Nghiên cứu phân tích hàm lượng tồn dư thuốc kháng sinh họ b lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp phân tích hiện đại

BÁO CÁO TÓM TẮTTiếng Việt “Nghiên cứu phân tích tồn dư thuốc kháng sinh họ p iactam trong các đối tượng sinh học băng các phương pháp phân tích hiện đại” ■ TS Dương Hồng Anh, Trường Đại

3.1 N ghiên cứu điều kiện đo các kháng sinh bàng phương pháp HPLC- 22

U V /V IS

3 2 N g h iê n cứ u điều k iện phân tích P-lactam bằng phương pháp 31

HPLC với detecto huỳnh quang

3 7 5 Q u y trinh phân tích P-lactam trong n ư ớ c tiêu băng p h ư ơ n g pháp

diện di m ao quản đ iện đ ộn g học m ix en

BÁO CÁO TÓM TẮT

Tiếng Việt “Nghiên cứu phân tích tồn dư thuốc kháng sinh họ p iactam trong các đối tượng

sinh học băng các phương pháp phân tích hiện đại”

■ TS Dương Hồng Anh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

■ CN Chu Thị Huệ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

■ NCS Nguyễn Thị Ánh Tuyết, Trường Đại học Y Thái nguyên

5 - Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

5.1.Mục tiêu ị Bám sát và cụ thế hóa định hướng m ục tiêu theo đặt hàng - nếu có )

Tìm phương pháp có độ nhạy cao, dễ áp dụng để phân tích dư lượng kháng sinh P-lactarn trong các mẫu sinh học (nước tiểu) thông qua các phương pháp sấc ký lỏng hiệu năng cao - HPLC với các detector ƯV-VIS, huỳnh quang, khối phổ và phương pháp điện di mao quản (CE).

5.2.1 Đc tài nghiên cứu 6 quy trình phân tích P-lactam trong các mẫu sinh học (nước tiểu)

bằng các phương pháp phân tích hiện đại

5.2.2 Công bố 3 bài báo tại tạp chí chuyên ngành và 1 báo cáo tại hội nghị Khoa học

5.2.3 Hỗ trợ 1 NCS, 3 thạc sĩ , 3 cử nhân

6- Ket quả đạt được

6.1 Đã xây dựng được 6 quy trình phân tích p-lactam trong các mẫu nưóc tiểu và sinh

1 Quy trình phân tích một số (3-lactam trong các mẫu nước tiểu với HPLC-UV-VIS

2 Quy trình phân tích một số P-lactam không có khả năng phát huỳnh quang trong mẫu nước tiểu bang detector huỳnh quang.

3 Quy trình phân tích một số (3-lactam trong mẫu sinh học bang phương pháp MPLC- MS

4 Quy trình phân tích mọt số p-lactam trong mẫu nước tiểu bano phương pháp điện di

5 Quy trình phân tích một số p-lactam trong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký mao quàn điện động học mixen (Micellar Electrokinetic Chromatography).

6 Quy trình chiêt dung môi và chiẻt pha răn đc tách làm giàu (3-lactam tù' các mẫu nước ticu và sinh học

5 - N guyễn Văn Ri, Lê N gọc Sơn, Đặng Thu Hiền, Xác định các kháng sinh ị3-lactam trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ (L C -M S/M S ), Tạp chí Hóa học, T 51, số 2A B (2013) Tr 131-134

• 3 cừ nhân K53 có nhiệm vụ được giao liên quan đến đề tài

1 Lê N gọc Sơn "Xác định hàm lượng kháng sinh /) - lactam trong thực phẩm

b ă n g p h ư ơ n g p h á p s ắ c k ý ỈOIIÍỊ hai lan k h ố i p h o ( L C - M S /M S ) ”.

