Nghiên cứu biến đổi di truyền ở một bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh bằng phương pháp giải trình tự vùng gen mã hóa

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN Ở MỘT BỆNH NHÂN MẮC DỊ TẬT TIM BẨM SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GEN MÃ... KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN Ở MỘT BỆ

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

Ở MỘT BỆNH NHÂN MẮC DỊ TẬT TIM BẨM SINH

BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GEN MÃ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN

Ở MỘT BỆNH NHÂN MẮC DỊ TẬT TIM BẨM SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG GEN MÃ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BIOTECHNOLOGY

~*****~

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Nguyễn Huy Hoàng - Viện trưởng, Trưởng phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam- Người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cho tôi trong suốt quá trình thực hiện hoàn thành nghiên cứu và hoàn thành bài khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS.NCVC - Nguyễn Thị Kim Liên, Phó Trưởng phòng Hệ gen học chức năng đã luôn theo sát giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm Qua đây tôi cũng rất biết ơn các anh chị trong phòng Hệ gen học Chức năng- Viện Nghiên cứu hệ gen đã dạy bảo, hướng dẫn tôi tận tình và giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực tập tại phòng

Tôi cũng chân thành cảm ơn các thầy cô giáo giảng dạy tại Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu và bổ ích trong suốt 4 năm học vừa qua

Một lần nữa, xin cảm ơn tất cả mọi người Kính chúc mọi người nhiều sức khỏe và hạnh phúc trong cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 4, tháng 5, năm 2021

Sinh viên

Dương Thị Hồng Hạnh

LỜI CAM ĐOAN

Em tên là Dương Thị Hồng Hạnh, sinh viên lớp 1701 - Trường Đại Học Mở Hà Nội, em xin cam đoan:

Đây là đề tài nghiên cứu do em trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Huy Hoàng

Em xin đảm bảo tính khách quan, trung thực, chính xác của các

số liệu trong nghiên cứu này

Những kết quả trong nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ một nghiên cứu nào khác

Hà Nội, ngày 4, tháng 5, năm 2021

Sinh viên

Dương Thị Hồng Hạnh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… ….8

Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh tim bẩm sinh 3

1.1.1 Khái niệm về tim bẩm sinh 3

1.1.2 Nguyên nhân gây ra bệnh tim bẩm sinh 4

1.1.3 Các dạng dị tật tim bẩm sinh và triệu chứng lâm sàng của bệnh tim bẩm sinh: 6

1.1.4 Chuẩn đoán bệnh tim bẩm sinh: 6

1.1.5 Ảnh hưởng của bệnh tim bẩm sinh với bệnh nhân: 7

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về lĩnh vực liên quan đến đề tài: 8

1.2 Các gen liên quan đ ến bệnh tim bẩm sinh: 11

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Vật liệu và hóa chất 18

2.2.1 Vật liệu 18

2.2.2 Hóa chất 18

2.2.3 Thiết bị 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp tách DNA tổng số 21

2.3.2 Phương pháp kiểm tra nồng độ DNA tổng số 22

2.3.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 23

2.3.4 Phương pháp giải trình tự vùng gen mã hóa 25

2.3.5 Thiết kế mồi nhân đoạn gen chứa các đột biến cần kiểm nghiệm 27

2.3.6 Kỹ thuật PCR 27

2.3.6.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR 27

2.3.6.2 Nhân đoạn gen LRP2 bằng kỹ thuật PCR 29

2.3.6.3 Chu trình nhiệt trong kỹ thuật PCR được thực hiện trên máy

GeneAmp PCR System 9700 thông qua 3 giai đoạn (Hình 5): 31

2.3.7 Phương pháp tinh sạch sản PCR 31

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Thu thập mẫu máu 34

3.2 Xác định nồng độ tinh sạch DNA 34

3.4 Tách chiết DNA tổng số 35

3.5 Kết quả xác định và chú giải biến thể 39

3.6 Kết quả sàng lọc biến thể liên quan đến bệnh tim bẩm sinh 40

PHẦN IV: KẾT LUẬN 44

4.1 Kết luận 44

4.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

ĐỀ CƯƠNG TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC 51

PDB Ngân hàng dữ liệu protein (Protein Data Bank)

Kb Kilo base paris (1kb = 1000 bp)

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

(European Molecular Bioinformatic Laboratory)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Tỷ lệ mắc bệnh TBS từ năm 1945 đến năm 2009

theo phân loại khuyết tật

10

Hình 2: Phân bố bệnh tim bẩm sinh trên toàn cầu về số

lƣợng sinh trên một triệu dân số

10

Hình 4: Quy trình phân tích và sàng lọc đột biến 20

Hình 5: Chu trình nhiệt đã đƣợc tối ƣu hóa 30

Hình 6: Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel 1% 35

Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen LRP2 37

Hình 9: Đột biến trên gen ở vị trí c.428-10_428-8dellTTT 42

MỞ ĐẦU

Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là một tình trạng bất thường về cấu trúc

và chức năng của tim Vấn đề có từ khi trẻ mới được sinh ra và còn được gọi là bệnh tim bẩm sinh hay dị tật tim bẩm sinh (Congenital Heart Defects CHDs) Trên thực tế, nhiều trường hợp bệnh tim bẩm sinh khiến trẻ vừa sinh ra đời đã tử vong ngay lập tức Trái tim của em bé bắt đầu phát triển từ khi thụ thai và được hình thành hoàn toàn sau 8 tuần mang thai Các dị tật tim bẩm sinh thường xảy ra trong 8 tuần đầu tiên Bệnh tim bẩm sinh xảy ra khi tim hoặc các mạch máu gần tim không phát triển bình thường trước khi sinh Các vấn đề về tim bẩm sinh có thể ở các dạng từ đơn giản đến phức tạp Một số khiếm khuyết ở tim có thể được bác sĩ theo dõi và xử trí bằng thuốc Một số trường hợp khác sẽ được yêu cầu phẫu thuật, đôi khi ngay sau vài giờ đầu sau khi sinh Một số em bé

có thể mắc một số vấn đề về tim đơn giản Những khiếm khuyết này có thể tự phục hồi khi em bé lớn lên Tuy nhiên một vài trường hợp sẽ có những khiếm khuyết cần được theo dõi và điều trị suốt đời

Dị tật tim bẩm sinh là các bệnh liên quan đến cấu trúc của tim và buồng tim Xảy ra khi cấu trúc của tim khác thường hoặc buồng tim có dị tật

