Phương pháp xác định hàm lượng vitamin B2 trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang

Trong các phương pháp lý học có thể dùng chủ yếu là phương pháp quang phổ trong vùng tia tím tửngoại và phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B2.. Tuy nhiên phương pháp này không phù

MỞ ĐẦU

Sự khám phá ra vitamin là một trong những thành tựu lớn của hoá sinh.Vitamin là một nhóm các hợp chất hoá học có mặt trong hầu hết các loạithực phẩm, được phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan trong dầu vàvitamin tan trong nước Mặc dù, các vitamin không cung cấp năng lượngnhưng chúng rất cần thiết cho các hoạt động sống của con người Vitaminthúc đẩy quá trình trao đổi chất và là thành phần không thể thiếu được trongcấu tạo của nhiều loại enzyme Do đó vitamin đóng vai trò như những chấtxúc tác.Trong các loại vitamin thì vitamin B2 (Riboflavin) giữ vai trò quantrọng trong nhiều hoạt động của cơ thể Vitamin B2 có nhiều trong các sảnphẩm từ sữa, men bia, thịt, gan, trứng, rau xanh và các sản phẩm từ cá

Các phương pháp định lượng vitamin B2 hầu hết chỉ tiến hành bằngphương pháp hóa học, vì phương pháp sinh học phụ thuộc một cách đáng kểvào tính chất của động vật và tương đối ít chính xác Trong các phương pháp

lý học có thể dùng chủ yếu là phương pháp quang phổ trong vùng tia tím tửngoại và phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B2

Xuất phát từ những vấn đề trên và được sự phân công của giáo viênhướng dẫn, em đã tiến hành tìm hiểu “ Phương pháp xác định hàm lượngvitamin B2 trong dược phẩm bằng phương pháp trắc quang”

Phần I Tổng quan 1.1 Giới thiệu chung về vitamin

1.1.1 Định nghiã

Vitamin là những hợp chất hữu cơ, được cung cấp cho cơ thể với sốlượng nhỏ từ thức ăn, là những chất không thể thiếu được với cơ thể ngườicũng như động vật để tạo ra các coenzyme cần thiết cho phản ứng chuyểnhóa khác nhau

1.1.2 Phân loại

Dựa vào độ tan của vitamin, người ta chia thành 2 nhóm:

- Vitamin hòa tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C

- Vitamin hòa tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E,vitaminK

1.1.3 Vai trò của vitamin

Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất xảy ra trong cơthể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin Các động vật cũng như conngười không có khả năng tự tổng hợp được các vitamin bằng quá trình đồnghóa Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là thức ăn Do vậy, cơ thể có thể thừahay thiếu vitamin Khi cơ thể bị thiếu hay không có một vitamin nào đó thì

sẽ mắc một số bệnh như quáng gà, còi xương, viêm đa dây thần kinh…

Ngược lại khi thừa vitamin nói chung, các vitamin không gây độc và bị đàothải ra ngoài.

1 2 Vài nét về vitamin B2

1.2.1 Lịch sử

Vitamin B2 được khám phá vào năm 1920 và lần đầu tiên vitamin B2 được tách từ trứng vào năm 1933 Lúc đầu, nó có tên là ovoflavin, sau đó được các nhà khoa học Booher, Elliger, Koschara tách được viboflavin từ casein Vì vậy nó mang tên là lactoflavin Tới năm 1935 Karrer và các cộng tác viên đã tổng hợp được hàng loạt các dẫn xuất có cấu tạo 6,7 dimetyl-9-isoaloxazin tương ứng đúng với lactoflavin tách được từ các nguyên liệu thiên nhiên

- Tinh thể khô, có vị đắng, bền với nhiệt và dung dịch axit.

- Vitamin B2 rất quan trọng đối với cơ thể , trong cơ thể vitamin B2 dễ

bị phosphoryl hóa tạo nên nhóm hoạt động của các enzym xúc tác cho cácquá trình oxi hóa - khử

- Vitamin B2 không bền với ánh sáng Khi tiếp xúc với ánh sáng làmmất hoạt tính, nên bảo quản vitamin B2 hạn chế tiếp xúc ánh sáng, dùng lọmàu nâu để bảo quản

- Riboflavin tương đối bền trong môi trường axit, nhưng lại dễ bị pháhủy nhanh trong môi trường kiềm, thuốc thử KMnO4

- Các chất khử như H hoạt tính, NaHSO4, TiCl khử nó một cách thuậnnghịch thành hợp chất leuco

