Khảo sát hoạt tính độc tế bào in vitro và tác động kháng khối u trên chuột nhắt gây u bằng dimethylbenzaanthracen (dmba) của cao chiết tam thất (panax notoginseng (burkill) f h chen)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ THU VÂN KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO VÀ TÁC ĐỘNG KHÁNG KHỐI U TRÊN CHUỘT NHẮT GÂY U BẰNG DIMETHYLBENZ[

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ THU VÂN

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO VÀ

TÁC ĐỘNG KHÁNG KHỐI U TRÊN CHUỘT NHẮT GÂY U BẰNG DIMETHYLBENZ[A]ANTHRACEN (DMBA) CỦA

CAO CHIẾT TAM THẤT (Panax notoginseng (Burkill) F.H Chen)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ THU VÂN

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO VÀ

TÁC ĐỘNG KHÁNG KHỐI U TRÊN CHUỘT NHẮT GÂY U BẰNG DIMETHYLBENZ[A]ANTHRACEN (DMBA) CỦA

CAO CHIẾT TAM THẤT (Panax notoginseng (Burkill) F.H Chen)

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ - DƯỢC LÂM SÀNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫncủa PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi Kết quả và số liệu trong luận văn này là trung thực

và chưa từng được công bố ở bất kỳ nghiên cứu khoa học nào trước đây

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2022

Tác giả luận văn

Lê Thị Thu Vân

TÓM TẮT

Khảo sát hoạt tính độc tế bào in vitro và tác động kháng khối u trên chuột nhắt

gây u bằng 7,12-dimethyl-benz[a]anthracen (DMBA) của cao chiết Tam thất Học viên: Lê Thị Thu Vân Thầy hướng dẫn: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi

Mở đầu: Trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu cho thấy Tam

thất, đặc biệt là Tam thất chế theo kiểu Hồng Sâm (hấp ở nhiệt độ cao) có tác dụng

ức chế sự phát triển của tế bào ung thư in vitro và ức chế sự tăng trưởng khối u in

vivo Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác động hỗ trợ điều trị ung thư

của Tam thất còn hạn chế Vì lý do trên, đề tài này được tiến hành để khảo sát hoạt

tính độc tế bào in vitro, độc tính cấp và tác động kháng khối u của cao chiết Tam thất.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Khảo sát hoạt tính độc tế bào của cao

chiết Tam thất được chế biến ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau (100

oC và 120 oC trong thời gian 2 - 4 - 6 - 8 - 10 giờ) trên dòng tế bào A549 Xác địnhđiều kiện chế biến thích hợp để chế biến cao chiết Tam thất cho thử nghiệm trênchuột Khảo sát độc tính cấp của cao chiết Tam thất trên chuột khỏe mạnh và tácđộng kháng khối u trên chuột nhắt gây u bằng DMBA

Kết quả: Tam thất được chế biến bằng cách hấp ở nhiệt độ 100 oC trong 8 - 10 giờhoặc ở nhiệt độ 120 oC trong 4 - 6 - 8 - 10 ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư phổiA549 so với mẫu Tam thất chưa chế biến hoặc mẫu Tam thất được chế biến ở điềukiện còn lại Tam thất chế ở điều kiện 120 oC trong 4 giờ được chọn để chế biến caochiết cho thử nghiệm trên chuột Cao chiết Tam thất không thể hiện độc tính cấpđường uống trên chuột nhắt Cao chiết Tam thất không ảnh hưởng tỉ lệ sống/chếtcủa chuột gây u bằng DMBA, làm giảm trọng lượng cơ thể chuột, giảm sự tăng kíchthước khối u da và làm tăng hiện tượng hoại tử tế bào ung thư phổi

Kết luận: Quá trình chế biến bằng cách hấp ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian

khác nhau làm tăng hoạt tính ức chế tế bào ung thư phổi A549 của Tam thất so vớimẫu chưa chế biến Cao chiết Tam thất không thể hiện độc tính cấp đường uống trên

chuột nhắt, có hoạt tính độc tế bào in vitro và tác động kháng khối u trên chuột gây u

bằng DMBA

Study on in vitro cytotoxic activity and anti-tumor effect of Panax notoginseng

extract in mice induced tumor by 7,12-dimethylbenz[a]anthracen (DMBA)

Le Thi Thu Van Supervisor: Assoc Prof Do Thi Hong Tuoi

Introduction: In recent years, some studies have reported that streamed Panax

notoginseng extract has in vitro cytotoxic activity and antitumor effect However,

studies on the antitumor effect of P notoginseng in Vietnam are limited Therefore, this study was conducted in order to evaluate in vitro cytotoxic activity, acute oral toxicity and antitumor effect of P.notoginseng extract in mice induced tumor by

7,12-dimethylbenz[a]anthracen (DMBA)

Materials and methods: Investigate of cytotoxic activity of streamed P.

notoginseng extract prepared at various temperature and time conditions (at 100 oCand at 120 oC for 2 - 4 - 6 - 8 - 10 h) on human lung cancer cell line A549 in order

to determine suitable condition to prepare P notoginseng extract for the in vivo study Acute oral toxicity P notoginseng extract is carried out on healthy mice and

antitumor effect on DMBA-induced tumor mice

Results: Streamed P notoginseng at 100 oC for 8 - 10 h and at 120 oC for 4 - 6 - 8 - 10 h

inhibited the proliferation of A549 cells compared with unstreamed P notoginseng and streamed P notoginseng at remaining conditions Streamed P notoginseng at

120 oC for 4h was chosen to prepare the extract for the study on mice The extracthad no oral acute toxicity The extract did not affect on survival/mortality of mice,reduced body weight, reduced the skin tumor size and exhibit the necrosis of lungcancer cells

Conclusion: Streamed P notoginseng had the antiproliferative activity on A549

cells compared with unstreamed Streamed P notoginseng extract had no oral acute toxicity, in vitro cytotoxic activity and antitumor effect on the DMBA-induced

tumor mice

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị, các bạn và các emmonitor ở Bộ môn Dược lý đã nhiệt tình hỗ trợ trong suốt quá trình tôi thực hiện đềtài luận văn tốt nghiệp.

Trân trọng cảm ơn

Lê Thị Thu Vân

MỤC LỤC

MỤC LỤC 7

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC BẢNG iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về Tam thất 3

1.1.1 Tên gọi 3

1.1.2 Phân loại thực vật 3

1.1.3 Phân bố sinh thái 3

1.1.4 Bộ phận dùng 3

1.1.5 Thành phần hóa học 4

1.1.6 Phương pháp chế biến Tam thất 4

1.1.7 Tác dụng dược lý 4

1.1.8 Độc tính của Tam thất 6

1.2 Tổng quan về ung thư 7

1.2.1 Định nghĩa 7

1.2.2 Dịch tễ học 7

1.2.3 Các nguyên nhân gây ung thư 9

1.2.4 Các phương pháp điều trị ung thư 10

1.2.5 Paclitaxel 13

1.3 Mô hình tiền lâm sàng khảo sát tác động kháng ung thư 14

1.3.1 Mô hình in vitro 14

1.3.2 Mô hình ex vivo 16

1.3.3 Mô hình in vivo 16

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.1 Cao chiết Tam thất 21

2.1.2 Động vật thử nghiệm 22

2.1.3 Dòng tế bào 22

2.1.4 Hóa chất 22

2.1.5 Thiết bị 23

2.1.6 Dụng cụ 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Khảo sát hoạt tính độc tế bào in vitro của cao chiết Tam thất 24

