Định lượng đồng thời glutathion và acid alpha lipoic trong thực phẩm chức năng dạng viên nén và viên nang bằng phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò dãy diod quang và đầu dò khối phổ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TÔ TRẦN BẢO NGỌC ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GLUTATHION VÀ ACID ALPHA-LIPOIC TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DẠNG VIÊN NÉN VÀ VIÊN N

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TÔ TRẦN BẢO NGỌC

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GLUTATHION VÀ ACID ALPHA-LIPOIC TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DẠNG VIÊN NÉN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG

VÀ ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TÔ TRẦN BẢO NGỌC

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GLUTATHION VÀ ACID ALPHA-LIPOIC TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DẠNG VIÊN NÉN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG

VÀ ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN:

TS NGUYỄN THỊ NGỌC DUNG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan danh dự về công trình nghiên cứu khoa học của mình, các kếtquả nghiên cứu được thực hiện và trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan

và tôn trọng tác giả của các công trình nghiên cứu được sử dụng trong đề tài

Đề tài nghiên cứu này không thử nghiệm, không gây tổn hại cho người và độngvật Tuân thủ đúng những quy định đã đề ra, không gian lận, ngụy tạo số liệu, không

sử dụng ý tưởng và kết quả nghiên cứu của người khác Công khai minh bạch về nộidung và kết quả nghiên cứu

Tác giả luận văn

Tô Trần Bảo Ngọc

Luận văn thạc sĩ Dược học 2020-2022

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI GLUTATHION VÀ ACID LIPOIC TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DẠNG VIÊN NÉN VÀ VIÊN NANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG VỚI ĐẦU DÒ

ALPHA-DÃY DIOD QUANG VÀ ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ

Tô Trần Bảo Ngọc Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Ngọc Dung Đặt vấn đề: Glutathion (GSH) và acid alpha-lipoic (ALA) là hai thành phần

làm trắng da và chống lão hóa chính, phổ biến trong các sản phẩm làm đẹp.Việc phát triển quy trình định lượng đồng thời hai hoạt chất này trong chếphẩm là cần thiết

Đối tượng và phương pháp: Đối tượng nghiên cứu: GSH và ALA trong thực

phẩm chức năng dạng viên nén và viên nang Phương pháp nghiên cứu: Xây

dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời GSH và ALA bằng phươngpháp HPLC-PDA và HPLC-MS

Kết quả: Đã xác định điều kiện sắc ký tối ưu cho phương pháp HPLC-PDA;

điều kiện khối phổ tối ưu, điều kiện sắc ký và chuẩn nội cho phương phápHPLC-MS Cả hai quy trình đều có tính đặc hiệu, đạt độ chính xác (RSD ≤2%), đạt độ đúng với tỷ lệ thu hồi từ 98 – 102 % (RSD ≤ 2%) Với phươngpháp HPLC-PDA, khoảng tuyến tính của GSH từ 100 – 600 µg/mL (r =0,9998), ALA từ 10 – 100 µg/mL (r = 0,9995) Với phương pháp HPLC-MS,khoảng tuyến tính của GSH từ 30 – 350 µg/mL (r = 0,9997), ALA từ 3 – 35µg/mL (r = 0,9997) Đã ứng dụng quy trình để xác định GSH và ALA trongchế phẩm viên nén và viên nang trên thị trường Kết quả hàm lượng GSH vàALA xác định từ hai quy trình khác nhau không có ý nghĩa thống kê

Kết luận: Đã xây dựng và thẩm định thành công quy trình định lượng đồng

thời GSH và ALA bằng phương pháp HPLC-PDA và HPLC-MS trong thựcphẩm chức năng dạng viên nén và viên nang

Từ khóa: HPLC, PDA, MS, glutathion, acid alpha-lipoic, thực phẩm chức

năng

Master's Thesis in Pharmacology 2020-2022

SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF GLUTATHION AND ALPHA-LIPOIC ACID IN FUNCTIONAL FOODS ON TABLETS AND CAPSULES BY LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH PHOTO DIODE ARRAY DETECTOR AND MASS

SPECTROMETRY

To Tran Bao Ngoc Supervisor: Dr Nguyen Thi Ngoc Dung Introduction: Glutathion (GSH) and alpha-lipoic acid (ALA) are two major

skin-whitening and anti-aging ingredients that are popular in beauty products

It is necessary to develop a procedure for simultaneous quantification of ofthese two compounds in a preparation

Objects and methods: Objects: GSH and ALA in functional foods in form

of tablets and capsules Methods: Developing and validating a process for

simultaneous quantification of GSH and ALA by HPLC-PDA and HPLC-MSmethods

Results: The optimal chromatographic conditions for HPLC-PDA method;

the optimal mass spectrometry parameters, the chromatographic conditionsand the internal standard for HPLC-MS method were determined Bothprocedures were proved to have selectivity, high precision (RSD  2%), and highaccuracy with a recovery rate of 98 – 102% (RSD  2%) With the HPLC-PDAmethod, the linear range of GSH was from 100 to 600 µg/mL (r = 0,998),ALA from 10 to 100 µg/mL (r = 0,9995) With the HPLC-MS method, thelinear range of GSH is from 30 to 350 µg/mL (r = 0,9997), ALA is from 3 to

35 µg/mL (r = 0,9997) The process has been applied to determine GSH andALA in several commercially preparations available on the market Thecontents of GSH and ALA determined by HPLC-PDA and HPLC-MSmethods are considered to be statistically non-significant

Conclusion: Two procedures for simultaneous quantification of GSH and

ALA in functional foods in form of tablets and capsules by HPLC-PDA andHPLC-MS methods was successfully etablished and validated

Keywords: HPLC, PDA, MS, glutathion, alpha-lipoic acide, functional

foods

LỜI CẢM ƠN

Trong cuộc sống của mỗi người, muốn thành công dù ít hay nhiều, trực tiếp haygián tiếp đều cần có sự giúp đỡ của mọi người xung quanh Đối với em, việc hoànthành luận văn thạc sĩ tại Khoa Dược của Đại học Y Dược là một sự thành công rấtlớn Và để đạt được em điều đó, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến cô TS Nguyễn ThịNgọc Dung đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài Cô luônnhiệt tình chỉ dạy kiến thức, chia sẻ kinh nghiệm nghiên cứu quý báu của mình và an

ủi mỗi khi em gặp khó khăn

Em chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm và Quýanh chị Trung tâm Khoa học và Công Nghệ Dược Sài Gòn đã hỗ trợ và tạo điều kiệnthuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu

Em xin gửi lời biết ơn đến Hội đồng phản biện, thầy PGS TS Trương NgọcTuyền và cô TS Lê Thị Thu Cúc đã dành thời gian đọc, phản biện và đóng góp ýkiến để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Cảm ơn bạn Phạm Lê Ngọc Yến đã hỗ trợ, giúp đỡ, động viên mình vượt quakhó khăn cũng như đã chia sẻ những kiến thức rất bổ ích Cảm ơn bạn Bùi Từ Khuê

vì đã luôn đồng hành cùng mình, đến được đây một phần là nhờ bạn luôn cạnh bênmình trong suốt nhiều năm qua Cảm ơn em Nguyễn Ái Vy, em Nguyễn Thanh Thy

và em Thân Thị Thùy Trang đã luôn hỗ trợ chị hết mình trong suốt thời gian nghiêncứu đề tài

Cuối cùng, con xin cảm ơn mẹ, người đã nuôi nấng, dạy bảo, hết lòng yêuthương và ủng hộ cho con trong suốt những năm học tập để con có được ngày hômnay

Trân trọng!