- Môi trường kiềm phần lớn tạo ra lumiflavin, môi trường axit tạo ralumicrom

- Vitamin B2 được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật

1.2.3 Vai trò của vitamin B 2 đối với sức khoẻ con người

- Vitamin B2 tham gia vào cấu trúc của enzym dehydrogenase hiếukhí (men vàng) ở dạng flavinmononucleotid (FMN) và flavinadenozindinucleotid ( FAD) Hai dẫn xuất này chính là xúc tác cho phản ứngchuyển vị hydro trong quá trình hô hấp của tế bào Vì vậy thiếu vitamin B2thì khả năng sinh trưởng và phát triển của tế bào biểu bì ruột bị rối loạn dẫnđến chảy máu đường ruột Các quá trình sinh lý, sinh hóa trong cơ thể xấu đi

và xuất hiện các triệu chứng rối loạn dẫn đến tình trạng nở miệng, longmóng, thiếu máu, rụng tóc

- Vitamin B2 cần thiết để nâng cao sức đề kháng cơ thể sống đối vớibệnh nhiễm trùng, để làm tăng tốc độ tái tạo máu cũng như ảnhhưởng đến sự phát triển của bào thai

- Ngoài ra, cùng với vitamin PP, vitamin A, vitamin B2 tham giaquá trình cảm nhận ánh sáng của mắt

1.2.4 Nhu cầu

Nhu cầu vitamin B2 phụ thuộc vào điều kiện nghề nghiệp, vào trạngthái sinh lý của cơ thể, vào lứa tuổi Trung bình người lớn cần1,8-2,0mg/24h ; trẻ em cần 0,5-1,5mg/24h ; phụ nữ mang thai cần : 2,0-4,0mg/24h Người và động vật không có sừng không tổng hợp được B2 màphải nhận từ nguồn thức ăn Động vật có sừng có thể tự tổng hợp đượcvitamin B2 ở ruột của chúng nhờ các vi sinh vật và cung cấp cho động vậtchủ

1.2.5 Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitamin B 2

Vitamin B2 có nhiều trong các sản phẩm từ sữa, rau cải , nấm men,bánh mì, men bia, thịt, gan, trứng và các sản phẩm từ cá Trong rau xanhcũng có nhiều vitamin B2, nó được tổng hợp từ các tế bào thực vật và vi sinhvật.

Bảng 1.2.1: Nguồn vitamin B2 trong thực phẩm

1.3.3.Phương pháp cực phổ

Phương pháp cực phổ được dùng có hiệu quả để định lượng riboflavintrong dược phẩm R.Brdicka và E.Kno-bloch là người đầu tiên đã nghiêncứu phương pháp cực phổ để định lượng vitamin B2 và nghiên cứu sự phụthuộc của vitamin B2 vào pH Sóng cực phổ của riboflavin có tính khuếchtán, chiều cao của sóng phụ thuộc theo đường thẳng vào nồng độ, vì thếsóng này rất phù hợp để định lượng

Để định lượng riboflavin, trước tiên ta lập đường chuẩn của mẫu chuẩnvới các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5mg trong 10ml dung dịch đệmphosphat 0,1M, pH =6,8 Sau đó ta hút các thể tích tương ứng 0,25; 0,5;0,75; 1,0; 1,25 ml dung dịch riboflavin chuẩn và đổ đầy dung dịch đệmphosphate đến thể tích 10ml Ta tiến hành đo cực phổ và ghi đường chuẩn

Chuẩn bị dung dịch thử: Hút 2ml mẫu thử và 8ml dung dịch đệmphosphate 0,1M, pH = 6,8 vào bình định mức 10ml Ta sục dung dịch bằngkhí Nito khoảng 15 phút và ghi đường cong trong cùng điều kiện với dungdich mẫu chuẩn, dùng acquy 2V Ta được hình cực phổ và xác địnhriboflavin theo đường chuẩn

Phương pháp cực phổ rất thích hợp để kiểm tra hàm lượng riboflavintrong các chế phẩm dược và có thể định lượng thẳng hỗn hợp vitamin nhóm

B Tuy nhiên phương pháp này không phù hợp để định lượng riboflavintrong các nguyên liệu sinh vật học vì riboflavin tồn tại trong các nguyên liệusinh vật học dạng kết hợp nên phương pháp cực phổ không xác định được