2.2.2 Khảo sát độc tính cấp đường uống của cao chiết Tam thất 26

2.2.3 Khảo sát tác động kháng khối u của cao chiết Tam thất trên chuột nhắt gây khối u bằng DMBA77 27

2.2.4 Xử lý kết quả 29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ 30

3.1 Hoạt tính độc tế bào ung thư phổi A549 của các mẫu thử từ Tam thất 30

3.2 Độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt của cao chiết Tam thất 33

3.2.1 Độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt của cao lỏng Tam thất 33

3.2.2 Độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt của cao đặc Tam thất 33

3.3 Tác động kháng khối u của cao chiết Tam thất 34

3.3.1 Tác động lên tỉ lệ sống/chết của chuột thử nghiệm 34

3.3.2 Tác động lên trọng lượng cơ thể chuột 35

3.3.3 Tác động kháng khối u 36

CHƯƠNG IV BÀN LUẬN 49

4.1 Hoạt tính độc tính tế bào của cao chiết Tam thất 49

4.2 Độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt của cao chiết Tam thất 50

4.3 Mô hình gây u trên chuột nhắt bằng DMBA 51

4.4 Tác động kháng khối u của cao chiết Tam thất 51

4.4.1 Tác động lên tỷ lệ sống/chết của chuột thử nghiệm 51

4.4.2 Tác động lên trọng lượng cơ thể chuột thử nghiệm 52

4.4.3 Tác động kháng khối u da của cao chiết Tam thất 52

4.5 Tác động kháng khối u phổi của cao chiết Tam thất 53

4.6 Cơ chế tác động kháng khối u của cao chiết Tam thất 54

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

5.1 Kết luận 55

5.2 Đề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Từ nguyên tiếng nước ngoài Từ nguyên tiếng Việt

Dulbecco's Modified Eagle

picrylhydrazyl

Mô hình chuột biến đổigen

Yếu tố tăng trưởnggiống insulin

Lethal dose for 100% of the animaltest population

Liều gây chết 100% thúvật thử nghiệm

Lethal dose for 50% of the animaltest population

Liều gây chết 50% thúvật thử

STT Từ viết tắt Từ nguyên tiếng nước ngoài Từ nguyên tiếng Việt

nitrosoguanidin

diphenyl tetrazolium bromid

butanon

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây và rễ củ Tam thất 3

Hình 1.2 Số lượng ca ung thư mắc mới trong năm 2020 7

Hình 1.3 Công thức hóa học của paclitaxel 13

Hình 1.4 Công thức phân tử của 7,12-dimethyl benz[a]anthracen (DMBA) 19

Hình 3.5 Các khối u trên da xuất hiện từ tuần thứ 11 36

Hình 3.6 Phần trăm thay đổi thể tích khối u da 37

Hình 3.7 Vi thể tế bào khối u da 41

Hình 3.8 Đại thể phổi của chuột ở các lô thử nghiệm sau khi ngâm formol 10%.42 Hình 3.9 Vi thể tế bào phổi 44

Hình 3.10 Đại thể buồng trứng của chuột ở các lô thử nghiệm sau khi ngâm formol 10% 45

Hình 3.11 Đại thể dạ dày của chuột ở các lô thử nghiệm sau khi ngâm formol 10% 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các nghiên cứu tác động kháng ung thư của Tam thất 5

Bảng 1.2 Tỉ lệ mới mắc, tử vong, hiện mắc của các loại ung thư tại Việt Nam (Globocan, 2020) 8

Bảng 2.3 Ký hiệu các mẫu cao chiết từ Tam Thất 21

Bảng 2.4 Danh mục hóa chất sử dụng 23

Bảng 2.5 Danh mục các thiết bị sử dụng 23

Bảng 3.6 Khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào A549 của doxorubicin 30

Bảng 3.7 Khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào A549 của mẫu Tam thất chưa chế biến (CCB) 30

Bảng 3.8 Khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào A549 của các cao chiết từ Tam thất chế biến (CB) ở nhiệt độ 100 oC 31

Bảng 3.9 Khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào A549 của các cao chiết từ Tam thất chế biến (CB) ở nhiệt độ 120 oC 32

Bảng 3.10 Số chuột chết trong 4 tuần điều trị 34

Bảng 3.11 Trọng lượng trung bình của chuột ở các lô trong 4 tuần điều trị 35

Bảng 3.12 Thể tích trung bình khối u da trong 4 tuần điều trị 37

Bảng 3.13 Thay đổi trong thể tích khối u trong 4 tuần điều trị 38

Bảng 3.14 Kết quả phân tích vi thể khối u da 40

Bảng 3.15 Số lượng và thể tích khối u phổi 42

Bảng 3.16 Kết quả phân tích vi thể phổi 43

Bảng 3.17 Kết quả phân tích vi thể buồng trứng 46

Bảng 3.18 Kết quả phân tích vi thể dạ dày 48

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển kinh tế xã hội, con người phải luôn đối mặt với các yếu

tố nguy cơ gây ung thư như ô nhiễm môi trường, hóa chất độc hại…Đến nay, gánhnặng ung thư vẫn đang tiếp tục tăng trên toàn cầu và gây ảnh hưởng nghiêm trọngđến thể chất, tinh thần và tài chính đối với cá nhân, gia đình, cộng đồng và hệ thống

y tế.1 Theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization - WHO),ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên toàn thế giới với gần 10 triệungười tử vong do ung thư trong năm 2020.2 Hiện nay, các thuốc hóa trị ung thư cógiá thành cao và thường gây ra những phản ứng bất lợi trong quá trình điều trị Vìvậy, xu hướng hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam là sử dụng các sản phẩm cónguồn gốc thảo dược trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư với ưu điểm íttác dụng không mong muốn và tiết kiệm chi phí cho người bệnh

Tam thất (Panax notoginseng (Burkill) F.H Chen) là một dược liệu quý thuộc

họ Nhân Sâm (Araliaceae) đã được chứng minh tác dụng qua các công trình nghiêncứu khoa học cũng như được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền Tam thất thể

hiện tác động dược lý đặc trưng của chi Panax như tăng lực, chống trầm cảm, tăng

sinh thích nghi, chống oxy hóa, cầm máu, kích thích miễn dịch, kích thích nội tiếtsinh dục nữ, giãn mạch ngoại biên.3 Trong những năm gần đây, nhiều công trìnhnghiên cứu cho thấy Tam thất, đặc biệt là Tam thất chế theo kiểu Hồng Sâm (hấp ở

nhiệt độ cao) có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư in vitro trên nhiều dòng tế bào ung thư và ức chế sự tăng trưởng khối u in vivo.4,5 Thị trường hiện nay

có những sản phẩm khác nhau gồm dược liệu thô (nguyên củ Tam thất), bột củ Tamthất, viên nang, viên nén kết hợp giữa Tam thất và một số dược liệu khác như Nghệ,Đan sâm để điều trị các bệnh liên quan đến máu, bệnh tim mạch (chứng đau thắtngực, hồi hộp, xơ vữa mạch vành…) Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu vềtác động hỗ trợ điều trị ung thư của Tam thất còn hạn chế

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài tiến hành “Khảo sát hoạt tính độc tế bào in

vitro và tác động kháng khối u trên chuột nhắt gây u bằng

7,12-dimethyl-benz[a]anthracen (DMBA) của cao chiết Tam thất với các mục tiêu cụ thể gồm:

1 Khảo sát hoạt tính độc tế bào in vitro của cao chiết Tam thất

2 Khảo sát độc tính cấp đường uống của cao chiết Tam thất trên chuột nhắt

3 Khảo sát tác động kháng khối u của cao chiết Tam thất trên chuột nhắt gây khối ubằng 7,12-dimethyl benz[a]anthracen (DMBA)

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về Tam thất

1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Panax notoginseng (Burkill) F.H Chen, Araliaceae (họ Ngũ gia bì)

Tên khác: Kim bất hoán, Nhân sâm tam thất, Sâm tam thất6,7

Tam thất phân bố chủ yếu ở vùng núi cao từ 1.200 - 2.000 m ở phía Tây Nam

tại Sapa, Bắc Hà (Lào Cai), Đồng Vân (Hà Giang), Hà Quảng và Thông Nông (CaoBằng)…Hiện nay sản lượng Tam thất tại nước ta khoảng 15 - 20 tấn/năm.6,10

1.1.4 Bộ phận dùng

Bộ phận dùng là rễ củ (Radix notoginseng), nụ hoa (Flos notoginseng) và lá (Folium notoginseng).6,7

1.1.5 Thành phần hóa học

Hơn 200 hoạt chất đã được phân lập từ Tam thất gồm saponin, flavonoid vàcyclopeptid.11 Trong đó, thành phần có hoạt tính chính của Tam thất là các saponinthuộc khung dammaran (chiếm khoảng 12,4% hàm lượng của rễ củ).12 Tỉ lệ saponin

toàn phần trong Tam thất cao hơn so với saponin toàn phần trong Nhân sâm (Panax

ginseng) và Sâm Mỹ (Panax quinquefolius) Các saponin gồm nhiều loại ginsenosid

và notoginsenosid khác nhau Nhiều loại ginsenosid trong Tam thất có mặt trong

cấu trúc protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT)

1.1.6 Phương pháp chế biến Tam thất

Mục đích của quá trình chế biến là loại bỏ hoặc giảm bớt tác dụng phụ và độc tínhhoặc thay đổi đặc tính của dược liệu hoặc tạo điều kiện thuận lợi cho việc bảo quản

và làm sạch dược liệu.14

Riêng đối với Tam thất, việc hấp hơi nước ở nhiệt độ cao sau đó sấy khô để đạt độ

ẩm thích hợp dẫn đến sự biến đổi các thành phần saponin Khi hấp ở nhiệt độ cao,nồng độ của các saponin phân cực như notoginsenosid R1, ginsenosid Rb1, Rg1,

Re, Rd giảm trong khi nồng độ các saponin kém phân cực như ginsenosid 20S-Rg3,

1.1.7 Tác dụng dược lý

Tác động chống khối u

Tam thất có tác dụng ức chế sự phát triển và di căn của các dòng tế bào ung thư

khác nhau in vitro và in vivo Đối với dạng chiết của Tam thất, qua quá trình chế

biến, thành phần của Tam thất thay đổi với sự tăng của các thành phần saponin kémphân cực như G-Rg3 (R&S), G-Rh1 (R&S), G-Rk3, G-Rh4, G-Rk1 và G-Rg5;những thành phần này được chứng minh có tác dụng kháng ung thư mạnh hơn cácsaponin nguyên thủy, đặc biệt G-Rg3 Dịch chiết Tam thất đã được chứng minh cóhoạt tính chống ung thư tiềm năng với ung thư đại trực tràng,16,17,18 ung thư gan,19,4

ung thư phổi,20 ung thư thể lympho bào,21,22 ung thư tuyến tụy,23 ung thư vú.24 Cơ

chế chính của tác dụng này có thể là ức chế sự tăng sinh tế bào và gây apoptosisthông qua giảm biểu hiện Bcl-2 và kích hoạt con đường caspase-3.25

1.1)

Bảng 1.1 Các nghiên cứu tác động kháng ung thư của Tam thất

Rk3 làm giảm khả năng sốngcủa tế bào, ức chế sự tăngsinh tế bào A549 và H460.RK3 ức chế sự tăng sinhcủa khối u, không ảnhhưởng đến trọng lượng cơthể chuột

Nian-Wu

He và cộng

sự16

Dịch chiếtTam thất

In vitro (LoVo) Dịch chiết Tam thất có hoạt

tính độc tế bào, chống tăngsinh tế bào LoVo

Li Li và

cộng sự27

NotoginsenosideR7

In vitro (HeLa) R7 ức chế sự tăng sinh tế

bào HelaQian Wu

và cộng

sự28

Ginsenoside Rh4 In vivo và in vitro (tế

bào và chuột ung thưđại trực tràng)

Rh4 có hoạt tính kháng ungthư đại trực tràng

Hoạt tính chống oxy hóa

Các nghiên cứu in vitro chứng minh dịch chiết từ Tam thất có tác dụng chống

oxy hóa do khả năng tạo phức chelat với các ion kim loại, hoạt động quét các gốc tự

do hydrogen peroxid, các gốc hydroxyl cao và yếu hơn superoxid anion và các gốc

tự do DPPH Tam thất hiệu quả trong phòng và điều trị các bệnh về mạch máu nhờtác dụng chống oxy hóa.5

Tác động chống viêm

Tác động chống viêm của dược liệu Tam thất được chứng minh qua một sốnghiên cứu Dịch chiết từ hoa Tam thất ức chế quá trình sản sinh nitric oxyd (NO),prostaglandin PGE2, TNF-α và IL-1β, làm giảm biểu hiện của mRNA và cácprotein iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β trong các tế bào RAW264.7 bị kích thích bởilipopolysaccharide (LPS).5

Tác động chống huyết khối

Trong dân gian, Tam thất được sử dụng để cầm máu, làm ngừng chảy máutrong và ngoài, giảm sưng và đau, làm tan huyết khối, thúc đẩy tuần hoàn Cácnghiên cứu cho thấy Tam thất có thể làm giảm cholesterol trong máu, giảm huyết

áp, có tác dụng trên các bệnh mạch vành, nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực Tam thất

ở liều 200 mg/kg có khả năng ức chế quá trình kết tập tiểu cầu trên chuột bị tắcđộng mạch não giữa Ngoài ra, Tam thất có thể làm tăng tính lưu động của màngtiểu cầu.5

1.1.8 Độc tính của Tam thất

Hiện nay có rất ít nghiên cứu báo cáo về độc tính của Tam thất Nghiên cứu củaYang và cộng sự (2017) cho thấy Tam thất không gây độc tính cấp, độc tính trêngen hay gây quái thai trên chuột.29

Tam thất được chế biến bằng cách hấp có hoạt tính dược lý thay đổi so với dạngTam thất chưa chế biến Dạng chưa chế biến của Tam thất thể hiện tác dụng cầmmáu, được dùng để điều trị xuất huyết nội hoặc ngoại, tiêu vết bầm, loại bỏ ứ máu,giảm sưng đau Trong khi đó, dạng chế biến bằng cách hấp thể hiện tác dụng chốngoxy hóa, tăng sản xuất tế bào máu trong điều trị thiếu máu.30 Vì vậy, cần nắm rõ tác

dụng của Tam thất dạng chưa chế biến và dạng chế biến để tránh những tác dụngbất lợi Ngoài ra, cần lưu ý là Tam thất bị chống chỉ định cho phụ nữ mang thai.5,11

1.2 Tổng quan về ung thư

1.2.1 Định nghĩa

Ung thư (còn được gọi là khối u ác tính) là một nhóm các bệnh có thể bắt đầu ởbất kỳ cơ quan hoặc mô nào trong cơ thể, liên quan đến sự tăng sinh bất thườngkhông kiểm soát của tế bào dẫn đến sự xâm lấn các bộ phận liền kề của cơ thểvà/hoặc lây sang các cơ quan khác thông qua hệ bạch huyết và máu Quá trình nàygọi là di căn và là nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư.1,31