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Glutathion 3

1.2 Acid alpha-lipoic 6

1.3 Chuẩn nội N-acetylcystein 10

1.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Hóa chất, dung môi, trang thiết bị 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 29

3.1 Khảo sát quy trình định lượng đồng thời glutathion và acid alpha-lipoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò dãy diod quang 29

3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời glutathion và acid alpha-lipoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò dãy diod quang 37

3.3 Khảo sát quy trình định lượng đồng thời glutathion và acid alpha-lipoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò khối phổ 52

3.4 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời glutathion và acid alpha-lipoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò khối phổ 58

3.5 Ứng dụng quy trình trong một số mẫu thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao đầu dò dãy diod quang và đầu dò khối phổ 73

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 77

4.1 Giá trị khoa học của đề tài 77

4.2 Đối với quy trình định lượng glutathion và acid alpha-lipoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò dãy diod quang 77

4.3 Đối với quy trình định lượng glutathion và acid alpha-lipoic bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đầu dò khối phổ 79

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83

5.1 Kết luận 83

5.2 Kiến nghị 83

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ALA Alpha-lipoic acid Acid alpha-lipoic

CEAD Coulometric electrode array

detector

Đầu dò dãy điện cựccoulometric

CZE Capillary zone electrophoresis Điện di mao quản vùng

DHLA Dihydrolipoic acid Acid dihydrolipoic (dạng khử)ECD Electrochemical detector Đầu dò điện hóa

ESI Electrospray ionization Ion hóa đầu phun điện tử

FID Flame ionization detector Đầu dò ion hóa ngọn lửa

FLD Fluorescrence detector Đầu dò huỳnh quang

FPD Flame photometric detector Đầu dò quang kế ngọn lửa

chromatography

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

HPLC High-performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ICH International Conference on

Harmonization

Hội nghị quốc tế về sự hòa hợp

LC Liquid chromatography Sắc ký lỏng

NADH Nicotinamide adenine

dinucleotid

Nicotinamid adenin dinucleotid

NADPH Nicotinamide adenine

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

UPLC Ultra Performacnce liquid

chromatography

Sắc ký lỏng siêu cao áp

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích glutathion và acid alpha-lipoic 12

Bảng 1.2 Danh sách một số thực phẩm chức năng chứa đồng thời glutathion và acid alpha-lipoic đang hiện có trên thị trường 14

Bảng 2.3 Hàm lượng GSH, ALA có trong viên nén và viên nang phối hợp 15

Bảng 2.4 Danh mục chất đối chiếu được sử dụng 15

Bảng 2.5 Danh mục dung môi, hóa chất được sử dụng 16

Bảng 2.6 Danh mục trang thiết bị được sử dụng 16

Bảng 2.7 Dung dịch chuẩn GSH khảo sát tính tuyến tính 21

Bảng 2.8 Dung dịch chuẩn ALA khảo sát tính tuyến tính 21

Bảng 2.9 Dung dịch chuẩn GSH khảo sát tính tuyến tính 27

Bảng 2.10 Dung dịch chuẩn ALA khảo sát tính tuyến tính 28

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện GSH và ALA 29

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi acetonitril – nước 30

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi acetonitril – acid phosphoric (pH=3,0) 31

Bảng 3.14 Chương trình rửa giải gradient 33

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát chương trình rửa giải gradient, pha động acetonitril – acid phosphoric (pH=3,0) 34

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát pha động acetonitril – acid phosphoric (pH=3,5) 34

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 35

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát dung môi đệm 36

Bảng 3.19 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống HPLC-PDA 38

Bảng 3.20 Kết quả khảo sát tính tuyến tính 40

Bảng 3.21 Kết quả xử lý thống kê phương trình hồi quy 41

Bảng 3.22 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 1 (viên nén) 42

Bảng 3.23 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 2 (viên nén) 42

Bảng 3.24 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 1 (viên nang) 43

Bảng 3.25 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 2 (viên nang) 43

Bảng 3.26 Tóm tắt kết quả độ chính xác trung gian (viên nén) 44

Bảng 3.27 Tóm tắt kết quả độ chính xác trung gian (viên nang) 44

Bảng 3.28 Kết quả khảo sát độ đúng (viên nén) 46

Bảng 3.29 Kết quả khảo sát độ đúng (viên nang) 47

Bảng 3.30 Đánh giá tổng hợp quy trình phân tích 48

Bảng 3.31 Kết quả khảo sát thế cone 53

Bảng 3.32 Kết quả khảo sát thế mao quản 54

Bảng 3.33 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi acetonitril - acid formic 0,1% 54

Bảng 3.34 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi acetonitril - acid acetic 0,1% 55

Bảng 3.35 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 56

Bảng 3.36 Kết quả khảo sát nhiệt độ cột 57

Bảng 3.37 Kết quả khảo sát nồng độ acid 57

Bảng 3.38 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống HPLC-MS 59

Bảng 3.39 Kết quả khảo sát tính tuyến tính 61

Bảng 3.40 Kết quả xử lý thống kê phương trình hồi quy 62

Bảng 3.41 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 1 (viên nén) 64

Bảng 3.42 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 2 (viên nén) 64

Bảng 3.43 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 1 (viên nang) 65

Bảng 3.44 Kết quả khảo sát độ lặp lại ngày 2 (viên nang) 65

Bảng 3.45 Tóm tắt kết quả độ chính xác trung gian (viên nén) 66

Bảng 3.46 Tóm tắt kết quả độ chính xác trung gian (viên nang) 66

Bảng 3.47 Kết quả khảo sát độ đúng (viên nén) 68

Bảng 3.48 Kết quả khảo sát độ đúng (viên nang) 69

Bảng 3.49 Đánh giá tổng hợp quy trình phân tích 70

Bảng 3.50 Kết quả định lượng GSH và ALA trong mẫu TPCN trên thị trường bằng phương pháp HPLC-PDA 75

Bảng 3.51 Kết quả định lượng GSH và ALA trong mẫu TPCN trên thị trường bằng phương pháp HPLC-MS 76

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của glutathion 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của acid alpha-lipoic 8

Hình 1.3 Cấu trúc của S-ALA và R-ALA 9

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của N-acetylcystein 10

Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện diện tích pic (A), chiều cao pic (B) và tỷ số S/N (C) của GSH và ALA 30

Hình 3.6 Phổ hấp thu UV của GSH và ALA 30

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu: định lượng GSH và ALA trong viên nang (A) và viên nén (B) 39

