Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp glucosamine của nấm men moniliella sp

Bảng 2: Hàm lượng glucosamine trong dịch lên men Bảng 3: So sánh dịch tế bào và khuẩn lạc các chủng quan sát ảng 4: Hoạt tính ph n giải các hợp chất h u cơ Bảng 5: Ảnh hưởng của pH đ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và động viên tư thầy cô, bạn bè

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Ths

Vũ Kim Thoa – khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, vạch ra phương hướng, phương pháp, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội, những người đã trang bị cho tôi những hành trang quý báu là kiến thức căn bản và chuyên sâu trong suốt thời gian học tập tại khoa

Cuối cùng tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã khích lệ, động viên và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong học tập

và nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn

Hà nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên PHẠM THỊ THÙY

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH Danh mục hình

Hình 1: Cấu trúc không gian của glucosamine

Hình 12: Vòng phân giải tinh bột

Hình 13: Vòng phân giải protein

Hình 14: Vòng phân giải lipid

Hình 15: Hàm lƣợng polyol trong dịch lên men theo thời gian

Danh mục bảng

Bảng 1 So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác

Bảng 2: Hàm lượng glucosamine trong dịch lên men

Bảng 3: So sánh dịch tế bào và khuẩn lạc các chủng quan sát

ảng 4: Hoạt tính ph n giải các hợp chất h u cơ

Bảng 5: Ảnh hưởng của pH đến khả năng lên men glucosamine

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 6

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1 GLUCOSAMINE 8

1.1.1 Cấu tạo và tính chất của Glucosamine 8

1.1.2 Cấu tạo hóa học và tính chất một số muối của glucosamine 10

1.1.3 Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó 11

1.1.4 Tình hình sản xuất glucosamine hiện nay 16

1.1.5 Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 16

1.2 NẤM MEN ĐEN MONILIELLA 17

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21

2.1.1 Chủng vi sinh vật 21

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 21

2.1.3 Thành phần môi trường 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Phương pháp vi sinh 23

2.2.2 Phương pháp kiểm tra hoạt tính vi sinh của chủng vi sinh vật nghiên cứu 24

2.2.3 Phương pháp sắc ký trao đổi ion 25

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 KẾT QUẢ SÀNG LỌC CHỦNG NẤM MEN MONILIELLA.SP CÓ KHẢ NĂNG SINH GLUCOSAMINE 27

3.2 QUAN SÁT HÌNH THÁI KHUẨN LẠC, TẾ BÀO CHỦNG NẤM MEN TUYỂN CHỌN 29

3.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA 33

3.3.1 Khả năng lên men các loại đường 33

3.3.2 Khả năng sinh tổng hợp amylase, protease, lipase 33

3.4 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GLUCOSAMINE CỦA CHỦNG TBY 3476 36

3.4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men 36

3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose 37

3.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng oxy 38

3.4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 39

3.4.5 Ảnh hưởng của pH 41

KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

LỜI MỞ ĐẦU

Glucosamin là một amino-mono-saccharide có trong mọi mô của cơ thể con người Glucosamin được cơ thể dùng để sản xuất ra các proteoglycan, những phân tử proteoglycan này hợp với nhau thành mô sụn Nguồn cung cấp

để tổng hợp Glucosamin lấy từ glucose trong cơ thể

Glucosamin là một đường hiếm cần cho công nghiệp dược và nghiên cứu hóa sinh Nó làm tăng khả năng hấp thu kháng sinh vào máu cũng như góp phần điều trị bệnh viêm khớp và các khối u Ngoài ra, glucosamin còn là vật liệu ban đầu để điều chế các chất trung gian D - arabrinose và D - arabonic acid cần thiết để sản suất riboflavin và vitamine B6

Do vậy, việc nghiên cứu thu nhận glucosamin để ứng dụng trong thực phẩm và y học có ý nghĩa lớn về mặt kinh tế đặc biệt là đảm bảo sức khỏe con người

