0915 nghiên cứu hoạt tính sinh học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn phân lập từ vùng biển đông bắc bộ và miền trung việt nam luận văn tốt nghiệp

Ngược lại, việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học đượcsảnsinh từ VSV biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể, nhiều hợp chấtthứcấp với cấu trúc hóa họ

MỞĐẦU

ViệtNamlàquốcgiavenbiểnnằmbênbờTâycủaBiểnĐông,cóđịachínhtrịvàđịakinhtếrấtquantrọngkhôngphảibấtkỳquốcgianàocũngcó.Vớibờbiểndàitrên

3.260 km trải dài từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 trong số 157 quốc gia ven biển,cácquốcđảovàcáclãnhthổtrênthếgiới.Chỉsốchiềudàibờbiểntrêndiệntíchđấtliềncủanướctalàxấpxỉ0,01(nghĩalàcứ100km2đấtliềncó1kmbờbiển).Trong63tỉnh,thànhphố của cả nước thì 28 tỉnh, thành phố có biển

và gần một nửa dân số sinh sống tại cáctỉnh, thành ven biển Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy, vùng

mộttrongsốcácvùngbiểncóhệđadạngsinhhọcphongphúnhất.Đồngthời,VSVbiểncósựphânbốrấtdồidàovàđadạng,tuynhiênchotớinay,ởnướctachưacónhiềucôngtrìnhnghiêncứucáchợpchấtthứcấpđượcsinhtổnghợptừcácVSVbiển

Ngược lại, việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học đượcsảnsinh từ VSV biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể, nhiều hợp chấtthứcấp với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú đã được phát hiện Đồng thờinhiềuhợpchấttrongsốnàyđãvàđangđượcthửnghiệmsâuhơnnhằmứngdụngtrongydược.Nhiều loạikháng sinh được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếmphần lớn trong đó có các xạ khuẩn biển Do

tráiđất,lànơicósựđadạngvềsinhhọclớnnhấttrêntráiđất.Vìmôitrườngbiểnđãđượcbiếtđếnnhưmộtnguồnphongphúcungcấpcáchợpchấtthiênnhiên,nhưmộtkhodượcliệukhổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá.Đặc thù môi trường sống khắc nghiệtdưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu

cơ với những đặc điểmcấutrúchóahọcđộcđáovàhoạttínhsinhhọcquýgiá

Hơnnữa,ngàycàngnhiềucácVSVgây bệnhtrongđócóvikhuẩnlaokhá ng vớ

i các kháng sinh hiện có và các bệnh ung thư Do đó, công cuộc tìm kiếm các loạithuốc mới chống lao, ung thư cũng nhưcác bệnh truyền nhi m khác v n đang là vấn đềmangtínhcấpbáchtrêntoàncầu

Vì vậy chúng tôi thực hiện luận án này với mục đích: “Nghiên cứu hoạt tính

sinhhọc một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Đông Bắc bộ vàmiền TrungViệt Nam”.

Mụctiêunghiêncứucủaluận án:

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩnphânlập từvùngbiểnĐôngBắcbộvàmiềnTrungViệt Nam

- Tìmkiếmcácchấtthứcấpcóhoạttínhsinhhọccaotừnguồnxạkhuẩnbiểnthôngquađánhgiásànglọchoạttínhkhángvisinhvậtkiểmđịnh,khánglaovàgâyđộctếbào

Nhữngđónggópmớicủaluậnán

- Từ 140 m u vật thu thập được từ 1 số vùng biển Việt Nam, 130 chủng visinhvật đãđượcphânlập

- SànglọchoạttínhkhángVSVKĐ(6chủngvikhuẩnvà1chủngnấm)vàkhánglao(H37Rv)củacặnchiếtcácchủngxạkhuẩnphânlậpđượcchothấy105/130chủngthểhiệnhoạttínhkhángítnhất1chủngVSVKĐ,3chủngthểhiệnhoạttínhkhánglao

- Đã lựa chọn và xác định được tên khoa học của mười chủng có hoạt tính

caobằng giải trình tự gen 16S rRNA Trong đó các chủng G017, G019, G043, G044,

G047,G068, G120 thuộc chiMicromonospora, các chủng G039, G065 thuộc chiStretomyces,chủngG057thuộcchiNocardiopsis.