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của GSH và ALA 40

Hình 3.9 Kết quả khảo sát kiểu ion hóa ESI của GSH, ALA và NAC 52

Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu: định lượng GSH (A) và ALA (B) trong viên nén 60

Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát tính đặc hiệu: định lượng GSH (A) và (B) trong viên nang 60

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và tỷ số diện tích pic của GSH và ALA so với chuẩn nội (IS) 62

MỞ ĐẦU

Trong xã hội hiện đại, khi các nhu cầu cơ bản được đảm bảo thì vấn đề sức khỏe

và sắc đẹp của con người ngày càng được chú trọng Việc sử dụng mỹ phẩm và thựcphẩm chức năng với mục đích làm đẹp ngày càng trở nên phổ biến

Glutathion (GSH) và acid alpha-lipoic (ALA) là hai thành phần chính trong rấtnhiều loại thực phẩm chức năng làm trắng và chống lão hóa da Ngoài tác dụng làmtrắng và chống oxy hóa mạnh, glutathion và acid alpha-lipoic còn nhiều tác dụng khácđối với cơ thể như: tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ sức khỏe tim mạch và ngăn ngừacác biến chứng Bên cạnh đó, glutathion cũng làm giảm nguy cơ mắc các bệnh vềthần kinh, da, chuyển hóa lipid và ung thư 1

Sự phối hợp của GSH và ALA trong các chế phẩm (ví dụ: Glutathion Reduced500mg Jarrow, Ivory Caps Pills, Relumins Advance White, …) có thể mang lại hiệuquả cao hơn do tác dụng hiệp đồng của chúng Ngoài ra, ALA còn được chứng minhgiúp sản xuất và duy trì mức GSH trong cơ thể thông qua việc ALA kích thích enzymgamma-glutamylcystein ligase (GCL) tổng hợp GSH và tăng sự hấp thu cystein trong

tế bào, nguyên liệu để tổng hợp GSH Các chất chống oxy hóa khác như vitamin C,vitamin E, Coenzym Q10 cũng cho tác dụng hiệp đồng với ALA 2, 3

Bên cạnh những lợi ích kể trên, việc sử dụng quá liều GSH và ALA cũng có thểgây ra các tác hại như sốt, tiêu chảy, tức ngực Hiện vẫn chưa có những nghiên cứutrên quy mô lớn nào được thực hiện để chứng minh tác dụng phụ nghiêm trọng khi

sử dụng GSH và ALA quá liều, tuy vậy việc kiểm soát chất lượng của các chế phẩmchứa GSH và ALA vẫn là cần thiết

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tíchmới và hiện đại đã được áp dụng vào phân tích và xác định hàm lượng của hoạt chấtnhằm kiểm soát chất lượng sản phẩm, đảm bảo an toàn cho sức khỏe người sử dụng.Sắc ký lỏng là một trong các phương pháp phân tích chính xác và nhanh chóng đã vàđang được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu Trên thế giới đã có nhiều côngtrình, bài báo khoa học liên quan đến việc xác định thành phần glutathion và acid

alpha-lipoic riêng rẽ trong các loại dược phẩm, chế phẩm sinh học, sử dụng chủ yếu

là phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với các loại đầu dò khác nhau

Trong khuôn khổ luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, đề tài “Định lượng đồng thời

glutathion và acid alpha-lipoic trong thực phẩm chức năng dạng viên nén và viên nang bằng phương pháp sắc ký lỏng với đầu dò dãy diod quang và đầu dò khối phổ” được thực hiện với các mục tiêu như sau:

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời GSH và ALA trongthực phẩm chức năng dạng viên nén/ viên nang bằng phương pháp HPLC-PDA;

- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời GSH và ALA trongthực phẩm chức năng dạng viên nén/ viên nang bằng phương pháp HPLC-MS;

- So sánh hai phương pháp HPLC-PDA và HPLC-MS;

- Xác định hàm lượng GSH và ALA từ các mẫu thực phẩm chức năng dạng viênnén/ viên nang trên thị trường bằng hai phương pháp định lượng đã xây dựng

“philothion”, có nghĩa là tình yêu trong tiếng Hy Lạp Năm 1921, Hopkins lại chorằng philothion được phân lập từ gan, cơ, xương và nấm men là một dipeptid baogồm cystein và glutamat và đã bỏ qua sự hiện diện của glycin trong philothion, saulại đổi tên là “glutathion” Năm 1927, dựa trên hàm lượng nitơ và lưu huỳnh trongglutathion được phân lập từ nấm men, máu và gan, Hunter và Eagles đã chỉ ra vàorằng glutathion không phải là một dipeptide mà là một tripeptide bao gồm glutamat– cystein – glycin Cấu trúc của glutathion (Hình 1.1) đã được công nhận bởi

Harington và Mead vào năm 1935 thông qua quá trình tổng hợp hóa học từ

N-carbobenzoxycystin và glycin ethyl ester 4

Ngày nay, glutathion được xem là một chất chống oxy hóa trong thực vật, độngvật và một số vi khuẩn Glutathion có khả năng ngăn chặn tế bào hư tổn gây ra cácphản ứng oxy hóa bởi các gốc tự do, preoxid, preoxy hóa lipid và kim loại nặng 5.Glutathion là loại thiol có mặt nhiều nhất trong tế bào động vật, từ 0,5 đến 10nM

và thường có rất nhiều trong gan 6 Con người có thể tự tổng hợp glutathion Vi khuẩnduy nhất có thể tự tạo glutathion là vi khuẩn halobacteria, một số vi khuẩn như vikhuẩn lam, vi khuẩn proteopbacteria có thể sinh tổng hợp glutathion 7

Ngoài ra, các hợp chất như N-acetylcystein (NAC) và acid alpha-lipoic (ALA),

đều có khả năng giúp tổng hợp glutathion 8 Glutathion cũng được sử dụng để giảiđộc methylglyoxal và formaldehyd, các chất chuyển hóa độc hại được tạo ra dưới áplực oxy hóa 9

1.1.2 Cấu trúc, danh pháp

CAS No.: 70-18-8

Mã ATC: V03AB32.

