LIPID TRONG MẪU MÁU TOÀN PHẦN VÀ HUYẾT TƯƠNG - ỨNG DỤNG THIẾT KẾ CÁC MẪU NỘI KIỂM CHO XÉT

NGHIỆM GLUCOSE HUYẾT Nguyễn Thị Vân Dung Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Minh Thuận.

TÓM TẮT

Mở đầu: Xét nghiệm (XN) glucose và HbA1c có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán

và theo dõi hiệu quả điều trị đái tháo đường Sự thay nồng độ HbA1c, glucose và cácchỉ số lipid ở điều kiện bảo quản, và việc không thường xuyên thực hiện nội kiểm trachất lượng tại phòng xét nghiệm (PXN) sẽ ảnh hưởng độ chính xác của kết quả XN

Mục tiêu: Nghiên cứu điều kiện ổn định đồng thời HbA1c, glucose và các chỉ số

lipid trong mẫu máu toàn phần (MTP) và huyết tương (HT), và thiết kế các mẫu nộikiểm cho XN glucose huyết

Phương pháp nghiên cứu: 10 ml MTP và HT của 10 người tình nguyện chống đông

bằng K2EDTA được chia vào các ống nghiệm vô khuẩn và bảo quản ở 3 mức nhiệt

độ 20-25°C, 2-8°C và -20°C Nồng độ HbA1c trong mẫu máu toàn phần được đobằng 2 phương pháp enzym (EA) và miễn dịch (IA) Nồng độ glucose và lipid trongmẫu MTP và HT được đo bằng phương pháp đo quang Xác định điều kiện bảo quảntốt nhất cho glucose để xây dựng mẫu nội kiểm cho XN glucose huyết

Kết quả: HbA1c với phương pháp IA (HbA1c-IA) ổn định ở 20-25°C trên 24 giờ, ở

2-8°C dưới 4 ngày và ở -20°C trên 30 ngày, trong khi HbA1c với phương pháp EA(HbA1c-EA) ổn định ngắn hơn Nồng độ glucose trong MTP thấp hơn trong mẫu HT,nhưng không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ của triglycerid, cholesteroltp, HDL-cholesterol trong MTP và HT ở cùng điều kiện bảo quản Bộ mẫu nội kiểm glucosehuyết đạt độ đồng nhất, độ ổn định ở -20oC trong 30 ngày

Kết luận: HbA1c-IA có vẻ ổn định hơn HbA1c-EA Glucose và lipid ổn định trong

HT hơn trong MTP, và lâu nhất ở -20 oC Bộ mẫu nội kiểm cho XN glucose huyết cóthể được sử dụng để nâng cao chất lượng XN glucose tại các PXN

Từ khóa: HbA1c, glucose, lipid, độ ổn định, nội kiểm

Master’s Thesis – Acedemic course: 2020 – 2022Specialty: Drug Quality Control and Toxicology – Code: 8720210

SIMULTANEOUS STABILITY STUDY OF HBA1C, GLUCOSE AND LIPID

IN HUMAN WHOLE BLOOD AND PLASMA - APPLICATIONS TO ESTABLISH INTERNAL QUALITY CONTROL PANELS FOR BLOOD

GLUCOSE TESTING Nguyễn Thị Vân Dung Supervisor: Dr Nguyen Thi Minh Thuan ABSTRACT

Background: Glucose and HbA1c tests are important in diagnosing and monitoring

the effectiveness of diabetes treatment Changes in the concentration of HbA1c,glucose and lipid indices under storage conditions, and the infrequent performance oflaboratory quality checks will affect the accuracy of the test results

Objectives: The purpose of this study was to evaluate the stability of HbA1c, glucose

and lipid indices in whole blood (WB) and plasma samples, and design internalcontrol samples for blood glucose testing

Materials and methods: 10 ml of WB and plasma collected from 10 healthy

volunteers anticoagulated with K2EDTA were divided into sterile test tubes andstored at the following temperatures: 20-25 oC, 2-8 oC and -20 oC The concentration

of HbA1c in WB samples was determined simultaneously using enzymatic assay(EA) and immunoassay (IA) Glucose and lipid concentrations in WB and plasmasamples were measured by spectrophotometry The best storage conditions forglucose were determined to establish internal control samples for blood glucosetesting

Results: %HbA1c measured by IA (HbA1c-IA) was stable for 24 hours at 20-25 °C,

for less than 4 days at 2-8 °C and for more than 30 days at -20 °C, while %HbA1cmeasured by EA (HbA1c-EA) was shorter stable HbA1c-IA Glucose concentrations

in WB were lower than in plasma samples, while the significant difference inconcentrations of triglycerides, cholesterol, HDL-cholesterol was not found between

WB and plasma samples under the same storage conditions The internal controlsamples for blood glucose testing achieved homogeneity, stability at -20 oC for 30days

Conclusion: HbA1c-IA appears to be more stable than HbA1c-EA Glucose and

lipids are stable for the longest time at -20°C in plasma than in WB The internalcontrol samples for blood glucose testing can be used to improve the quality ofglucose testing in laboratories

Keywords: HbA1c, glucose, lipid, stability, internal control.

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Tổng quan về các chất phân tích 3

1.2 Một số nghiên cứu về độ ổn định của HbA1c, glucose và các chỉ số lipid huyết 11

1.3 Tổng quan về nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm 13

1.4 Tình hình thực hiện nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm glucose huyết 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1.Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Hóa chất – Thiết bị, dụng cụ 23

2.3 Nơi thực hiện đề tài 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.5 Phân tích số liệu 35

2.6 Đạo đức nghiên cứu 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 37

3.1.Khảo sát độ ổn định của HbA1c trong máu toàn phần ở các mức nhiệt độ bảo quản 37

3.2.Khảo sát độ ổn định đồng thời của glucose và các chỉ số lipid trong mẫu máu toàn phần và huyết tương 44

3.3 Đánh giá chất lượng bộ mẫu nội kiểm glucose 51

3.4 So sánh độ ổn định bộ mẫu nội kiểm nghiên cứu với bộ mẫu thương mại 56

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 58

4.1 Độ ổn định của các chất phân tích HbA1c, glucose và các chỉ số lipid trong mẫumáu toàn phần và mẫu huyết tương dưới sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độbảo quản 584.2 Đánh giá chất lượng bộ mẫu nội kiểm glucose huyết 624.3 Hạn chế của đề tài 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, chữ

4AAP 4-amino antipyrine

AC Affinity chromatography Sắc ký ái lực

CE Cappillary electrophoresis Điện di mao quản

CHE Cholesterol esterase

CHO Cholesterol oxidase

CLIA Clinical Laboratory

Hệ số biến thiên của phân tích

CVI Within-subject biologic variation Biến thiên sinh học trong cá

thểDAP Dihydroxy acetone phosphate

DCCT Diabetes Control and

Complications Trial

Thử nghiệm kiểm soát vàbiến chứng bệnh đái tháođường

FVO Fructosyl peptide oxidase

HbA Adult hemoglobin

HbF Fetal hemoglobin

Ký hiệu, chữ

HDL High Density Lipoprotein Lipoprotein tỉ trọng caoHDL-C High Density Lipoprotein

CholesterolHPLC High pressure liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IEC Ion exchange chromatography Sắc ký trao đổi ion

IQC Internal Quality Control Nội kiểm tra chất lượngISO International Organization

GPO Glycerol phosphate oxidase

LDL Low density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấpLDL-C Low density lipoprotein