Dị tật tim bẩm sinh có thể liên quan đến bất kỳ phần nào của tim bao gồm buồng tim, van tim, vách tim, các động mạch và tĩnh mạch của tim Chúng đều làm ảnh hưởng đến dòng chảy bình thường của máu qua tim, khiến cơ thể trẻ không nhận đủ lượng oxy cần thiết [1] Chính vì vậy chuẩn đoán sớm bệnh tim bẩm sinh rất cần thiết

Chẩn đoán muộn bệnh sẽ làm chậm sự bắt đầu của các phương pháp điều trị đặc hiệu dẫn đến những hậu quả đáng tiếc, đe dọa đến cuộc sống bao gồm tình trạng lâm sàng nặng hơn gây tâm lý nặng nề cho bệnh nhân

trường hợp bệnh được di truyền, các anh chị em khác trong gia đình cũng

có nguy cơ bị ảnh hưởng cao Đối với những gia đình này, việc không có một chẩn đoán cụ thể và tiếp cận với tư vấn di truyền, làm tăng nguy cơ

về việc có một đứa trẻ khác bị bệnh được sinh ra

Giải trình tự gen thế hệ mới (giải trình tự vùng gen mã hóa – whole exome sequencing, hoặc toàn bộ bộ gen của con người – whole genome sequencing) [2] có thể được sử dụng để nghiên cứu các gen bệnh theo di truyền Mendel Giải trình tự gen thế hệ mới đã được xem như là một công cụ hữu hiệu cho phát hiện các gen bệnh mới, đặc biệt giải trình tự vùng mã hóa có thể sẽ trở thành công cụ phổ biến nhất được sử dụng để xác định gen bệnh theo di truyền Mendel cho những năm tới Hàng chục nghìn biến thể gen có thể được xác định trong vùng gen mã hóa trong nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch, thần kinh, chuyển hóa

Mục đích của đề tài: Đề tài tiến hành giải trình tự toàn bộ vùng

gen mã hóa (WES) ở một số bệnh nhi mắc dị tật tim bẩm sinh để tìm hiểu

rõ nguyên nhân di truyền của bệnh, từ đó có phương pháp chẩn đoán, điều trị và tư vấn di truyền thích hợp cho bệnh nhân và gia đình

Nội dung đề tài:

 Thu thập mẫu máu của bệnh nhi mắc tim bẩm sinh

 Tách chiết và bảo quản DNA tổng số

 Giải trình tự vùng gen mã hóa của 01 bệnh nhân nhi mắc bệnh dị tật tim bẩm sinh, dự đoán và xác định đột biến gen liên quan đến bệnh

 Kiểm chứng và đánh giá đột biến tìm được

Phần I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh tim bẩm sinh

1.1.1 Khái niệm về tim bẩm sinh

Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là dị tật bẩm sinh phổ biến nhất ở người và

là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở trẻ sơ sinh Các dị tật tim bẩm sinh thường xảy ra trong 8 tuần đầu tiên khi tim hoặc các mạch máu gần tim không phát triển bình thường trước khi sinh Với tỷ lệ mắc bệnh thay đổi từ 0,8 - 2% ở trẻ sơ sinh dự đoán tỷ lệ mắc TBS lên đến 4% ở tất cả trẻ sơ sinh, bệnh tim bẩm sinh gây ra tỷ lệ thai chết lưu lớn hơn nhiều [3;4] Ngoài ra, các dị tật nhẹ chưa được chẩn đoán của tim thường xuất hiện muộn hơn ở tuổi trưởng thành hoặc không được chẩn đoán suốt đời Trong trường hợp này, người ta dự đoán tỷ lệ mắc TBS lên đến 4% ở tất

cả trẻ sơ sinh

Phần lớn bệnh TBS được cho là do đột biến gen Điều này được quan sát ban đầu về sự di truyền trong các gia đình Một bằng chứng khác đến từ các hội chứng bẩm sinh do sự mất đoạn của các vùng nhiễm sắc thể sẽ dẫn đến TBS cùng với một số biểu hiện khác Trong vài thập

kỷ qua, cùng với sự ra đời của giải trình tự gen và các kỹ thuật khác, người ta có thể xác định được nguyên nhân di truyền của bệnh TBS Trong các trường hợp hội chứng, mặc dù có thể xác định được sự mất đoạn nhiễm sắc thể gây ra bệnh, nhưng trong nhiều trường hợp, gen chịu trách nhiệm về kiểu hình tim vẫn chưa được xác định

Bệnh tim bẩm sinh (TBS) là một tình trạng bất thường về cấu trúc và chức năng của tim Vấn đề có từ khi trẻ mới được sinh ra và còn được gọi là dị tật tim bẩm sinh Trên thực tế, đã có nhiều trường hợp bệnh tim bẩm sinh khiến trẻ vừa sinh ra đời đã tử vong ngay lập tức

Các vấn đề về tim bẩm sinh có thể ở các dạng từ đơn giản đến phức tạp Một số khiếm khuyết ở tim có thể được bác sĩ theo dõi và xử trí bằng thuốc Một số trường hợp khác sẽ được yêu cầu phẫu thuật, đôi khi ngay sau vài giờ đầu sau khi sinh Một em bé có thể mắc một số vấn đề

về tim đơn giản và sẽ tự hồi phục khi lớn lên Tuy nhiên, một vài trường hợp sẽ có những khiếm khuyết cần được điều trị suốt đời

Các dấu hiệu bệnh tùy thuộc vào kiểu cụ thể của dị tật có thể nguy hiểm tính mạng Các triệu chứng thường thấy gồm thở nhanh, tím tái, khó lên cân, và cảm thấy mệt mỏi [5] Các triệu chứng của bệnh tim bẩm sinh ở trẻ sơ sinh và trẻ em có thể bao gồm:

 Da, móng tay và môi có màu hơi xanh (các bác sĩ gọi đây là chứng xanh tím, một tình trạng do máu thiếu oxy)

do dị tật tim gồm có suy tim

1.1.2 Nguyên nhân gây ra bệnh tim bẩm sinh

Nguyên nhân của một bất thường tim bẩm sinh thường không rõ [6] Một số trường hợp có thể là do nhiễm trùng trong giai đoạn mang thai như nhiễm Rubella, việc sử dụng một số loại dược phẩm hay các chất như rượu hay thuốc lá, bố mẹ có quan hệ cận huyết, hay tình trạng dinh dưỡng kém hoặc béo phì ở người mẹ [7] Bố hoặc mẹ mắc bệnh tim bẩm sinh cũng là một yếu tố nguy cơ [8] Một số bệnh di truyền có liên quan đến dị tật tim bao gồm hội chứng Down, hội chứng Turner và hội chứng