Danh pháp IUPAC:

(2S)-2-amino-5-[[(2R)-1-(carboxymethylamino)-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl] amino]-5-oxopentanoic acid

Công thức phân tử: C10H17N3O6S

Khối lượng phân tử: 307,32 g/mol 10

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của glutathion

1.1.3 Tính chất vật lý

Bột kết tinh màu trắng hoặc không màu

Độ tan: Dễ tan trong nước, ethanol, amoniac và dimethylformamid; khó tantrong dichloromethan

Nhiệt độ nóng chảy: 195 C

pKa = 2,12; 3,53; 8,66 và 9,22 11

Dung dịch ổn định ở pH 3-6 10

1.1.4 Tính chất hóa học

Glutathion (Hình 1.1) là một tripeptid (γ-glutamyl-cysteinyl-glycin), trong đó

nhóm carboxyl của mạch bên glutamat liên kết với nhóm amin của cystein thông qualiên kết gamma peptid, và nhóm carboxyl của cystein liên kết peptid với glycin.Dựa trên công thức cấu tạo của glutathion, các tính chất hóa học của glutathion

có thể được tóm tắt là: (1) tính chất của acid, (2) tính chất của acid α-aminocarboxylic,(3) tính chất của peptid, (4) khả năng phản ứng đặc biệt khi có sự hiện diện của liênkết γ-glutamyl, và (5) khả năng phản ứng do bản chất mercaptan (RSH) của nó.Glutathion có bản chất là một thiol (-SH) nên tương đối dễ tan trong nước,amoniac lỏng, và dimetylformamid và tan trong hỗn hợp rượu và nước Nhóm thiolđóng vai trò quan trọng trong phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng alkyl hóa, phản ứng

với hợp chất carbonyl một cách dễ dàng Glutathion khử ức chế quá trình oxy hóalipid trực tiếp, bằng cách tương tác với các gốc tự do để tạo thành gốc sulfhydryltương đối không ổn định hoặc bằng cách cung cấp nguồn điện tử, cho phép glutathionperoxidase khử hydro và peroxid lipid Kim loại (sắt, đồng) đóng vai trò là chất quantrọng giúp đẩy nhanh phản ứng oxy hóa của glutathion dựa trên sự dịch chuyển pKacủa nhóm SH trong gốc cysteine giữa GSH (pKa là 8,66) và sản phẩm phân hủy của

nó là cysteinylglycine (pKa là 6,4) 12

Bản chất peptid của GSH được chứng minh bằng phản ứng biuret dương tính.Sản phẩm khác của quá trình tự phân hủy của glutathion, cysteinylglycin, sẽ thamgia vào chu trình, sau khi đun nóng hoặc để ở nhiệt độ phòng 13

1.1.5 Chuyển hóa trong cơ thể

Glutathion tồn tại ở trạng thái khử (GSH) và oxy hóa (GSSG) Tỷ lệ GSSG/GSHtrong tế bào là thước đo sự mất cân bằng oxy hóa tế bào, tỷ lệ này càng cao thì sự mấtcân bằng oxy hóa càng lớn 4 Trong các tế bào và mô khỏe mạnh, hơn 90% tổng lượngglutathion ở dạng khử (GSH), phần còn lại ở dạng oxy hóa disulfid (GSSG) 14.Trong các phản ứng oxy hóa khử với các phân tử gốc tự do, glutathion dạng khử(GSH) có nhóm hoạt động thiol (-SH) nên là chất cho điện tử, và chuyển hóa thànhdạng bị oxy hóa (GSSG) 15

GSH cũng có thể được tái tổng hợp từ GSSG bởi NADPH và enzym glutathionreductase Tuy nhiên, khi enzym này hoạt động quá tải và GSSG bị oxy hóa tích lũyquá nhiều (nhiều hơn so với GSH), các tế bào lúc này sẽ dễ bị tổn thương hơn Haiphân tử GSH được hình thành sẽ tiếp tục quá trình chuyển hóa các phân tử gốc tự dotrong cơ thể 16

17 Có hơn 100.000 nghiên cứu khoa học chứng minh tầm quan trọng của glutathionđối với bệnh nhân bị ung thư, xơ nang, Alzheimer.

Nicola Traverso, Roberta Ricciarelli và các đồng sự đã chứng minh được việctăng hàm lượng glutathion sẽ dẫn đến tăng khả năng chống oxy hóa và khả năngchống lại stress oxy hóa trên các tế bào ung thư 18

Vai trò của glutathion trong điều trị các bệnh về trí nhớ, chẳng hạn Alzheimer,cũng đã được báo cáo Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng stress oxy hóa là nguyên nhânquan trọng dẫn đến căn bệnh này và do đó bệnh có thể được điều trị bằng glutathion

ở giai đoạn nhẹ 19

Glutathion còn được cho thấy có tác dụng trắng da, cải thiện độ đàn hồi và giảmnếp nhăn trên da ở một số đối tượng, tuy hiệu quả không kéo dài Sử dụng glutathionđường uống được xem là liệu pháp an toàn và hiệu quả cho cơ thể 20 Trong sản xuấtrượu, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng, glutathion ở dạng khử glutathion (GSH)

Vì ở dạng này, glutathion dễ hấp thu ở dạ dày và ruột bền vững nhất, giúp sáng da vàngăn chặn tạo ra hắc tố melanin, bằng cách can thiệp vào quá trình chuyển hóa vàngăn ngừa hoạt động của enzym tyrosinase 1

Glutathion cũng được sử dụng để giải độc methylglyoxal và formaldehyd, cácchất chuyển hóa độc hại được tạo ra dưới áp lực oxy hóa 9

Khi dùng quá liều, glutathion dư sẽ được đào thải qua đường tiểu và đường mật

vì cơ chế tan trong nước 10 Chưa có nhiều nghiên cứu về độ an toàn khi dùngglutathion trong thời kỳ mang thai và cho con bú

1.2 Acid alpha-lipoic

1.2.1 Nguồn gốc

Acid alpha-lipoic (ALA) được phát hiện bởi nhà enzym học Irwin Gunsalus củađại học Illinois vào năm 1948 và vào tháng 3/1951, nhà sinh hóa học J Lester Reedcủa Đại học Texas đã xem ALA là một loại vitamin mới Những năm gần đây, ALAđược nghiên cứu ứng dụng nhiều trong y học sức khỏe và làm đẹp ở người 21

Acid lipoic (LA), còn được gọi là acid alpha-lipoic (ALA) hay acid thioctic, làmột hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh ALA được tạo ra ở động vật và cần thiết cho

quá trình trao đổi chất hiếu khí Ở một số quốc gia, nó cũng được sử dụng như mộtchất chống oxy hóa có trong một thực phẩm chức năng và dược phẩm hỗ trợ điều trịđái tháo đường và các biến chứng liên quan đến hệ thần kinh do bệnh đái tháo đườnggây ra, được bày bán trên thị trường 22, ví dụ như: Puritan's Pride Alpha Lipoic Acid(Mỹ), Best Naturals Alpha Liopic Acid 600 (Mỹ), Doctor's Best Alpha-Lipoic Acid

600 (Mỹ), Bivantox 300 tab (Việt Nam), Lydura (Việt Nam), Acid Thioctic 600 (ViệtNam), Almintic (Việt Nam), Cymiras (Việt Nam), …

ALA có trong nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là trong thận, tim, gan, rau bina,bông cải xanh và chiết xuất từ nấm men Tuy nhiên, lượng ALA có trong nhữngnguồn thực phẩm lại không cao 23 Ví dụ, quá trình tinh chế ALA để xác định cấu trúccủa nó đã sử dụng ước tính 10 tấn bã gan, nhưng chỉ thu được 30 mg ALA 24 Vì vậy,hầu hết các ALA có sẵn trên thị trường đều được tổng hợp từ phòng thí nghiệm.ALA thường được dùng để chữa bệnh tiểu đường và các triệu chứng liên quanđến thần kinh, bao gồm bỏng rát, đau và tê ở chân và cánh tay Ngoài ra, ALA cònđược chứng minh là có tác dụng với bệnh tim mạch, trị béo phì và giảm lão hóa.Tại Đức, ALA được phê duyệt như một loại thuốc để điều trị bệnh thần kinh dotiểu đường từ năm 1966 và được bán dưới dạng dược phẩm không cần kê đơn 25