- Dịchlênmenc ủa 5chủngcóhoạtt ínhcaođãđượcnghiêncứuthànhphầnhóahọcbằngcácphươngphápsắcký.Đãxácđịnhđược44hợpchất

Phầntổngquantạiliệutổnghợpcácnghiêncứutrongnướcvàngoàinướcđềcập đếncácvấnđềchínhsau:

- Cặpmồidùngđểkhuếchđạigen 16srARNcủa xạkhuẩn

- Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế: 3 chủng vi khuẩn Gram –

(EscherichiacoliATCC25922,PseudomonasaeruginosaATCC27853,S.entericaATCC122

28),3chủngGram+(E.faecalisATCC13124,StapphylococusaureusATCC25923,Bacillus cereusATCC 13245),1 chủng Nấm menCandida albicansATCC10231 được

cungcấpbởiviệnKiểmnghiệmvệsinhantoànthựcphẩmquốcgia

- Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:KB- ung

thưbiểumô(CCL–17TM);HepG2-ungthưgan(HB–8065TM);MCF-7-ungthưvú(HTB

2.1.3 Thiết bị:Máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu vi sinh bao gồm : Máy

sốcnhiệt;máyvortex;máykhuấytừ;tủcấyantoànsinhhọcClassII;tủnuôicấy;máyly

tâm Centrifuge 5430; cân phân tích; máy PCR Mygenie 96 Thermal Block; máy điệndi;máy lắc; tủlạnh-80oC và -20oC; máy khửtrùng; thiết bị lặnScuba, thuyềnđánhc á loại vừa, thiết bịlấy m u thông thường nhưc u ố c , t ờ i , m á y đ o t ọ a đ ộ , m á y đ o đ ộ sâu;kính hiển

vi điện tử quét SEM; máy quang phổ Hewlett Packard; máy đo phổ hồngngoại Impact-410; máy đo phổ khối Quardrupole LC MS- Agilent Technologestheo kiểu phun

FTIR-mù điện tử (ESI); máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance500 (500 MHz),

sử dụng TMS làm chất chuẩn; máy độ quay cực Tasco P-2000; máyđođiểmnóngchảyMel Temp3.0củacácnướcMỹvàChâuÂu

Các dụng cụ dùng trong nghiên cứu vi sinh thông thường như: que cấy (Đức);đĩapepri(Đức,Ý); bìnht a m g i á c ; q u e r i a ; q u e t r a n g ( Đ ứ c ) ; Ố n g

e p p e n d o f 1 5 m l ; 2 ml; 15 ml; 50 ml; đầu típ các loại: 10, 100, 200, 1000 µl;Bình tam giác các loại dungtíchtừ125ml–5000ml

TửLong, 29 m u ở Đảo Cô Tô – Thanh Lân , 9 m u trầm tích ở Hạ Long - Cát Bà, 10 muHải miên Hải Vân – Sơn Chà và 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa Các m uđượclấyở cáctọađộvàđộsâukhácnhau

3.2 Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn:Từ 140 m u được nuôi cấy trên các

môitrườngkhácnhau(M1,NZSG,ISP1,ISP2,A1,SWA),chúngtôiđãchọnđược130chủngxạkhuẩn.ĐasốcácchủngđềumọctrênmôitrườngA1vàM1.CácchủngđềupháttriểntốttrênmôitrườngA1.Vìvậychúngtôichọn môitrườngA1đểnuôicấygiữchủngtrongA1+10%glycerolở–80oC

3.3 Khảosáthoạttínhsinhhọccácchủngphânlậpđƣợc

KếtquảthửhoạttínhkhángVSVKĐvớicặnthôthuđược105130chủngphânlậpcótínhkhángcácchủngVSVKĐ80,8%,trongđócó29130chủngphânlậpcóhoạttínhkháng từ 3 chủng VSV kiểmđịnh trở lên, chiếm 22,3% và 59 130 chủng có hoạt tínhkháng nấm chiếm 45,4%.Ngoài

ra, có 11 130 chủng phân lập là có hoạt tính khángVSVKĐ Gram âm, chiếm 8,5% Đặcbiệt, các chủng G002, G004, G026, G057, G119,G120, G124, G126,G039,G065, LC09

và LC19 thể hiện hoạt tính phổ rộng trên cả vikhuẩnvi khuẩnGram(+),vikhuẩnGram(-)vànấm