Marfan Các bệnh tim bẩm sinh được chia thành hai nhóm chính: các bệnh tim bẩm sinh tím và các bệnh tim bẩm sinh không tím, dựa vào việc bệnh nhi có khả năng chuyển màu tím tái hay không Các bất thường có thể ở thành trong của tim, các van tim, hay các mạch máu lớn dẫn máu đến và đi khỏi tim

 Bệnh tim bẩm sinh do di truyền

+ Di truyền trên nhiễm sắc thể thường mang gen trội với các hội chứng

đa dị tật: Bệnh tim bẩm sinh là dị tật chính như hội chứng Noonan (bệnh

di truyền có liên quan tới tim), hội chứng Marfan (hội chứng di truyền ảnh hưởng đến mô liên kết)

+ Di truyền trên nhiễm sắc thể thường mang gen lặn: hội chứng Jervell (quá trình kéo dài, đột tử), hội chứng Ellis Van Creveld (tim chỉ có 1 nhĩ kèm các dị tật khác) Di truyền theo thể ẩn có liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính: thường bị ở trẻ trai như hội chứng Hunter (dị tật ở nhiều van tim và động mạch vành), loạn dưỡng cơ Duchenne

+ Đã có nhiều tổn thương tim bẩm sinh do bất thường cấu trúc di truyền được phát hiện, có thể là đảo đoạn, mất đoạn hay thêm đoạn DNA Các bất thường hay gặp nhất tại NST số 21, 13 và 18, chiếm khoảng 5 - 8 % trường hợp TBS, trong đó đột biến cấu trúc NST 21 là phổ biến nhất Ngoài ra cũng đã phát hiện ra tổn thương tại một số NST khác, bao gồm đột biến cấu trúc nhánh dài nhiễm sắc thể số 22 (22q11, Hội chứng DiGeorge), nhánh dài NST số 1 (1q21), nhánh ngắn NST số 8 (8p23)

 Các nguyên nhân từ môi trường gây bệnh tim bẩm sinh

+ Các tác nhân vật lý như các loại tia phóng xạ, tia gama, tia quang tuyến

X Nhiễm độc các loại hóa chất, độc chất, các thuốc kháng động kinh, thuốc an thần Nhiễm trùng virus đặc biệt là Rubella trong 3 tháng đầu có thai Các bệnh của mẹ mắc khi đang mang thai: đái tháo đường, bệnh

Lupus ban đỏ (là bệnh tự sinh ra kháng thể chống lại chính bản thân mình) Đặc biệt nguy hiểm là mẹ bị nhiễm virus cúm trong ba tháng đầu mang thai

1.1.3 Các dạng dị tật tim bẩm sinh và triệu chứng lâm sàng của bệnh tim bẩm sinh:

Hầu hết các vấn đề về tim bẩm sinh là các vấn đề về cấu trúc như lỗ

và van bị rò rỉ [7] Cụ thể như:

 Các khuyết tật van tim: Một có thể quá hẹp hoặc đóng hoàn toàn Điều đó làm cho máu khó đi qua Đôi khi, nó không thể vượt qua được Trong các trường hợp khác, van có thể không đóng đúng cách, do đó máu bị rò rỉ ngược lại

 Các vấn đề với "vách ngăn" của tim: có thể là vách ngăn giữa các buồng tim (tâm nhĩ và tâm thất) Các lỗ hổng trên vách ngăn giữa buồng tim bên trái và bên phải có thể khiến máu bị trộn lẫn

 Các vấn đề với cơ tim: Những vấn đề này có thể dẫn đến suy tim,

có nghĩa là hoạt động bơm máu của tim không hiệu quả như bình thường

Kết nối không tốt giữa các mạch máu: Ở trẻ sơ sinh, điều này có thể khiến máu đi đến phổi và các bộ phận khác của cơ thể hoặc ngược lại diễn ra không bình thường Những khiếm khuyết này có thể làm mất oxy trong máu và dẫn đến suy các cơ quan

1.1.4 Chuẩn đoán bệnh tim bẩm sinh:

Bệnh tim bẩm sinh có thể chuẩn đoán trước (giai đoạn mang thai) hoặc sau khi sinh

- Chẩn đoán khi mang thai:

Ban đầu có thể nghi ngờ bệnh tim bẩm sinh khi siêu âm định kỳ cho

em bé trong bụng mẹ Siêu âm chuyên khoa, được gọi là siêu âm tim thai, sau đó sẽ được tiến hành vào khoảng tuần thứ 18 đến 22 của thai kỳ để chẩn đoán xác định Điều này cũng có thể được thực hiện nếu có tiền sử gia đình mắc bệnh tim bẩm sinh hoặc nơi có nguy cơ cao Siêu âm tim là một loại siêu âm quét, trong đó sóng âm tần số cao được sử dụng để tạo

ra hình ảnh của tim Tuy nhiên, không phải lúc nào cũng có thể phát hiện các dị tật tim, đặc biệt là các dị tật nhẹ bằng siêu âm tim thai

- Chẩn đoán sau khi sinh:

Đôi khi có thể chẩn đoán trẻ mắc bệnh tim bẩm sinh ngay sau khi sinh nếu có một số dấu hiệu hoặc triệu chứng đặc trưng của bệnh tim bẩm sinh, chẳng hạn như da có màu xanh (tím tái)

Tuy nhiên, một số khiếm khuyết không gây ra bất kỳ triệu chứng đáng chú ý nào trong vài tháng hoặc thậm chí vài năm

1.1.5 Ảnh hưởng của bệnh tim bẩm sinh với bệnh nhân:

- Theo WHO tỷ lệ mắc bệnh khoảng 0,5–0,8 % và không có khác biệt về giới tính, chủng tộc

- Bệnh tim bẩm sinh chiếm đến 90% tổng số các bệnh tim mạch ở trẻ Tần xuất mắc bệnh tim bẩm sinh ở trẻ sơ sinh khoảng từ 0,7 – 0,8%, nam nữ mắc ngang nhau, không có sự khác nhau giữa các chủng tộc, địa

lý cũng như điều kiện kinh tế xã hội Bệnh tim bẩm sinh ở trẻ sơ sinh là những bất thường của tim xuất hiện ngay từ khi đứa trẻ mới sinh ra Bất

kỳ một cơ quan nào trong cơ thể cũng có nguy cơ bị dị dạng hay bất thường về cấu trúc nhưng những bất thường về cấu trúc tim mạch là những bất thường đáng chú ý nhất Hiệu ứng bệnh lý của nó có thể nhân bản theo cấp số cộng và đôi khi có thể khiến trẻ tử vong ngay lập tức mà không thể cứu chữa được