1.3.4.Phương pháp huỳnh quang

Đo huỳnh quang màu xanh của riboflavin được coi như một phươngpháp cơ bản hay dùng nhất để định lượng chất này trong các nguyên liệuthiên nhiên Nồng độ của huỳnh quang phụ thuộc vào pH của dung dịch,nồng độ cực đại nằm ở vùng pH = 6-7 Huỳnh quang giảm mạnh nhất ở pHdưới 3,8 và pH trên 7,7 Độ chính xác của phương pháp đo huỳnh quangdựa trên cơ sở điều kiện triết và loại trừ các huỳnh quang phụ có ảnh hưởngkhi đo

Cách tiến hành định lượng sau khi chuẩn bị mẫu thử, dụng cụ và cácthuốc thử hóa học : Nhỏ vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 10ml dung dịch chiếtcủa mẫu thử, cho vào trong hai ống nghiệm mỗi ống 1ml dung dịch mẫuchuẩn riboflavin và hai ống kia mỗi ống 1ml nước Trong mỗi một ốngnghiệm lại cho thêm 1ml axit axetic kết tinh, lắc đều và cho thêm 0,5mldung dịch Kali pemanganat và để yên trong 2 phút Sau đó cho thêm vào cả

4 ống nghiệm mỗi ống 0,5ml dung dịch nước oxy già và lắc đều Màu củakali pemanganat mất trong 5 giây Cho tiếp vài giọt cồn caprylic hoặcaxeton Điều chỉnh máy so màu huỳnh quang ở độ nhạy thích hợp Sau đótiến hành tính cả mẫu thử có cho thêm mẫu chuẩn và mẫu thử chính khôngcho thêm mẫu chuẩn Tính trung bình cả hai lần đo Định lượng mẫu trắngsau khi cho 20mg natri hidro sunfit vào từng ống nghiệm.Từ đó tính ra nồng

độ của riboflavin trong mẫu thử

Phương pháp huỳnh quang có nhược điểm là sự phân tích bằng ánhsang không xảy ra hoàn toàn được và các sản phẩm phân tích lumicrom vàlumiflavin sẽ bị phân hủy tiếp khi tiếp xúc với ánh sáng

1.3.5.Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Kuhn và đồng nghiệp là người đầu tiên đã đo quang phổ hấp thụ củariboflavin và tìm thấy trong dung dịch nước riboflavin bốn cực đại hấp thụ ởcác bước sóng 223nm ; 375nm ; 267nm ; 444nm C.Daglish, M.Baxter xácđịnh rằng quang phổ hấp thụ tia tím tử ngoại của riboflavin phụ thuộc đáng

kể vào pH Và khi xác định về định lượng cần phải đo quang phổ hấp thụcủa mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng một chất đệm như nhau

Tiến hành định lượng trong điều kiện tránh ánh sáng Cân chính xácmột lượng bột viên tương ứng với khoảng 10mg riboflavin, thêm hỗn hợpgồm 5ml axit axetic kết tinh và 100ml nước Đun cách thủy 1 giờ, lắc liêntục Thêm 500ml nước, để nguội, thêm 30ml dung dịch natri hidroxyd 1N vàlắc liên tục, pha loãng với nước thành 1000,0ml, lắc đều Lọc loại bỏ dungdịch đầu Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở bước song 444nm, trong cốcdày 1cm, so với mẫu trắng là nước Tình hàm lượng riboflavin trong mẫutheo giá trị A(1%,1cm) ở 444nm là 328

Phương pháp quang phổ hấp thụ vùng tử ngoại được dùng như mộtphương pháp thử đặc hiệu để xác định các nguyên liệu riboflavin và dượcphẩm

Theo sự phân công của giáo viên hướng dẫn, em xin trình bày vềphương pháp định lượn vitamin B2 bằng phương pháp quang phổ hấp thụphân tử

Phần II Phân tích Vitamin B2 bằng phương pháp

quang phổ hấp thụ phân tử

2.1.Cơ sở lý thuyết của phương pháp

2.1.1Nguyên tắc

Muốn xác định một cấu tử X nào đó, người ta chuyển nó thành những chất

mà có khả năng hấp thụ ánh sáng, sau đó đo sự hấp thụ ánh sáng của nó Từ

đó suy ra hàm lượng của chất cần phân tích

Phản ứng thực hiện trong phép so màu có phản ứng trực tiếp và gián tiếp

2.1.2 Các định luật cơ bản về sự hấp thụ bức xạ đơn sắc

Định luật Bugơ-Lambe : I0=I+Ia+Ir

Trong đó: Ia là phần cường độ bị hấp thụ

Ir là phần cường độ bị phản xạ

I là cường độ ló ra

Định luật hấp thụ ánh sáng :