2. H o à n g T h ị H ư ơ n g K 5 2 ,, D eterm ination o f [ì-lactam antibiotics by H PLC with

6/2012

3 N g u y e n H o n g S o n , K 5 2 „D eterm ination o f /i-lactam antibiotics by H P LC with m ass spectrom etry d e te c to r ” ( A d v a n c e d P r o g r a m ) , đ ã b ả o v ệ 6 / 2 0 1 2

7 - Thòi gian thực hiện: 24 tháng (Từ tháng 7 /2011 đến tháng 7 /2 0 1 3 )

8 - Tinh hình kinh phí của đề tài

PGS.ĨS $ ê ’P(M

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN

1 - Name of the project

Study of detemination of residua! P'lactam in Biomaterials by modem analytical methods

2 - Code Number: QG 11.14

3 - Head of project: Assoc Dr Nguyen Van Ri

4 - Participants:

+ Dr Hong Anh Duong, Hanoi University of Science

+ Bachelor Chu Thi Hue, Hanoi University of Science

Sciences, T I 7, N 4 , 2 0 1 2 , T r 5 5 - 5 9

4 - N g u y e n T h i A n h T u y e t , N g u y e n V a n R i, I n v e s t i g a t i o n o f o p t i m a l c o n d i t i o n s a n d b u i l d i n g

s e p a r a t i o n p r o c e s s e s a n d d e t e m i n e o f p - l a c t a m a n t i b i o t i c s b y c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s m e t h o d s ,

Journal o f Science a n d Technology, 8 9 ( 0 1 ) / 2 ( 2 0 1 2 ) p 2 9 5 - 2 9 9

5 - Nguyen Van Ri, Le Ngoc Son, Dang Thu Hien, detemination of P-Iactam antibiotics in food

b y l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w i t h a t r i p l e q u a d r u p o l e m a s s s p e c t r o m e t e r ( L C - M S / M S ) , Journal o f Chem istry, T 5 1, N 2 a b ( 2 0 1 3 ) T r 131 - 1 3 4

6 3 T r a i n i n g

• S u p p o r t l P h D s t u d e n t , N g u y e n T h i A n h T u y e t , h a s s u c c e s s f u l l y d e f e n d e d a t g r a s s r o o t s le v e l

C o u n c i l , D e c e m b e r 2 1 , 2 0 1 2

• 3 Masters, the study of |3-lactam analyzing:

+ Tran Thi Duns, master K20

+ Nho Pham, master K20

+ Nguyen Thi Nhu Hoa, master K21

MỞ ĐẦU

N gày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng Đ e có được sức khỏe tốt, con người phải sống trong một môi trường không ô nhiễm , đồng thới cần sử dụng các thực phẩm giàu chất dinh dưỡng nlurng an toàn, đặc biệt là không có các chất độc hại như các kim loại nặng, các kháne sinh tồn dư.

(3-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp, được dùng rất phổ biến để chữa bệnh cho con người và vật nuôi từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 Tuy nhiên, liều lượng và cách dùng kháng sinh là vần đề rất quan trọng Nếu dùng không đúng; sẽ dễ dẫn tới hiện tượng vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chừa trị bệnh càng khó khăn [2,3] Ngoài ra còn gày lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh

do virut không chừa được băng kháng sinh nhưnơ vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuân đoán các bệnh và ảnh hường sức khỏe của nơười bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi Vì vậy kiềm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J Chalker đã đăng trên báo l’Lao động” 10/10/2006, năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày) Cũng theo tài liệu trên, qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ

em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cẩu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Nhiều nhà quàn lý đã thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiêm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn E)ối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), ti

lệ kháng thuốc ờ Ampicilin là 88%, Amoxicilin là 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệiih nhiễm trùng huyết và viêm phổi), ti lệ kháng thuốc của Ampicilin gần 97% và Amoxicilin

là 42%

Năm 2001, Tô chức Y tê Thê giới đã đê ra “Kê hoạch toàn câu đê kiểm soát sự dê kháng kháng sinh” Ke hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế cùa tất cà các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chan đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sư lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triên là

t h u ố c uià m ạ o , không đ ú n g phẩm c h ấ t , h à m lượng h o ặ c không có h o ạ t c h ấ t

Phân tích các kháng sinh, đặc biệt là p-Lactam là loại kháng sinh rât phô biên

ư penicillin, am picillin, am oxicillin trong các đối tượng sinh học đã được nhiều

là khoa học trong và ngoài nước quan tâm Phương pháp sử dụng phổ biến là sắc ký

ng hiệu năng cao với các detector khác nhau như Ư V -V IS , huỳnh quang, khối phổ

ần đây, một kỹ thuật m ới được phát triển có thể phân tích nhanh được các kháng sinh phương pháp điện di m ao quản Có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định )ng thời các kháng sinh Ị3-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và