Bệnh tim bẩm sinh ở trẻ sơ sinh có thể khiến trẻ tử vong sau sinh trong thời gian rất ngắn hoặc làm cho chất lượng cuộc sống của trẻ sau này bị giảm sút nghiêm trọng, cha mẹ khó chăm sóc bé

1.1.6 Tình hình nghiên cứu về lĩnh vực liên quan đến đề tài:

- Tình hình nghiên cứu trong nước:

Ảnh hưởng của bệnh tim bẩm sinh ~ 1% tổng số trẻ sinh sống trong dân số nói chung Các bệnh tim bẩm sinh phức tạp liên quan đến nhiều dị tật hơn, bao gồm động mạch chủ phổi và động mạch vành dị thường Trong vài thập kỷ qua, việc chẩn đoán và điều trị các bệnh tim bẩm sinh

đã được cải thiện rất nhiều [9]

Theo tổ chức y tế thế giới, cứ 1.000 trẻ em ra đời, thì 8 trẻ trong số

đó mắc bệnh TBS [1] Tại Việt Nam, mỗi năm có thêm 20.000 trường hợp mang căn bệnh này, chỉ có 1/10 số đó được can thiệp phẫu thuật Trẻ

bị TBS dễ rơi vào tình trạng suy tim nặng, di chứng không phục hồi ảnh hưởng tới tình trạng toàn thân

Các bệnh tim bẩm sinh rất đa dạng, có thể chia thành hai nhóm lớn

là nhóm đi kèm và không đi kèm với các hội chứng di truyền khác Nhóm đi kèm với các hội chứng di truyền khác bao gồm các hội chứng: Hội chứng Down, Hội chứng Edward, Hội chứng Patau, Hội chứng Holt-Oram, Hội chứng Noonan, Hội chứng Ellis-van Creveld, Hội chứng Costello, Hội chứng Leopard, Hội chứng Alagille, Hội chứng Turner, Hội chứng Williams-Beuren, Hội chứng Anderson, Hội chứng Cat-Eye, Hội chứng Marfan, Hội chứng Char, Hội chứng Charge… Nhóm không

đi kèm với các hội chứng di truyền khác được xác định do đột biến gen đơn gây ra

Các dạng bệnh tim bẩm sinh phổ biến bao gồm: thông liên nhĩ, thông liên thất, van động mạch chủ hai lá, hẹp eo động mạch chủ, bất

thường van hai lá, hai đường ra tâm thất phải, hội chứng Eisenmenger, hội chứng thiểu sản thất trái, hội chứng Wolff-Parkinson-White, hội chứng Brugada, hội chứng QT dài, bất thường hồi lưu tĩnh mạch phổi, ống động mạch tồn lưu, còn lỗ bầu dục, thiểu sản phổi, thiểu sản phổi với khuyết tật thông liên thất, hẹp van động mạch phổi, thiểu sản phổi với vách ngăn thất nguyên vẹn, tứ chứng Fallot, chuyển vị các động mạch lớn, thiểu sản van ba lá, thân chung động mạch, vòng mạch máu, khiếm khuyết thông liên thất

Các dị tật tim bẩm sinh thường gặp nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong số các dị tật bẩm sinh ở trẻ Ngày nay với những tiến bộ trong chẩn đoán và điều trị đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của những trường hợp tim bẩm sinh phức tạp

- Tình hình nghiên cứu trên thế giới:

Thống kê năm 2015 cho thấy có 48,9 triệu người mắc bệnh tính trên toàn thế giới Nó tác động lên 4 đến 75 người trên mỗi 1.000 trẻ sinh

ra với khoảng từ 6 đến 19 trên 1.000 trẻ có dị tật mức độ từ vừa đến nặng [7;8] Bệnh tim bẩm sinh là nguyên nhân hàng đầu của các ca tử vong liên quan dị tật bẩm sinh Trong năm 2015 nó dẫn đến 303.300 cái chết, giảm so với 366.000 ca tử vong vào năm 1990

Hình 1: Tỷ lệ mắc bệnh TBS từ năm 1945 đến năm 2009 theo phân

loại khuyết tật

Hình 2: Phân bố bệnh tim bẩm sinh trên toàn cầu về số lƣợng sinh

trên một triệu dân

1.2 Các gen liên quan đ ến bệnh tim bẩm sinh:

Bệnh tim bẩm sinh có thể là kết quả của biểu hiện sai lệch của các gen tham gia vào quá trình phát triển tim Các đột biến trong một loạt các yếu tố phiên mã, các phân tử tín hiệu phát triển và các phân tử làm thay đổi chất nhiễm sắc gây ra ít nhất 20% bệnh tật, nhưng nguyên nhân của hầu hết bệnh TBS vẫn không giải thích được

Sự phát triển của tim là một quá trình phức tạp đòi hỏi sự tương tác chính xác của các phân tử tín hiệu, yếu tố phiên mã, đồng yếu tố và protein cấu trúc Cả hai yếu tố di truyền và không di truyền đều liên quan đến bệnh tim bẩm sinh [10]

Tỷ lệ mắc TBS là khoảng 4-6 /1000 trẻ đẻ sống và tỷ lệ thực sự có thể

là 40/1000 nếu bao gồm van động mạch chủ hai lá [11,12] Mặc dù có những tiến bộ trong chẩn đoán và can thiệp, hiểu biết của chúng ta về nguyên nhân và cơ chế của TBS vẫn còn hạn chế Trong hai thập kỷ qua, phân tích liên kết và sàng lọc gen ứng viên đã giúp xác định nguyên nhân

di truyền trong một số trường hợp TBS

Các gen quy định trình tự phát triển phức tạp mới chỉ được làm sáng

tỏ một phần Một số gen có liên quan đến các khuyết tật cụ thể Một số gen có liên quan đến các biểu hiện của tim Đột biến của một protein cơ

tim, chuỗi nặng α-myosin (MYH6) có liên quan đến khuyết tật vách liên nhĩ [13] Một số protein tương tác với MYH6 cũng có liên quan đến các

khuyết tật về tim

Yếu tố phiên mã GATA4 tạo thành một phức hợp với TBX5 tương tác với MYH6 Một yếu tố khác, gen homeobox (phát triển), NKX2-5 cũng tương tác với MYH6 Các đột biến của tất cả các protein này có liên quan đến cả khuyết tật thông liên nhĩ và tâm thất; Ngoài ra, NKX2-5 có liên

quan đến các khiếm khuyết trong dẫn truyền điện của tim và TBX5 liên

quan đến hội chứng Holt-Oram bao gồm các khiếm khuyết về dẫn truyền

điện và các bất thường của chi trên Các đồng yếu tố báo hiệu Wnt BCL9,

BCL9L và PYGO có thể là một phần của con đường phân tử này, vì khi

gen của chúng bị đột biến, điều này gây ra các kiểu hình tương tự như các đặc điểm có trong hội chứng Holt-Oram [14] Một gen T-box khác,