CholesterolLPL Lipoprotein lipase

NGSP National Glycohemoglobin

Standardization ProgramPEGME Polyethylene glycol methyl ether

PVS Polyvinyl sulfonic acid

VLDL Very low density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng rất thấpWHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

DANH MU ̣C CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Mẫu nội kiểm cho xét nghiệm glucose 22

Bảng 3.1 Kết quả xác định %HbA1c ở 20 – 25 oC bằng xét nghiệm miễn dịch 37

Bảng 3.2 Kết quả xác định %HbA1c ở 20 – 25 oC bằng xét nghiệm enzym 38

Bảng 3.3 Kết quả xác định %HbA1c ở 2 – 8 oC bằng xét nghiệm miễn dịch 40

Bảng 3.4 Kết quả xác định %HbA1c ở 2 – 8 oC bằng xét nghiệm enzym 41

Bảng 3.5 Kết quả xác định %HbA1c ở -20 oC bằng xét nghiệm miễn dịch 42

Bảng 3.6 Kết quả xác định %HbA1c ở -20 oC bằng xét nghiệm enzym 43

Bảng 3.7 Kết quả định lượng Glucose, Triglycerid, Cholesteroltp, HDL-C ở 20-25 oC trong máu toàn phần 44

Bảng 3.8 Kết quả định lượng Glucose, Triglycerid, Cholesteroltp, HDL-C ở 20-25 oC trong mẫu huyết tương 45

Bảng 3.9 Kết quả định lượng Glucose, Triglycerid, Cholesteroltp, HDL-C ở 2-8 oC trong máu toàn phần 47

Bảng 3.10 Kết quả định lượng Glucose, Triglycerid, Cholesteroltp, HDL-C ở 2-8 oC trong huyết tương 48

Bảng 3.11 Kết quả định lượng Glucose, Triglycerid, Cholesteroltp, HDL-C ở -20 oC trong huyết tương 50

Bảng 3.12 Độ đồng nhất của lô mẫu nghiên cứu 52

Bảng 3.13 Kết quả độ ổn định mẫu nghiên cứu ở điều kiện vận chuyển giả định 53

Bảng 3.14 Độ ổn định của bộ mẫu nội kiểm glucose trong 30 ngày 54

Bảng 3.15 Kết quả so sánh độ ổn định của bộ mẫu đối chiếu với bộ mẫu thử nghiệm sau 30 ngày 56

DANH MU ̣C CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ

Trang

Hình 1.1 Cấu tạo của Hemoglobin 3

Hình 1.2 Quá trình glycosyl hóa Hemoglobin 4

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động sắc kí ái lực Boronat 5

Hình 1.4 Cơ chế của phản ứng miễn dịch đo độ đục 6

Hình 1.5 Nguyên tắc xét nghiệm HbA1c trực tiếp bằng enzym 7

Hình 1.6 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 12s 15

Hình 1.7 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 13s 16

Hình 1.8 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 22s 17

Hình 1.9 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc R4s 18

Hình 1.10 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 41s 19

Hình 1.11 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 10x 20

Hình 2.1 Quy trình lấy mẫu máu 27

Hình 3.1 Đồ thị so sánh %HbA1c ở 20-25 oC được đo bằng 2 phương pháp xét nghiệm miễn dịch và xét nghiệm enzym 39

Hình 3.2 Đồ thị xét mối tương quan giữa 2 phương pháp xét nghiệm miễn dịch và xét nghiệm enzym ở thời điểm T0 40

Hình 3.3 Đồ thị so sánh %HbA1c ở 2 – 8 oC được đo bằng 2 phương pháp xét nghiệm miễn dịch và xét nghiệm enzym 41

Hình 3.4 Đồ thị so sánh %HbA1c ở -20 oC được đo bằng 2 phương pháp xét nghiệm miễn dịch và xét nghiệm enzym 43

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn nồng độ glucose huyết của bộ mẫu nghiên cứu trong 30 ngày (nồng độ trung bình - Level 1, nồng độ cao - Level 2) 55

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn 2 nồng độ glucose huyết của bộ mẫu đối chiếu trong 30 ngày (nồng độ trung bình - Level 1, nồng độ cao - Level 2) 57

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu 25

Độ ổn định của chất phân tích trong phép thử sinh hóa lâm sàng có thể đượcđịnh nghĩa là “khoảng thời gian mà chất này duy trì giá trị của nó trong giới hạn đãthiết lập, bằng cách lưu trữ mẫu và các chất sẽ được phân tích trong những điều kiện

cụ thể nhất định” 12 Điều kiện lý tưởng là nên thực hiện xét nghiệm trên các mẫuhuyết thanh hoặc huyết tương mới để tránh sự thoái hóa các chất phân tích Tuy nhiên,trong một vài trường hợp đặc biệt, các mẫu có thể được sử dụng lại 6 Chính vì vậy,một số nghiên cứu đã đánh giá độ ổn định của các thông số sinh hóa trong các điềukiện vận chuyển và bảo quản mẫu ở giai đoạn tiền xét nghiệm nhằm đảm bảo tínhchính xác của kết quả xét nghiệm 6-11

Xét nghiệm glucose và hemoglobin A1c (HbA1c) có ý nghĩa quan trọng trongchẩn đoán bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và theo dõi hiệu quả kiểm soát đường huyếtcho bệnh nhân 13,14 Mối tương quan giữa nồng độ HbA1c và nồng độ của glucosetrong máu làm cho HbA1c trở thành một chỉ số hữu ích để theo dõi lượng đườnghuyết trong thời gian dài ở bệnh nhân ĐTĐ 13-15 Bên cạnh các xét nghiệm chỉ sốHbA1C và glucose, xét nghiệm các chỉ số lipid huyết (bao gồm triglycerid,cholesterol toàn phần, HDL-C và LDL-C) cũng rất quan trọng để giúp đánh giá yếu

tố nguy cơ, tình trạng bệnh và sự tuân thủ trong điều trị của bệnh nhân ĐTĐ và có rốiloạn lipid huyết 13.

Mặc dù trên thế giới đã có nghiên cứu về độ ổn định của HbA1c, glucose vàcác chỉ số lipid huyết trong các điều kiện khác bảo quản khác nhau, nhưng chưa cónghiên cứu về điều kiện bảo quản HbA1c với các phương pháp định lượng khác, cũngnhư các nghiên cứu đánh giá độ ổn định của glucose và các chỉ số lipid huyết trongđiều kiện bảo quản ở Việt Nam hiện nay Bên cạnh đó, để đánh giá độ tin cậy của xétnghiệm dựa trên độ đúng và độ chính xác của kết quả phân tích, các PXN phải thựchiện nội kiểm tra xét nghiệm hằng ngày để phát hiện ra các sai sót chính trong quátrình thực hiện xét nghiệm, khắc phục và đưa ra kết quả chính xác cho bệnh nhân

Với mong muốn góp phần nâng cao chất lượng kết quả xét nghiệm HbA1c,glucose và các chỉ số lipid nhằm giúp cho việc chẩn đoán bệnh lý chính xác và điềutrị hiệu quả cho người bệnh; đồng thời xây dựng được các mẫu dùng trong nội kiểm

tra chất lượng xét nghiệm glucose huyết, đề tài “Nghiên cứu điều kiện ổn định đồng thời HbA1c, glucose và các chỉ số lipid trong máu toàn phần và huyết tương - ứng dụng thiết kế các mẫu nội kiểm cho xét nghiệm glucose huyết” được thực

hiện với các mục tiêu sau:

1 Đánh giá độ ổn định của HbA1c ở các mức nhiệt độ khác nhau theo thờigian và bằng các phương pháp định lượng khác nhau

2 Khảo sát độ ổn định của glucose và các chỉ số lipid trong mẫu máu toànphần và mẫu huyết tương ở các điều kiện nhiệt độ bảo quản khác nhau theo thời gian

3 Ứng dụng xây dựng các mẫu chuẩn dùng trong nội kiểm tra chất lượng xétnghiệm glucose huyết

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về các chất phân tích

1.1.1 Vai trò và nguyên lý định lượng HbA1c

1.1.1.1 Nguồn gốc và chức năng của HbA1c

Hình 1.1 Cấu tạo của Hemoglobin

Hemoglobin (Hb) là protein có cấu trúc bậc bốn hoàn chỉnh của hồng cầu Hbgồm nhóm ngoại là heme (protoporphyrin kết hợp 1 ion Fe++) và phần protein làglobin Globin gồm 4 chuỗi polypeptid liên kết với nhau bởi những tương tác khôngđồng hóa trị Mỗi chuỗi polypeptid kết hợp với 1 heme tạo thành 1 tiểu đơn vị của

Hb Chuỗi polypeptid được gọi tên theo chữ Hy Lạp α, β, δ, γ Một phân tử Hb có 4tiểu đơn vị nên có thể nhận 4 phân tử oxy Hb có chức năng vận chuyển oxy từ phổitới tổ chức và CO2 từ tổ chức tới phổi 16

Tùy theo giai đoạn phát triển mà xuất hiện những dạng Hb khác nhau với cấutrúc dưới đơn vị khác nhau Hb chủ yếu của người trưởng thành là HbA (có tổ hợpchuỗi polypeptid là α2-β2) chiếm 97% Hb toàn phần, còn lại là dạng HbA2 (α2-δ2)

<3%, HbF (α2-γ2) <1%

Nồng độ glucose của hồng cầu cũng tương đương với nồng độ glucose tronghuyết tương của máu Khi nồng độ glucose máu tăng cao hơn mức bình thường trongmột khoảng thời gian đủ dài, glucose sẽ vào nhóm amin của valin ở đầu tận chuỗi βcủa HbA1 gọi là phản ứng đường hóa hemoglobine (hay glycosyl hoá) Các loại

đường đơn trong máu gắn kết không thuận nghịch với HbA tạo thành phức hợp HbA1.Tùy thuộc vào loại đường đơn và vị trí gắn vào HbA mà có 4 loại HbA1 đó là:HbA1a1, HbA1a2, HbA1b, HbA1c Đường đơn trong máu chủ yếu là glucose do vậythành phần chủ yếu của HbA1 là HbA1c (70%) Do vậy HbA1c có giá trị chuyên biệthơn HbA1a1, HbA1a2, HbA1b nói riêng và HbA1 nói chung.

Hình 1.2. Quá trình glycosyl hóa HemoglobinTình trạng gắn kết này biểu hiện trong suốt đời sống của hồng cầu khoảng 120ngày 17

Nồng độ HbA1c phản ánh mức glucose huyết trong vòng 8-12 tuần trước xétnghiệm Nồng độ HbA1c bình thường khoảng ≤ 5,6%, đây là một thông số rất quantrọng để giúp kiểm soát glucose huyết ở bệnh nhân ĐTĐ 14

1.1.1.2 Một số phương pháp định lượng HbA1c

Hiện nay các phương pháp xét nghiệm HbA1c được thực hiện dựa trên 2nguyên lý chính 17,18,19:

- Sự khác biệt về điện tích: bao gồm phương pháp sắc ký trao đổi ion, phươngpháp điện di mao quản

- Sự khác biệt về cấu trúc: bao gồm phương pháp sắc ký lỏng cao áp, sắc ký

ái lực Boronat, phương pháp miễn dịch và phương pháp enzym

 Phương pháp định lượng HbA1c dựa trên sự khác biệt về điện tích

Hemoglobin được glycosyl hoá (A1c, gắn glucose) và hemoglobin khôngglycosyl hoá (A0, không gắn glucose) có các các tính chất hóa học khác nhau nên

cho phép phân tách 2 loại này, định lượng riêng A1c cũng như tổng A1c + A0 Các

kỹ thuật áp dụng phương pháp này, bao gồm: sắc ký trao đổi ion (IEC, ion exchangechromatography), điện di mao quản (CE, cappillary electrophoresis)

 Phương pháp định lượng HbA1c dựa trên sự khác biệt về cấu trúc

Phương pháp sắc ký ái lực Boronat: Sắc ký ái lực phân tích các hemoglobin

được glycosyl hóa (GHb, không chỉ mỗi HbA1c) và hemoglobin không glycosyl hóa(NGHb, không chỉ mỗi HbA0)

Hình 1.3 Cơ chế hoạt động sắc kí ái lực Boronat

“Nguồn: Trinitybiotech.com 20”

Boronat được gắn cố định trên một matrix trơ, không tan Boronat tương tácchọn lọc với các nhóm cis-diol trên các phân tử đường (như glucose) để tạo liên kếtđồng hóa trị chặt nhưng thuận nghịch GHb sẽ được giữ lại, trong khi Hb không bịglycosyl hóa sẽ bị rửa giải bằng đệm Tác nhân hòa tan chứa diol như sorbitol đượcdùng để đẩy HbA1c ra Cả hai loại GHb được phát hiện bằng phương pháp quangphổ tại bước sóng 414nm 19 Phương pháp này định lượng tổng lượng GHb Điều nàykhiến sắc ký đồ của AC không giống như IEC và CE, NGHb xuất hiện trước, sau đó

là GHb

Phương pháp miễn dịch (IA, immunoassasy): Nguyên lý kĩ thuật xét nghiệm

HbA1c bằng phương pháp miễn dịch dựa trên sự đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên– kháng thể để nhận ra cấu trúc nhóm tetrapeptid hay hexapeptid bị glycosyl hóa ởđầu N-tận trên chuỗi β của hemoglobin 19 Phương pháp miễn dịch đo độ đục là mộttrong các phương pháp định lượng HbA1c ứng dụng nguyên lý này

Đầu tiên, các polyhapten (polyme tổng hợp có chứa các bản sao kháng nguyêncủa HbA1c) sẽ phản ứng với các kháng thể kháng HbA1c tự do trong chất phản ứng

để tạo thành phức hợp kháng thể - polyhapten không tan, tạo nên độ đục cho chấtphản ứng ban đầu Sau khi mẫu máu phân tích (có chứa HbA1c) được bơm vào,HbA1c sẽ đẩy các polyhapten ra khỏi phức hợp không tan ban đầu để gắn với khángthể kháng HbA1c tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể hoà tan, giúp cho độđục của mẫu sẽ được giảm đi so với ban đầu Mức độ đục của phản ứng sẽ tỉ lệ vớilượng HbA1c có trong mẫu, và được định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang

19

Hình 1.4 Cơ chế của phản ứng miễn dịch đo độ đục

“Nguồn: Shaivya Gupta et al (2017) 19”

Phương pháp miễn dịch đòi hỏi cần thực hiện 2 xét nghiệm độc lập cho HbA1c

và tổng số Hb Trên thực tế, sự kết hợp kết quả của hai xét nghiệm có thể làm giảm

độ chính xác của xét nghiệm đo HbA1c

Phương pháp enzym:

Máu toàn phần được ly giải, sau đó được thủy phân bởi protease tạo ra các acidamin và peptid glycosyl hóa Enzym fructosyl valin oxidase sẽ oxy hóa valin glycosyl

và phóng thích ra hydrogen peroxid (H2O2) tiếp tục bị phân hủy bởi peroxidase với

sự tham gia của chất sinh màu Cường độ màu tạo thành tỉ lệ thuận với nồng độHbA1c 19,21

Hình 1.5 Nguyên tắc xét nghiệm HbA1c trực tiếp bằng enzym

Nguyên lý của phương pháp như sau 21:

HbA1c𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑒→ glycosylated dipeptidGlycosylated dipeptid + 𝑂2+ 𝐻2𝑂2𝐹𝑃𝑂𝑋→ glucosen + dipeptid + 𝐻2O

𝐻2𝑂2 + 4AAP + phenol𝑃𝑂𝐷→ Quinoneimin + 2𝐻2O

1.1.2 Vai trò và nguyên lý định lượng glucose

1.1.2.1 Vai trò của glucose trong xét nghiệm chẩn đoán ĐTĐ

Glucose là carbohydrat quan trọng nhất lưu hành trong máu ngoại vi Glucose

là nguồn cung cấp năng lượng chính cho tế bào Nếu nồng độ glucose trong máu quácao có thể gây một số nguy hiểm như: giảm khả năng tiết insulin (tuyến tụy phải làmviệc quá sức, dễ bị tổn thương); tăng khả năng xơ cứng mạch máu, xơ vữa động mạch,dẫn đến các bệnh lý về gan, thận, tim mạch như suy thận, nhồi máu cơ tim, đột quỵ Ngược lại, nồng độ glucose trong máu giảm có thể do sử dụng không đúng liệu phápinsulin, do bệnh u mỡ, rối loạn bẩm sinh của quá trình chuyển hóa carbohydrat hoặcnhịn ăn 13,14

Nồng độ glucose trong máu của mỗi người là khác nhau, thay đổi theo chế độ

ăn Nồng độ glucose trong máu lúc đói (thường vào buổi sáng khi chưa ăn uống) bìnhthường nằm trong khoảng từ 5,6 – 6,9 mmol/l Sau khi ăn 1 - 2 tiếng, nồng độ glucosetrong máu sẽ tăng lên, nhưng vẫn ở dưới ngưỡng 7 mmol/l 13,14 Nếu định lượngglucose trong máu cao hơn ngưỡng trên thì có khả năng mắc bệnh ĐTĐ hoặc rối loạndung nạp glucose Chỉ số đường huyết lúc đói ở phụ nữ có thai thường thấp hơn ngườibình thường khoảng 3,94 ± 0,43 mmol/l 13,14

Xét nghiệm đường huyết là xét nghiệm quan trọng, cần thực hiện định kỳ đểsớm phát hiện bệnh ĐTĐ và có phương án điều trị kịp thời, ngăn ngừa các biến chứngnguy hiểm có thể gặp phải do bệnh gây ra

1.1.2.2 Nguyên lý định lượng glucose

Phương pháp xét nghiệm glucose được thực hiện trong các PXN phổ biến hiệnnay là phương pháp đo quang sử dụng enzym Phương pháp enzym có độ đặc hiệucao và thời gian ngắn nên rất hiệu quả Ba loại enzym phổ biến hiện nay thường dùng

để định lượng glucose máu là hexokinase, glucose oxidase và glucose dehydrogenase.Trong đó, phương pháp sử dụng glucose oxidase thường phổ biến với các hóa chấtcho máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động và một số máy xét nghiệm sinh hóa tựđộng

Nguyên lý của phương pháp như sau 22:

𝛽 − 𝐷 − 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 + 𝐻2O𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ acid gluconic + 𝐻2𝑂2

𝐻2𝑂2 + 4AAP + phenol𝑃𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ Quinoneimin + 2𝐻2OGlucose oxidase có tính đặc hiệu cao với β-glucose Tuy nhiên, trong huyếtthanh có cả 2 dạng α-glucose (chiếm tỉ lệ 1/3) và β-glucose (chiếm tỉ lệ 2/3) Vì vậy,một số kit định lượng glucose huyết được thêm mutarotase để chuyển α-glucose thànhβ-glucose H2O2 được tạo ra tỉ lệ thuận với nồng độ glucose H2O2 tiếp tục tham giaphản ứng với phenol và 4-aminoantipyrine (4AAP) dưới sự xúc tác của enzymperoxidase tạo ra phức chất quinoneimine có màu đỏ Độ hấp thu của quinoneimineđược đo ở bước sóng 505 nm tỷ lệ với nồng độ glucose trong mẫu 22

Ưu điểm của phương pháp này là thời gian nhanh và giá thành thấp Nhượcđiểm là còn nhiều yếu tố ảnh hưởng tác động đến phản ứng và thường làm giảm nồng

độ glucose so với thực tế

1.1.3 Vai trò và nguyên lý định lượng triglycerid

1.1.3.1 Vai trò của triglycerid đối với cơ thể

Triglycerid là dạng chất béo phổ biến nhất trong thức ăn tiêu thụ hàng ngày, làthành phần chủ yếu của các dầu thực vật và mỡ động vật Triglycerid có vai trò quantrọng trong việc cung cấp năng lượng cho cơ thể và các quá trình chuyển hóa khác 17.Triglycerid được vận chuyển trong máu nhờ các phân tử lipoprotein, trong đóchylomicron và VLDL là các lipoprotein rất giàu triglycerid Ở cơ thể người, mức độcao triglycerid trong mạch máu dẫn đến xơ vữa động mạch gây nguy cơ về các bệnhtim mạch và đột quỵ Đo triglycerid rất quan trọng trong chẩn đoán và quản lý bệnhtăng lipid huyết Những bệnh này có thể là di truyền hoặc thứ phát sau các rối loạnkhác bao gồm thận hư, ĐTĐ và rối loạn nội tiết 16,23

1.1.3.2 Nguyên lý định lượng triglycerid

Định lượng triglycerid trong máu bằng phương pháp dùng enzym so màu theophương trình phản ứng sau 22:

Triglycerid + 𝐻2O𝐿𝑃𝐿→ glycerol + 3 acid béo

Độ hấp thu của hợp chất quinoneimin có màu đỏ ở bước sóng 505 nm tỷ lệ thuậnvới nồng độ triglycerid có trong mẫu thử 22

1.1.4 Vai trò và nguyên lý định lượng cholesterol toàn phần

1.1.4.1 Vai trò của cholesterol đối với cơ thể

Cholesterol là 1 alcol steroid được tìm thấy duy nhất ở động vật và hiện diệnhầu như trong tất cả các tế bào và các dịch của cơ thể Cholesterol là tiền thân củanhiều steroid quan trọng về mặt sinh lý, gồm các acid mật và hormon steroid Khoảng2/3 cholesterol huyết tương este hóa với acid béo thành cholesterol este Cholesteroltoàn phần gồm cholesterol tự do và cholesterol este được mang bởi các phân tửlipoprotein để lưu thông trong máu 16

Cholesterol trong cơ thể có từ 2 nguồn gốc chính là:

- Nguồn gốc ngoại sinh: Một số thức ăn giàu cholesterol như: thịt, lòng đỏ trứng,nội tạng động vật…

- Nguồn gốc nội sinh: gan (chiếm 80%), ruột và một số cơ quan khác tổng hợpchủ yếu cholesterol từ acetyl CoA

Xét nghiệm cholesterol máu toàn phần dùng để đánh giá tình trạng rối loạn lipidmáu, đánh giá nguy cơ hình thành mảng xơ vữa động mạch, nghiên cứu chức năngcủa gan và hỗ trợ chẩn đoán tình trạng rối loạn chức năng tuyến giáp 22