ôi trường chủ yếu là các côn g trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

i điện di mao quản [4-25] C ó thể nhận xét tóm tắt là phương pháp HPLC là phương láp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời gian phân tích ngắn, đặc biệt là

iư ơng pháp kết họp với detector khối phổ (H PL C -M S) T uy nhiên phương pháp cũng

3 một số nhược điểm là thời gian phân tích dài, sử dụng m ột lượng lớn dung môi lớn

à giá thành phân tích cao N gư ợ c lại, phương pháp điện di m ao quản lại sử dụng m ột rợng hóa chất rất ít, thời gian phân tích nhanh, lượng mẫu bơm nhỏ và chi phí thấp,

ơn trong HPLC hàng trăm lần Tuy nhiên phương pháp điện di m ao quản có độ nhạy hông cao.

Trong khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi nghiên cứu các phương pháp HPLC

ới các detector Ư V -V IS, huỳnh quang, khối phổ, và phương pháp điện di mao quàn để ánh giá các phương pháp, nhằm tìm ra phương pháp phù họp để phân tích các mẫu inh học mà trước hết là các mẫu nước tiểu cho các phòng thí nghiệm V ì vậy đề tài có

èn “Nghiên cứu phân tích tồn dư thuốc kháng sinh họ P-lactam trong các đối tượng sinh học lằng các phương pháp phân tích hiện đại”.

C ác tác g iả

t r ư ờ n g n u ô i c a y P enicilium notatum , Penicillium chrysogenum ( p e n i c i l l i n ) h a y

Cephalospơriumaerem onium ( C e p h a l o s p o r i n C ) v à c á c k h á n g s i n h b á n t ồ n g h ợ p x u ấ t p h á t từ

c á c k h á n g s i n h t h i ê n n h i ê n V -»

C á c p e n i c i l l i n là c á c a m i d c ù a a x i t 6 - a m i n o p e n i c i l l a n i c , k h á c n h a u b ờ i g ố c R , n h ữ n s

c a c b o n b ấ t đ ố i c ó c ấ u h ì n h 2 S , 5 R , 6 R

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau

Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

ic cephalosporin, kháng sinh bán tổng hợp, được phân thành bốn thế hệ dựa trên phổ tác dụng 'i với vi khuẩn gram (-) và độ bền cùa chúng với các P-lactamase.

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một sổ cephalosporin

IV: hoạt phô tác

Ngán can xây dựng và giám độ bên của mang tê bào vi khuân nên chù yêu kìm hãm sự tồn tại và phát triển cùa vi khuẩn Các kháng sinh P-lactam có hoạt phổ rộng.

Kháng thuốc.

Vi khuân sinh ra các P-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng P-lactam, theo phàn ưng ái nhân vào nhóm c = 0 , làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra P-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin).

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH P-LACTAM

1.2.1 Các nghiên cứu ở nước ngoài

Phân tích các khánơ sinh họ P-lactam trong thực phẩm cũng như trong các đối tượng siinh học luôn được nhiều nhà khoa học quan tâm do liên quan trực tiếp tới sức khỏe con người

C ó rất nhiều phương pháp phân tích và xác định |3-lactam, phương pháp đầu tiên là phương pỉhap quang học.

cúa chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang Các phương pháp này đơn giiản, dễ thực hiện nên thông dụng, được ứng dụng khi xác định P-lactam trong dược phẩm,

si nil học và môi trường Các P-lactam hấp thụ u v nhưng hệ sô hâp thụ không cao, chúng cũng tạ<o phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy cùa phép đo Trong nhiều trường hợp, cáic [V lactam được thùy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.

Theo F Bclal và các cộng sự [ 10], AMO và AMP được xác định trong thuốc uống bang phương pháp phổ hấp thụ phân từ Dung dịch phân tích có pH=7, KC1 50mM, P d cụ 10 mM

phức màu vàng được phát hiện ở bước sóng 335nm, giới hạn phát hiện thu được là 0,76 /1.

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các P-lactam với độ nhạy khá cao

a trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các P-lactam.

