Nghiên cứu phối hợp các chủng vi khuẩn lactic ưa ẩm để lên men pho mát

LỜI MỞ ĐẦU Pho-mát là một sản phẩm của ngành công nghiệp chế biến nghiệp sữa, là sản phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao với đầy đủ các axit amin không thay thế, vitamin A, B2

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Viện đại học Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong thời gian học tập tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS Nguyễn La Anh – Chủ nhiệm

bộ môn công nghệ sinh học vi sinh,Viện Công nghiệp Thực phẩm, người đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn em trong suất quá trình thực tập Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị, cán bộ, nghiên cứu viên trong phòng đã giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt quá trình nghiên cứu

Cuối cùng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc gia đình, người thân, và bạn bè đã động viên, khuyến khích đã em trong suất quá trình học tập và nghiên cứu

Xin chân thành cảm ơn !

Hà nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015

Nguyễn Mạnh Quỳnh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong chuyên đề này đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU viii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về pho mát 3

1.1.1 Pho mát 3

1.1.2.Vai trò c ủa vi khuẩn lactic trong sản xuất pho-mát 5

1.1.2.1.Vi khuẩn lactic 5

1.1.2.2 Quá trình chuyển hóa lactose 5

1.1.2.3 Quá trình chuyển hóa axit lactic 6

1.1.2.4 Quá trình chuyển hóa citrate 8

1.1.2.5 Quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo 10

1.1.2.6 Quá trình phân giải protein 12

1.2 Giống khởi động cho sản xuất pho-mát 15

1.3 Quy trình sản xuất pho-mát 18

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho-mát trên thế giới và Việt Nam 21

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Nguồn sữa, đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1.Ngu ồn sữa 23

2.1.2 Ch ủng giống 23

2.2 Hóa chất 23

2.3 Thiết bị 24

2.4 Môi trường 24

2.4.1 Môi tr ường MRS 24

2.5 Phương pháp nghiên cứu 25

2.5.1 Ph ương pháp vi sinh 25

2.5.2 Xác định mật độ tế bào 25

2.5.2.1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục 25

2.5.2.2 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp trang cấy 27

2.5.3 Ph ương pháp phân biệt chủng 27

2.5.4 Ph ương pháp xác định độ axit 28

2.5.5 Ph ương pháp cảm quan 29

2.5.6 Ph ương pháp định lượng exopolysaccharide(EPS) 30

2.5.7 Ph ương pháp xác định hàm lượng đường tổng số phenol - axit sunfuric 31

2.5.8 Ph ương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 31 2.5.9 Ph ương pháp sản xuất pho-mát tươi 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng 2 chủng VNC1, VNC53 34

3.2 Mối tương quan giữa mật độ tế bào và mật độ quang 35

3.3 Ảnh hưởng của mật độ giống tới thời gian đông tụ sữa 36

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng đông tụ sữa 38

3.5 Phối hợp các chủng ưa ấm trong lên men đông tụ sữa làm pho-mát 40

3.5.1 Xác định tỷ lệ chủng giống trong bộ chủng kết hợp 40

3.5.2 Cảm quan mẫu pho mát tươi làm từ sữa đông tụ của hỗn hợp chủng 41

3.5.3 Động học của hỗn hợp chủng VNC1/ VNC53 trên môi trường sữa 42

3.5.3.1 Đặc tính của pho mát làm từ hỗn hợp chủng 44

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45 4.2 Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Các loại pho mát 4

Bảng 2 Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho-mát Cheddar (ủ chín 6 tháng) 12

Bảng 3 Một số loại vi khuẩn lactic ưa ấm được bán thương mại bởi các nhà cung cấp giống khởi động trong lên men 15

Bảng 4 Sản lượng pho-mát thế giới giai đoạn 2000-2020 21

Bảng 5 Khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau của VNC1 và VNC53 27

Bảng 6 Phiếu đánh giá tiêu chí cảm quan của mẫu pho-mát 29

Bảng 7 Phối hợp tỷ lệ giống VNC1/VNC53 41

Bảng 8 Kết quả cảm quan các mẫu pho-mát tươi sử dụng bộ chủng kết hợp với các tỷ lệ giống khác nhau 41

Bảng 9: Đặc tính của sữa lên men bởi hỗn hợp chủng 44

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic 6

Hình 2 Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho-mát 7

Hình 3 Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit+ thuộc Lactococcus và Leuconostoc sp. 9

Hình 4 Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus 10

Hình 5 Các con đường chuyển hóa axit béo tự do 11

Hình 6 Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm sữa lên men 14

Hình 7 Một số chế phẩm giổng khởi động sử dụng chủng ưa ấm trong sản xuất pho-mát 17

Hình 8 Các bước chính trong sản xuất pho-mát 19

Hình 9 Thống kê tiêu thụ và giá trị các loại sản phẩm sữa năm 2013 22

Hình 10: Hình thái tế bào hai chủng ưa ấm VNC1 và VNC53 23

Hình 11 Đường cong sinh trưởng thể hiện mối quan hệ của thời gian và mật độ tế bào chủng VNC1và VNC53 34

Hình 12 Đường tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa OD và mật độ tế bào chủng VNC1và VNC53 35