Glucosamin trong nước hiện nay chủ yếu được thu nhận từ nguyên liệu chính là vỏ các loài giáp xác, chủ yếu là vỏ tôm Vỏ tôm chứa khoảng 20 % là chitin - polymer của D - glucosamin Nguồn vỏ tôm phế liệu ở nước ta rất dồi dào, chủ yếu trong các nhà máy chế biến hải sản Tuy vậy, việc thu nhận glucosamin theo phương pháp này chủ yếu dùng axit đặc để thủy phân, nên việc tách chiết và tinh chế gặp phải nhiều khó khăn khi loại bỏ phần hóa chất

dư thừa, nhằm để thu glucosamin tinh khiết

Hướng tới mục tiêu tìm kiếm một phương pháp thu nhận chế phẩm glucosamine hiệu quả cao, phù hợp với điều kiện trong nước, dễ dàng áp dụng vào sản xuất nhằm tạo ra một sản phẩm hỗ trợ sức khỏe con người, giá thành phù hợp với thu nhập của người Việt Nhóm nghiên cứu đã tìm hiểu và tiếp cận phương pháp thu nhận glucosamine bằng vi sinh vật Thu nhận glucosamin bằng phương pháp vi sinh vật đang là một trong những hướng nghiên cứu có tiềm năng hiện nay Vi sinh vật vốn là nguồn nguyền liệu dồi

mang lại lợi ích kinh tế, an toàn và thân thiện với môi trường hơn so với các phương pháp hóa học truyền thống Do vậy, nhóm nghiên cứu tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp glucosamine của nấm men Moniliella.sp”

Nội dung nghiên cứu:

- Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng sinh tổng hợp glucosamine

- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp glucosamine

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GLUCOSAMINE

1.1.1 Cấu tạo và tính chất của Glucosamine

Glucosamine là chất rắn dạng tinh thể không màu không mùi, không nóng chảy ở nhiệt độ 88oC, điểm phân hủy 110oC, tan được trong nước và methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform Công thức cấu tạo của glucosamine:

Tên UIPAC: (3R, 4R, 5S, triol

6R)-3-amino-6-(hydromethyl)oxane-2,4,5-Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxyl-D-glucose; glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)-glucosamine

2-Amino-1-deoxyl-β-D-Công thức phân tử: C6H13O5N

Phân tử lượng: Mglucosamine = 179,17

Hình 1: Cấu trúc không gian của glucosamine

NH2 Bazo Shiff dưới dạng keo sánh, màu nâu

1.1.2 Cấu tạo hóa học và tính chất một số muối của glucosamine

Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin đƣợc sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc

1.1.2.1 Glucosamin hydroclorua

Công thức cấu tạo:

Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride; Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride

Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl

Công thức phân tử: C8H15O6N

aminomonosacharit được thấy trong tự

nhiên, nguyên liệu để tổng hợp

proteoglycan Glucosamin kích thích tế

bào sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp

nên cấu trúc proteoglycan bình thường

Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra

mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo

nên sụn khớp Bình thường sụn khớp

được cấu tạo chủ yếu bởi nước, collagen

và proteoplycan

Hình 2: đau đốt sống lưng, cổ

kích thích sinh sản mô liên kết của

xương, giảm quá trình mất canxi của

Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển [9]

Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn, khớp

Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%, 45% ở tuổi 80) Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]

Hình 5: Các vị trí tổn thương

Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống viêm khớp

Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến hiện nay là:

Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald Tallarida thuộc

trường Đại Học Y khoa

Temple, Philadelphia (Mỹ)

cho thấy nếu sử dụng

glucosamin đơn độc sẽ

không có hiệu quả chống

đau Nhưng nếu kết hợp với

một loại thuốc nhóm kháng

viêm không steroid (NSAID)

thì tác dụng chống đau,

chống viêm tăng lên rất

nhiều Thực tế lâm sàng cho

thấy thuốc glucosamin mang

lại nhiều ưu điểm trong điều

trị hơn hẳn các thuốc

NSAID Nhược điểm của

thuốc NSAID là có nhiều tác

dụng phụ, còn khi sử dụng

glucosamin thì lại rất ít tác

dụng phụ Một vài dị ứng

không đáng kể đối với người

có cơ địa quá mẫn cảm

với thuốc Trước đây

glucosamine được xếp vào nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamine, chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng chậm với các bệnh viêm khớp

Hiện nay cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận xếp

glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp Các loại khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng được các yêu cầu trên lâm sàng

Ở Việt Nam, hiện nay đang sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamin như : Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9] Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài

Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho kết quả như sau [8]:

 Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gian ngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời gian dài

 Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID

 Người ta dùng phối hợp glucosamin và NSAID cho kết quả tốt hơn khi dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn Sau đó ngưng sử dụng NSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tục được duy trì theo kiểu tuyến tính

 Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc Ngược lại, ngưng uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau

đó

 Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được phát huy

Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosaminsulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH

= 1 - 3) sẵn có trong dạ dày Khi đó, các ion glucosamin và các ion sulfat bị trộn lẫn với một lượng lớn ion Cl- và ion H+ Nếu khảo sát hỗn hợp này và

tách loại muối glucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muối dạng sulfat đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axit HCl có mặt trong dạ dày

1.1.4 Tình hình sản xuất glucosamine hiện nay

Hiện nay glucosamine được thu nhận từ việc thủy phân chitin và chitosan trong môi trường acid HCl đậm

đặc Yếu tố nồng độ axit và nhiệt

độ thủy phân rất quan trọng, nếu

nồng độ của axit không thích hợp

thì quá trình deacetyl hóa và deosid

chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu

nhiệt độ không thích hợp thì sản

phẩm cuối cùng là glucosamin có

thể bị giáng hóa thành những phân

tử đơn giản hơn Hình 7: Chitosan và glucosamin 1.1.5 Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl)

1.1.5.1 Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3]

Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7 Sau đó khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt

độ 95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ, tẩy màu rửa sạch, sấy khô Chitosan được đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 – 2oC trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 – 60o

C

1.1.5.2 Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14]

Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô Nguyên liệu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%, đun sôi Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô Chitin thu được

có màu trắng phớt hồng Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 95 - 1000C, tẩy màu bằng than hoạt tính, để kết tinh và lọc Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng, hiệu suất quá trình 51,4%

1.2 NẤM MEN ĐEN MONILIELLA

Con người biết đến nấm men đen vào khoảng cuối thế kỷ 19 là một nhóm phân loại không đồng nhất, thành tế bào có melanine và sinh sản bằng phương thức nảy chồi Tuy nhiên, nấm men đen là một loại nấm rất khó để nhận dạng, vì vậy, những hiểu biết vẫn chưa hoàn chỉnh

Chi Moniliella:

Chi Moniliella được thiết lập bởi Stolk và Dakin (1966) cho hai loài mới là M acetoabutens và M tomentosa Moniliella là một chi khá đặc biệt trong giới nấm nói chung và nấm men nói riêng Moniliella là nhóm nấm men

có sắc tố đen thuộc Basidiomycota, sinh sản cả bằng nảy chồi và phân đốt, có

khả năng lên men và chịu áp suất thẩm thấu cao Hiện nay, có 9 loài trong

Moniliella được biết đến, đó là M acetoabutens, M.fonsecae, M megachiliensis, M mellis, M nigrescens, M oedocephalis, M.pollinis, M.spathulata và M.suaveolens [27]

Hình thái khuẩn lạc: Tế bào hình elip hoặc hơi trụ, kích thước lớn Khuẩn lạc lúc đầu màu kem, sau chuyển sang màu xám đen hoặc màu đen oliu, bề mặt nhẵn, mượt Các chuỗi hướng ngọn của các bào tử đính dạng chồi

được tạo thành từ các gai nhỏ Đôi khi xuất hiện bào tử áo hình chùy, vách dầy Có khi xuất hiện sợi thật và giả [1]

Sinh sản: thường sinh sản bằng nảy chồi hay phân đốt, không hình thành túi bào tử [4]

Phân bố: thường phân bố ở những nơi có nhiều dầu mỡ hoặc nơi có nồng độ đường cao như phấn hoa, mật ong…

Hầu hết các loài đều có khả năng lên men một số lợi đường như glucose, sucrose, maltose Ngoài ra, chúng còn có khả năng tổng hợp nhiều lọi polyol, đặc biệt là glucosamine và glycerol là những đường có ứng dụng lớn trong công nghiệp [9]