Tại Việt Nam, ước tính có 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong do ung thư(Bảng 1.2).32 Tỷ lệ mắc mới các loại ung thư được trình bày trong Hình 1.2 Cứ

100.000 người thì có 159 người chẩn đoán mắc mới ung thư và 106 người tử vong doung thư Năm 2020, Việt Nam xếp thứ 91/185 về tỷ suất mắc mới và thứ 50/185 về tỷsuất tử vong trên 100.000 người tương ứng với năm 2018 (99/185 và 56/185).33

Hình 1.2 Số lượng ca ung thư mắc mới trong năm 2020

Số

Nguy

cơ tíchluỹ

Số

Nguy

cơ tíchlũy

Sốlượng

Tỉ lệ(trên100000)

Thực quản 3281 1,8 0,33 3080 2,5 0,31 3472 3,57Não, hệ thần

1.2.3 Các nguyên nhân gây ung thư

Ung thư gây ra bởi sự thay đổi các gen trong tế bào gây rối loạn quá trình pháttriển và phân chia tế bào.32

Một số nghiên cứu báo cáo các yếu tố có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư gồm:

Yếu tố nội sinh:

- Yếu tố di truyền: Rối loạn di truyền bẩm sinh hoặc mắc phải trong quá trìnhsống

- Yếu tố nội tiết: Estrogen được xem là chất gây ung thư Các liệu pháp hormonthay thế dạng phối hợp làm tăng khả năng mắc ung thư vú; các liệu pháp thay thếhormon với estrogen đơn lẻ làm tăng nguy cơ ung thư nội mạc tử cung

- Tuổi: Tỉ lệ mắc các loại ung thư càng tăng khi tuổi càng cao Tỉ lệ mắc ungthư khoảng dưới 25/100000 ở nhóm dưới 20 tuổi, khoảng 350/100000 ở nhóm 45 –

49 tuổi và hơn 1000/100000 ở nhóm trên 60 tuổi

- Tình trạng suy giảm miễn dịch: Những bệnh nhân ghép cơ quan đang dùngthuốc ức chế miễn dịch hoặc những bệnh nhân nhiễm HIV có hệ miễn dịch suygiảm tăng nguy cơ mắc ung thư

- Béo phì: Người béo phì có thể tăng nguy cơ mắc một số loại ung thư như ungthư vú (đối với phụ nữ đã qua thời kỳ mãn kinh), đại tràng, trực tràng, nội mạc tửcung, thực quản, thận, tụy và túi mật

- Tình trạng viêm kéo dài có thể gây tổn thương ADN và dẫn đến ung thư

Yếu tố ngoại sinh:

- Tác nhân hóa học: Rượu bia, khói thuốc lá, dẫn xuất từ anilin và thuốc nhuộmmàu (benzidin, 4-aminodiphenyl, ), hydrocarbon thơm đa vòng (7,12-dimethylbenz[a]anthracen, 3-4 benzopyren,…), thạch tín (một chất gây ô nhiễm nước uống),aflatoxin (chất gây ô nhiễm thực phẩm), acrylamid, chất tạo ngọt nhân tạo

- Tác nhân sinh học: Một số virus, vi khuẩn, ký sinh trùng có thể gây ra ungthư như Epstein-Barr Virus (EBV), Hepatitis B Virus (HBV), Hepatitis C Virus(HCV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), Human Papillomavirus (HPVs),Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus Type 1 (HTLV-1), Kaposi Sarcoma-

Associated Herpesvirus (KSHV), Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV),

Helicobacter pylori (H pylori), Opisthorchis viverrini, Schistosoma hematobium.

- Tác nhân vật lý: Một số tia bức xạ ion hóa có năng lượng cao như radon, tia

X, tia gamma… có thể phá hủy ADN và gây ra ung thư, tia cực tím từ ánh nắng mặttrời có thể làm tăng lão hóa và tổn thương da, dẫn đến ung thư da.34,35

1.2.4 Các phương pháp điều trị ung thư

Mục đích điều trị ung thư:

- Triệt căn: Thường áp dụng đối với bệnh giai đoạn sớm, tổn thương còn khutrú, điều trị nhằm giải quyết tận gốc bệnh với hy vọng chữa khỏi bệnh, kéo dài thờigian sống và không để lại di chứng.36

- Tạm thời: Đối với những bệnh giai đoạn muộn, việc điều trị nhằm kéo dài tuổithọ và nâng cao chất lượng sống cho bệnh nhân.36

Do mỗi loại ung thư có nguyên nhân, sự phát triển và tiên lượng khác nhau nên

có những phương pháp điều trị khác nhau Đặc biệt do đặc tính của tổ chức và tếbào ung thư là phát triển mạnh tại chỗ, xâm lấn ra các vùng xung quanh, di căn vào

hệ thống bạch huyết và các cơ quan nên thường phải phối hợp nhiều phương phápđiều trị để đạt hiệu quả.36

Các phương pháp điều trị ung thư gồm điều trị tại chỗ - tại vùng như phẫuthuật, xạ trị và điều trị toàn thân như hóa trị (chemotherapy), điều trị nội tiết(hormonotherapy), điều trị miễn dịch (immunotherapy)36 và phương pháp điều trịmới như liệu pháp hướng đích phân tử, 37 liệu pháp sử dụng y học cổ truyền.38

Dựa trên đặc điểm của khối u và quyết định lựa chọn điều trị của bệnh nhân,các bác sĩ thường phải kết hợp các phương pháp trên để xây dựng kế hoạch điều trị

cá thể hoá cho từng bệnh nhân

1.2.4.1 Phẫu thuật

Phẫu thuật là phương pháp điều trị ung thư lâu đời nhất Một số loại ung thưkhu trú, có thể chỉ cần phẫu thuật triệt căn để điều trị bệnh Kết quả điều trị bằngphẫu thuật phụ thuộc vào kích thước khối u, loại ung thư và vị trí khối u nguyênphát Khi đã có di căn, không còn chỉ định phẫu thuật triệt căn khối u nguyên phát.36

1.2.4.2 Xạ trị

Xạ trị là phương pháp dùng tia bức xạ ion hóa có năng lượng cao như các sóngđiện từ (tia X, tia gamma) hoặc các hạt nguyên tử (electron, nơtron) để tiêu diệt các

tế bào ung thư Một số loại ung thư có thể điều trị khỏi bằng xạ trị, đặc biệt khi khối

u còn khu trú và nằm hoàn toàn trong trường chiếu Xạ trị kết hợp phẫu thuật giúpgiới hạn phạm vi phẫu thuật, tăng khả năng điều trị hơn so với phẫu thuật đơnthuần Kết quả xạ trị phụ thuộc vào đặc điểm của khối u, đặc điểm của tia xạ vànhiều yếu tố khác.36

1.2.4.3 Hóa trị

Hóa trị là phương pháp sử dụng thuốc để điều trị ung thư.36

Hoá trị thường phối hợp nhiều hóa chất có cơ chế tác động và độc tính khácnhau để tăng khả năng diệt tế bào u, giảm độc tính liên quan tới liều và giảm khảnăng kháng thuốc Phác đồ đa hóa trị liệu thường phối hợp các hóa chất nhất định,điều trị lặp lại theo chu kỳ Khoảng cách giữa các chu kỳ là khoảng thời gian ngắnnhất cho phép các mô lành hồi phục