Hình 13 Ảnh hưởng của mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNC1 37

Hình 14 Ảnh hưởng của mật độ tế bào tới thời gian đông tụ sữa chủng VNC53 37

Hình 15 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi của pH và sự đông tụ sữa bởi chủng NVC1 39

Hình 16 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi của pH và sự đông tụ sữa bởi chủng NVC53 40

Hình 17 Hình ảnh một số mẫu pho-mát tươi 42

Hình 18 Sự thay đổi mật độ tế bào của hỗn hợp chủng VNC1, VNC53 43

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

STT

Ký hiệu Chữ viết tắt

1 OD Optical Density (mật độ quang)

2 MRS Medium Resolusion Spectrograph

3 CFU Colony Forming Unit(mật độ tế bào)

9 TCA cycle Tricarboxylic acid cycle

10 FAA Free amino acid

LỜI MỞ ĐẦU

Pho-mát là một sản phẩm của ngành công nghiệp chế biến nghiệp sữa, là sản phẩm giàu dinh dưỡng, có hàm lượng protein cao với đầy đủ các axit amin không thay thế, vitamin A, B2, B12 và chất khoáng…Pho-mát là thực phẩm lý tưởng có khả năng kết hợp nhiều loại thức ăn giúp tăng hương vị, đem lại lợi ích về sức khỏe, và được các chuyên gia dinh dưỡng đánh giá cao

Trong công nghiệp sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa nói chung và pho-mát nói riêng, điều quan trọng là tạo ra sản phẩm có chất lượng cao và ổn định Giống khởi động là một trong các yếu tố quan trọng quyết định chất lượng của pho-mát Các sản phẩm giống khởi động đã được thương mại hóa thường là sự kết hợp của một, hai hoặc

một vài chủng vi khuẩn lactic thuộc các chi Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc Các vi khuẩn này góp phần tạo nên các đặc điểm đặc trưng về cấu trúc,

hương vị và chất lượng của pho-mát

Hiện nay, ở Việt Nam nghiên cứu về giống khởi động ứng dụng cho sản xuất pho-mát vẫn chưa được tiến hành nhiều, đã có một số báo cáo về tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có tiềm năng là giống khởi động cho sản xuất pho-mát Tuy nhiên, việc kết hợp các chủng ưa ấm nhằm tạo ra bộ chủng giống khởi động để lên men sữa trong sản xuất pho-mát và nghiên cứu quá trình lên men bởi các chủng này vẫn chưa được tiến hành ở điều kiện trong nước Ngoài ra, nhu cầu sản xuất pho-mát trong nước nhằm đa dạng hóa sản phẩm ngày càng tăng Mặt khác, các trang trại sữa có nhu cầu chế biến sữa thành các sản phẩm có giá trị gia tăng nhằm chủ động điều tiết nguồn

sữa tươi sản xuất ra Xuất phát từ những nhu cầu thực tế, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phối hợp các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm để lên men pho- mát”

Mục tiêu của đề tài: Xây dựng được bộ chủng giống khởi động gồm các chủng

ưa ấm ứng dụng cho sản xuất pho-mát

Nội dung nghiên cứu:

Khảo sát ảnh hưởng của mật độ, nhiệt độ tới khả năng đông tụ sữa của các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm

Phối hợp các chủng ưa ấm trong lên men đông tụ sữa

Nghiên cứu động học quá trình lên men và đánh giá chất lượng pho-mát tươi thu được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về pho mát

1.1.1 Pho mát

Pho mát là một thực phẩm lên men có nguồn gốc từ sữa của động vật có vú như sữa bò, cừu, lạc đà,dê …nhưng chủ yếu là từ sữa bò Hiện trên toàn thế giới có hơn 400 loại pho mát được sản xuất với đầy đủ màu sắc, hương vị, cấu trúc khác nhau Pho mát

là một thực phẩm bổ dưỡng, có hàm lượng dinh dưỡng cao: giàu protein, chất béo, các axit amin không thay thế, vitamin , canxi, phot pho, kẽm …[2,27,29]

Pho-mát là thực phẩm có nguồn gốc lâu đời, được phát hiện lần đầu tiên ở Trung

Á Nghề làm pho mát phát triển và được các khách du lịch châu Á đưa nghệ thuật làm pho mát sang châu Âu khoảng từ 8000 đến 3000 năm trước công nguyên Đặc biệt, trong xã hội đế chế La Mã cổ đại pho mát đã trở thành món ăn hết sức phổ biến, được các tu sĩ trong các tu viện ở châu Âu nghiên cứu và cải thiện chất lượng Năm 1620, pho mát được các khách du lịch châu Âu đem đến Mỹ Việc sản xuất và tiêu thụ pho mát tăng mạnh ở thị trường mới này Ngành công nghiêp buôn bán pho mát được sinh

ra và tăng trưởng ở nửa sau của những năm 1800 và kéo dài đến hiện tại [22,30]

Pho mát được làm bằng cách đông tụ sữa hoặc các nguyên liệu từ sữa như: sữa tách béo, sữa gầy , whey cream, cream, nhờ hoạt động của enzym rennet, pepsin , chymosin hoặc các tác nhân đông tụ thích hợp khác và làm tách một phần nước khỏi quện sữa đông