Các cặn chiết của các chủng xạ khuẩn phân lập được cũng đã được khảo sátsànglọchoạttínhkháng lao.Kếtquảkhảosátchothấytrongsốcácchủng đượcthử nghiệm,

có3chủngG017,G019vàG043thểhiện hoạttínhđốivớiMycobacteriumtuberculosis

H37Rvvớigiátrị MIClần lượtlà21,25 và18μg/ml.g/ml

Từ các kết quả sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ cũng như hoạt tính khánglao,trong luận án này đã lựa chọn được 10 chủng xạ khuẩn có hoạt tính tốt nhất để thựchiệncácnghiêncứutiếptheo

3.4 Kếtquảđịnh danh10 chủngxạkhuẩncóhoạttính

3.4.1 Quansátđặcđiểm hìnhtháicác chủngnghiêncứu

Cácchủngnghiêncứuđượcnuôicấytrong14ngàyở30ºCtrênmôitrườngthạch(ISP2).Kếtquảquansáthìnhtháichothấysợikhuẩntycơchấtpháttriểntốttrênnềncơchất của môi trường, nhưng sợi khuẩn ty khí sinh thì

sợikhísinhrấtphongphú,làmàuvàng,trắngsangmàucamsốngđộnghoặctừnâuđensangmàuđensaukhihìnhthànhbàotử(Hình3.13).ThêmvàođóviệcquansátdướikínhhiểnviđiệntửSEM,bàotửđượcsinhrađơnlẻvàcóđườngkínhkhoảng0,5-1µm.Cácbàotửlà dạng nốt và mịn trên bề mặt và không di chuyển được (xem Hình 3.13) Cáchình tháibàotửđượccoilàmộttrongnhữngđặcđiểmquantrọngtrongviệcđịnhloàixạkhuẩn

Hình 3.13.Hình ảnh khuẩn lạc trên đĩa thạch và bào tử dưới kính hiển vi điện tử

quét(SEM)tươngứngcủa10chủngnghiêncứu

3.4.2 Nhângen16SrRNA

TừDNAgenomcủa10chủngnghiêncứu,sửdụngcặpmồi16SF,16SR,chúngtôitiếnhànhPCR nhânđoạngen16SrRNA, vớichutrìnhnhiệt:

12 17 97

5 99

7 0 34

0 0 0 0 1 4

33 100

97 100 34

100 90

Vớicặpmồiđượcthiếtkếdựatrêntrìnhtựbảothủcủagen16SrRNAxạkhuẩnvàkhuônlàDNAgenomthìtheolýthuyếtsảnphẩmPCRcóđộdàixấpxỉ1500bp(Hình3.14)

G019HALONGCATBAVN KP339505Micromonosporasp.S7- SC13ThailandKM456224Micromonosporasp.M SSRFM95IndiaG017HALONGCATBAVN KM456225Micromonosporasp.MSSRFM107IndiaG0

39 Ha LongCatBa VN EU214935Streptomycessp.CNQ- 153SD01USAJQ670764 Streptomyces sp

135001 ChinaHQ873939 Streptomyces sp

AML828 MexicoG065VANPHONGVN GU808333Streptomycessp.VITTK3IndiaA Y336514Nocardiopsissp.20039ChinaG05 7COTOTHANH LAN VN KM886195Nocardiopsissp.13-33- 8ChinaG120BAITU LONGVN

Hình3.15.Câyphátsinhloàidựatrêntrìnhtựgen16SrRNAcủacácchủngnghiêncứu

Câyphátsinhloàidựatrêntrìnhtựgen16SrRNAh o à n chỉnhchothấymốiquanhệ giữa các chủng

nghiên cứu với các thành viên đại diện của các chiMicromonosporasp.,Stretomycessp.,Nocardiopsissp

Nghiên cứu quan hệ của các chủng trên cây phátsinh loài (Hình 3.15) cho thấy: ChủngG017, G019,G043, G044, G047, G068, G120 cómối quan hệ gần gũi với các chủng

G065thuộcchiStretomycessp.,chủngG057thuộcchiNocardiopsissp.