Muốn tăng hiệu quả điều trị cần đảm bảo thuốc đến được và nồng độ thuốc tạikhối u càng cao càng tốt Một số khối u lớn có những vùng kém máu nuôi dưỡng

Vì vậy, ngoài đường uống và đường tĩnh mạch, thuốc nồng độ cao có thể được đưavào một vùng cơ thể có khối u qua động mạch (ung thư gan, ung thư đầu cổ) hoặcvào các khoang (phúc mạc, phế mạc, bàng quang), nhờ đó làm tăng nồng độ thuốctại chỗ và giảm được tác dụng phụ toàn thân.36

Với một số loại ung thư có nguy cơ tái phát cao sau phẫu thuật tối ưu hoặc xạtrị, có thể phòng ngừa tái phát bằng cách bổ sung hóa trị bổ trợ

1.2.4.4 Điều trị nội tiết

Các yếu tố nội tiết thường được dùng như androgen, estrogen, progestogen,corticosteroid, tamoxifen, thyroxin, lentaron… hoặc có thể dùng tia xạ hoặc phẫuthuật nhằm điều trị nội tiết như cắt bỏ buồng trứng hoặc tinh hoàn Phương phápđiều trị ung thư bằng nội tiết đặc biệt hữu ích trong ung thư tuyến tiền liệt, các loại

ung thư khác có thụ thể hormon trên tế bào (ung thư vú, ung thư nội mạc tử cung)thường có thể điều trị giảm nhẹ bằng liệu pháp điều trị đối kháng hormon.36

1.2.4.5 Liệu pháp miễn dịch

Liệu pháp miễn dịch là liệu pháp hỗ trợ, dùng khả năng miễn dịch của cơ thể đểchống ung thư gồm miễn dịch thụ động không đặc hiệu và miễn dịch chủ độngkhông đặc hiệu.36 Một số hợp chất đóng vai trò quan trọng trong điều trị ung thư như:

- Các interferon (INF): Có 3 loại interferon chủ yếu là INF α, β và γ, trong đóINFα có hoạt tính trong bệnh bạch cầu mạn tính thể tủy, bệnh đa u tủy, bạch cầu tếbào tóc và một số u lympho ác tính không Hodgkin…

- Các interleukin (IL): IL2 hiệu quả trong một số ung thư hắc tố và ung thư biểu

1.2.4.6 Liệu pháp hướng đích phân tử

Liệu pháp hướng đích phân tử là dùng các chất ngăn cản các phân tử đặc hiệuliên quan đến quá trình sinh ung thư và phát triển của khối u, từ đó có khả năngngăn chặn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư Phương pháp này thường ítgây độc hơn những phương pháp khác và có thể áp dụng riêng lẻ hoặc phối hợp vớicác thuốc hóa trị khác.37

1.2.4.7 Liệu pháp y học cổ truyền

Trong những thập niên gần đây, một số thuốc y học cổ truyền và dẫn chất củachúng đã được đưa vào trong điều trị ung thư như là phương pháp điều trị thay thếhoặc bổ sung vì tính an toàn, hiệu quả, ít tác dụng bất lợi.38 Nhiều nghiên cứu chothấy việc phối hợp thuốc có nguồn gốc thảo dược với các phương pháp điều trị ung

thư thông thường giúp điều hòa miễn dịch, nâng cao chất lượng sống của bệnhnhân.39 Thuốc y học cổ truyền đã được chứng minh là ít độc tính, giúp nâng caochất lượng cuộc sống, kéo dài thời gian sống và giúp cải thiện điểm số Karnofskytrong điều trị phổi không tế bào nhỏ.40

Một số hợp chất được chiết xuất từ dược liệu như curcumin, resveratrol, berberin,dioscin, baicalein, wogonin, silibinin, quercetin, tanshinon IIA và celastrol đã đượcchứng minh trong các thử nghiệm lâm sàng có tác động kháng ung thư (ức chế sựphát triển, tăng sinh, hình thành mạch và di căn của nhiều bệnh ung thư trên người).38

1.2.5 Paclitaxel

Paclitaxel là hợp chất tự nhiên có tác dụng chống ung thư, được phân lập từ vỏ

thân cây Thông đỏ (Taxus brevifolia) vào năm 1967.41

Hình 1.3 Công thức hóa học của paclitaxel42

1.2.5.1 Cơ chế tác động

Paclitaxel làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các ống vithể và làm ổn định các ống vi thể sẵn có do ức chế quá trình giải trùng hợp Do đó,paclitaxel ức chế sự tái cấu trúc bình thường của mạng ống vi thể Sự tái cấu trúcnày rất quan trọng ở gian kỳ của quá trình phân bào và với hoạt động của ty lạpthể.43 Ngoài ra, paclitaxel liên kết với đầu N-31 acid amin của tiểu đơn vị β-tubulintrong vi ống,44 kích thích phosphoryl hóa của β-tubulin trong tế bào Nl15 biệt hóa

và không biệt hóa, kết quả làm chết tế bào.45 Paclitaxel có thể ức chế sự tăng sinh tếbào và điều hòa đáp ứng miễn dịch.43

1.2.5.1 Dược động học

Paclitaxel được dùng bằng đường tiêm tĩnh mạch Thuốc phân bố rộng vào các

mô và các dịch cơ thể, tỷ lệ gắn với protein huyết tương là 89 - 98% Thuốc khuếchtán nhiều ra ngoài mạch và/hoặc gắn nhiều với các thành phần của mô Paclitaxelđược chuyển hóa tại gan qua CYP2C8 và CYP3A4 thành các chất chuyển hóa, chủyếu là 6α-hydroxypaclitaxel Sau khi tiêm tĩnh mạch, khoảng 2 - 13% lượng thuốcđược đào thải qua nước tiểu dưới dạng ban đầu, 70% lượng thuốc đào thải qua phân,trong đó 5% dưới dạng chưa chuyển hóa Độ thanh thải là 5,8 - 16,3 lít/giờ/m2 (khithời gian truyền là 1 - 6 giờ) và 14,2 - 17,2 lít/giờ/m2 (khi thời gian truyền là 24 giờ).43

1.2.5.3 Chỉ định

Paclitaxel được sử dụng phối hợp với doxorubicin trong điều trị bổ trợ là phác đồđược lựa chọn hàng đầu trong điều trị ung thư vú di căn Ngoài ra, paclitaxel được chỉđịnh điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư Kaposi liên quan đến AIDS.43

1.2.5.4 Paclitaxel trong một số mô hình nghiên cứu in vivo

Paclitaxel được dùng làm chất đối chiếu để đánh giá hiệu quả của các tác nhânđộc tế bào khác trong một số mô hình nghiên cứu trên động vật như: ung thư tuyếntiền liệt,46 ung thư phổi,47 mô hình ung thư đầu cổ, buồng trứng, tuyến tiền liệt vàung thư vú ở người,48 ung thư buồng trứng.49

1.3 Mô hình tiền lâm sàng khảo sát tác động kháng ung thư

1.3.1 Mô hình in vitro

Mô hình in vitro thực hiện trên các tế bào được tách ra khỏi cơ thể và nuôi cấy

trong môi trường có điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ giống môi trường cơ thể động

vật hoặc người Mô hình in vitro có ưu và nhược điểm như sau:

- Ưu điểm: Nghiên cứu được cơ chế tác dụng và chuyển hóa các chất trong tếbào, ít tốn kém, kết quả lặp lại, độ chính xác cao, các điều kiện thử nghiệm đượckiểm soát, lượng chất được sử dụng ít, có thể dùng để sàng lọc với số lượng mẫulớn, thích hợp để nghiên cứu dược chất quý, đắt tiền Đặc biệt, mô hình này giúpgiải quyết vấn đề y đức trong nghiên cứu.50,51

- Nhược điểm: Không có sự tương tác giữa các tế bào, một số hình thái và chứcnăng của tế bào bị mất hoặc biểu hiện kém hơn so với tế bào trong cơ thể.51

Hiện nay, mô hình in vitro trên các dòng tế bào ung thư người được sử dụng

phổ biến trong nghiên cứu dược lý học ung thư để dự đoán đáp ứng lâm sàng, xâydựng giả thuyết sinh dược học cho các thử nghiệm sau và giúp xác định cơ chế mớiliên quan đến đáp ứng thuốc Mô hình này thích hợp cho sàng lọc ban đầu cácnguyên liệu làm thuốc có hoạt tính kháng khối u.52

Hiện nay, việc nghiên cứu các chất có hoạt tính kháng ung thư bằng mô hình

in vitro dựa trên khảo sát hoạt tính độc tế bào Hoạt tính độc tế bào là do các chất

thử nghiệm tác động lên cấu trúc và/hoặc chức năng của tế bào dẫn đến suy giảmchức năng của các cơ quan cụ thể và/hoặc gây tử vong

Một số phương pháp nghiên cứu hoạt tính độc tế bào in vitro53:

- Thử nghiệm đo tỉ lệ sống tế bào dùng protease làm chỉ dấu

- Thử nghiệm đo tỉ lệ sống tế bào dùng ATP làm chỉ dấu

- Phương pháp nhuộm đỏ trung tính54

- Phương pháp đếm tế bào bằng tryptan blue55

- Thử nghiệm đo tỉ lệ sống tế bào MTT

Các nghiên cứu hoạt tính độc tế bào ung thư phổi in vitro thường sử dụng dòng

tế bào A549 - dòng tế bào ung thư biểu mô được phân lập từ khối u ung thư phổicủa bệnh nhân người da trắng 58 tuổi Dòng tế bào này được ứng dụng trong nghiêncứu khả năng tăng sinh tế bào ung thư và các cơ chế liên quan; nghiên cứu tác dụngcủa insulin và yếu tố tăng trưởng giống insulin (Insulin-like Growth Factor -1, IGF-1) lên sự tăng sinh và quá trình chết tế bào.57 Dòng tế bào A549 được sử dụng phổbiến trong các nghiên cứu về tác dụng kháng ung thư của một số chất như betulin58,bischalcon59, acid garlic60, silymarin61, limonin62,…

1.3.2 Mô hình ex vivo

Mô hình ex vivo sử dụng tế bào, lát cắt cơ quan hoặc cơ quan được phân lập và

nuôi cấy trong vòng 24 giờ Mô hình này thường được dùng trong thử nghiệm sàng

lọc trước khi tiến hành trên mô hình in vivo.

Mô hình ex vivo có ưu điểm và nhược điểm63:

- Ưu điểm: Môi trường thử nghiệm gần với điều kiện trong cơ thể và giữ đượccấu trúc giải phẫu

- Nhược điểm: Tiến hành trong vòng 24 giờ sau khi phân lập nên không thểnghiên cứu tác động/độc tính lâu dài của mẫu thử Trong quá trình phân lập, nhiềuloại tế bào dễ bị lẫn vào nhau dẫn đến khó chuẩn hóa quy trình, khó thực hiện vớilượng mẫu lớn do số lượng tế bào thu được ít Mô hình cần sử dụng động vật phânlập cơ quan, lát cắt, tế bào nên gặp vấn đề liên quan đến đạo đức trong nghiên cứu

1.3.3 Mô hình in vivo

Nghiên cứu in vivo thực hiện trực tiếp trên cơ thể động vật sống, thích hợp khảo

sát dược động học, quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể và độc tính mạn

Mô hình in vivo có ưu, nhược điểm sau:

- Ưu điểm: Khác với in vitro, mô hình in vivo là công cụ giúp khảo sát được đặc

điểm dược động học (PK) và dược lực học (PD), là các dữ liệu quan trọng cho sựphát triển thành công trên lâm sàng của nhiều loại thuốc hóa trị liệu.51,64

- Nhược điểm: Sự khác biệt giữa người và động vật dẫn đến sự đáp ứng khác

nhau đối với một thuốc của người và thú thử nghiệm Các mô hình in vivo cần thời

gian nghiên cứu dài, chi phí cao, tốn nhiều công sức chăm sóc, cần số lượng mẫulớn, sử dụng số lượng động vật thử nghiệm nhiều.51

Mô hình nghiên cứu trên chuột đã tạo ra một cuộc cách mạng trong nghiên cứuthuốc điều trị ung thư Những tiến bộ gần đây trong phát triển các dòng chuột lai,chuột chuyển gen và chuột suy giảm miễn dịch đã tạo ra các mô hình chuột có liênquan về mặt lâm sàng phản ánh tổng quan tiến triển của bệnh ở người và khả năngđáp ứng với liệu pháp Tùy đối tượng là chuột miễn dịch bình thường hay chuột suygiảm miễn dịch, một số mô hình nghiên cứu khác nhau có thể ứng dụng thực tế

Đối với chuột miễn dịch bình thường, có 3 mô hình:

- Mô hình cảm ứng bằng hóa chất

- Mô hình chuột biến đổi gen (genetically engineered mouse - GEM)

- Mô hình chuột biến đổi gen đặc biệt

Đối với chuột suy giảm miễn dịch, chúng ta có 2 mô hình:

- Mô hình ghép đồng loài

- Mô hình ghép dị loài 65

1.3.3.1 Mô hình ghép đồng loại hoặc dị loài

Mô hình ghép đồng loài hoặc dị loài: Cấy ghép tế bào ung thư hoặc mảnh từkhối ung thư nguyên phát của người/chuột trên chuột suy giảm miễn dịch [chuột suygiảm miễn dịch nghiêm trọng (Severe combined immunodeficiency- SCID), chuộtnude, chuột thiếu RAG1, RAG2, chuột NOD (Nonobese diabetic) kết hợp SCID, ]

để không xảy ra phản ứng thải trừ Hai phương pháp cấy ghép thường sử dụng gồm:

- Tiêm tế bào ung thư hoặc ghép các mảnh từ khối u dưới da trực tiếp vào cơquan nơi phát sinh khối u (kỹ thuật cấy ghép theo chiều thẳng)

- Tiêm tế bào ung thư hoặc ghép các mảnh từ khối u dưới da chuột

Ưu điểm

- Có thể thu kết quả liên quan đáp ứng điều trị trong vài tuần từ sinh thiết khối u

- Phản ánh được sự phức tạp và các thuộc tính của khối u con người

- Theo dõi được các đặc điểm tế bào và phân tử của khối u nguyên phát

- Có thể sử dụng để hỗ trợ phát triển các phương pháp điều trị phân tử

- Dễ đo lường sự tăng trưởng khối u với mô hình dùng kỹ thuật tiêm dưới da

- Điều chỉnh được ảnh hưởng của khối u trong vi môi trường nhờ sử dụng kỹ thuậtcấy ghép theo chiều thẳng giúp tái tạo môi trường cơ quan mà khối u phát triển

- Giúp nghiên cứu sự xâm lấn, di căn trong mô hình ghép dị loài theo chiều thẳng

- Có thể được tạo ra gần như hoàn toàn chất nền từ vi môi trường u người

Nhược điểm

- Vi môi trường khối u ở chuột không tương đồng với vi môi trường khối u ởngười do chuột đã bị giảm hoặc không có hệ miễn dịch

- Những khối u từ chuột không đại diện hoàn toàn cho khối u người.