Pho mát được phân loại theo tên nước sản xuất, loại sữa sử dụng, loài động vật nuôi lấy sữa, hàm lượng chất béo, độ ẩm, cấu trúc, chín bằng nấm mốc hay không, quy trình công nghệ làm pho mát, độ ẩm trong thành phần chất rắn không phải chất béo Những tiêu chí này được sử dụng độc lập hoặc kết hợp với nhau Việc miêu tả này không thể hiện sự khác nhau về cơ sở lý thuyết tại sao pho mát này lại khác pho mát khác

Phân loại pho-mát dựa vào cấu trúc và công nghệ sản xuất:

- Pho-mát tươi đông tụ bởi axit, không bổ sung rennet hoặc nếu có thì với tỷ lệ rất bé Axit được tạo ra thường bằng vi khuẩn lactic Tuy nhiên có một số loại pho-mát tươi được axit hóa trực tiếp bởi gluconodelta - lactone Sản phẩm điển hình Cottage, Quark, Cream và pho-mát tươi Bắc Mỹ

- Pho-mát tươi đông tụ bởi rennet là chính, không bổ sung vi khuẩn lactic hoặc nếu có thì rất ít Son phẩm điển hình là Quesco, Balnco, Quesco Fresco, Halloumi, pho-mát tươi từ Ý

- Pho-mát đông tụ bởi axit ở nhiệt độ cao Sản phẩm có độ ẩm cao nhưng chắc Sản phẩm điển hình như Ricotta (Ý), Channa và Paneer (Ấn Độ), pho-mát trắng Mỹ Latin

- Pho-mát mềm ủ chín: vi khuẩn lactic được cấy vào để lên men lactic (có kéodài hơn) trước khâu được đông tụ bởi rennet Sản phẩm điển hình Fetta, Camembert, Brie, Blue

- Pho-mát bán cứng có qua giai đoạn rửa hạt pho-mát sau đông tụ: Sản phẩm điển hình Gouda, Edam, Colby

- Pho-mát cứng nhiệt độ thấp, không qua giai đoạn rửa hạt pho-mát sau đông tụ Sản phẩm điển hình Cheddar, Pasta Filata

- Pho-mát cứng nhiệt độ cao, quá trình tách nước hỗ trợ bằng nhiệt độ cao Sản phẩm điển hình Romano, Swiss, Parmersan

Ngoài ra, trên thị trường có loại pho-mát chế biến: tức là pho-mát được bổ sung thêm sữa bột, các sản phẩm từ casein, hương, màu, chất bảo quản, chất ổn định, đóng thành bánh, hoặc đóng khuôn ở dạng tấm mỏng, có bọc sẵn màng film để tiện dùng hoặc được sử dụng như đồ ăn sẵn

Nội dung nghiên cứu của khóa luận đề cập đến là pho-mát tươi đông tụ bởi axit

lactic sinh ra trong quá trình lên men bởi vi khuẩn lactic

1.1.2.Vai trò của vi khuẩn lactic trong sản xuất pho-mát

1.1.2.1.Vi khu ẩn lactic

Vi khuẩn lactic dùng để chỉ một nhóm lớn các vi khuẩn có lợi, có khả năng chuyển hóa đường hexose thành axit lactic, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men [27,28] Vi khuẩn lactic đã được sử dụng rộng rãi trong các quá trình lên men thực phẩm trên toàn thế giới Vi khuẩn lactic không chỉ đóng góp vào sự phát triển các đặc tính mong muốn của sản phẩm mà còn tăng cường tính an toàn của sản phẩm, kéo dài thời gian sử dụng thông qua các quá trình chuyển hóa Trong sản xuất pho-mát, các vi khuẩn lactic có thể chủ động bổ sung vào sữa hoặc đã có mặt trong sữa tươi, chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh hóa, vi khuẩn lactic đã tạo lập nên các đặc tính cảm quan như: cấu trúc, hương thơm và vị cho pho-mát Quá trình sinh hóa cơ bản xảy ra trong sản xuất pho-mát có: quá trình chuyển hóa lactose, quá trình chuyển hóa axit lactic, quá trình chuyển hóa citrate, quá trình phân giải lipit và chuyển hóa axit béo, quá trình phân giải protein

1.1.2.2 Quá trình chuy ển hóa lactose

Lên men lactose thành L – axit lactic là chức năng cơ bản của chủng giống khởi động trong sản xuất pho-mát Sự axit hóa này không chỉ tới ảnh hưởng đến cấu trúc ban đầu của quện sữa mà còn ảnh hưởng tới chất lượng pho-mát do pH quyết định khả năng hòa tan của casein [15] Ngoài ra, pH còn gián tiếp tác động tới việc tổng hợp chất thơm: tạo ra hệ đệm quy định sự sinh trưởng của vi sinh vật và khả năng hoạt động của các enzym trong quá trình ủ chín

Hình 1 Các con đường lên men hexose (glucose) chính ở vi khuẩn lactic [12]

Trong sản xuất, việc vi khuẩn axit lactic vận chuyển lactose vào tế bào thông qua

hệ thống phosphotransferase, phosphoenolpyruvate sử dụng một permease dùng triệt

để nguồn lactose có trong sữa là điều rất cần thiết để tránh sự phát triển quá mức của

hệ vi sinh vật không mong muốn khác cũng như tăng năng suất của quá trình lên men