Wei Liu và cộng sự [21], sử dụng phản ứng quang hóa của P-lactam với hệ luminol- Fe(CN)ó kết họp phương pháp chiết pha rắn đã phân tích một sổ P-lactam trong sữa đạt độ

ạy cao: PEN là 0,5 mg/L, ceữadine 0,04 mg/L, cefadroxil là 0,08 mg/1, CEP là 0,1 mg/L Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn, các phương pháp quang

c chủ yếu chi dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều

u tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra,

mg nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế cùa iương pháp này.

Iương pháp điện hóa: Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các (3- Dtam nhưng không phổ biến nhiều Theo Daniela p Santos và cộng sự [25], các tác giả sử

mg sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 |J.M (0,39 mg/L) trong môi -Tơng đệm axetat 0,1M pH=5,2.

1C ký bản mỏng (TLC ) Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để

ểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tò ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu song song

ột lúc rất tiện lợi Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo quang có thể phân :h định tính và định lượng Tuy nhiên, theo tài liệu [1] thì phương pháp này chủ yếu dùng để ịnh tính các P-lactam.

ắc kỷ điện di (CE): Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về iệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng

ể tách và xác định các kháng sinh P-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.

Attila Gaspar và cộng sự [18] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ ephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis -

!ZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25nM có pH = 6,8 Phương pháp này tách được 14 háng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin c , cefoxitin, efazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim eftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 - 1,62 mg/L Trong đó CEP và

"EF có giới hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/L; khoảng tuyến tính 5 - 200 mg/L M.I.Bailon-Perez và cộng sự [9] sử dụng phương pháp CZE và detector u v - DAD, iha động dùng hệ đệm tris 175mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm ạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, oxacillin,

’EN, nafcillin trong nền mẫu nước (nước sông, nước thải ) Giới hạn phát hiện tương ứng ),8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 Hg/L cùng độ thu hồi đạt 94 - 99 %.

n ọ t vai trò v ô c ù n g q u a n t r ọ n g t r o n g v i ệ c t á c h v à p h â n tíc h c á c chất t r o n g m ọ i lĩn h v ự c k h á c

ìhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượn^ vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách

pha đảo được sử dụng rất rộng rãi đê xác định các kháng sinh (ỉ-lactam trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ƯU thế so với các phương pháp khác vì có dộ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại

cao, k ỉio à n g t u y ế n tín h r ộ n g

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phcp phát hiện các chất sau khi rửa giải Hiện

nay c ó rât n h iê u lo ạ i d e t e c t o r đ ư ợ c s ử d ụ n g c h o m ụ c đ í c h n à y đ ã m ờ ra k h ả n ă n g ứ n g d ụ n g c a o

của phương pháp Detector UV-Vis được dùng rất phổ biến do có thể xác định được nhiều loại chàt và đơn giàn, không quá đắt E Benito-Pena và cộng sự [ 11] sừ dụng phương pháp HPLC, detector u v để phân tích đồng thời AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin, CLO, nafcillin

và dicloxacillin trong nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột LUNA C|8 (150mmx4,6mm, 5fim); pha động: A = HiO (axit trifloaxetic - TFA 0,01%), B = Acetonitril (axit trifloaxetic - TFA 0,01%); chạy gradient: bất đầu B 0% trong 3 phút, thay đổi B 0-37% trong 5 phút; giữ B 37 % trong 11 phút, thay đổi B 37 - 67 % trong 5 phút, giữ B 67% trong 5 phút, tốc độ pha động 1 5ml/phút; nhiệt độ cột 35°C; bước sóng phát hiện 220 nm Phương pháp này đạt giới hạn phát hiện thấp, tương ứng 5,9; 5,7; 25,6; 2,5; 4,3; ,10,3; 3,3; 6,4 Hg/L

Blanchflower WJ và cộng sự [12] dùng HPLC - MS phân tích penicillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,ómmxl50mm, 5ịim); pha động: ACN - (C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 ng/kg, trong thịt 25-100 ịig/kgrộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC Đối với phân tích dư lượng, detector khôi phô (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.

Các tác giả Boison J o. và cộng sự [13,14] sử dụng cột Spherisorb ODS2 (250mmx4,6mm, 5|im); pha động: ACN-Na2S2Ơ3 15,7mM trong đệm photphat 0,1M pH 6,5; tốc độ pha động lml/phứt, detector u v 325nm; phân tích đồng thời AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2 - 5 Ịig/kg.