Trong số các chủng thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ hoặc kháng lao, 5chủng(G019, G043, G057, G065 và G120) được lựa chọn sinh khối lượng lớn hơn (30 l)vàtiến hànhnghiêncứucáchợpchấtthứcấp.

3.5 Kếtquảsinhkhốilƣợnglớncácchủngcóhoạttínhcaonhất

Tiến hành thao tác như đã nêu ở phần phương pháp, đĩa cấy được nuôi ở tủấm28oC,sau7ngàykiểmtrađộthuầnkhiếtcủacáckhuẩnlạc.Khuẩn

lạccủa5chủngđượclựachọncómàusắc,bềmặt,hìnhdạngđặctrưng,khôngcócácmàusắcvàsắctốlạ.Tiếnhànhnhângiốngcấp1:Dùngquecấylấymộtsốkhuẩnlạcriêngrẽcấyvàobìnhtamgiác125mlchứa10mlmôitrườngA1.Nuôilắc(200vòng/phút)ở28oCtrong7ngày,sauđónhân giống cấp 2: Chuyển 10 ml dịch nuôi giống cấp

1 vào mỗi bình tam giác 1000 mlchứa 500 ml môi trường mới A1 (với tỉ lệ bổ sung giống 2%), chế

độ nuôi tương tự nhưnhângiốngcấp1(Hình3.16)

Hình3.16.Hìnhảnhhoạthoávànhângiốngcấp1củacácchủngnghiêncứu

Tiến hành lên men 30 lít cho mỗi chủng: Chuẩn bị 30 bình tam giác 2800 mlcóchứa sẵn 1000 ml môi trường A1+, khử trùng và để nguội Bổ sung mỗi bình 20mldịchnhân giống cấp 2 (với tỉ lệ bổ sung giống 2%) Sinh khối với các điều kiện trình bàyở(Bảng3.10), sau7-14ngàythuhồi sảnphẩm(Hình3.17)

Hình3.17.Hìnhảnhnhângiốngcấp2vàsinhkhối30lít/1chủng

Hợp chấtG019-1thu được dưới dạng chất rắn màu vàng Phổ khối phân giải

caoHRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ởm/z234,0761 [M+H]+(tính toán cho CTPTC12H11NO4làm/

tínhiệu của 2 nhóm metin vòng thơm dưới dạng singlet ở δH7,89 (1H, 8),2nhómmetylởδH2,45(3H,s,CH3-10)và2,48(3H,s,CH3-11)

s,H-5)và7,68(1H,s,H-Dựavàophổ13C-NMR,DEPTvàHSQCchophépxácđịnhhợpchấtG019-1có12 nguyên tử

cacbon trong đó có 2 nhóm metyl ở δC19,4 (CH3-10) và 20,0 (CH3-11),1nhómcacbonylởδC160,5(COOH)và9cacbonvòngthơmởδC125,8(C-8),128,6(C-5),129,8(C-4a),138,5(C-8a),144,8(C-7),146,3(C-2)và149,9(C-3).Độchuyểndịchhóa

họccủa4cacbonbậc4vềphíatrườngthấplàC-8a,C-2,C-3vàC-4chophépxácđịnh4cacbon này liên kết với dị

tố (nitơ hoặc oxy) Các cacbon này cũng tương đồng như carboxylicđượctáchchiếttừmộtsốloàihảimiên(JayatilakeGSetal.,1996;WangLetal.,2012)(xemBảng3.1)

hợpchất3,4-dihydroxy-quinolin-2-Bảng 3.1.DữliệuphổN M R củahợp chất(G019-1)(DMSO,