1.1.4.2 Nguyên lý định lượng cholesterol toàn phần

Cholesterol toàn phần trong máu được định lượng theo phương pháp dùngenzym 22:

Cholesterol ester + 𝐻2O𝐶𝐻𝐸→ cholesterol + 3 acid béoCholesterol + 𝑂2𝐶𝐻𝑂→ glycerol − 3 − phosphat + ADP

𝐻2𝑂2 + 4AAP + Phenol𝑃𝑂𝐷→ Quinoneimin + 4𝐻2OCHE: Cholesterol esterase; CHO: Cholesterol oxidase ; 4AAP: 4-aminoantipyrine ; POD: Peroxidase

Độ hấp thu của hợp chất quinoneimin (hợp chất có màu đỏ) ở bước sóng 505nm

tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol

1.1.5 Vai trò và nguyên lý định lượng HDL-Cholesterol

1.1.5.1 Vai trò của HDL-Cholesterol đối với cơ thể

HDL là một trong những lipoprotein chính trong huyết tương Chúng đượctổng hợp tại gan dưới dạng phức hợp của apolipoprotein và phospholipid HDL vậnchuyển cholesterol từ máu về gan, nơi cholesterol được chuyển hóa thành acid mật

và bài tiết vào ruột Cholesterol kết hợp với HDL (ký hiệu là HDL-C) được xem làmột dạng cholesterol có lợi cho cơ thể chống lại quá trình xơ mỡ động mạch bằngcách mang cholesterol dư thừa ứ đọng từ trong thành mạch máu trở về gan 16

1.1.5.2 Nguyên lý định lượng HDL-C

HDL-C được định lượng theo phương pháp so màu dùng enzym 23:

HDL − C esters + 𝐻2O 𝐶𝐻𝑂,𝐶𝐻𝐸→ acid béo tự do + ADP

𝐻2𝑂2 + 4AAP + TODP𝑃𝑒𝑟𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒→ Quinone + 5𝐻2OPVS: polyvinyl sulfonic acid; PEGME: polyethylene glycol methyl ether;CHO: Cholesterol oxidase; CHE: Cholesterol esterase; 4AAP: 4-aminoantipyrine;TODB: N-Bis (4-sulfobutyl)-3-methylaniline)

Hợp chất quinone (có màu xanh tím) có thể được định lượng ở bước sóng 600

nm bằng phương pháp đo quang

1.2 Một số nghiên cứu về độ ổn định của HbA1c, glucose và các chỉ số lipid huyết

Từ những năm 1960, nghiên cứu độ ổn định của các chất phân tích đã đượccoi là một khía cạnh quan trọng đối với y học thử nghiệm Dựa trên kết quả xétnghiệm, các quyết định lâm sàng đã được chỉ định cho bệnh nhân 1,2

HbA1c hiện được định lượng bằng khá nhiều phương pháp cũng như thiết bịxét nghiệm sản xuất bởi nhiều hãng khác nhau, do đó vấn đề tính đồng nhất về kếtquả xét nghiệm HbA1c giữa các phương pháp/thiết bị cũng được quan tâm nghiêncứu trên thế giới Một trong những vấn đề quan trọng nhất trong phép đo HbA1c làđiều kiện thu thập và bảo quản mẫu sẽ đảm bảo độ chính xác của kết quả Nghiên cứucủa tác giả Little và cs 24 cho thấy mẫu máu toàn phần sử dụng để đo HbA1c bằng 2

phương pháp HPLC trao đổi ion và sắc kí ái lực Boronat cho thấy mẫu định lượngbảo quản tại nhiệt độ 4 oC ổn định tới 57 ngày, tại nhiệt độ phòng (17 – 23 oC) ổnđịnh trong 3 – 7 ngày Tuy nhiên, xét nghiệm HbA1c cũng có những nhược điểmriêng: độ nhạy cho chẩn đoán thấp hơn, chi phí xét nghiệm cao hơn, bất tương đồnggiữa kết quả HbA1c và glucose huyết trên một số nhóm bệnh nhân riêng biệt 14,25.Kết quả HbA1c có thể tăng giả tạo khi xuất hiện tình trạng kéo dài đời sống hồng cầu– chu trình tế bào hồng cầu bị kéo dài (như sau cắt lách) Các biến thể của hồng cầucũng là một trong các nguyên nhân ảnh hưởng đến độ chính xác của các phương phápxét nghiệm HbA1c Tuỳ theo phương pháp xét nghiệm HbA1c, ảnh hưởng của cácbiến thể nêu trên ở mức độ khác nhau và được đánh giá là có ý nghĩa lâm sàng trongtrường hợp sai lệch kết quả > ±7% tại nồng độ HbA1c 6% và/hoặc 9% 26.

Nghiên cứu của Karami và Baradaran 27 trên 58 bệnh nhân đái tháo đường chothấy mức chênh lệch khá lớn về giá trị HbA1c định lượng giữa phương pháp enzym(máy Diazyme), phương pháp sắc kí ái lực Boronat (máy Nycocard), phương phápsắc kí cột (máy Biosystem) so với phương pháp HPLC (máy Knauer-HPLC) Tuynhiên, nghiên cứu khác của Davari và cs 28 trên 140 bệnh nhân lại cho kết quả địnhlượng HbA1c tương đồng giữa 2 phương pháp enzym và phương pháp miễn dịch đo

độ đục Những thay đổi về phương pháp định lượng theo thời gian cũng có thể dẫnđến những thay đổi về đặc tính ổn định của cùng một phương pháp xét nghiệm 29,30.Các phương pháp phân tích khác nhau dựa trên các kỹ thuật xét nghiệm khác nhau,chẳng hạn như sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực, xét nghiệm miễn dịch và điện didùng để định lượng HbA1c Kết quả định lượng HbA1c cũng có thay đổi đáng kể khiđược đo tại các PXN hoặc phương pháp khác nhau 5

Nghiên cứu khác đánh giá độ ổn định của 35 xét nghiệm sinh hóa và miễn dịch(bao gồm xét nghiệm glucose, triglycerid, cholesterol, HDL-C) cho thấy sau thời gianbảo quản khoảng 10 giờ (bao gồm thời gian vận chuyển), việc lưu trữ máu toàn phầntrong ống lithium – heparin hoặc huyết thanh ở 21±1 oC trong tối đa 10 giờ khônggây ảnh hưởng đáng kể đến nồng độ các chất phân tích ngoại trừ folat và phosphat 8.Những nghiên cứu khác đánh giá độ ổn định của các chất phân tích trong huyết thanh

và huyết tương ở những điều kiện bảo quản khác nhau (nhiệt độ và thời gian) cũngcho kết quả tương đương nhau 6,7,9,10,11.