Vì thế người ta thường sử dụng một hoặc kết hợp nhiều hơn một chủng có khả năng sử dụng lactose, có khả năng tương tác với nhau tạo ra tính đặc trưng cho sản phẩm[6]

1.1.2.3 Quá trình chuy ển hóa axit lactic

Lactate cũng là một chất tạo hương vị đặc trưngpho mát Ở một số pho mát Thụy

Sĩ, lactate là nguồn cơ chất chính cho vi khuẩn propionic Propionibacterium sp sinh

trưởng Chúng chuyển hóa lactate thành axit propionic (cũng là hợp chất thơm) và CO2 – tạo ra cấu trúc mắt của pho-mát [16] Ngoài ra, lactate có thể bị oxy hóa theo các con đường khác nhau, tổng hợp nên các hợp chất thơm khác như acetate, ethanol, formate ở giai đoạn ủ chín Tuy nhiên, mức độ oxy hóa này phụ thuộc vào hệ vi sinh vật và sự có

mặt của oxy trong từng loại pho-mát trong quá trình sản xuất Một số chủng lactobacili

và pediococci phân lập từ pho-mát Cheddar có khả năng oxy hóa lactate thành acetate và

CO2 trong điều kiện hiếu khí ở phòng thí nghiệm và hệ thống oxy hóa này được cho là cũng xảy ra dưới những điều kiện ủ chín của pho-mát Cheddar Khi có mặt của oxy, một

vài chủng pediococci có thể oxy hóa lactate thành formate và acetate Sự có sẵn oxy không chỉ phụ thuộc vào kích thước khối pho-mát mà còn do tính thấm oxy của vật liệu bao gói quy định Ở các loại pho-mát có màng bọc, quá trình oxy hóa lactate xảy ra rất hạn chế do lượng oxy sẵn có thấp [15,18]

Hình 2 Các con đường chuyển hóa lactate trong giai đoạn ủ chín pho-mát [15]

1) S ự raxemic hóa; 2) Chuyển hóa bởi Propionibacterium freudenreichii ở pho-mát Thụy Sĩ;

3) Quá trình oxi hóa lactate; 4) Chuy ển hóa thành formate, ethanol và acetate; 5) Chuyển hóa

k ị khí lactate thành butyrate và H 2

Ở một số loại pho-mát rắn, quá trình đường phân có thể tạo ra một số sản phẩm

không mong muốn trong giai đoạn ủ chín Dưới điều kiện kị khí, Clostridium tyrobutyricum chuyển hóa lactate thành butyrate và khí H2 Quá trình này không chỉ tạo

ra khí H2 gây hiện tượng vỡ pho-mát mà còn liên quan đến sự phát triển của các hợp chất không có hương vị [15] Để tránh hiện tượng này, một số kỹ thuật làm giảm số lượng bào tử trong sữa được sử dụng như: vệ sinh sạch sẽ, ngăn cản sự nảy mầm của bào tử bằng việc bổ sung lysozyme hay bổ sung thêm nitrate (NO3-) hoặc loại bỏ cơ học các bào từ bằng vi lọc [18]

1.1.2.4 Quá trình chuy ển hóa citrate

Hàm lượng citrate trong sữa tươi khoảng 8 mmol/ lít sữa, nhưng 94% trong số này bị mất trong quá trình sản xuất pho-mát do hòa tan vào huyết tương sữa [16] Tuy nhiên, một lượng ít citrate còn lại trong curd (10mmol/kg quện sữa) lại đóng vai trò quan trọng trong quá trình thành các hợp chất thơm bay hơi Một số loài có khả năng chuyển hóa citrate (Cit+) như Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis (trước đây gọi là Streptococcus diacetylactis) và Leuconostoc spp (như Leuconostoc mesenteriodes subsp cremoris và Ln lactis) [12,13,16] Các loài này có gen mã hóa

cho protein vận chuyển citrate ngoại bào vào tế bào chất nằm trên plasmid

Các chủng Cit+ không sử dụng citrate như là nguồn năng lượng nhưng chúng nhanh chóng chuyển hóa citrate khi có mặt của lactose và một số loại đường khác theo các con đường như hình 3 Sản phẩm của quá trình chuyển hóa là CO2, diacetyl, acetate, acetoin và có thể có 2,3 – butanediol CO2 đóng vai trò chính trong việc tạo nên cấu trúc “mắt” của một số pho-mát Hà Lan Diacetyl là một hợp chất thơm quan trọng của pho-mát, nhưng các phản ứng dẫn đến sự tổng hợp diacetyl thì chưa được nghiên cứu sâu Diacetyl có thể được tổng hợp trực tiếp từ acetaldehyde – thiamine pyrophosphate (Acetaldehyde TPP) và acetyl – CoA nhưng enzym diacetyl synthase chưa được nhận dạng một cách rõ ràng ở LAB hoặc có thể được tổng hợp từ quá trình oxy hóa α – acetolactate [17] Diacetyl thường được tổng hợp với một lượng rất nhỏ (<0,11 mmol) trong khi đó lượng acetoin sinh ra cao hơn 10 – 50 lần [18]