Khối lượng phân tử: 206,35 g/mol 26

Công thức cấu tạo:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của acid alpha-lipoic

1.2.3 Tính chất vật lý

Bột kết tinh hình kim màu vàng, gần như không mùi

Độ tan: Dễ tan trong nước và lipid (ALA dạng tự do không liên kết với protein)

Độ tan trong nước được kiểm soát bởi gốc cacboxylat, và tan trong lipid do có cấutrúc acid octanoic

Về bản chất ALA là một acid lipoic, có tính chất của: 1) nhóm dithiolan (dị vòng

5 cạnh có chứa lưu huỳnh), 2) một acid béo dị vòng và 3) một acid béo thia (acid béo

có chứa lưu huỳnh)

Acid alpha-lipoic hay acid 5-[(3R)-1,2-dithiolan-3-yl] pentanoic là một hợp chất

hữu cơ có chứa lưu huỳnh (organosulfur), có nguồn gốc từ acid octanoic ALA chứahai nguyên tử lưu huỳnh (ở C6 và C8) được nối với nhau bằng liên kết disulfur ALA

có khả năng vô hiệu hóa các gốc tự do, đóng vai trò một chất chống oxy hóa quantrọng trong cơ thể 27

Ngoài ra, khả năng tạo phức chelat kim loại của ALA có thể tăng khả năngchống oxy hóa Thực vậy, ALA trực tiếp chelat hóa các kim loại độc hại một cáchhiệu quả, và gián tiếp hỗ trợ quá trình này nhờ khả năng tăng nồng độ glutathion bêntrong tế bào Các kim loại có thể tạo phức trực tiếp với ALA và dạng khử của nó, aciddihydrolipoic DHLA, bao gồm: mangan, kẽm, chì, coban, niken, sắt, đồng, asen vàthủy ngân 28

1.2.5 Chuyển hóa trong cơ thể

ALA là một chất tự nhiên được tổng hợp trong ty thể của tế bào, đóng vai trò làcoenzym cho hai loại enzym pyruvat dehydrogenase và ketoglutarat-dehydrogenase

ALA chứa hai nhóm thiol (lưu huỳnh), có thể bị oxy hóa hoặc khử Acid dihydrolipoic(DHLA) là dạng khử của acid lipoic bởi enzym lipoamid dehydrogenase với sự thamgia của NADH và NADPH 29.

ALA dạng oxy hóa chứa một carbon bất đối nên tồn tại hai đồng phân quang học

là R-ALA và S-ALA (Hình 1.3) Chỉ đồng phân R được tổng hợp nội sinh và liên kết cộng hóa trị với protein ALA tự do có thể chứa R-ALA hoặc hỗn hợp 50:50 (racemic) của R-ALA và S-ALA 30

Hình 1.3 Cấu trúc của S-ALA và R-ALA

1.2.6 Tác dụng dược lý

ALA là thành phần phổ biến trong các công thức vitamin tổng hợp, thực phẩm

bổ sung điều trị tiểu đường, tim mạch 31 và thành phần sản phẩm giảm cân (nhữngngười dùng ALA giảm được trung bình 0,69 kg, nhiều hơn những người dùng giảdược) 32

Theo một nghiên cứu gần đây, ALA kết hợp với insulin có thể tăng hiệu quả bảo

vệ bệnh nhân bị tiểu đường đối với việc lây nhiễm virus SARS-CoV2 nhờ khả năngkháng một số virus, giảm hoạt hóa NF-B, tăng glutathion nội bào và tăng cường khảnăng miễn dịch ở người 33

Ngoài ra, ALA cũng là một trong những chất chống oxy hóa mạnh bên cạnhvitamin E, vitamin C, retinol, coenzym Q10 và glutathion, trong việc điều trị chốnglão hóa da, do những hư tổn do tia cực tím, tuổi tác và các tác nhân khác gây nên 34

ALA được coi là một loại thuốc an toàn, ít tác dụng phụ Một số trường hợp cóthể gặp triệu chứng nhẹ như buồn nôn, phát ban, ngứa ALA có thể sử dụng với liềulớn lên đến 2400 mg mà không có tác dụng phụ có hại Tuy nhiên, không có bằngchứng nào cho thấy hiệu quả điều trị được nâng cao khi dùng liều cao ALA 35.

1.3 Chuẩn nội N-acetylcystein

N-Acetylcystein (NAC) là một hợp chất chứa thiol, được dùng để điều trị cácbệnh phổi tắc nghẽn và sung huyết, chủ yếu là những bệnh liên quan đến tăng tiếtchất nhầy, chẳng hạn như viêm phế quản mãn tính và xơ nang

Sự đa dạng về mặt dược lý của NAC khá độc đáo và chủ yếu là do sự có mặtcủa gốc cysteinyl thiol của phân tử Vậy nên NAC có tính chất hóa học bao gồm tính

ái nhân và tính oxi hóa khử, cung cấp các đặc tính chống oxy hóa, cũng như khả năngtrải qua quá trình chuyển hóa hydro hoặc phản ứng trao đổi thiol-disulfide (TDE) vớicác cặp oxi hóa khử thiol khác 36

CAS No.: 616-91-1

Danh pháp IUPAC: N-acetyl-L-cystein.

Công thức phân tử: C5H9NO3S

Khối lượng phân tử: 163,20 g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của N-actylcystein

Bột tinh thể màu trắng

Độ tan: Tan tốt trong nước, ethanol, methanol và chloroform

Nhiệt độ nóng chảy: 109,5 oC

pKa: 9,52

1.4 Tổng quan các công trình nghiên cứu

Trên thế giới, nhiều công trình đã định lượng GSH và ALA riêng lẻ, trong trongthực phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm Tuy nhiên, việc định lượng đồng thờiGSH và ALA trên cùng một đối tượng chưa được tiến hành, đặc biệt là trên thựcphẩm chức năng – đối tượng đang được khai thác và sử dụng rộng rãi hiện nay tronglĩnh vực chăm sóc sức khỏe và làm đẹp

Phương pháp xác định hàm lượng GSH hoặc ALA được mô tả trong tài liệu rất

đa dạng như HPLC, UPLC, HILIC, CE, CZE… đối với GSH và HPLC, GC cho ALA.Nhiều loại đầu dò đã được sử dụng như UV-Vis, FLD, MS, ECD…

Trong phạm vi đề tài, tiến hành xây dựng quy trình định lượng đồng thời GSH

và ALA bằng HPLC-PDA và HPLC-MS, là hai hệ thống sắc ký lỏng phổ biến và sẵn

có tại phòng thí nghiệm, khảo sát trên 2 dạng đối tượng thực phẩm chức năng phổbiến chứa GSH và ALA là viên nén và viên nang cứng (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Một số phương pháp phân tích glutathion và acid alpha-lipoic bằng