7c ho phépxá 6.TươngtácxagiữaprotoncủanhómCH3ởδH2,48(CH 3-11)

cđịnhnhómmetylnàygắnvớicacbonC-với C-6, C-7, C-8 cho phép xác định nhóm metyl này gắn cđịnhnhómmetylnàygắnvớicacbonC-với cacbon C-7 Ngoài ratươngtác giữa H5 với C-4 và C-8a cho phép xác định liên kết giữa C-4a với C-4, C-5 vàC-8a Kết

hợp các dữ kiện phổ MS, 1D- NMR và 2D- NMR cho phép xác định

chấtG019-1là3,4-dihydroxy-6,7-dimethyl-quinolin-2-carboxylic.Đâylàmộthợpchấtmới

CấutrúchóahọccủahợpchấtG019-1

Hợpchất2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol(G019-2)

ChấtG019-2thu được dưới dạng chất dầu không màu Phổ khối phân giải

caoHRESI-MS cho pic ion hóa giả phân tử ởm/z199,0946 [M+Na]+(theo tính toánlýthuyếtchoC TPTC8H16NaO4làm/z199,0941), chophépxá cđịnhcôngthứcphântửcủa là C8H16O4 Phổ13C- NMR và DEPT cho thấy phân tử có 8 nguyên tử cacbon, trongđó có 2nhóm metin lai hóa sp3ở δC71,2 (C-2); 75,5 (C-5), 5 nhóm metylen ở 69,2 (C-3),71,2(C-10),71,4(C-9),71.5(C-7)và75,7(C-6) và1 nhómmetyl ởδC17,7

Phổ1H- NMR xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm metyl ở δH1,10 (d,J= 6,5 Hz, 11)và12protonnằmtrongkhoảngδH3,35–3,63.Độchuyểndịchhóahọccủacác nhómmetin và metylen trên phổ1H- NMR và13C- NMR cho phép xác định tất cảcácnhómnàyđềugắnvớioxy (xemBảng3.2)

Phổ HMBC cho tương tác xa giữa các proton ở δH3,35 and 3,47 (CH2-6) với C-2

và tương tác giữa proton của nhóm CH2-3 ở 3,63 với C-5 cho phép xác định vòng dioxane Tương tác xa giữa nhóm metylv ớ i C - 5 v à C - 6 v à t ư ơ n g t á c g i ữ a

1,4-n h ó m metyle1,4-n CH2-9 với C-7, tươ1,4-ng tác giữa CH2-7 với C-3 cho phép xác đị1,4-nh 1,4-nhómmetylgắn ở vịtrí C-5 vànhómetylenglycolgắnvớiC-7quanguyêntửoxy

Hai proton của nhóm CH2-6 cho 1 tương tác lớn (J=10,0 Hz) và 2 tương tác

nhỏhơn (J= 5,0 và 6,0 Hz) Tương tác lớnJ=10,0 Hz được xác định là tương tác

germinalgiữa 2 proton của CH2-6 Hai tương tác nhỏ không đặc trưng cho tương

tácantihaygauche.Mặtkhác,docáctínhiệuchồnglấpnêncấuhìnhtươngđốicủaC-2vàC-5khôngxác

định được 1 cách rõ ràng Từ các dữ liệu phổ1H- NMR,13C- NMR, HSQC, HMBC,cho phép xác định chấtG019-2là

2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol Hợpchấtnàylầnđầutiênđượccôngbố

1ởδC131,3chophépxácđịnhcacbonnàygắnvớioxy.Sựxuấthiệncủanhómamideđược khẳng định bởi tươngtáctrên phổ HMBCgiữaprotons của CH2-2’ (δH3,32) vớicacboncarbonylởδC177,0(C-

4’).KếthợpcácdữliệuphổvàsosánhvớitàiliệuthamkhảochophépxácđịnhchấtG019-3làN-(4-hydroxyphenylethyl)propionamide