TBX1, có liên quan đến hội chứng DiGeorge, loại bỏ phổ biến nhất có

các triệu chứng bao gồm các khuyết tật của đường dẫn tim bao gồm tứ chứng Fallot [15]

- Hiện nay, các gen liên quan đến bệnh tim bẩm sinh đã được nghiên

cứu, cụ thể như các gen NOS3; CELA1; NKX2.5; NOTCH1; TBX1;

GATA… Sau khi sàng lọc đột biến trên trình tự gen của trẻ mắc, chúng

tôi đã tìm thấy gen LRP2 được xác định liên quan đến hội chứng Donnai

Barrow và là một yếu tố nguy cơ gây xơ vữa động mạch và các bệnh liên quan, chẳng hạn như bệnh tim mạch vành và đột quỵ

1.3 Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân:

1.4.1 Giới thiệu chung về gen LRP2:

- LRP2 Protein được mã hóa bởi gen này liên quan đến lipoprotein mật

độ thấp 2 (LRP2) hoặc megalin, là một thụ thể nội bào đa phối tử được

biểu hiện ở nhiều mô khác nhau nhưng chủ yếu ở các biểu mô hấp thụ

như thận Glycoprotein này có một miền ngoại bào đầu tận cùng amin lớn, một miền xuyên màng đơn, và một đuôi tế bào chất có đầu tận cùng carboxy ngắn Các miền liên kết phối tử ngoại bào liên kết các đại phân

tử đa dạng bao gồm albumin, apolipoprotein B và E, và lipoprotein

lipase Protein LRP2 rất quan trọng đối với sự tái hấp thu của nhiều phối

tử, bao gồm lipoprotein, sterol, protein liên kết vitamin và hormone Protein này cũng có một vai trò trong tín hiệu tế bào; các phối tử ngoại bào bao gồm hor mon tuyến cận giáp và nhím siêu âm morphogen trong khi phối tử tế bào bao gồm các protein giàn giáo MAP kinase và các protein tương tác JNK Sự tái tạo của thụ thể màng này được điều chỉnh bởi quá trình phosphoryl hóa miền tế bào chất của nó Các đột biến trong gen này gây ra hội chứng Donnai-Barrow (DBS) và hội chứng thận yếu (FOAR)

1.4.2 Cấu trúc gen LRP2:

- LRP2 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 (2q31,1) [Hình 3] Cụ thể gen

LRP2 kéo dài 235.489 bp và nằm từ nucleotide 169.127.109 đến

nucleotide 169.362.597 trên nhiễm sắc thể số 2

Hình 3: Vị trí gen LRP2 trên NST số 2

- Lipoprotein (a) là một biến thể lipoprotein mật độ thấp có chứa một

protein gọi là apolipoprotein (a) Các nghiên cứu về di truyền và dịch tễ học đã xác định lipoprotein (a) là một yếu tố nguy cơ gây xơ vữa động

mạch và các bệnh liên quan, chẳng hạn như bệnh tim mạch vành và đột quỵ [16;17;18]

Lipoprotein (a) [Lp (a)] bao gồm LDL và apolipoprotein cụ thể (a), được liên kết cộng hóa trị với apoB có trong vỏ ngoài của hạt Nồng độ Lp (a) trong huyết tương có tính di truyền cao và chủ yếu được kiểm soát bởi

gen LPA nằm trên nhiễm sắc thể 6q 26-27 Các protein Apo (a) khác nhau

về kích thước do sự đa hình về kích thước [KIV-2 VNTR], do một số lần

lặp lại kringle IV thay đổi trong gen LPA Sự thay đổi kích thước này ở cấp

độ gen cũng được biểu hiện trên cấp độ protein, dẫn đến các protein apo (a)

có 10 đến hơn 50 kringle IV lặp lại, mỗi biến đổi kringle IV bao gồm 114 axit amin [19;20] Các kích thước apo (a) biến đổi này được gọi là "apo (a) isoforms "

Nhiều nghiên cứu xác nhận mối tương quan chặt chẽ giữa tăng Lp (a)

và bệnh tim đã dẫn đến sự đồng thuận rằng Lp (a) là một yếu tố dự báo độc lập quan trọng của bệnh tim mạch [16] Các nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng Lp (a) có thể góp phần trực tiếp vào tổn thương xơ vữa động mạch bằng cách tăng kích thước mảng bám, viêm nhiễm, không ổn định và tăng trưởng tế bào cơ trơn [21] Dữ liệu di truyền cũng ủng hộ lý thuyết rằng Lp (a) gây ra bệnh tim mạch[18]

1.5 Hội chứng Donnai - Barrow:

Hội chứng Donnai – Barrow là một rối loạn di truyền được Dian Donnai và Margaret Barrow mô tả lần đầu tiên vào năm 1993 [22] Nó có

liên quan đến LRP2 [23] Đây là một rối loạn di truyền ảnh hưởng đến

nhiều bộ phận của cơ thể

Rối loạn này được đặc trưng bởi các đặc điểm bất thường trên khuôn mặt, bao gồm đôi mắt mở to, nổi bật với các góc bên ngoài hướng xuống dưới; mũi củ cải ngắn với sống mũi tẹt; tai bị xoay về phía sau

Những người mắc hội chứng Donnai – Barrow bị mất thính lực nghiêm trọng do các bất thường của tai trong (mất thính giác thần kinh giác quan) Ngoài ra, họ thường gặp các vấn đề về thị lực, bao gồm cận thị cực độ (cận thị cao), bong tróc hoặc suy giảm mô nhạy cảm với ánh sáng ở phía sau của mắt (võng mạc) và mất thị lực dần dần Một số có một khoảng trống hoặc phân chia ở phần có màu của mắt (u mống mắt) [24;25]

Ở hầu hết những người mắc hội chứng Donnai – Barrow, mô nối nửa trái và phải của não (thể tích) kém phát triển hoặc không có Những người

bị ảnh hưởng cũng có thể có những bất thường về cấu trúc khác của não Nhìn chung, họ bị thiểu năng trí tuệ từ nhẹ đến trung bình và chậm phát triển