Điều kiện phân tích

HPLC-Cột sắc ký: Purospher STAR RP-18Pha động: methanol - đệm phosphat (15:85)Bước sóng phát hiện: 467/525 nm

2010

37

2

Nho trắngRượu vang

trắng

FLD

HPLC-Cột sắc ký: Fusion-RP 80APha động: natri acetat- methanolTốc độ dòng: 0,7 mL/phútThê tích tiêm mẫu: 9 lNhiệt độ cột: 25CBước sóng phát hiện: 340/450 nm

2010

38

3

Nước épnho trắngRượu vang

trắng

PDA

UPLC-Cột sắc ký: BEH-C18Pha động: nước - acid trifluoroacetic - methanolThê tích tiêm mẫu: 2 L

Nhiệt độ cột: 25 CBước sóng phát hiện: 303 nm

- Pha A: nước – acid formic (0,1%)

- Pha B: acetonitril - acid formic (0,1%)Tốc độ dòng: 1 mL/phút

Thê tích tiêm mẫu: 2 L

1981

41

Điều kiện phân tích

nén/gói)

So sánh:

CEAD vàHPLC-ESI-MS

HPLC-HPLC-CEAD

Cột sắc ký: ACE 3-C-18Pha động: acetonitril-methanol-kali dihydrophotphat (350:65:585)

Tốc độ dòng 0,45 mL/phútThê tích tiêm mẫu: 20 LBước sóng phát hiện: 215 nm

HPLC-ESI-MS

Cột sắc ký: ACE 3-C-18Pha động: acid acetic- acetonitril (55:45)Tốc độ dòng: 0,2 mL/phút

HPLC-Cột sắc ký: Luna 5µm C18Pha động: acetonitril – đệm phosphat (1:1)Tốc độ dòng: 1 mL/phút

Thể tích tiêm mẫu: 20 LNhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

2010

43

8

Viên nangALA, thực

phẩm

FLD

HPLC-Cột sắc ký: Cosmosil 5 C18Pha động: acetonitril - KH2PO4 (30:70)Tốc độ dòng: 1 mL/phút

Thể tích tiêm mẫu: 20 LBước sóng phát hiện: 210 nm

HPLC-Cột sắc ký: Luna C18Pha động: acetonitril - kali dihydrophosphatTốc độ dòng: 1 mL/phút

Thể tích tiêm mẫu: 20 LBước sóng phát hiện: 340 nm

2020

45

Hiện nay, trên thị trường có nhiều chế phẩm viên uống làm trắng da, chống lãohóa phối hợp hai thành phần GSH và ALA (ví dụ: Glutathion Reduced 500mg Jarrow,Ivory Caps Pills, Relumins Advance White, …) nhằm mang lại hiệu quả cao chongười sử dụng Thông tin về một số chế phẩm tìm thấy được trình bày trong Bảng1.2.

Bảng 1.2 Danh sách một số thực phẩm chức năng chứa đồng thời glutathion và acid

alpha-lipoic đang hiện có trên thị trường

Glutathione White 800 Rose Chem International Corp.,

Mỹ

HB Glutathione - C Plus Robinson Pharma, Inc., Mỹ

Relumins Advance White 1650 mg

Sakura L-Glutathione Reduced Sakura, Nhật

Trang web: chiaki.vn và healthybeautyduocpham.com, ngày 01/07/2021

Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu phân tích hàm lượng gluthathion và acid lipoic riêng rẽ trên nhiều đối tượng mẫu khác nhau (xem mục 1.1.7 và 1.2.7), nhưngchưa có phương pháp nào định lượng đồng thời hai chất được công bố, đặc biệt địnhlượng trong mẫu thực phẩm chức năng phối hợp gluthathion và acid alpha-lipoic

alpha-CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là 5 loại thực phẩm chức năng chứa đồng thờiglutathion và acid alpha-lipoic đang hiện có trên thị trường (Bảng 2.1)

Với mục đích lựa chọn nền mẫu phù hợp, có tính đại diện, sau khi tham khảocông thức của 6 loại TPCN trên, mẫu thử viên nang được phối hợp từ 4 loại chế phẩmviên nang cứng, mẫu thử viên nén là viên HB Glutathion - C Plus

Bảng 2.3 Hàm lượng GSH, ALA có trong viên nén và viên nang phối hợp

Hàm lượng GSH Hàm lượng ALA

2.2.2 Dung môi, hóa chất

Bảng 2.5 Danh mục dung môi, hóa chất được sử dụng Dung môi – hóa chất Nguồn gốc Độ tinh khiết Độ tinh khiết

Ammonium dihydrogen

phosphat

2.2.3 Trang thiết bị

Bảng 2.6 Danh mục trang thiết bị được sử dụng

Hệ thống LC-PDA Water Alliance 2695

Và các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát quy trình định lượng đồng thời GSH và ALA bằng phương pháp

HPLC-PDA

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu

Dung môi pha mẫu: acetonitril – nước (50:50, tt/tt).

Dung dịch chuẩn gốc GSH (1): Cân chính xác khoảng 100,0 mg GSH chuẩn cho

vào bình định mức 100 mL, thêm 50 mL dung môi pha mẫu, siêu âm 5 phút Đểnguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc cónồng độ GSH khoảng 1000 µg/mL

Dung dịch chuẩn gốc ALA (2): Cân chính xác khoảng 10,0 mg ALA chuẩn cho

vào bình định mức 100 mL, thêm 50 mL dung môi pha mẫu, siêu âm 5 phút Đểnguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc cónồng độ ALA khoảng 100 µg/mL

Dung dịch hỗn hợp chuẩn (3): Hút chính xác 5 mL dung dịch (1) và 5 mL dung

dịch (2) cho vào bình định mức 20 mL, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều.Lọc qua màng lọc nylon 0,45 m Dung dịch thu được có nồng độ GSH và ALA lầnlượt là 250 µg/mL và 25 µg/mL

Dung dịch thử (viên nén) (4): Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình một viên,

nghiền thành bột mịn Cân chính xác khoảng một lượng bột chế phẩm tương ứng với10,0 mg GSH vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 5 mL dung môi pha mẫu, siêu

âm 15 phút Để nguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc qua giấy lọc(bỏ dịch lọc đầu) Hút chính xác 5 mL dịch lọc cho vào bình định mức 20 mL, thêmdung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc nylon 0,45 m Dung dịch

có nồng độ GSH khoảng 250 µg/mL và ALA khoảng 12,5 µg/mL

Dung dịch thử (viên nang) (5): Cân 20 viên mỗi loại, tính khối lượng trung bình

một viên, nghiền thành bột mịn Cân chính xác khoảng một lượng bột chế phẩm tươngứng với 10,0 mg GSH vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 5 mL dung môi pha

mẫu, siêu âm 15 phút Để nguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc quagiấy lọc (bỏ dịch lọc đầu) Hút chính xác 5 mL dịch lọc cho vào bình định mức 20

mL, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc nylon 0,45 m.Dung dịch có nồng độ GSH khoảng 250 µg/mL và ALA khoảng 36 µg/mL

Mẫu phân hủy (thực hiện với 2 nền mẫu thử viên nang và viên nén): cân chính

xác khoảng một lượng bột chế phẩm tương ứng với 10,0 mg GSH vào bình định mứchoặc đĩa petri (đối với mẫu phân hủy bởi nhiệt), chế phẩm được phân hủy trong cácđiều kiện tương ứng như sau:

Mẫu (1): mẫu thử phân hủy dưới ánh sáng mặt trời trong 8 giờ.