Một số loài Lactobacillus có khả năng sử dụng citrate để tổng hợp succinate (hình

3) Succinate là một axit hữu cơ, có vị cay mặn, là một trong 15 hợp chất cần thiết tạo nên hương vị của pho-mát Ở pho mát Emmental, hàm lượng succinate được công bố là

0,8 – 1,4 g/kg [9] Ở pho-mát Cheddar, một số loài Lactobacillus tổng hợp succinate

thông qua chu trình tricacboxilic acid dạng rút gọn (chu trình TCA) [12] Ở pho-mát Thụy Sĩ, succinate được các vi khuẩn propionic tổng hợp từ quá trình dị hóa axit aspartic Các chủng này không phải đóng vai trò là chủng khởi động

Hình 3 Các con đường chuyển hóa citrate của các chủng Cit+ thuộc Lactococcus và

Leuconostoc sp. [15,18]

Hình 4 Con đường tiềm năng tổng hợp succinate của các chủng Lactobacillus [9]

Các enzym tham gia: 1 – lactate dehydrogenase; 2 – pyruvate casrboxylase; 3 –malate dehydrogenase; 4 – fumarase; 5 – fumarate reductase; 6 – citrate lyase; 7 – aspartate aminotransferase; 8 – aspartase; 9 – aconitase; 10 – isocitrate lyase

1.1.2.5 Quá trình phân gi ải lipit và chuyển hóa axit béo

Chất béo sữa có vai trò quan trọng để tạo nên những hợp chất hương thuần túy của pho-mát Những nghiên cứu ở pho-mát Cheddar cho thấy pho-mát được sản xuất từ sữa đã thay chất béo bằng nguồn lipit khác đã không tạo ra hương thơm chính xác Trên thực tế, việc phát triển hương vị hài hòa là khó khăn chính khi sản xuất loại pho-mát ít hoặc tách chất béo [10]

Quá trình phân giải lipit diễn ra chủ yếu trong giai đoạn ủ chín pho-mát Lipase tồn tại trong pho-mát do nhiều nguồn khác nhau Bản thân sữa tươi cũng chứa enzym lipoprotein lipase, tuy nhiên hoạt tính của enzym bị mất ở sữa đã thanh trùng Một số pho-mát Ý như Provolone, Pecorino trong quá trình sản xuất người ta bổ sung hỗn hợp lipase, esterase cùng với enzym rennet Hệ enzym lipase/esterase của chủng khởi động

ít được quan tâm hơn hệ enzym phân giải protein Các loài Lactococcus có hoạt tính

phân giải lipit yếu nhưng có thể đã giải phóng một lượng lớn axit béo tự do khi mật độ

tế bào ở mức cao sau giai đoạn đông tụ sữa Các lipase/esterase của Lactococcus thường là enzym nội bào Các loài Lactobacillus lên men lactic đồng hình bắt buộc như: Lactobacillus helveticus, Lb delbrueckii subsp bulgaricus và Lb delbrueckii subsp lactis cũng tổng hợp esterase [16] Các loài Lactobacillus lên men lactic dị hình tùy nghi như Lb casei, Lb paracasei và Lb plantarum chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật

không đóng vai trò là chủng khởi động (Nonstarter lactic acid bacteria – NSLAB) cũng

có hoạt tính phân giải lipit yếu

Hình 5 Các con đường chuyển hóa axit béo tự do [18]

Quá trình phân giải triglyceride tạo ra các axit béo, glycerol, mono – hoặc diglyceride Chất béo trong sữa của các động vật nhai lại chứa lượng lớn các chuỗi axit béo ngắn và trung bình, khi bị thủy phân chúng đóng góp đáng kể vào việc tạo hương của nhiều loại pho-mát Các axit béo tự do có thể phản ứng với ethanol hoặc các nhóm chứa gốc lưu huỳnh tạo ra các ester hoặc thioester (hình 5) Có tới 14 loại ester khác nhau được tìm thấy trong pho-mát Emmental, và ester cũng được cho là góp phần vào hương thơm ở pho-mát Parmigiano – Reggiano Các ester phổ biến nhất trong số 38

ester được tìm thấy trong pho-mát Parmigiano – Reggiano bao gồm: ethyl butanoate, ethyl hexanoate, ethyl acetate, ethyl octanoate, ethyl decanoate và methyl hexanoate [12,16]

1.1.2.6 Quá trình phân gi ải protein

Phân giải protein là quá trình phức tạp nhất và có thể là quan trọng nhất trong số các sự kiện sinh hóa diễn ra ở giai đoạn ủ chín pho-mát Quá trình này ảnh hưởng đến sự hình thành hương vị của pho-mát theo nhiều hướng khác nhau Một vài chuỗi peptit ngắn, axit amin tạo hương vị và có thể là cả vị không mong muốn (như vị đắng) cho pho-mát (bảng 2) Sự phân giải casein làm thay đổi cấu trúc pho-mát (làm mềm) tạo điều kiện để giải phóng các hợp chất có vị trong khi nhai Ngoài ra, quá trình này còn là nguồn cung cấp cơ chất (axit amin) cho một loạt các quá trình dị hóa diễn ra sau đó như:

sự khử amin, khử cacboxyl, chuyển amin, khử lưu huỳnh [18]