Moniliella bao gồm nhiều loài với hình dáng và kích thước đa dạng Vì

vậy, trong quá trình phân loại thường gặp khó khăn Một số chi có nhiều đặc

điểm hình thái tương đồng với Moniliella bao gồm: Geotrichum,

Trichosporon, Candida và Aureobasidium

Bảng 1 So sánh đặc điểm của chi Moniliella và một số chi khác

Moniliella

Khuẩn lạc mịn, sau đó bông xù, thường từ màu trắng rồi chuyển dần sang màu vàng xanh, xám, đen Sinh sản bằng phương thức nảy chồi hoặc phân đốt Thành tế bào dày, có melanine nhưng thiếu xylose

và fucose Hầu hết các chủng đều có khả năng thủy phân Ure, có khả năng lên men

và tạo mùi trái cây, có khả năng thủy phân lipit

Phân bố ở những nơi có nhiều dầu

mỡ hoặc có áp suất thẩm thấu cao như phấn hoa, mật ong

Geotrichum

Khuẩn lạc màu trắng, bột hoặc lông xù

giống Moniliella nhưng khuẩn lạc không

chuyển sang màu xám đen Chỉ sinh sản bằng phân đốt, không nảy chồi Tế bào to

và dài, khoảng 10 𝜇m

Phân bố trong đất, nước và không khí

Trichosporon Khuẩn lạc màu kem, ướt hoặc khô, có

hoặc không bông xù Tế bào bé, mỏng

Sinh sản bằng nảy chồi hoặc phân đốt

Kích thước từ 5-10𝜇m

Phân bố trong đất hoặc nơi có nhiều dầu mỡ

Canida Tế bào hình tròn hay elip Sinh sản vô

tính theo kiểu nảy chồi

Thường ở những nơi có nồng độ đường cao như mật mía Một số chi xuất hiện ở những nơi có nhiều dầu mỡ như C.sake, C haemuloni

Aureobasidium Khuẩn lạc lúc đầu màu trắng sau chuyển

sang màu sẫm hoặc đen Đường kính sợi nấm từ 2-10𝜇m, sinh sản theo phương thức nảy chồi

Phân bố nhiều trong đất, xác thực vật, lá cây

Chi Phaeococcomyces

Gồm 2 loài đã được công nhận là P exophialae, P scatenatus Khuẩn

lạc sinh trưởng chậm, nhầy, bề mặt có nhiều nếp nhăn, màu đen Tế bào dạng

hình cầu đến elip Bào tử đính chuyển từ không màu sang nâu đậm hoặc đen [16]

Chi Exophiala

Phân bố nhiều trong đất, nước, thực vật, gỗ mục,… chúng là nguyên

nhân gây nhiều bệnh ở người Gồm nhiều loài: E castellanii, E jeanselmei,

E moniliae, E pisciphila, E.salmonis, E spinifera, E eanselmei Chi có đặc

điểm hình thái và sinh lý rất đa dạng, hình thái cơ bản có thể tóm tắt như sau: Chiếm ưu thế trong môi trường nuôi cấy tế bào là dạng phân đốt, thon dần về phía ngọn, một vài đốt hợp với nhau ở bên trong, mỗi đốt là một tế bào, đôi khi gồm 2 tế bào Khi còn trẻ, các tế bào có dạng hình cầu, sinh sản bằng nảy chồi giống như nấm men thông thường, xếp thành chuỗi dài Sau một thời gian nuôi cấy, bắt đầu hình thành các vách ngăn bên trong sợi nấm, tạo thành đốt Các đốt này có hình trụ, mọc kiểu tia và đặc trưng bởi các em thắt hẹp Sau đó, từ các đốt sinh ra các bào tử hình elip kích thước 1-3 hoặc 3-6𝜇m Các bào tử này thường gồm một tế bào, tập trung ở đỉnh của đốt hay trên cuống bào tử đính [16]

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng nấm men thuộc chi Moniliella trong bộ sưu tập giống của Trung

tâm Vi sinh vật – Viện Công nghiệp Thực phẩm (TBY 3406.6, TBY 3476 và TBY 2127.3)

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

Hóa chất: Agar (Việt Nam), Glucose (Trung Quốc), Yeast extract (Tây

Ban Nha), Axit citric (Trung Quốc), Urea (Trung Quốc), Axit phosphoric (Sigma), Glycerol (Merk), Glucosamin(Sigma), casein (Trung Quốc) và các hóa chất thông dụng khác