Nếu chiều một chùm sáng đơn sắc có cường độ Io qua một dung dịch có

bề dày là b(cm) thì sau khi ra khỏi dung dịch nó bị hấp thụ một phần, nêncường độ chỉ còn lại là It với điều kiện It < Io

It là cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi đã truyền qua dd

A là mật độ quang phụ thuộc tuyến tính vào C

Ý nghĩa của hệ số hấp thụ phân tử ε

- Trường hợp C tính bằng mol/l và bằng 1mol/l, b tính bằng cm và bằng

1cm thì : A = 

 đặc trưng cho bản chất của chất tan trong dung dịch, nó chỉ phụ thuộc vàobước sóng Định luật Lambert – Beer chỉ đúng khi dùng bức xạ đơn sắc

- Trường hợp nồng độ C tính theo % và bằng 1%, b = 1cm thì E(1%,1cm)

là hệ số hấp thụ riêng, nó đăc trưng cho mỗi chất Trong phân tích kiểmnghiệm hay dùng E(1%,1cm)

2.1.3.Tính chất cộng tính của mật độ quang

n

n n n

n o

o

D D

D D D

I

I I

I I

I I

I D

I

I I

I I

I I

I I

I D

lg lg lg

lg lg

3 2 1

1 3

2 2

1 1 0

1 3

2 2

1 1

2.1.4.Điều kiện áp dụng định luật Lambert_beer

- Ánh sáng phải đơn sắc

- Khoảng nồng độ phải thích hợp : định luật L-B chỉ đúng trong một khoảnggiới hạn nhất định của nồng độ

- Dung dịch phải trong suốt

- Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của ánh sang

UV-VIS.

2.2.Chọn điều kiện xây dựng quy trình định lượng

Để xây dựng quy trình định lượng , chúng ta cần khảo sát để chọn cácđiều kiện thích hợp

2.2.1Chọn bước sóng ứng với các cực đại hấp thụ

Bước sóng cực đại là tại đó giá trị mật độ quang A là lớn nhất Cách xácđịnh : cho một lượng chất dung dịch chuẩn của chất cần xác định X tạo phứcmàu với thuốc thử R Sau đó tiến hành khảo sát mật độ quang của dung dịch

ở các bước sóng khác nhau từ 380 – 800nm Đo bước sóng từ 380 – 600nm,khoảng cách mỗi lần đo là 10nm Từ giá trị mật độ quang lớn nhất thu được

ta suy ra bước sóng cực đại

2.2.2.Chọn pH tối ưu

Nếu thuốc thử là một axit yếu thì nồng độ H+ có ảnh hưởng lớn tới sựtạo phức, làm ảnh hưởng đến giá trị mật độ quang Vì vậy trước khi phântích ta cần phải khảo sát lại giá trị pH tối ưu Cách xác định : Lấy một lượngtiêu chuẩn chất cần phân tích chế hóa với các thuốc thử để tạo màu Sau đóthay đổi các giá trị pH của phức màu bằng cách thêm axit hoặc bazo Tiếnhành đo giá trị mật độ quang của dung dịch phức màu Tại giá trị pH nào màgiá trị mật độ quang lớn nhất chính là giá trị pH tối ưu

2.2.3.Chọn khoảng thời gian tối ưu

Thời gian tối ưu được xác định đối với phức, là khoảng thời gian mà mật

độ quang đạt giá trị lớn nhất và ổn định Các xác định : Cho một lượng chấttiêu chuẩn cần phân tích được chế hóa với thuốc thử để tạo phức màu, sau

đó khảo sát giá trị mật độ quang của phức trong khoảng thời gian khác nhau(1p,3p,5p,10p ) Tại khoảng thời gian nào mà phức đạt giá trị mật độ quang

ổn định và lớn nhất thí đó là khoảng thời gian tối ưu

- Chọn tỉ lệ thuốc thử : Sự hấp thụ của các chất lạ, thuốc thử cũng cóthể ảnh hưởng đến kết quả định lượng Vì vậy trong quá trình làm phản ứngtạo màu phải chú ý đến điều kiện và các thành phần tham gia phản ứng.