Bảng 2 Mô tả vị và ngưỡng giá trị của vị của một số axit amin của pho-mát Cheddar (ủ chín 6

Nồng độ trong Cheddar (µg/g) Cảm nhận

Vị Ngọt Mặn Chua Đắng Umami

Các enzym xúc tác cho quá trình phân giải có thể bắt nguồn từ nhiều nguồn khác nhau: từ tác nhân đông tụ (chymosin, pepsin hay các proteinase có nguồn gốc từ thực vật hoặc nấm); từ sữa (plasmin, cathepsin D); các chủng khởi động và các chủng tự nhiên có trong sữa; các chủng khởi động thứ cấp gặp ở một số loại pho-mát rắn:

Propionibacterium freudenreichii ở pho-mát Thụy Sĩ, P camemberti ở pho-mát

Camembert và Brie, P roqueforti ở pho-mát Blue [15] Ngoài ra, các peptidase hoặc

proteinase cũng có thể được bổ sung vào quện sữa để đẩy nhanh quá trình chín [10]

Ở hầu hết các loại pho-mát, quá trình thủy phân casein ban đầu diễn ra chủ yếu nhờ hoạt động của enzym đông tụ và một mức độ ít hơn của các plasmin, tạo ra các peptit chuỗi dài và trung bình Các oligopeptit này được hấp thụ vào tế bào nhờ kênh vận chuyển oligopeptit, di -/tri – peptit [12] Trong tế bào chất, các peptit bị phân giải nhờ một loạt các enzym nội bào Các peptidase của LAB được chia thành các endopeptidase, aminopeptidase, di -/tri – peptidase [8] Sản phẩm cuối cùng của quá trình phân giải protein là các axit amin tự do (FAA) Nồng độ FAA phụ thuộc vào từng loại pho-mát và được dùng như là một chỉ số của sự chín [10] Nồng độ của FAA trong pho-mát ở bất kì giai đoạn của quá trình chín là kết quả của sự giải phóng các axit amin

từ casein và sự chuyển hóa các axit amin thành các sản phẩm khác qua quá trình dị hóa Các axit amin chính ở pho-mát Cheddar là glutamate, leucine, arginine, lysine, phenylalanine và serine [23] Nồng độ của các axit amin thường là tăng lên trong quá trình chín, ngoại trừ arginine [20]

Mặc dù một số peptit, axit amin có hương vị đặc trưng như vị đắng, ngọt, malt nhưng nhìn chung chúng chỉ tạo nên hương vị cơ bản của pho-mát Việc tác động nhằm làm tăng quá mức hoạt tính của một vài enzym phân giải protein, cũng như việc thêm các axit amin vào pho-mát hầu như không ảnh hưởng tích cực đến hương vị của sản phẩm Sự phân giải protein một cách không cân đối có thể dẫn tới sự dư thừa các peptit có vị đắng và do đó, làm giảm hương vị vốn có của pho-mát [24]

Hình 6 Khái quát các con đường chuyển hóa protein tạo hương ở các sản phẩm sữa lên men

[23]

Trong tế bào, hầu hết axit amin bị chuyển hóa thành α – keto axit nhờ enzym aminotransferase Axit α – Keto là chất trung gian, có thể bị chuyển hóa thành axit hydoroxy, aldehyde hay CoA – ester Các phản ứng này hầu hết diễn ra nhờ enzym, nhưng cũng có thể xảy ra sự chuyển đổi hóa học như sự hình thành benzaldehyde từ axit phenypyruvic [21] Các aldehyde có thể bị khử hydro hoặc hydro hóa để tạo thành các chất tương ứng là alcohol và axit hữu cơ Các hợp chất này là cơ chất cho các enzym esterase và acyltransferase hoạt động, tạo ra các (thio) – ester Một trong những vai trò sinh học của sự phân giải axit amin là tổng hợp nên các tiền chất, chẳng hạn như cần thiết cho sự tổng hợp sterol và các chuỗi axit béo có nhánh

Ngoại bào

Nội bào

Axit amin

Axit amin

Con đường chuyển hóa axit amin quan trọng khác, được bắt đầu bởi enzym lyase như: cystathionine β – lyase có khả năng xúc tác chuyển hóa methionine thành methanethiol [15]; threonine aldolase, thuộc lớp enzym lyase khác, có thể chuyển hóa trực tiếp threonine thành acetaldehyde [14]

1.2 Giống khởi động cho sản xuất pho-mát

Các sản phẩm pho-mát sớm nhất dựa trên quá trình lên men tự nhiên bởi sự phát triển của hệ vi sinh vật có sẵn trong sữa, bao gồm cả những vi khuẩn lactic và những vi sinh vật không sinh axit lactic Hệ vi sinh vật trong sữa thường rất đa dạng, mặc dù đôi khi mang lại những đặc tính cảm quan tốt hơn, nhưng lại không đảm bảo sự ổn định và đồng nhất của sản phẩm Do đó, trong công nghiệp thường sử dụng giống khởi động xác định để sản xuất pho-mát Nhiệm vụ chính của giống khởi động vi sinh vật là: kiểm soát và tăng tốc độ quá trình lên men, cải thiện chất lượng dinh dưỡng và các đặc tính cấu trúc, cảm quan, bảo quản sản phẩm về mặt sinh học và kéo dài thời gian sử dụng Trong công nghiệp sản xuất pho-mát, các chủng lactic ưa ấm thường được sử dụng nhiều hơn cả Người ta ước tính rằng hai phần ba quá trình lên men sữa là sử dụng các chủng ưa ấm Trong ngành công nghiệp sữa liên quan tới quá trình lên men, thì các chủng nào càng lên men nhanh thì càng tốt Đây dường như là một đặc tính ưu