Thiết bị: Box cấy (Việt Nam), Cân điện tử (Precisa, Thụy Điển), Kính

hiển vi quang học (Lieca), Máy đo pH (Thụy Điển), Tủ ấm (Đức), Máy lắc ổn nhiệt (Việt Nam), Máy ly tâm lạnh (Hàn Quốc), Nồi hấp thanh trùng (Việt Nam), Máy sắc kí lỏng cao áp (Agilient Technologies 1260 infinity)…

Dụng cụ: Đĩa petri, piepette tự động các loại, ống Fancol, ống nghiệm,

ống Eppendorf, ống đong, đèn cồn, que cấy, bình tam giác, nút cao su, bình Schoot,

Chuẩn bị: Cân các thành phần theo tỷ lệ Cho hỗn hợp vào bình Schoot sau đó đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút để môi trường nguội , đổ ra đĩa peptri trong điều kiện vô trùng

Tác dụng: Dùng làm môi trường tinh sạch và bảo quản

Môi trường GYU20

Chuẩn bị Yeast extract: Cân 10g yeast extract, bổ sung nước cất hòa tan Đưa về thể tích 90ml bằng ống đong, sau đó đựng vào bình Schoot

Chuẩn bị dung dịch Urea 10%: cân 10g urea hòa tan trong nước cất, chỉnh thể tích về 100ml bằng bình định mức Lắc đều và lọc thanh trùng bằng màng lọc 0,2 µl vào ống Fancol vô trùng Bảo quản trong ngăn đá, mỗi lần dùng 1 ống, không sử dụng lại (Urea không được hấp)

Hấp dung dịch glucose và yeast extract trong các bình Schoot riêng ở

121 °C trong 15 phút Để nguội (< 60°C) và hòa trộn dung dịch glucose, yeast extract 10ml urea 1 % (cho 1000 ml) trong box cấy

Tác dụng: môi trường nhân giống, môi trường lên men sinh tổng hợp

glucosamine

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Hoạt hóa và giữ giống

Hoạt hóa: Các chủng giống nấm men do Trung Tâm Vi Sinh Vật-Viện Công Nghệ Thực Phẩm cung cấp Từ đó lấy 1ít nấm men cần hoạt hóa và cấy ria lên đĩa peptri chứa môi trường malt-glucose 40Bx, sau đó đem nuôi ở nhiệt

độ 28-300

C trong 2-3 ngày Khi thấy nấm men đã mọc mà không thấy xuất hiện khuẩn lạc lạ thì đã hoạt hóa xong Trường hợp nấm men chưa sạch (có khuẩn lạc lạ) thì phải làm sạch lại như cách trên

Giữ giống:

Chuẩn bị glycerol 50% (100ml): cân 50g glycerol, bổ sung nước cất sau

đó hòa tan và đưa về thể tích 100ml

Khi chủng giống nấm men đã được hoạt hóa, chọn lấy một khuẩn lạc riêng rẽ và cấy vào ống nút xoáy chứa môi trường Malt-glucose 40Bx Đem ống nuôi ở nhiệt độ 28-300

C trong 2-3 ngày, sau đó bổ sung glycerol 50% vào, sau đó cất giữ giống trong tủ lạnh đông

2.2.1.2 Phương pháp lên men sinh tổng hợp glucosamine

Các chủng được cấy hoạt hóa trên đĩa môi trường Malt-glucose 4°Bx nuôi

ở 28°C trong 3 ngày Sau đó lấy một khuẩn lạc riêng rẽ từ đĩa cấy vào bình tam giác 100 ml đã vô trùng (sấy 140°C trong 4 tiếng) chứa 5 ml môi trường GYU20 được đậy bằng nút cao su vô trùng Nuôi lắc ở 28°C, 50rpm trong 2 ngày Sau 2 ngày nuôi cấy bổ sung 45 ml môi trường GYU20 vào mỗi bình nuôi lắc ở 28°C, 150rpm trong 8 ngày, cứ 2 ngày lấy mẫu 1 lần Kết thúc quá trình lên men sau 8 ngày, lấy mẫu ở các mốc: 0 ngày, 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày,

8 ngày Các mẫu thí nghiệm được ly tâm (10000rpm ở 10°C trong 10 phút), thu dịch và bảo quản trong ngăn đá Một phần dùng để đo OD, nồng độ dịch đường Mẫu sau khi được bảo quản trong ngăn đá lấy ra để phân tích các