ChấtG019-4thuđượcdướidạngchấtrắnmàutrắng.PhổkhốiESI-MS(negative)xuất hiện pic ion phân

tử deproton hóa tạim/z178,1 [M-H]- Số liệu phổ NMR của 4tươngtựnhưphổcủachấtG019-3.Sosánhsựkhácnhaucủaphổgiữahaihợpchấtthấy xuất hiện một nhóm acetyl thay vì các nhóm propionyl Các dữ liệu phổ NMR củaG019-4phù hợp dữ liệu phổ của chấtN-(4-

cókhảnăngứcchếenzimaldosereductasevớigiátrịIC501,6×10-4M

Hợp chấtA d e n i n e (G019-5), hợp chất 2’-deoxyadenosine (G019-7) và hợpchấtAdenosine(G019-8)

Phổ khối ESI củaG019-5xuất hiện pic ion giả phân tử tạim/z136,1 [M+H]+.Trênphổ1H- NMR củaG019-5thấy xuất hiện tín hiệu của 2 proton vòng thơm tại δH8,13 (1H, s,H-8), 8,20 (1H, s, H-2).Phân tích số liệu phổ NMR và so sánh với tài

liệuthamkhảochophép xácđịnhchấtG019-5làadenine.

ChấtG019-7thu được dưới dạng chất rắn không màu Phổ ESI MS củaG019-7cho

pic ion phân tử proton hóa tạim/z252,1 [M+H]+ Phổ 1D- NMR (1H và13C) củaG019-7thấy xuất hiện tín hiệu của2 nửa 2-deoxy-arabionoside như trong cấu tạo củaG019-6 Tuy nhiên, trong vùng trường thơm, chấtG019-7còncó tín hiệu của các protonvà cacbon của adenine

[δC120,8 (C-5), δC141,5, δH8,20 (CH-8), δC149,9 (C-4), δC153,6 δH8,34 (CH-2) và δC157,5

(C-6)] Phân tích chi tiết các dữ liệu phổ MS, NMRcho

phépxácđịnhhợpchấtG019-7là2'-deoxyadenosine

ChấtG019-8thuđượcdướidạngchấtrắnmàutrắng.PhổESIMScủaG019-7chỉra pic ion giả phân tử

tạim/z268,1 [M+H]+ Phổ 1D NMR củaG019-8có tín hiệu gầngiống với những tín hiệu

củaG019-7, ngoại trừ sự có mặt của một oxymethine trongG019-8thayvìcácmethylene trongG019-7.Hơnnữa,protonH-1’xuất hiệndướidạng

một doublet trong phổH NMR củaG019-8 Trong khi đó, proton này xuất hiện dướidạng

double doublet trong phổ1H NMR củaG019-7 Điều này cho phép giả thiết 8làmộtadenosine.DữliệuphổNMRtrùngvớibáocáotrướcđấycủaadenosine.

chấtG019-Cấu trúchóahọccủaG019-5,G019-7vàG019-8

Hợp chất 2’-deoxythymidine 6), hợp chất2’-deoxyuridine

(G019-9)vàhợpchấtUridine (G019-10) PhổkhốiESIcủaG019-6xuấthiệnpiciongiảphântửtạim/z243.1[M+H]+.Trênphổ1H- NMR

củaG019-6thấy xuất hiện tín hiệu của một proton olefin tại δH7,83 (s, H-6), một nhóm

methyl tạiδH1,90 (s, CH3-7) và một dải proton aliphatic ởδH2,27 (2H,

liệu phổ NMR và so sánh với tài liệuthamkhảochophépxácđịnhchấtG019-6là2’-deoxythymidine.

Cấu trúchóahọccủaG019-6,G019-9vàG019-10 3.7 Táchc h i ế t v à x á c đ ị n h c ấ u t r ú c c á c h ợ p c h ấ t t h ứ c ấ p t ừ c h ủ n g x ạ k h

OH

2'

1'3' 3

NH

2

NH 2 67

O 2' 1'

3

N

67

C-NMR cho thấy sự có mặt của 10 nguyên tử cacbon trong đó có 1 nhóm metin laihóa sp3ởδC68,3 (C-2’), 1 nhóm metyl ở δC21,2 (CH3-3’), 2 nhóm cacbonyl ở 170,8(C-7); 174,7 (C-1’), 6 cacbon vòng thơm trong đó có 4 nhóm metin ở δC120,4 (C-3),132,4(C-4),123,2(C-5),128,8(C-6)và2cacbonbậc4