2.3 Máy quang phổ UV-VIS:

2.3.1 Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

2.3.2.Các bộ phận chính của máy đo phổ hấp thụ phân tử UV-VIS

Không phụ thuộc vào vùng phổ, các máy đo độ truyền quang và độ hấp thụ(mật độ quang) của dd bao gồm 5 bộ phận cơ bản sau :

- Nguồn bức xạ có năng lượng ổn định, hiện nay trang bị 2 loại đèn: W-Lamp(vùng khả kiến),D-Lamp(vùng tử ngoại)

- Bộ phận tạo bức xạ có bước sóng thích hợp với chất nghiên cứu gồm :

hệ lăng kính, cách tử

- Ngăn đựng mẫu gồm các cuvet chứa đựng dd đo, thường sử dụng cuvetthủy tinh cho vùng khả kiến, nếu đo trong vùng tử ngoại thì phải dùng cuvetthạch anh

- Đêtectơ là loại thiết bị có khả năng thu những thông tin : cơ, điện,quang thành những tín hiệu, thường là tín hiệu điện Trong máy UV-VIS thìđêtectơ là các tế bào quang điện với hiệu ứng quang điện ngoài hay các nhânquang điện

- Bộ phận chỉ thị kết quả :là một máy tính hoặc bộ phjận giống máy tính

có chức năng thu nhân và hiển thị kết quả phân tích(các dãy phổ phân tích)

2.4.Các phương pháp định lượng trong quang phổ hấp thụ phân tử.

2.4.1.Phương pháp tỉ lệ so sánh

Theo định luật Lambert-Beer, sau khi đo độ hấp thụ của dung dịchchuẩn so sánh (S) và dung dịch mẫu thử (X) ta có:

Ax = .b.CxTrong đó : As: là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ Cs

Ax: là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử có nồng độ Cx

Vì hệ số hấp thụ  và bề dày của cuvet b là như nhau nên ta có :

Ax/As = Cx/Cs  Cx = Cs Ax/AsChú ý : Nồng độ của dung dịch thử Cx và dung dịch chuẩn Cs không đượcchênh lệch nhau quá nhiều Các nồng độ này càng gần nhau kết quả càngchính xác

Ưu điểm: Độ chính xác tương đối cao

Nhược điểm: - Không thể xác định được hàng loạt mẫu

- Sai số do mắt quan sát

- Mắc sai số do thành phần hóa học chất phân tích có thể lẫncác tạp chất hóa học khác

2.4.2.Phương pháp thêm chuẩn so sánh

Trong phương pháp quang phổ, để loại trừ các yếu tố ảnh hưởng gây sai

số cho quá trình định lượng : Xử lý mẫu ( chiết xuất), sai lệch do thiết bị vàhóa chất thuốc thử , người ta đã áp dụng phương pháp thêm

Nguyên tắc tiến hành: Lấy hai lượng giống nhau của một mẫu thử Thêmmột lượng chất chuẩn đã biết vào một mẫu Tiến hành xử lý cá hai mẫutrong cùng điều kiện, thu được 2 dung dịch: dung dịch thử và dung dịch thử

đã thêm chuẩn Đo độ hấp thụ của cả 2 dung dịch thu được :

Ax : Độ hấp thụ của dung dịch thử

A’x : Độ hấp thụ của dung dịch thử đã thêm chuẩn

Với Cs là nồng độ của dung dịch chuẩn, ta tính được nồng độ Cx theophương trình :

Ax/A’x = Cx/ (Cs + Cx)  Cx = Cs Ax/( A’x – Ax)

2.4.3 Phương pháp đường chuẩn :

Bước 1 :Xây dựng đường chuẩn D=f(C) (D=aC+b)

- Pha dung dịch chuẩn gốc ban đầu (thường đặc) khoảng 10-3M(10

-3N) Khi cần dung dịch có nồng độ nhỏ hơn thì ta pha loãng ra gọi là dungdịch làm việc

- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn C1,C2,C3,C4,C5,C6 và 1 mẫu trống,pha vào bình định mức, đánh số thứ tự từ 1 dến 7 Dùng thuốc thử thích hợp

Bước 2:Chuẩn bị mẫu phân tích :

-Chuẩn bị như dãy chuẩn,trong cùng điều kiện như dung dịchchuẩn

Bước 3:Xử lý mẫu:

-Đo mật độ quang Dx

-Xây dựng đường chuẩn dựa trên D đo được ,từ đó xác định nồng

độ Cx

- Sự hấp thụ ánh sáng phải tuân thủ theo định luật Lambert-Beer

- Thành phần mẫu phức tạp (ta có thể loại bỏ nhưng không thể hoàntoàn…) đường chuẩn bị sai số

- Điều kiện mẫu chuẩn không thể giống hoàn toàn mẫu phân tích Dễ dẫnđến sai số

- Kết quả chính xác của phép đo phụ thuộc vào máy