Những người bị hội chứng Donnai – Barrow cũng có thể có một lỗ trên cơ ngăn cách bụng với khoang ngực (cơ hoành), được gọi là thoát vị

cơ hoành Dị tật bẩm sinh nghiêm trọng tiềm ẩn này cho phép dạ dày và ruột di chuyển vào lồng ngực và có thể chèn ép tim và phổi đang phát triển Một lỗ hở trên thành bụng cho phép các cơ quan trong ổ bụng nhô ra qua rốn cũng có thể xảy ra ở những người bị ảnh hưởng Đôi khi những người mắc hội chứng Donnai – Barrow có bất thường về ruột, tim hoặc các cơ quan khác và chứng vẹo cột sống

- Nguyên nhân:

Các đột biến trong gen LRP2 gây ra hội chứng Donnai – Barrow Gen

LRP2 cung cấp hướng dẫn để tạo ra một protein gọi là megalin, có chức

năng như một thụ thể Các protein thụ thể có các vị trí cụ thể mà một số protein khác, được gọi là phối tử, khớp với nhau như chìa khóa vào ổ khóa Cùng nhau, các phối tử và các thụ thể của chúng kích hoạt các tín hiệu ảnh hưởng đến sự phát triển và chức năng của tế bào Megalin có nhiều phối tử tham gia vào các quá trình khác nhau của cơ thể, bao gồm sự hấp thụ

vitamin A và D, chức năng miễn dịch, phản ứng với căng thẳng và vận chuyển chất béo trong máu

Megalin được nhúng trong màng tế bào lót bề mặt và khoang của cơ thể (tế bào biểu mô) Receptor giúp di chuyển các phối tử của nó từ bề mặt

tế bào vào trong tế bào (endocytosis) Nó hoạt động trong sự phát triển và chức năng của nhiều bộ phận của cơ thể, bao gồm não và tủy sống (hệ thần kinh trung ương), mắt, tai, phổi, ruột, hệ thống sinh sản và các ống nhỏ trong thận, nơi hình thành nước tiểu (ống thận)

Các đột biến gen LRP2 gây ra hội chứng Donnai-Barrow được cho là

dẫn đến thiếu protein megalin chức năng Việc thiếu megalin chức năng trong ống thận làm cho các phối tử khác nhau của megalin được bài tiết qua nước tiểu chứ không được hấp thu trở lại vào máu Các đặc điểm của hội chứng Donnai – Barrow có thể là do megalin không có khả năng giúp hấp thụ các phối tử này, gián đoạn các đường truyền tín hiệu sinh hóa hoặc các tác động khác của protein megalin không có chức năng Tuy nhiên, người

ta vẫn chưa rõ những bất thường này dẫn đến các dấu hiệu và triệu chứng

cụ thể của rối loạn như thế nào

Một tình trạng trước đây được phân loại là một rối loạn riêng biệt được gọi là hội chứng facio-oculo-acoustico-thận (FOAR) cũng đã được

phát hiện là do đột biến LRP2 gây ra Hội chứng FOAR hiện được coi là rối

loạn tương tự như hội chứng Donnai – Barrow

1.6 Công nghệ giải mã hóa toàn bộ hệ gen biểu hiện (WES):

Giải trình tự vùng gen exome (Whole exome sequencing - WES) là một

ứng dụng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) để xác định các biến thể trên tất cả các vùng mã hóa trong hệ gen Việc phát hiện các biến dị di truyền giúp phát hiện các biến dị gây ra bệnh di truyền đã biết, từ đó tiến hành sàng lọc ung thư/bệnh di truyền sớm hoặc theo dõi đáp ứng điều trị; cung cấp các biến dị cho nghiên

cứu, đánh giá đa dạng quần thể bằng cách xác định tần số alen WES ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu bệnh hiểm nghèo, khó chuẩn đoán, không phát hiện rõ nguyên nhân như ung thư, tim mạch, thần kinh [26]

Ưu điểm của việc giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là phương pháp tiếp cận hợp lý đối với những vùng gen quan tâm hay những vùng exome chứa gen đột biến, ví dụ exome chỉ chiếm 2% trong hệ gen người nhưng biến đổi trong đó lại gây nên 85% các căn bệnh đã biết [27] Do vậy, việc nghiên cứu lâm sàng các bệnh di truyền hiện nay dựa trên kết quả giải trình

tự WES đã được sử dụng rất phổ biến

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân và các thành viên trong gia đình bệnh nhân mắc bệnh tim bẩm sinh tại Khoa Tim mạch, Bệnh viện E Tất cả các đối tượng tham gia nghiên cứu đều được cung cấp đầy đủ thông tin Mục tiêu nghiên cứu và tham gia nghiên cứu tự nguyện theo đúng quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh học của tổ chức trong nước và trên thế giới

Tất cả các thông tin liên quan đến bệnh nhân và nghiên cứu đều được bảo mật

Nghiên cứu này được sự đồng ý từ gia đình bệnh nhân và đã được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Viện Nghiên cứu hệ gen thông qua

2.2 Vật liệu và hóa chất

2.2.1 Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu là mẫu máu của bệnh nhân tim bẩm sinh và gia đinh người bệnh ở Việt Nam được cung cấp bởi Khoa tim mạch - Bệnh viện E

2.2.2 Hóa chất

Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

 Bộ Kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA purification Minikit của hãng Thermo (Mỹ) và QIAamp DNA của hãng QIAGEN dùng

để tách DNA tổng số

 Bộ Kit giải trình tự WES của hãng Illumina

 Bộ KIT GeneJET Extraction của hãng Thermo (Mỹ) dùng để tinh sạch PCR

 Nhóm hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Taq DNA polymerase, buffer, dNTP, mồi đặc hiệu

 Nhóm hóa chất dung cho điên di gel agarose: Gel agarose, đệm TAE 1X, dye, ethydium bromide

 Cân điện tử Precisa ( Thụy Sĩ)

 Máy chu trình nhiệt GeneAmp PCR System 9700 (Mỹ)

 Máy chụp Gel BioRad (Đức)

 Máy điện di BioNeer (Nhật Bản)

 Pipette Gilson (Pháp)

 Bể ổn nhiệt Memmert (Hàn Quốc)

 Bộ dụng cụ điện di (Đài Loan)

 Máy đo quang phổ (Đức)

 Ống đầu côn hãng Thermo

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu bao gồm các bước chính: thu thập mẫu máu, tách chiết DNA, giải trình tự toàn bộ vùng gen mã hóa, phân tích số liệu nhằm tìm ra đột biến liên quan đến bệnh, sàng lọc và kiểm chứng lại đột biến gây bệnh theo hình 4

Hình 4: Quy trình phân tích và sàng lọc đột biến

- Thu thập mẫu máu:

Mẫu máu của bệnh nhân và các thành viên trong gia đình bao gồm

bố, mẹ và anh, chị, em bệnh nhân đƣợc cung cấp bởi Khoa Tim mạch - Bệnh viện E Hà Nội, sau khi đƣợc sự đồng ý của bố mẹ bệnh nhân Mỗi đối tƣợng tham gia nghiên cứu đƣợc thu thập 2 ml máu tĩnh mạch, chống đông EDTA 1,5 mg/ml Tất cả mẫu máu sau đó đƣợc bảo quản ở nhiệt độ -20°C

- Tách chiết DNA và giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa của một

số bệnh nhân mắc dị tật tim bẩm sinh:

Mẫu máu của các bệnh nhân và thành viên trong gia đình được tách chiết bằng bộ kit QIAamp DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm DNA tổng số được tiến hành điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

và đo quang phổ để xác định nồng độ và độ tinh sạch

2.3.1 Phương pháp tách DNA tổng số

DNA tổng số được chiết xuất từ các mẫu máu toàn phần bằng bộ kit QIAamp DNA Blood Mini Kit-QIAGEN Phương pháp này bao gồm các bước sau:

 Bước 1: Dùng pipet lấy 20 μl QIAGEN Protease (hoặc proteinase K) vào đáy của ống ly tâm 1,5 ml

 Bước 2 Cho 200 μl mẫu máu toàn phần vào ống ly tâm

 Bước 3: Thêm 200 μl Buffer AL vào mẫu Trộn đều trong 15 giây

 Bước 4: Ủ ở 56°C trong 10 phút

 Bước 5: Ly tâm nhanh để loại bỏ các giọt bên trong nắp

 Bước 6: Thêm 200 μl ethanol (96-100%) vào mẫu và trộn trong 15 giây Sau khi trộn, ly tâm nhanh để loại bỏ các giọt bên trong nắp

 Bước 7: Cẩn thận chuyển hỗn hợp từ bước 6 lên cột QIAamp Mini (trong ống thu 2 ml) Đậy nắp và ly tâm ở tốc độ 6000 x g (8000 vòng / phút) trong 1 phút Đặt cột vào một ống 2 ml sạch và loại

bỏ dịch

 Bước 8: Cẩn thận mở cột và thêm 500 μl Buffer AW1 Đậy nắp và

ly tâm ở tốc độ 6000 x g (8.000 vòng / phút) trong 1 phút

 Bước 9: Đặt cột vào ống 2 ml sạch, và loại bỏ dịch lọc

 Bước 10: Cẩn thận mở cột và thêm 500 μl Buffer AW2 Đậy nắp

và ly tâm ở tốc độ tối đa (14.000 vòng / phút) trong 3 phút

 Bước 11: Đặt cột vào ống thu mới 2 ml và loại bỏ phần lọc Ly tâm ở tốc độ tối đa trong 1 phút

 Bước 12: Đặt cột vào một ống ly tâm 1,5 ml sạch và loại bỏ hoàn toàn dịch lọc Cẩn thận mở cột và thêm 200 μl Buffer AE hoặc nước cất Ủ ở nhiệt độ phòng (15–25°C) trong 1 phút, và sau đó ly tâm ở 6.000 x g (8.000 vòng / phút) trong 1 phút

Sau khi có mẫu DNA, mẫu DNA sẽ được điện di trên gel agarose 1% Mẫu được nhuộm Ethidium bromide trong 3 đến 5 phút và rửa bằng nước cất trong 2 đến 3 phút Cuối cùng quan sát bản gel dưới tia UV

Sau đó, sản phẩm DNA tổng số được đo quang phổ để xác định

nồng độ và độ tinh sạch

2.3.2 Phương pháp kiểm tra nồng độ DNA tổng số

Kiểm tra nồng độ DNA là một bước không thể thiếu trong quá trình tách chiết DNA vì số lượng và chất lượng DNA có thể ảnh hưởng đến chất lượng PCR Biết được nồng độ DNA sẽ dễ dàng tính toán được số lượng cần thiết Enzyme Tag polymerase dùng để nhân đúng số lượng DNA mong muốn và có kết quả chính xác cao Phương pháp dùng trong nghiên cứu này là đo quang phổ DNA Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào sự hấp phụ ánh sáng khác nhau của các bazo nito của phân tử DNA mạch kép và mạch đơn để xác định hàm lượng DNA trong dung dịch Phân tử DNA hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm Giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu cho phép xác định nồng độ nucleic acid trong dung dịch

Đơn vị A260nm tương ứng nồng độ 50 ng/ml cho một dung dịch DNA sợi đôi Nồng độ DNA trong mẫu được tính theo công thức sau:

C DNA (ng/ml)= A 260nm x 50 x Độ pha loãng

Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở

280 nm (A280nm) Ở bước sóng này, các protein có mức hấp thụ cao nhất Ngoài ra, các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid Một dung dịch nucleic acid được coi là sạch (không tạp nhiễm protein) khi tỷ số: A260nm/A280nm nằm trong khoảng 1,8-2

Các bước đo OD:

 Chuẩn bị mẫu DNA đo OD: Hòa 10 ml dịch DNA cần đo vào 90

ml nước khử ion vô trùng (pha loãng 10 lần)

 Đo đối chứng: Lấy 100 ml nước khử ion vô trùng vào cuvet, đo ở bước sóng 260 nm, 280 nm

 Đo mẫu: Lấy 100 ml mẫu DNA đã chuẩn bị ở trên vào cuvet, đo ở bước sóng 260 nm, 280 nm

 Đọc độ hấp thụ trên máy đo quang phổ ở bước sóng 260 nm, 280

Thông thường, gel có chứa một phần đường của thạch tinh khiết gọi là agarose, chất này ngoài việc làm gel đồng nhất hơn nó còn hoạt động như một rây phân tử, làm tách biệt các đoạn dựa trên kích thước của chúng khi trong điện trường

Các đoạn DNA càng nhỏ sẽ chuyển động càng nhanh và càng

xa so với các đoạn lớn Để xác định kích thước của một đoạn DNA, người ta so sánh với các đoạn DNA tiêu chuẩn (Marker)

Nồng độ gel agarose được sử dụng khác nhau mà tùy thuộc vào thí nghiệm cần nghiên cứu, thường nằm trong vùng khoảng 0,8 – 1,5%

Để hiện hình các băng DNA trên bảng gel, người ta thường sử dụng thuốc nhuộm Ethydium bromide (EtBr) Chất này liên kết với DNA bằng cách xen vào giữa và kế sát cặp bazo (liên kết nhuộm) Khi chiếu UV vào bản gel, các liên kết nhuộm sẽ hấp thụ và phát huỳnh quang, có thể nhận thấy bằng mắt thường hoặc chụp ảnh