1.3 Tổng quan về nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Kết quả xét nghiệm đóng góp một phần rất quan trọng đối với các quyết địnhchẩn đoán, điều trị, phát hiện và tầm soát bệnh, nghiên cứu khoa học và giảng dạy

Do đó, việc quản lý chất lượng xét nghiệm là một yêu cầu không thể thiếu trong hoạtđộng xét nghiệm

1.3.1 Khái niệm nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Nội kiểm tra chất lượng (Internal Quality Control- IQC) gọi tắt là nội kiểm tra,

là công cụ kiểm tra chất lượng hàng ngày trong nội bộ một PXN, được thực hiện bởinhân viên PXN nhằm đánh giá liên tục các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng xétnghiệm, từ đó đi đến quyết định liệu kết quả xét nghiệm có đủ tin cậy trước khi trảcho bác sĩ lâm sàng hoặc bệnh nhân 31

1.3.2 Mục đích của nội kiểm tra chất lượng

Nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm là một phần của kiểm tra chất lượng (QC)nhằm góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng (QA) Nội kiểm tra chất lượnghướng đến các mục đích sau 31:

- Phát hiện sai số và xác định loại sai số (sai số ngẫu nhiên, sai số hệ thống);

- Tìm ra nguyên nhân gây sai số, đề xuất hành động phù hợp để tránh lỗi hệthống có thể xảy ra;

- Theo dõi điều kiện môi trường, việc sử dụng hóa chất, thuốc thử cũng nhưgiám sát việc bảo dưỡng, bảo trì và hiệu chuẩn thiết bị định kỳ cảnh báo các thay đổi

có xu hướng ảnh hưởng lên các thông số kỹ thuật của phương pháp;

- Đánh giá độ tin cậy của kết quả thử nghiệm; đánh giá phương pháp, thiết bị,hóa chất, thuốc thử và tay nghề của thử nghiệm viên

1.3.3 Mẫu nội kiểm

Mẫu nội kiểm hay còn gọi là mẫu chuẩn biết trước nồng độ là vật liệu đủ đồngnhất và ổn định đối với một hoặc nhiều tính chất quy định, được thiết lập phù hợp

cho việc sử dụng dự kiến trong quá trình đo Tính chất quy định của mẫu nội kiểm cóthể là định lượng hay định tính 31.

Mẫu nội kiểm tốt có một số đặc tính như sau 31:

- Tương tự mẫu bệnh nhân

- Có nhiều nồng độ liên quan đến quyết định lâm sàng

 Yêu cầu và phương pháp đánh giá chất lượng mẫu nội kiểm

- Độ đồng nhất: Theo TCVN 8245:2009, “ngay cả khi vật liệu được kỳ vọng làđồng nhất như trong trường hợp dung dịch thì vẫn cần đánh giá sự đồng nhất giữacác đơn vị bao gói” Có thể giảm tác động của tính không đồng nhất giữa các đơn vịbao gói bằng cách lấy nhiều đơn vị bao gói ở mỗi thời điểm để kiểm nghiệm tínhđồng nhất Số lượng tối thiểu các đơn vị bao gói được lựa chọn ngẫu nhiên từ 10 - 30nhưng không ít hơn 10 32

- Độ ổn định: Độ ổn định thường được kiểm tra để giám sát xem các đại lượng

đo có bị thay đổi trong suốt quá trình nghiên cứu hay không Mẫu thử cần được thửtrong các điều kiện thay đổi xuất hiện trong quá trình triển khai chương trình nhưđiều kiện xử lý, đóng gói và vận chuyển mẫu khi được phân phối cho các đơn vị thamgia theo quy định của TCVN 8245 (ISO Guide 35) 32

 Phương pháp phân tích kết quả nội kiểm tra chất lượng xét nghiệm

Áp dụng các quy luật Westgard để phân tích kết quả chạy mẫu nội kiểm Việcphân tích kết quả nội kiểm phụ thuộc vào số lần chạy mẫu nội kiểm với mẫu bệnhnhân 31

Định nghĩa luật Westgard: Luật Westgard là các luật kiểm soát chất lượng(Quality control – QC) được xây dựng dựa trên các phương pháp thống kê, nhằmphân tích xem các kết quả chạy mẫu nội kiểm nằm trong hay ngoài giới hạn cho phép

31

Quy tắc 1 2s : Khi một kết quả chạy mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng nằm nằm ngoài

giới hạn ± 2 SD nhưng vẫn nằm trong giới hạn ± 3 SD và không có các lỗi khác xảy

ra thì nguyên nhân có thể là do lỗi ngẫu nhiên, trường hợp này cảnh báo cho phòngxét nghiệm cần giám sát các lần xét nghiệm tiếp theo và không cần làm lại xét nghiệm

31

Hình 1.6 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 12s

“Nguồn: westgard.com 33”

Quy tắc 1 3s : Khi một kết quả chạy mẫu chuẩn hoặc mẫu chứng nằm ngoài giới

hạn ± 3 SD, nguyên nhân có thể là do lỗi ngẫu nhiên, trường hợp này phòng xétnghiệm phải loại bỏ kết quả của lần chạy và làm lại xét nghiệm trước khi thực hiệnxét nghiệm trên mẫu bệnh nhân 31

Hình 1.7 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 13s

“Nguồn: westgard.com 33”

Quy tắc 2 2s : Áp dụng qua các lần chạy liên tiếp nhau của cùng một mức mẫu

chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc trong cùng một lần chạy của các mức mẫu chuẩn(hoặc mẫu kiểm chứng) khác nhau 31:

- Khi hai kết quả liên tiếp của một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) nằmcùng một phía ngoài giới hạn + 2SD hoặc – 2SD thì lần chạy này không đạt, đây làlỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểmchứng

- Khi kết quả của hai mức mẫu chứng khác nhau trong cùng lần chạy nằm ngoàigiới hạn + 2SD hoặc – 2SD (ví dụ: kết quả của mức mẫu chuẩn thấp (hoặc mẫu kiểmchứng thấp) nằm ngoài giới hạn + 2SD và kết quả của mức mẫu chuẩn trung bình(hoặc mẫu kiểm chứng trung bình) cũng nằm ngoài giới hạn + 2SD) thì lần chạy nàykhông đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩnhoặc mẫu kiểm chứng

Hình 1.8 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 22s

“Nguồn: westgard.com 33”

Quy tắc R 4s : Áp dụng qua các lần chạy liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn

(hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc trong cùng một lần chạy của các mức mẫu chuẩn (hoặcmẫu kiểm chứng) khác nhau 31:

- Khi hai kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểmchứng) có sự chênh lệch vượt quá ± 4SD (ví dụ: khi một kết quả nằm ngoài giới hạn+ 2SD và kết quả xét nghiệm tiếp theo nằm ngoài giới hạn – 2SD hoặc ngược lại) kếtquả chạy mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) không đạt, đây là lỗi ngẫu nhiên, tìmnguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng

- Khi kết quả trong cùng một lần chạy ở hai mức mẫu chứng khác nhau có sựchênh lệch vượt quá ± 4SD (ví dụ: khi một kết quả của mức mẫu chứng thấp nằmngoài giới hạn +2SD và kết quả của mức mẫu chứng trung bình nằm ngoài giới hạn-2SD và ngược lại) thì lần chạy này không đạt, đây là lỗi ngẫu nhiên, tìm nguyênnhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng

Hình 1.9 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc R4s

“Nguồn: westgard.com 33”

Quy tắc 4 1s : Áp dụng ở các lần chạy liên tiếp nhau của cùng một mức mẫu

chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng); hoặc của các mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khácnhau 31:

- Khi 4 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng)cùng nằm trên giới hạn + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD thì kết quả lần chạy này khôngđạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫukiểm chứng

- Khi 2 kết quả liên tiếp của hai mức mẫu chuẩn (hoặc hai mẫu kiểm chứng)cùng nằm phía trên + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD (ví dụ: hai kết quả liên tiếp củamức mẫu chuẩn thấp nằm phía trên + 1SD và hai kết quả liên tiếp của mức mẫu chuẩntrung bình cũng nằm cùng nằm trên giới hạn + 1SD hoặc dưới giới hạn -1SD), kếtquả lần chạy này không đạt, đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạylại mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng

Hình 1.10 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 41s

“Nguồn: westgard.com 33”

Quy tắc 10x: Áp dụng ở các lần chạy liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn

(hoặc mẫu kiểm chứng) hoặc của hai mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng) khácnhau 31:

- Khi 10 kết quả liên tiếp của cùng một mức mẫu chuẩn (hoặc mẫu kiểm chứng)cùng nằm về 1 phía trên hoặc dưới giá trị trung thì kết quả lần chạy này không đạt,đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫukiểm chứng

- Khi 5 kết quả liên tiếp của mỗi mức mẫu chuẩn hoặc mẫu kiểm chứng cùngnằm phía trên hoặc dưới giá trị trung bình (ví dụ: 5 kết quả liên tiếp của mức mẫuchứng thấp đều nằm phía trên giá trị trung bình và 5 kết quả liên tiếp của mức mẫuchứng cao cũng nằm phía trên giá trị trung bình) thì kết quả lần chạy này không đạt,đây là lỗi hệ thống, tìm nguyên nhân, khắc phục và chạy lại mẫu chuẩn hoặc mẫukiểm chứng

Hình 1.11 Kết quả nội kiểm tra vi phạm quy tắc 10x

Kết quả xét nghiệm bị ảnh hưởng bởi rất nhiều yếu tố nhất là giai đoạn tiềnphân tích 3,4,5 Chính vì vậy việc tối ưu hóa điều kiện xét nghiệm đồng thời tiến hànhnội kiểm hàng ngày là 1 yêu cầu cấp thiết để đảm bảo chất lượng xét nghiệm Đặcbiệt, đối với những chất mà kém ổn định do thời gian bảo quản kéo dài như glucose2-4

Theo khuyến cáo của CLSI (Viện tiêu chuẩn xét nghiệm lâm sàng) các xétnghiệm hóa sinh nên tiến hành nội kiểm ở 2 mức nồng độ bình thường và bất thường

34

1.4.2 Các mẫu nội kiểm cho xét nghiệm glucose

Hiện nay, nội kiểm do PXN tự sản xuất (In-house control) với ưu điểm là giáthành rẻ và có thể tận dụng được các tài nguyên sẵn có Tuy nhiên, các nghiên cứu vềmẫu nội kiểm do các PXN tự sản xuất còn rất hạn chế, phần lớn các PXN đều sử dụngcác mẫu nội kiểm đi kèm theo máy hoặc được cung cấp từ bên thứ 3

Mẫu nội kiểm đi kèm theo máy (In-kit control): dùng cùng thiết bị, hóa chất,

mẫu hiệu chuẩn, kiểm chuẩn của cùng một hãng Các nhà sản xuất thiết bị vì lý dothuận tiện, độ ổn định tốt và thời gian bảo quản kéo dài Thông thường các mẫu nộikiểm do chính nhà sản xuất thiết bị tạo ra sẽ phù hợp với công nghệ phân tích củahãng máy đó Tuy nhiên, cũng chính vì điều này mà các nhà sản xuất thiết bị sẽ tạo

ra các mẫu QC tối ưu nhất cho máy của mình Việc này vô tình sẽ làm kết quả nộikiểm không đánh giá được chính xác các lỗi đang xảy ra với thiết bị, nhất là khi phântích trên nền mẫu bệnh nhân thực

Mẫu nội kiểm bên thứ 3 (Third party control): là mẫu không do nhà sản xuất

thiết bị cung cấp, có tính khách quan cao, thuận tiện khi sử dụng do hạn bảo quản dài

và có nhiều thông số trong một mẫu nội kiểm

Các mẫu nội kiểm đang được sử dụng tại các PXN đều phải nhập khẩu từ nướcngoài với chi phí khá cao nên các PXN nhỏ có thể không thực hiện đầy đủ nội kiểmtra chất lượng xét nghiệm theo đúng quy định Vì vậy, việc nghiên cứu tạo ra các mẫunội kiểm với chi phí hợp lý cho xét nghiệm glucose huyết sẽ khuyến khích cho cácPXN nâng cao công tác quản lý chất lượng xét nghiệm glucose huyết

Một vài mẫu nội kiểm thương mại đang được sử dụng phổ biến hiện nay chocác xét nghiệm glucose được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Mẫu nội kiểm cho xét nghiệm glucose

Giá thành (vnđ)

Hạn sử dụng

Nhiệt độ bảo quản (ºC)

Erba Nội kiểm Sinh hóa/ nồng

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Nguyên liệu

Các mẫu máu toàn phần của những người đến kiểm tra sức khỏe đồng ý chomáu tại Trung tâm xét nghiệm Buôn Ma Thuột được thu thập vào ống có chất chốngđông máu

Tiêu chuẩn chọn mẫu

Người hiến máu có đủ tiêu chuẩn về tuổi, sức khỏe và các điều kiện khác theoquy định trong Điều 4 Thông tư 26/2013/TT-BYT 35:

- Tuổi từ đủ 18 đến 60 tuổi

- Cân nặng ít nhất 42 kg đối với nữ, 45 kg đối với nam

- Không đang bị nhiễm trùng cấp tính, không đang sử dụng các loại thuốc bấtkỳ

Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu

- Mẫu máu không có thông tin, ngày, giờ thu thập mẫu

- Mẫu máu bị đông vón hoặc bị tán huyết

- Ống đựng mẫu bị nứt, vỡ hoặc sử dụng chất chống đông không phải K2 EDTA

- Các bộ kit định lượng glucose (số lô: 2209003, hạn dùng: 03/2025), triglycerid(số lô: 2203009, hạn dùng: 06/2023), cholesterol toàn phần (số lô: 2203135, hạndùng: 03/2024), HDL-C (số lô: 2208126, hạn dùng: 04/2024) dùng cho hệ thống máysinh hóa tự động Erba XL640

- Nội kiểm Sinh hóa Acusera 2 nồng độ (Randox): Randox 2 (số lô: 1489UN,hạn dùng: 05/2024), Randox 3 (số lô: 1174UE, hạn dùng: 06/2024).

- Glucose tinh khiết (số lô: 20171016, hãng sản xuất: Guangdong (China))

2.2.2 Trang thiết bị

- Hệ thống máy xét nghiệm Standard F HbA1c (hãng SD Biosensor)

- Máy sinh hóa tự động Erba XL640 (hãng Erba)

- Máy ly tâm tốc độ cao

- Micro pipette

- Tủ đông

- Máy lắc

- Máy vortex

2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

- Găng tay, khẩu trang, áo choàng y tế

- Đầu cone, Eppendorf

- Ống đựng mẫu 1,5 – 2 ml

2.3 Nơi thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Hóa sinh - Khoa Dược – ĐH Y Dược Tp.HCM và Trung tâm xét nghiệm Buôn Ma Thuột

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành theo trình tự sau:

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ tóm tắt các bước nghiên cứu

Thu thập mẫu máu từ người tình

nguyện

Lưu trữ, xử lý mẫu

- Bảo quản mẫu ở điều kiện khảo sát

- Định lượng HbA1c, glucose, TG,CHOLTP, HDL-C

Khảo sát độ ổn định của chất phân tích ở những

điều kiện bảo quản khác nhau

Xác định điều kiện tối ưu hóa của chất phân tích

Thu thập mẫu máu từ người tình

nguyện

Lưu trữ, xử lý mẫu

- Bảo quản mẫu ở -20 oC

- Định lượng glucose

Đánh giá chất lượng mẫu: độ đồng nhất, độ ổn định

Ứng dụng thử các mẫu chuẩn cho nội kiểm trachất lượng xét nghiệm trên máy sinh hóa