thế của các loài Lactococcus Các loài khác cũng làm giảm độ pH của sữa nhưng với

tốc độ chậm hơn nhiều [7] Tuy nhiên, nhiều loại pho-mát rắn cũng được sản xuất nhờ giống khởi động là các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt: pho-mát Thụy Sĩ, Emmental, Provolone…

Bảng 3 Một số loại vi khuẩn lactic ưa ấm được bán thương mại bởi các nhà cung cấp giống

khởi động trong lên men[25]

Dairy Supply

Lactococcus lactis ssp cremoris

Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis

Lactococcus lactis ssp lactis

Nhóm LAB ưa ấm thường lên men thích hợp nhất ở khoảng 300C, mặc dù có dải nhiệt độ sinh trưởng từ 20 - 400C Trong sản xuất pho-mát, giống khởi động LAB ưa

ấm bao gồm các chủng thuộc hai chi, Lactococcus và Leuconostoc Trong đó,

Lactococcus lactis ssp lactis, Lactococcus lactis ssp cremoris đóng vai trò chính là sinh axit, các loài Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc lactis , Leuconostoc cremoris tạo hương thơm cho pho-mát [5]

Các giống khởi động ưa ấm có thể được phân loại thành 4 nhóm sau, dựa trên khả tổng hợp các chất tạo hương cho sản phẩm:

- Loại O: Gồm những chủng khởi động không tạo hương: Lactococcus lactis ssp lactis và Lactococcus lactis ssp cremoris

- Loại D: Gồm các chủng có khả năng lên men citrate – đóng vai trò tạo hương:

Lactococcus lactis ssp lactis biovar diacetylactis

- Loại B (hoặc L): Chỉ gồm các chủng Leuconostoc có khả năng lên men citrate

để tạo hương

- Loại BD (hoặc LD): Gồm cả các chủng có khả năng tạo chất thơm như Lc lactis ssp lactis biovar diacetylactis và các chủng thuộc chi Leuconostoc

Sản xuất pho-mát có thể là nhờ chủng ưa ấm đơn lẻ hoặc kết hợp các chủng với nhau Trong hỗn hợp giống khởi động thì các chủng sinh axit thường chiếm ưu thế 90 – 99%, còn các chủng tham gia tạo hương chỉ chiếm 1 – 10% [4]

Một số chế phẩm giống khởi động ưa ấm trên thị trường như: Flora Danica có sự

kết hợp của 4 chủng ưa ấm Lactococcus lactis subsp lactis; Lactococcus lactis subsp cremoris; Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis; Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris MA 11 gồm 2 chủng Lactococcus lactis subsp lactis; Lactococcus lactis subsp cremoris; MD 89 chỉ sử dụng duy nhất chủng Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis Tuy nhiên, nhiều hãng cung cấp giống khởi

động thường chỉ có từ 1 đến 2 chủng ưa ấm loại O như hãng New England, Hansen, Daniso

Hình 7 Một số chế phẩm giổng khởi động sử dụng chủng ưa ấm trong sản xuất pho-mát

1.3 Quy trình sản xuất pho-mát

Sản xuất pho mát là quá trình loại nước khỏi quyện sữa đông, quá trình bắt đầu bằng lên men vi sinh vật và đông tụ protein sữa nhờ enzym rennet (bao gồm phức hợp các enzymes pepsin, chymosin, lipase) hay các tác nhân đông tụ khác Quy trình sản xuất pho mát gồm các bước: nhận sữa, làm sạch, tiêu chuẩn hóa, thanh trùng, làm nguội, lên men, cắt quyện sữa, tách nước, ép thành bánh, xử lý muối, ngâm chín, bao gói, bảo quản Ở mỗi quốc gia, mỗi hãng sản xuất pho mát, quy trình công nghệ được thay đổi nhằm tạo ra sản phẩm đặc trưng

Các bước của quy trình sản xuất pho-mát như sau:

+ Nhận sữa, xử lý sơ cấp sữa: Sữa sau khi được vắt từ con vật khỏe mạnh, đem bảo quản ngay ở 4-6ºC, Sau đó vận chuyển đến cơ sở sản xuất, sữa phải sạch, có mùi đặc trưng, khuấy đều đem đi phân tích các chỉ tiêu lý học, hóa học, sinh học Sữa lạnh

có độ nhớt cao, trước khi lọc sữa được đưa về 30 – 40ºC, được lọc bằng máy lọc khung bản hay thiết bị chuyên dùng – máy làm sạch sữa có lực ly tâm lớn tách được sữa sạch

và cặn bẩn

+ Tiêu chuẩn hóa: Pho-mát có thể làm từ sữa bò hoặc kết hợp của nhiều loại sữa, sữa đã tách béo, tách một phần chất béo Trước khi đưa vào sản xuất sữa được tiêu chuẩn hóa nhằm đảm bảo nguồn nguyên liệu sữa ổn định, đồng nhất để tạo ra sản phẩm pho-mát có chất lượng ổn định