Mẫu (2): mẫu thử phân hủy bởi nhiệt độ 80  2 C trong 24 giờ.

Mẫu (3): mẫu thử phân hủy trong dung môi pha mẫu trong 24 giờ.

Mẫu (4): mẫu thử phân hủy trong nước trong 24 giờ.

Các mẫu sau khi phân huỷ trong các điều kiện với thời gian tương ứng đượcchuyển vào bình định mức 10 mL Pha loãng mẫu đến vạch bằng dung môi pha mẫu,lọc qua giấy lọc, bỏ 2 mL dịch lọc đầu Lần lượt hút 5 mL dịch lọc cho vào bình địnhmức 20 mL, pha loãng đến vạch bằng dung môi pha mẫu Lọc qua màng lọc nylon0,45 µm

2.3.1.2 Điều kiện sắc ký ban đầu

Sau khi tham khảo các tài liệu ở mục 1.4, điều kiện sắc ký ban đầu được đề nghịnhư sau:

2.3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sát bước sóng phát hiện: Quan sát sắc ký đồ ở các bước sóng 195 nm,

215 nm và 334 nm

- Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động: Pha động gồm acetonitril – nước lần lượt ởcác tỉ lệ 90:10, 70:30, 50:50, 30:70, 10:90, 1:99 (tt/tt); pha động gồm acetonitril –acid phosphoric (pH=3,0) lần lượt ở các tỉ lệ 70:30, 50:50, 30:70, 20:80, 1:99 (tt/tt)

- Khảo sát cách thức triển khai sắc ký: Sắc ký dung dịch chuẩn với hệ dung môi

đã chọn ở chế độ isocratic hoặc gradient

- Khảo sát pH pha động: Thay dung dịch acid phosphoric (pH=3,0) bằng acidphosphoric (pH=3,5)

- Khảo sát tốc độ dòng: Tiến hành khảo sát các tốc độ dòng khác nhau 1,0mL/phút; 0,8 mL/phút; 0,5 mL/phút

- Khảo sát dung môi pha động: thay acid phosphoric (pH=3,5) bằng và đệmamoni dihydrophosphat (pH 3,5)

Tiêu chí lựa chọn: Các pic hoạt chất tinh khiết, tách hoàn toàn (độ phân giải Rs

≥ 1,5), hệ số bất đối As nằm trong khoảng 0,8 -1,5 và số đĩa lý thuyết biểu kiến N ≥2000

2.3.2 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời GSH và ALA trong thực phẩm

chức năng bằng phương pháp HPLC-PDA

Quy trình định lượng GSH và ALA trong thực phẩm chức năng bằng phươngpháp HPLC-PDA được thực hiện theo Quyết định của Cục trưởng Cục quản lý Dược,

Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013 về việc ban hành Số tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8 46

Các chỉ tiêu cần thẩm định bao gồm: tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độchính xác, độ đúng, tính tuyến tính và miền giá trị

2.3.2.1 Tính phù hợp hệ thống (system suitability)

Ý nghĩa

Khảo sát tính phù hợp hệ thống nhằm đảm bảo hệ thống sắc ký có hiệu năngphù hợp để xác định độ phân giải và độ lặp lại của phép phân tích được thực hiện

Quy trình đạt tính phù hợp hệ thống khi:

- RSD của thời gian lưu và diện tích pic  2%

- Rs của GSH, ALA và các pic liền kề ≥ 1,5

Cách tiến hành

Chuẩn bị mẫu trắng (dung môi pha mẫu), mẫu chuẩn GSH, mẫu chuẩn ALA,dung dịch hỗn hợp chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và các mẫu phân hủy Phântích các mẫu theo điều kiện sắc ký đã chọn

- Sắc ký đồ dung dịch thử thêm chuẩn cho tín hiệu pic GSH và ALA cao hơn sovới dung dịch thử

- Phổ UV của pic GSH và ALA tương ứng trong dung dịch chuẩn, dung dịchhỗn hợp chuẩn, dung dịch thử và dung dịch thử thêm chuẩn tương ứng giống nhau

- Độ tinh khiết của pic GSH và ALA đạt theo quy định (giá trị Purity angle nhỏhơn Purity threshold).

- Trong sắc ký đồ các mẫu phân hủy, pic GSH, ALA tách hoàn toàn (độ phângiải so với các pic liền kề không nhỏ hơn 1,5) với các pic tạp chất (nếu có)

2.3.2.3 Tính tuyến tính (linearity)

Ý nghĩa

Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả củaphương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đođược (Y) và nồng độ chất phân tích (X) theo phương trình: Y = aX + b

Miền giá trị thường được biểu thị bằng khoảng nồng độ, mà ở đó vẫn còn phụthuộc tuyến tính giữa giá trị đo thực và nồng độ chất khảo sát

Cách tiến hành

Từ dung dịch hỗn hợp chuẩn gốc, pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng

độ khác nhau theo bảng 1 và 2 Tiến hành sắc ký 2 lần mỗi dung dịch, ghi nhận tínhgiá trị trung bình Thiết lập phương trình hồi quy, vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quangiữa diện tích pic và nồng độ của GSH và ALA trong mẫu Sử dụng trắc nghiệm trắcnghiệm t (student) kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy và trắcnghiệm F (Fisher) kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy

Bảng 2.8 Dung dịch chuẩn ALA khảo sát tính tuyến tính

2.3.2.4 Độ chính xác (precision)

Ý nghĩa

Độ chính xác là mức độ sát gần giữa các kết quả thử so với giá trị trung bình

Độ chính xác trong định lượng được biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD).Gồm độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ sao lại

- RSD hàm lượng GSH và ALA của mỗi ngày và của 2 ngày  2%

- So sánh hàm lượng GSH và ALA 2 ngày bằng phân tích phương sai Anova 1yếu tố, kết quả khác nhau không có ý nghĩa thống kê

2.3.2.5 Độ đúng (accuracy)

Ý nghĩa

Độ đúng của quy trình phân tích là mức độ sát gần giữa giá trị tìm thấy và giátrị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng 1 mẫu thử đã được làm đồng nhấttrên cùng điều kiện Độ đúng được biểu thị dưới dạng phần trăm tìm thấy của chấtphân tích đã biết trước được thêm vào mẫu thử:

Độ đúng hay tỷ lệ phục hồi (%) = Lượng hoạt chất thu hồi x 100

Lượng hoạt chất thêm vào

Cách tiến hành

Chuẩn bị dung dịch thử thêm chuẩn bằng cách thêm chính xác một lượng chấtchuẩn cần phân tích vào mẫu thử Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với 3 mứcnồng độ 80%, 100% và 120% so với mức nồng độ định lượng (viên nén: GSH khoảng

250 µg/mL và ALA khoảng 12,5 µg/mL; viên nang: GSH khoảng 250 µg/mL và ALAkhoảng 36 µg/mL) Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 3 mẫu độc lập Phân tíchmẫu theo quy trình

Yêu cầu

- Tỷ lệ phục hồi từ 98,0 - 102,0%

- RSD của tỷ lệ thu hồi  2%

2.3.3 Khảo sát quy trình định lượng đồng thời GSH và ALA bằng phương pháp

HPLC-MS

2.3.3.1 Lựa chọn chuẩn nội

Dựa vào tài liệu tham khảo các công trình nghiên cứu, có nhiều chất khác nhauđược sử dụng làm chuẩn nội cho quy trình phân tích GSH và ALA bằng HPLC như:

N-acetyl cystein (NAC), glutathion ethyl ester, acid thiosalicylic, bisphenol A … Khi

xem xét cấu trúc hóa học, NAC là chất chuẩn có cấu trúc hóa học gần giống GSH(một tripeptide bao gồm glutamat – cystein – glycin), có thể sử dụng được cả chế độESI (+), ESI (-) khi sử dụng đầu dò MS, và đều cho tín hiệu m/z với cường độ cao.Thêm vào đó, NAC là hóa chất dễ tìm và giá thành phù hợp nên được dùng làm chuẩnnội trong phương pháp HPLC-MS

2.3.3.2 Chuẩn bị mẫu

Dung môi pha mẫu: acetonitril – nước (50:50, tt/tt).

Dung dịch chuẩn gốc GSH (1): Cân chính xác khoảng 100,0 mg GSH chuẩn

cho vào bình định mức 100 mL, thêm 50 mL dung môi pha mẫu, siêu âm 5 phút Đểnguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc cónồng độ GSH khoảng 1000 µg/mL

Dung dịch chuẩn gốc ALA (2): Cân chính xác khoảng 10,0 mg ALA chuẩn cho

vào bình định mức 100 mL, thêm 50 mL dung môi pha mẫu, siêu âm 5 phút Đểnguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn gốc cónồng độ ALA khoảng 100 µg/mL

Dung dịch chuẩn nội gốc NAC (IS) (3): Cân chính xác khoảng 10,0 mg NAC

(IS) cho vào bình định mức 100 mL, thêm 50 mL dung môi pha mẫu, siêu âm 5 phút

Để nguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch chuẩn nộigốc có nồng độ NAC khoảng 1000 µg/mL

Dung dịch hỗn hợp chuẩn (4): Hút chính xác 2 mL mỗi dung dịch (1), (2) và

(3) cho vào bình định mức 20 mL, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọcqua màng lọc nylon 0,22 m Dung dịch thu được có nồng độ GSH, ALA và NAC(IS) lần lượt là 100 µg/mL, 10 µg/mL và 100 µg/mL

Dung dịch thử (viên nén) (5): Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình một viên,

nghiền thành bột mịn Cân chính xác khoảng một lươngj bột chế phẩm tương ứng với10,0 mg GSH vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 5 mL dung môi pha mẫu, siêu

âm 15 phút Để nguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc qua giấy lọc(bỏ dịch lọc đầu) Hút chính xác 1 mL dịch lọc và 1 mL dung dịch (3) cho vào bìnhđịnh mức 10 mL, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc nylon0,22 m Dung dịch có nồng độ GSH khoảng 100 µg/mL và ALA khoảng 5 µg/mL(nồng độ NAC (IS) khoảng 100 µg/mL)

Dung dịch thử (viên nang) (6): Cân 20 viên mỗi loại, tính khối lượng trung bình

một viên, nghiền thành bột mịn Cân chính xác khoảng một lượng bột chế phẩm tươngứng với 10,0 mg GSH vào bình định mức 10 mL, thêm khoảng 5 mL dung môi phamẫu, siêu âm 15 phút Để nguội, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc quagiấy lọc (bỏ dịch lọc đầu) Hút chính xác 1 mL dịch lọc và 1 mL dung dịch (3) chovào bình định mức 10 mL, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều Lọc qua mànglọc nylon 0,22 m Dung dịch có nồng độ GSH khoảng 100 µg/mL và ALA khoảng14,5 µg/mL (nồng độ NAC (IS) khoảng 100 µg/mL)

Mẫu phân hủy (thực hiện với 2 nền mẫu thử của viên nang và viên nén): cân

chính xác khoảng một lượng bột chế phẩm tương ứng với 10,0 mg GSH vào bìnhđịnh mức hoặc đĩa petri (đối với mẫu phân hủy bởi nhiệt), chế phẩm được phân hủytrong các điều kiện tương ứng như sau:

Mẫu (1): mẫu thử phân hủy dưới ánh sáng mặt trời trong 8 giờ.

Mẫu (2): mẫu thử phân hủy bởi nhiệt độ 80  2 C trong 24 giờ.

Mẫu (3): mẫu thử phân hủy trong dung môi pha mẫu trong 24 giờ.

Mẫu (4): mẫu thử phân hủy trong nước trong 24 giờ.

Các mẫu sau khi phân huỷ trong các điều kiện với thời gian tương ứng đượcchuyển vào bình định mức 10 mL Pha loãng mẫu đến vạch bằng dung môi pha mẫu,lọc qua giấy lọc, bỏ 2 mL dịch lọc đầu Lần lượt hút 1 mL dịch lọc và 1 mL dungdịch (3) cho vào bình định mức 10 mL, pha loãng đến vạch bằng dung môi pha mẫu.Lọc qua màng lọc nylon 0,22 µm.

2.3.3.3 Điều kiện sắc ký ban đầu

Sau khi tham khảo các tài liệu ở mục 1.4, điều kiện sắc ký ban đầu được đề nghịnhư sau:

• Hệ thống Water ACQUITY Arc HPLC/UHPLC System

2.3.3.4 Điều kiện khối phổ ban đầu

Điều kiện khối phổ ban đầu được chọn theo chế độ mặc định của máy như sau:

• Detector: MS/ESI (-)

• Thế cone: 35 V

• Thế mao quản: 0,8 kV

• Scan range: 100-400 Da

2.3.3.5 Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sát tỷ lệ và thành phần pha động: Pha động gồm acetonitril – acid formic0,1% lần lượt ở các tỷ lệ 90:10, 80:20, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70 (tt/tt); pha độnggồm acetonitril – acid acetic 0,1% lần lượt ở các tỷ lệ 80:20, 60:40, 50:50, 40:60,30:70 (tt/tt)

- Khảo sát nồng độ acid: thay đổi nồng độ dung dịch acid acetic 0,1% bằng0,05%, 0,01% và 0,005%