Quy trình:

- Chuẩn bị gel agarose:

 Cân 0,8 g agarose cho vào100 ml dung dịch đệm TAE 1X

 Đun hỗn hợp trên lò vi sóng cho đến khi dung dịch trong suốt

 Để nguội xuống khoảng 50°C rồi đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn lược

 Để khoảng 30 phút gel đông đặc hoàn toàn, gỡ lược ra và đặt bản gel vào bề mặt điện di Đổ đệm TAE 1X vào bề mặt dung dịch ngập cách mặt gel 1-2 mm

- Tra mẫu DNA:

 Lấy 3-5 µl mẫu DNA trộn với 1-3 µl đệm màu loading dye (Chất này vừa có tác dụng tạo màu để quan sát, vừa có tác dụng giúp cho mẫu DNA lắng xuống đáy giếng trước khi chạy điện di) và tra vào các giếng nhỏ trong bản gel

 Sử dụng marker 1 kb để làm thang DNA chuẩn

- Chạy điện di:

 Tiến hành điện di mẫu DNA với thang DNA chuẩn ở hiệu điện thế 100 V trong 30 phút DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương Quan sát sự di chuyển của màu bromophenol blue để biết khi nào dừng điện di

- Nhuộm bản gel điện di bằng EtBr:

 Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µl/ml trong thời gian 5-10 phút Sau

đó lấy bản gel ra tráng qua nước khoảng 3-5 phút rồi quan sát chụp ảnh dưới ánh sáng tia tử ngoại của máy soi chụp gel (Bio – Rad)

2.3.4 Phương pháp giải trình tự vùng gen mã hóa

Các bước thực hiện như sau:

- Bước 1: Phân tích dữ liệu giải trình tự để xác định biến đổi di truyền

- Bước 2: Tạo thư viện bằng SureSelect All Exon V6

DNA tổng số sau khi được phân mảnh, lai và tinh sạch bằng SureSelect All Exon V6 để gắn được tất cả các exome đã biết theo hướng dẫn của nhà sản xuất Illumia

- Bước 3: Giải trình tự thế hệ mới Illumina

Thư viện lai exome sau khi được xử lý, được tiến hành giải trình tự trên máy giải trình tự thế hệ mới Illumina

DNA tổng số sẽ được cắt, lai và tinh sạch bằng SureSelect All Exon V6 để tạo thư viện exome theo hướng dẫn của nhà sản xuất Illumina Thư viện exome sau khi được xử lý, được tiến hành giải trình tự trên máy giải trình tự thế hệ mới Illumina theo hướng dẫn của nhà sản xuất Illumina Kiểm định chất lượng đọc ban đầu bằng phần mềm FastQC Bước này đặc biệt quan trọng vì nó đảm bảo cho các bước phân tích tiếp theo

Sau khi giải trình tự trên máy Illumina, chất lượng đọc được kiểm tra bằng phần mềm FastQC Dữ liệu trình tự được sắp xếp và so sánh với trình

tự gen người (hg19) bằng phần mềm BWA 0.7.10 (Li and Durbin, 2009) [31] Công cụ Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) được sử dụng

để xử lý dữ liệu sau khi gióng hàng Các biến thể được phát hiện bằng phần mềm Genome Analysis Toolkit v3.4 (McKenna et al., 2010) [28] Ảnh hưởng của biến thể được xác định bằng các phần mềm SnpEff v4.1

(Cingolani et al., 2012) [29] Đây là công cụ chú thích và dự báo ảnh

hưởng của các biến thể gen (như thay đổi axit amin) Dữ liệu đầu vào của công cụ này là các biến thể được dự đoán (SNPs, chèn, xóa và MNPs), là kết quả của giải trình tự, và có định dạng VCF (Variant Call Format)

Trong dữ liệu đầu ra, SnpEff sẽ phân tích các biến đầu vào để chú giải và tính toán các tác động mà các biến thể có thể tạo ra SnpEff đưa ra các kết quả như sau: Kiểu gen và các điểm bị ảnh hưởng bởi biến thể; vị trí của các biến thể; ảnh hưởng của biến thể đến quá trình tổng hợp protein; so sánh với các dữ liệu khác để tìm các biến thể đã biết

- Sàng lọc biến thể liên quan đến bệnh tim kèm dị tật khác:

Sau khi phân tích, các biến thể được sàng lọc theo các tiêu chí sau:

• Biến thể xảy ra trên các gen đã được công bố là liên quan đến bệnh dị tật tim bẩm sinh

• Biến thể có tần suất alen MAF < 1% Tần suất alen của biến thể được tham khảo dựa trên bộ cơ sở dữ liệu 1000 hệ gen người (1000 Genomes Project)

• Lọc các biến thể dự đoán là có ảnh hưởng đến chức năng của protein

• Những đột biến được báo cáo là lành tính trên cơ sở dữ liệu ClinVar bị loại bỏ

- Kiểm chứng các đột biến trên bệnh nhân và thành viên gia đình:

Các đột biến tiềm năng gây bệnh tìm được được kiểm chứng bằng phương pháp giải trình tự Sanger trên cả bệnh nhân và gia đình nhằm xây

dựng phả hệ và nghiên cứu cơ chế di truyền của bệnh

2.3.5 Thiết kế mồi nhân đoạn gen chứa các đột biến cần kiểm nghiệm

Cặp mồi khuếch đại gen được thiết kế dựa trên trình tự gen LRP2 có

mã số là ENSG00000081479 từ cơ sở dữ liệu Ensembl Cặp mồi phù hợp cần đạt các tiêu chí sau:

• Bám một cách chính xác vào DNA mẫu;

• Chiều dài cặp mồi phù hợp, thường từ 18-30 nucleotide;

• Tỉ lệ %GC phù hợp, thường từ 50-60%;

• Tránh hình thành dạng xoắn cặp tóc, cặp mồi tránh bắt cặp với nhau;

• Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm nhỏ hơn nhiệt độ của Taq polymerase, thường nằm trong khoảng 50-60°C

Trong nghiên cứu này, cặp mồi khuếch đại gen được thiết kế bằng công

cụ Primer – BLAST

Kích thước đoạn gen được khuếch đại bằng cặp mồi trên là 240 bp

Gen LRP2 có nucleotide thay đổi: c.428-10_428-8dellTTT

Mồi sử dụng: Mồi xuôi: 5’-AGGGAGCATACTTCTTTTGTGTATC-3’ Mồi ngược: 5’-CTGAGGAGTCCCTGCAATCA-3’

2.3.6 Kỹ thuật PCR

2.3.6.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của Polymerase Chain Reaction, được dịch là