+ Đồng hóa: Đồng hóa nhằm làm giảm kích thước của các cầu béo, làm chúng phân bố đều trong sữa, ta tiến hành đồng hóa hỗn hợp dưới tác dụng của áp lực cao khoảng 200-250 bar, ở nhiệt độ 65-70ºC, làm phá tan liên kết giữa những hạt chất béo, tránh hiện tượng tạo màng, phân lớp

Hình 8 Các bước chính trong sản xuất pho-mát[22]

Axít hóa và đông tụ

Nhận sữa nguyên liệu, xử lý nhiệt,

tiêu chuẩn hóa

Cắt quyện sữa

Axít làm đông tụ sữa

tươi Sữa nguyên liệu được xử lý sơ cấp

Phân phối, tiêu thụ

Ủ chín Bao gói

+ Thanh trùng: Thanh trùng nhằm tiêu diệt các vi sinh vật và vô hoạt một phần

enzyme có mặt trong sữa, chế độ thanh trùng phổ biến 72 – 76oC, trong 15 – 20 giây

Tuy nhiên, thanh trùng cũng làm giảm hàm lượng canxi trong sữa do đó làm giảm khả

năng đông tụ sữa bằng enzym Để khắc phục nhược điểm này, nhà sản xuất thường bổ

sung thêm muối calcium chloride Một số loại pho-mát được làm từ sữa tươi chưa qua

thanh trùng

+ Làm nguội, lên men: Sữa sau thanh trùng được đưa về nhiệt độ lên men, ở giai

đoạn này nhà sản xuất thường bổ sung thêm muối calcium chloride và các chất khác

tùy theo bí mật công nghệ của mỗi hãng Sau đó bổ sung một lượng giống thích hợp

vào môi trường sữa

+ Đông tụ sữa: Casin sữa có thể đông tụ nhờ axit đông tụ, enzym hoặc giống khởi

động Ở một số loại pho-mát, quá trình này diễn ra nhờ sự kết hợp cả các tác nhân Giống

khởi động trong sản xuất pho-mát là các vi khuẩn lactic ưa ấm, ưa nhiệt có thể là một hoặc

kết hợp nhiều chủng: (LL) Lactococcus lactis subsp lactis, (LLC) Lactococcus lactis

subsp cremoris, (LLD) Lactococcus lactis subsp diacetylactis biovar… với các

pho-mát sử dụng sữa chưa thanh trùng thì hệ vi sinh vật sẵn có trong sữa được xem như là

chủng giống khởi động

+ Cắt quyện sữa và tách nước: cắt sữa đông tụ thành các miếng nhỏ với kích thước

khác nhau tùy loại pho-mát, đảo trộn nhẹ nhàng và gia nhiệt từ 38-58ºC, tốc độ gia nhiệt 0,3-0,6ºC/phút trong thời gian 20-60 phút, tăng nhanh quá trình tách whey Pho-mát được

lọc qua vải lọc hoặc thiết bị lọc chuyên dụng tách whey và quện sữa

+ Ép tạo hình và muối: sau khi tách nước, quện sữa có thể được xay nhỏ, bổ sung

thêm muối và ép, có thể tạo khuôn hoặc được ép thành khuôn trước, sau đó bổ sung muối

bằng cách ngâm trong bể muối từ 1 -2 ngày Kết thúc quá trình này, thu được pho-mát tươi

và sử dụng được

+ Ủ chín: đây là quá trình phức tạp tạo cảm quan về cấu trúc, màu sắc, hương vị Nhiệt độ ủ chín thường 4 – 12oC, thời gian ủ chín có thể từ 30 ngày đến vài năm tùy loại pho-mát Pho-mát tươi có thời gian sử sụng ngắn (1 – 2 tuần)

+ Bao gói và bảo quản: pho-mát chủ yếu được bao gói bởi các lớp polyetylen hoặc tráng trực tiếp lên bề mặt ngoài của pho-mát nhằm hạn chế trao đổi khí và phân bố độ ẩm , bảo quản ở -5ºC

1.4 Tình hình sản xuất và tiêu thụ pho-mát trên thế giới và Việt Nam

Sản lượng pho-mát trên thế giới liên tục tăng từ giai đoạn 1980 (8,7 triệu tấn) –

2011 (20 triệu tấn ) và có xu hướng tăng trưởng ổn định đến năm 2020 Pho-mát được chế biến từ sữa bò chiếm hơn 80% sản lượng pho-mát trên toàn thế giới, 20% còn lại pho-mát được chế biến từ các nguồn sữa khác như: cừu, dê, lạc đà….Trong đó, châu

Âu và bắc Mỹ sản xuất hơn 75% pho-mát của toàn thế giới Tình hình tiêu thụ pho-mát cũng khác nhau rõ rệt giữa các nước và theo khu vực, chủ yếu tập trung ở các nước đang phát triển sản lượng tiêu thụ pho-mát tăng trưởng với tốc độ chậm hơn [26]

Bảng 4 Sản lượng pho-mát thế giới giai đoạn 2000-2020[26]