- Hầu hết dòng tế bào sử dụng trong ghép dị loài đã trải qua nhiều lần chuyểnđổi trong ống nghiệm nên có nhiều khác biệt với khối u ban đầu

- Tính đồng nhất của các tế bào trong khối u không phản ánh được tính khôngđồng nhất của khối u trong cơ thể người

- Mô hình tiêm dưới da: Thể hiện được sự tương tác phức tạp giữa tế bào khối uvới vi môi trường

- Mô hình cấy theo chiều thẳng: Khi muốn kiểm tra khối u cần phẫu thuật hoặc

áp dụng những phương pháp hình ảnh phức tạp và đắt tiền; tốn nhiều thời gian, chiphí cao, nhiều khó khăn về kỹ thuật.65

1.3.3.2 Mô hình chuột biến đổi gen (genetically engineered mouse - GEM)

Bộ gen của chuột được thay đổi ở một hay một vài gen liên quan đến khối u áctính bằng quy trình tái tổ hợp tương đồng trong tế bào gốc phôi chuột

Mô hình áp dụng để theo dõi đáp ứng điều trị khối u trong cơ thể và nghiên cứuảnh hưởng của việc thay đổi gen theo thời gian Các mô hình này dựa trên sự biểuhiện quá mức của gen sinh ung thư như c-myc66, v-Ha-ras hoặc SV40 T-antigen67

trong các loại khối u khác nhau như u tủy, u lympho, ung thư biểu mô và sarcoma

1.3.3.3 Mô hình cảm ứng bằng hóa chất

Đây là một trong những mô hình tiền lâm sàng lâu đời và đa dạng nhất được sửdụng nghiên cứu về ung thư vì mô phỏng hiệu quả sinh bệnh học tiến triển nhiềugiai đoạn theo thời gian của khối u liên quan đến chất gây ung thư và các tác nhânthúc đẩy khối u.68 Mô hình này tiến hành trên chuột có hệ miễn dịch bình thường.Chuột được tiêm phúc mô hoặc cho uống một hoặc một số tác nhân gây ung thư, cóthể kết hợp với este phorbol - chất kích thích khối u Những tác nhân thường được

sử dụng là hydrocarbon thơm đa vòng gây đột biến trong tế bào vật chủ và/hoặckích thích viêm mạn tính dẫn đến hình thành khối u như N-methyl-N-nitro-N-nitroso-guanidin (MNNG)69; N-nitroso-N-methylurea (NMU)70; 7,12-dimethyl-benz(a)-anthracen (DMBA)71; azoxymethan (AOM)72; nitrosamin (diethylnitrosamin) (DEN)73;benzo(a)-pyren (BaP)74, N-nitrosobis (2-oxopropyl) amin (BOP)75, 4-methyl-nitro-

samino-3-pyridyl-1-butanon (NNK)71 Những tác nhân khác nhau dẫn đến mức độnhạy cảm khác nhau, tỷ lệ mắc khối u và ung thư hóa khác nhau tùy theo quy trình,

độ tuổi và chủng chuột sử dụng, liều lượng và tiến độ của chất gây ung thư và chấtkích thích Những chất gây ung thư được sử dụng trên chuột có hệ miễn dịch bìnhthường gồm DEN gây ung thư biểu mô tế bào gan, NMU gây ung thư vú, NMU-MNNG gây ung thư dạ dày, AOM gây ung thư đại trực tràng, BOP gây ung thưtuyến vú, tuyến tụy, NNK gây ung thư phổi, DMBA và BaP gây ung thư tế bào vảy.Nghiên cứu này chọn mô hình cảm ứng bằng 7,12-dimethyl benz[a]anthracen(DMBA) vì phương pháp này dễ thực hiện, thao tác đơn giản, được áp dụng nhiềutrong mô hình nghiên cứu về tác động kháng khối u tại Việt Nam và trên thế giới.7,12-dimethyl benz[a]anthracen (DMBA) là hydrocarbon đa vòng thơm gây ungthư; ức chế miễn dịch ở nhiều loài khác nhau và được ứng dụng rộng rãi để gâykhối u vú, da và các cơ quan khác.76 Cơ chế gây ung thư của DMBA:

- Trực tiếp: DMBA gây điều khiển ngược của thụ thể aryl hydrocarbon (arylhydrocarbon receptor - AhR), làm biến đổi tiền gen sinh ung thư (proto-oncogen)thành gen sinh ung thư (oncogen), dẫn đến hình thành tế bào ung thư nguyên phát

- Gián tiếp: DMBA thúc đẩy ung thư bằng việc phá hủy sự giám sát miễn dịchchống lại các tế bào khối u

Hình 1.4 Công thức phân tử của 7,12-dimethyl benz[a]anthracen (DMBA)

- Ngoài ra, các chất chuyển hóa của DMBA cũng là tác nhân gây đột biến.76

DMBA chuyển hóa chủ yếu qua 2 enzym cytocrom P450 (CYP) là CYP1B1 vàepoxid hydrolase trong microsom tạo DMBA-3,4-dihydrodiol-1,2-epoxid (DMBA-DE) Chất này có hoạt tính liên kết với ADN gây đột biến và khởi đầu ung thư

Trong đó, enzym chịu trách nhiệm chuyển hóa DMBA ở người, động vật gặm nhắm

là CYP1B, có biểu hiện liên quan đến nhiều loại ung thư (vú, phổi, buồng trứng)

Mô hình cảm ứng bằng DMBA trên chuột trong nghiên cứu được tiến hành theo

albino được cho uống DMBA liều 50 mg/kg/tuần trong 5 tuần liên tục Kết quả thu

được là khối u xuất hiện từ tuần thứ 10 và sau tuần 20, 100% chuột có khối u trên

da, trên phổi, dạ dày và ruột

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Cao chiết Tam thất

Nguyên liệu: Tổng 31 mẫu dược liệu Tam thất thu mua từ các nguồn khác nhau:

Tam thất có nguồn gốc từ Việt Nam được thu mua từ Hà Giang và Lai Châu và Tamthất có nguồn gốc từ Trung Quốc được cung cấp bởi Viện Shandong Analysis andTest Center (29 mẫu rễ củ khô và 2 mẫu tươi) Các mẫu tươi được sấy ở nhiệt độ

60 oC cho tới khô Tất cả các mẫu khô sau đó đươc xay thành bột mịn và qua rây 355.Mẫu cao chiết từ Tam thất chế: Cân chính xác 250 mg bột dược liệu, cho vàoống thép không rỉ, thêm tiếp 2 ml nước cất, đậy kín và hấp ở các điều kiện 100 °Ctrong 2, 4, 6, 8, 10 và 120 °C trong 2, 4, 6, 8, 10 giờ (mỗi điều kiện tiến hành trên 3mẫu thử) Dược liệu sau khi hấp được chuyển vào bình định mức 25 ml, bổ sungvừa đủ thể tích bằng MeOH 87% (250 mg dược liệu tương ứng 25 ml MeOH 80%),chiết siêu âm ở 40 °C trong 1 giờ Dịch chiết được sử dụng để đánh giá hoạt tínhđộc tế bào

Mẫu Tam thất từ Tam thất chưa chế biến: bột dược liệu Tam thất chế từ 3 lôđược chiết với MeOH 80% thu được cao chiết toàn phần