Phổ1H- NMR củaG057-1đo trong CD3OD thấy xuất hiện tín hiệu của 4

nhómmetin vòng thơm, 1 nhóm metin sp3và 1 nhóm metyl Giống như đo trong CD3OD,phổ1H- NMR củaG057-1đo trong DMSO-d 6 cho tín hiệu của 4 nhóm metin vòng thơm

Hz,H-4),7,11(1H,t,J=7,8 Hz,H-5),7,70 (1H,dd,J=1,5;7,8Hz,H-6),1nhómmetylvà1

nhóm metin dưới dạng A3X ở δH1,28 (3H, d,J= 7,0 Hz, CH3-3’), 4,09 (1H, q,J=7,0Hz, 2’), dựa vào độ chuyển dịch hóa học của proton H-2’ cho phép dự đoán protonnày gắnvới oxy Ngoài ra trên phổ1H- NMR còn có thêm tín hiệu của 4 proton(exchangeable)dưới dạng singlet ở δH11,88 (1H, s, NH), 8,13 (1H, br s, NH2-a), 7,05(1H,br s, NH2-b),6,05(1H,br.s, OH)x3mbảng3.3

H-Bảng 3.3.DữliệuphổN M R củaG057-1(1H:500 MHz,13C:125MHz,DMSO-d6).

6 với C-7 Trên phổ HMBC cho tương tác xa giữa nhóm metyl với cacbonyl C-1vàprotonoxymetin H-2’vớicacbonylC-1cho phép xácđịnh liênkếtgiữaC-3’/C2’/C-1’

Hợp chấtG057-2thu được dưới dạng chất rắn màu vàng Phổ khối phân giải

caoHRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ởm / z 233.1079 [M+H]+(tính toánchoCTPTC16H13N2làm/z233,1086),chophépxácđịnhcôngthứcphântửcủal à C16H12N2 Trênphổ1H- NMR cho tín hiệu của 4 nhóm metin vòng thơm thế ở dạng 1,2-disubstituted ở δH8,05

(d,J= 7,5 Hz, H-4/H-4’), 7.08 (t,J= 7,5 Hz, H-5/H-5’), 7,12 (t,J= 7,5 Hz, H-6/H-6’), 7,41 (d,J= 7,5 Hz, H-7/H-7’) và 1 proton dưới dạng singlet ở δH7,84xembảng3.4.

Trênphổ13C-NMR,DEPT cho thấy sựcó mặtc ủ a 8 n g u y ê n t ử

c a c b o n t r o n g đócó5nhómmetinvòng thơmvà3ca cbonbậc 4,dựavàođộ chuyểndị chhóahọccho phép xác định cacbon bậc 4 ở δCδC136,5 và nhóm metin ở 131,2 gắn với nitơ Từcác

dữ liệu phổ MS,1H- NMR,13C- NMR cho phép xác định hợp chấtG057-2có

cấutrúcđốixứngvàlà1hợpchấtb i s

-indole.TươngtácxatrênphổHMBCgiữaH-4/H-4’ với C-3/C-3’ (δC110.8) và H-2/H-2’ với C-3/C-3’ và C-7a/C-7a cho phép ghépnốicácm ả n h p h â n t ử c ủ a v ò n g b e n z e n v ớ i v ò n g p y r o l e ở v ị t r í C - 3 a / C -

3 ’ a v à C - 7 a / C - 7’a Kết hợp các dữ liệu phổ MS, 1D- NMR và 2D- NMR cho phép xác định chấtG057-2là

3,3’-bis-indole phụ lục 13 Đây là một hợp chất lần đầut á c h c h i ế t t ừ

c h ứ c h y d r o x y l v à k e t o n e ở max3412c m 1, 1669c m-1.Phổ khối phân giải

cao HRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa ởm/z189,0657[M+H]+(tính toán choCTPT C10H9N2O2làm/z189,0664),c h o p h é p x á c đ ị n h c ô n g thức phân tử của làC10H8N2O2tương ứng với 8 nối đôi tương đương Trên phổ1H-NMRchotínhiệucủa 4nhóm