2.4.2 Cỡ mẫu

Hầu hết các nghiên cứu về độ ổn định mẫu xét nghiệm thu thập mẫu từ các đốitượng khỏe mạnh với cỡ mẫu dao động từ 10 đến 30 người 11 Vì vậy, nghiên cứu nàythu thập mẫu máu toàn phần của người tình nguyện đạt tiêu chuẩn người cho mẫu ởmục 2.1 với cỡ mẫu tối thiểu 10 người

Để khảo sát độ ổn định của các thông số sinh hóa ở các mức nhiệt độ, cần thuthập 10 ml máu tĩnh mạch của 10 người tình nguyện

Do thể tích huyết tương chiếm khoảng 55-60% thể tích máu toàn phần nên đểchuẩn bị 50 mẫu huyết tương cho mỗi mức nồng độ của bộ mẫu nội kiểm glucose,cần thu thập thêm30 ml máu toàn phần từ hai người tình nguyện

2.4.3 Lựa chọn chất chống đông cho các thông số khảo sát

Nhiều nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của các chất chống đông máu đến sựthay đổi của các thông số xét nghiệm, góp phần xây dựng các điều kiện bảo quản mẫumáu tối ưu

Hầu hết các bộ kit thương mại cho định lượng HbA1c đều yêu cầu mẫu đượcthu thập trong chất chống đông EDTA Một số nghiên cứu tiến hành định lượngHbA1c trong mẫu được thu thập trong các ống chứa chất chống đông K3 EDTA, Na-citrate, Na-heparin và Na-florua/Na2 EDTA, và đã chứng minh rằng không có thayđổi đáng kể về giá trị HbA1c trong các mẫu máu có chất chống đông máu khác nhau

36

Một nghiên cứu khác so sánh nồng độ trung bình của các thông số trong cácống chứa chất chống đông khác nhau, kết luận rằng: CHOLtp, LDL trong ống chứaheparin khác biệt có ý nghĩa, trong khi triglycerid trong ống K2 EDTA khác biệtkhông có ý nghĩa so với ống lấy máu chứa gel; HDL-C trong các ống heparin, K2EDTA và natri citrate khác không có ý nghĩa thống kê so với ống chứa gel 37.Glucosetrong các mẫu máu nên được thu thập vào các ống chứa NaF (chất ức chế glycolysis)

và được ly tâm trước khi vận chuyển về PXN để đảm bảo việc đo lường nồng độglucose được chính xác 38.Tuy nhiên, một số nghiên cứu quan sát thấy glucose vẫn

bị giảm trong ống NaF Điều đó chứng tỏ NaF không phải là chất chống đông đảm

bảo độ ổn định tốt nhất cho glucose Do đó, nhiều ống đựng máu được nghiên cứuvới chất chống cải tiến nhằm tăng cường độ ổn định của glucose như: NaF/Na-heparin, NaF/K2 oxalate và NaF/citrate/NaF EDTA phù hợp cho mẫu máu toàn phầnđược gửi đến PXN trong vòng 24 giờ 39.

Trong một số trường hợp không đủ thể tích mẫu máu để chia vào các ống đựngmáu chứa chất chống đông đặc hiệu cho thông số xét nghiệm Do đó, cần phải chọnlựa một ống đựng máu có chất chống đông mà không ảnh hưởng nhiều đến kết quảxét nghiệm nói chung Mặt khác, điều này cũng góp phần tiết kiệm chi phí nguyênvật liệu lấy mẫu Dựa trên các nghiên cứu đánh giá trước 39,40, trong nghiên cứu nàychúng tôi đã chọn ống đựng máu có chất chống đông K2 EDTA cho các xét nghiệmđồng thời thông số HbA1c, glucose và các chỉ số lipid huyết, kết hợp với khảo sátđiều kiện nhiệt độ bảo quản để tối ưu hóa độ ổn định của các thông số này

2.4.4 Lấy mẫu và xử lý mẫu

Máu toàn phần của người tình nguyện được thu thập vào buổi sáng sớm (trướckhi ăn) và được chống đông K2 EDTA Các mẫu huyết tương được tách từ máu toànphần bằng phương pháp ly tâm trong vòng 30 phút tính từ thời điểm lấy mẫu máu 41

Hình 2.1 Quy trình lấy mẫu máu

2.4.4.1 Khảo sát độ ổn định của các chất

Tiến hành thu thập 10 ml mẫu máu toàn phần tĩnh mạch ở mỗi người tìnhnguyện (10 người) và cho vào các ống đựng máu có chứa sẵn chất chống đông K2EDTA Tiếp theo lấy 5 ml máu toàn phần đem ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong

5 phút ở nhiệt độ phòng để tách phần huyết tương 41 Chia 5 ml máu toàn phần (0,5ml/ống) và huyết tương (0,3 ml/ống) vào các ống nghiệm vô khuẩn, sau đó đem bảoquản mẫu ở các điều kiện để đánh giá độ ổn định của các thông số khảo sát

2.4.4.2 Sản xuất thử nghiệm bộ mẫu nội kiểm

Tiến hành thu thập các mẫu máu toàn phần từ người tình nguyện theo tiêu chuẩndựa trên Điều 4 Thông tư 26/2013/TT-BYT 35, các mẫu máu được cho vào các ống

có chất chống đông K2 EDTA, sau đó đem ly tâm ở nhiệt độ phòng để tách phầnhuyết tương Kiểm tra nồng độ glucose ban đầu trên máy phân tích Sau khi chia 0,3

ml huyết tương vào các ống đựng mẫu thích hợp dán nhãn IQC-bình thường (nồng

độ glucose 5,5 mmol/l) và IQC-cao (nồng độ glucose 15,1 mmol/l), các ống đựngmẫu được vặn nắp chặt và để ở nhiệt độ bảo quản tối ưu

Mẫu đối chiếu (kiểm soát) là mẫu nội kiểm sinh hóa Acusera được chuẩn bịtheo hướng dẫn của nhà cung cấp (Randox) Lọ mẫu được lấy ra khỏi tủ mát và để ởnhiệt độ phòng Nhẹ nhàng gõ nhẹ vào miệng lọ đã định vị thẳng đứng và đảm bảorằng vật liệu đông khô nằm ở đáy lọ Sau đó, tháo nắp vặn và cao su một cách cẩnthận, tránh làm mất chất đông khô Hoàn nguyên bằng cách thêm từ từ và chính xác5,0ml nước cất / khử ion vào thành lọ Sau đó cẩn thận thay nút cao su và để yên trong

30 phút ở nhiệt độ phòng để đảm bảo rằng tất cả các thành phần của chất đông khô

đã được hòa tan và tránh sự hình thành bọt Phân phối thể tích cần thiết vào cốc đựngmẫu, sau đó chạy thử nghiệm QC Kết quả mẫu kiểm soát phải nằm trong phạm vibảng giá trị kiểm soát của nhà sản xuất

2.4.5 Khảo sát độ ổn định của HbA1c trong máu toàn phần ở các mức nhiệt độ bảo quản

Kết quả định lượng HbA1c có thể khác nhau do các phương pháp định lượngkhác nhau Do đó, trong nghiên cứu này, độ ổn định của HbA1c trong máu toàn phần

ở các mức nhiệt độ bảo quản khác nhau sẽ được đánh giá bằng 2 phương pháp là xét