Tam Thất chưa chế biến và Tam Thất được chế biến ở các điều kiện khác nhau

(nhiệt độ, thời gian chế biến) được ký hiệu trong Bảng 2.3 Mỗi điều kiện chế biến

được thực hiện lặp lại trên 3 mẫu dược liệu để thu được 3 mẫu cao chiết khác nhau

Bảng 2.3 Ký hiệu các mẫu cao chiết từ Tam Thất

Mẫu cao chiết Tam thất được sử dụng trong nghiên cứu in vivo:

Cao đặc và cao lỏng Tam thất thành phẩm (gọi tắt là cao lỏng Tam thất) đạt

tiêu chuẩn cơ sở (Phụ lục 1) do Bộ môn Dược liệu - Đại học Y Dược TP Hồ Chí

Minh cung cấp

Cao đặc Tam thất được điều chế từ Tam thất chế biến bằng cách hấp ở nhiệt độ

120 oC trong 4 giờ Sau đó, tiến hành sấy và chiết với methanol 80% (chiết 2 lần

bằng phương pháp hồi lưu với methanol 80% với tỉ lệ dược liệu: dung môi là 1:10)

Từ đó, cao đặc Tam thất được pha với cao Táo đỏ và nước cất thành 15 ml caolỏng Tam thất chứa lượng cao tương ứng với 2 g dược liệu

2.1.2 Động vật thử nghiệm

Chuột nhắt đực và cái, chủng Swiss albino, 6 - 8 tuần tuổi, khỏe mạnh, không

có biểu hiện bất thường, trọng lượng 23 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện vaccin vàsinh phẩm y tế Nha Trang Chuột được nuôi ổn định trong môi trường trước tiếnhành thí nghiệm 5 ngày Lồng chuột có kích thước 25 x 35 x 15 cm và được cungcấp nước uống, thức ăn đầy đủ trong suốt quá trình thử nghiệm

2.1.3 Dòng tế bào

Dòng tế bào ung thư biểu mô phổi người A549 có nguồn gốc từ Công ty ATCC(American type culture collection, Mỹ) được lưu trữ, hoạt hóa và nuôi cấy tại khoaDược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

2.1.4 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong quá trình nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.4.

Bảng 2.4 Danh mục hóa chất sử dụng

1

2.1.5 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng trong quá trình nghiên cứu được trình bày trong Bảng 2.5.

Bảng 2.5 Danh mục các thiết bị sử dụng

STT Thiết bị Nhà sản xuất Nguồn gốc

2.1.6 Dụng cụ

Các dụng cụ được sử dụng trong quá trình nghiên cứu: micropipet, pipet 5, 10,

25 ml; falcon 15, 50 ml; bình nuôi cấy 25 cm2, 75 cm2; eppendorf 1,5 ml, 2 ml; đĩanuôi cấy 96 giếng; đầu tip, màng lọc 0,22 µm; buồng đếm tế bào; găng tay; kim chochuột uống; kim tiêm; thước jẹp califer

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát hoạt tính độc tế bào in vitro của cao chiết Tam thất

Vô trùng môi trường, dụng cụ và hóa chất

Tủ an toàn sinh học được chiếu UV trong 30 phút, chờ quạt thổi trong 3 phúttrước khi tiến hành thao tác Các dụng cụ được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 oCtrong 30 phút, xịt cồn trước khi đưa vào sử dụng Các hóa chất, mẫu thử sau khichuẩn bị được lọc vô trùng qua màng lọc 0,22 µm

Chuẩn bị mẫu thử

- Mẫu thử từ Tam Thất: pha mẫu thử trong dung dịch DMSO 0,2% trong môitrường nuôi cấy để tạo thành dung dịch mẹ có nồng độ tương đương 30 mg bộtdược liệu/ml

- Doxorubicin: dung dịch mẹ 2 mg/ml

Các dung dịch mẹ được bảo quản ở - 20 oC, được pha loãng trong môi trường nuôicấy để đạt nồng độ khảo sát, lọc vô trùng qua màng lọc 0,22 µm trước khi sử dụng

Nuôi cấy và xử lý tế bào

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12, bổ sung 10% FBS,

2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µM streptomycin Tế bào được nuôitrong bình nuôi cấy 75 cm2, ủ ở 37 oC, 5% CO2 cho đến khi đạt độ phủ 70 - 80%.Thu và đếm tế bào sống với trypan blue, chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ1x104 tế bào/giếng Ủ tế bào trong 18 - 24 giờ ở ở 37 oC, 5% CO2 để tế bào pháttriển ổn định và bám lên bề mặt đĩa nuôi cấy

Xử lý tế bào với các mẫu thử từ Tam thất được pha trong môi trường nuôi cấy ởcác nồng độ khác nhau từ 0,25 - 3 mg/ml (tính theo khối lượng bột dược liệu), nồng

độ cuối cùng của DMSO trong môi trường nuôi cấy là 0,2% Mẫu đối chứng dươngDoxorubicin được pha loãng và xử lý với tế bào ở các nồng độ: 0,1 - 5 µM Mẫu đốichứng âm (xử lý với môi trường nuôi cấy chứa 0,2% DMSO) được tiến hành đồngthời Sau khi xử lý với các mẫu thử hoặc mẫu đối chứng, tế bào được ủ ở

37 oC, 5% CO2 trong 72 giờ và đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng thử nghiệm MTT

Đánh giá tỷ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT

Nguyên tắc

Tỷ lệ sống của tế bào được xác định nhờ vào hoạt tính của enzym succinatdehydrogenase (SDH) của ty thể chỉ có trong tế bào sống SDH chuyển MTT[3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] thành tinh thểformazan Tinh thể này tan trong dung môi hữu cơ như isopropanol tạo thành dungdịch màu tím được đo mật độ quang OD (optical density) có bước sóng 570 nm, tỷ

lệ tế bào sống được tính dựa trên độ hấp thu của mẫu.78,79

Tính kết quả

% ức chế so với mẫu chứng = 100% – (OD mẫu thử/OD mẫu chứng) x 100%

Thực hiện

Tế bào sau khi được xử lý với mẫu thử hoặc mẫu đối chứng trong 72 giờ, loại

bỏ môi trường nuôi cấy Rửa tế bào bằng dung dịch PBS, bổ sung dung dịch MTT0,5 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh, ủ ở ở 37 oC, 5%

thành trong dung dịch isopropanol acid hóa Đo độ hấp thu ở bước sóng 570 nmbằng máy đọc microplate.

2.2.2 Khảo sát độc tính cấp đường uống của cao chiết Tam thất

Những con chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc không chết sẽ được theodõi trong vòng 14 ngày Ba trường hợp có thể xảy ra:

- Trường hợp 1: Số lượng chuột thử nghiệm được bảo toàn sau khi uống mẫuthử Xác định liều cao nhất không làm chuột chết (Dmax) của mẫu thử và liều tươngđối an toàn để thử tác dụng dược lý Ds ≤ 1/5 Dmax

- Trường hợp 2: Tỷ lệ chuột tử vong là 100% sau khi uống mẫu thử Tiến hànhthử với liều giảm ½ so với liều đầu Tiếp tục giảm liều đến khi tìm được liều tốithiểu gây chết 100% chuột (LD100), liều tối đa không gây chết chuột (LD0) và liềugây chết 50% chuột (LD50)

- Trường hợp 3: Tỷ lệ tử vong thấp hơn 100% sau khi uống mẫu thử, không xácđịnh được liều LD100 và LD50 Tuy nhiên trong trường hợp này, có thể xác định liều