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao Như trong [7,8] C.Y.W Yang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250mmx4,6mm, 5|.im) phân tích AMO trong cá (pha động: ACN/đệm photphat 50mM pH 5.6 - 20/80; detector huỳnh quang: 258nm - 440nm) và AMP trong sữa bò( pha động: ACN/đệm photphat lOmM pH 5,6 - 24/76; detector huỳnh quang: 346nm - 422nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5 ng/kg và 0,3 Ị-ig/kg Tuy vậy, do các P-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phàn ứng quang hóa [7,8,19] nên chi áp dung với số ít chất hoặc phân tích riêng tùng chất chứ không áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector

độ dẫn để phân tích các P-lactam Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xứ lý mẫu đối với các phưưng pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ Qui trình xử lý chủ yếu sử dụng chiết lỏng-lỏng (còn gọi là chiết

D Hurtaud và cộng sự, [20] s ử dụng etylaxetat để chiết tách CLO, oxacillin, iiđoxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91% Còn trong [12], Blanchflower WJ và cộng sự đã sừ dụng diclometan và hexan để tách penicillin V, PEN, jxacillin, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa đạt hiệu suất 89 - 117%.

Khi tách và làm giàu các P-lactam trong mẫu phân tích bàng kĩ thuật SPE thì thường dùng theo hai phương pháp chiết pha đảo (thường là Cis) và trao đổi ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ.

Trong [24], K Takeba và cộng sự sử dụng cột chiết pha rắn pha đảo C|g và dung môi rửa giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt hiệu suất thu hồi 83 - 89% Qua nhiều công trình cho thấy việc kết hợp phương pháp sắc ký lòng hiệu năng cao và kĩ thuât chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích P-lactam do có độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao.

1.2.2 Nghiên cứu trong nước

Theo nghiên cứu của Phạm Hùng Vân [2] và công sự, 204 chủng s pneumoniae bao gồm 96 chủng xâm lấn và 108 chủng không xâm lấn được thu nhận từ 10 bệnh viện khác nhau tại Việt Nam, bao gồm hai bệnh viện lớn tại Hà Nội, một bệnh viện lớn tại Đà Nằng, và 7 bệnh viện tại TP.HỒ Chí Minh Các chùng vi khuẩn này được làm thử nghiệm E-test để phát hiện đề kháng penicillin và amoxicillin/clavulanic acid và thử nghiệm kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch một số kháng sinh khác như macrolides, sulfamethoxazol/trimethoprim, chloramphenicol và fluoroquinolones Kết quả cho thấy có đến 80% các S pneumoniae kháng được penicillin với 38% và kháng vừa với penicillin 42%, 72%

đề kháng erythromycin, 86% kháng clarithromycin, 74% kháng azithromycin, 75% kháng sulfamethoxazol-trimethoprim và 29% kháng chloramphenicol; vi khuẩn hãy còn nhạy cảm cao với linezolide, các fluoroquinolones và amoxicillin/clavulanic acid với tỳ lệ đề kháng khá thấp

từ 0% đến 2% Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy vi khuẩn kháng penicillin có tỷ lệ đề kháng các kháng sinh erythromycin, clarithromycin, azithromycin và sulfamethoxazol-trimethoprim cao hơn một cách rất có ý nghĩa thống kê so với vi khuẩn kháng vừa.

Còn theo của Phạm Hùng Vân [3], đã có 235 chùng vi khuẩn Staphylococcus aureus từ 7 phòng thí ngiệm vi sinh của 7 bệnh viện ở Đà Nang, cần Thơ và TP Hồ Chí Minh được gửi về trung tâm nghiên cứu Kết quà ghi nhận được cho thấy 47% s aureus kháng methicillin, 42% đối với gentamicin, 63% đối với erythromycin, 68% đối với azithromycin, 39% đối với ciprofloxacin, 38% đối với cefuroxime, 30% đối với amoxicillin-clavulanic acid, 34% đối với cefepime, 28% đối với ticarcillin clavulanic acid, 38% đối với chloramphenicol, 25% đối với cotrimoxazol,

17% đ ố i v ớ i l e v o f l o x a c i n , v à c h i 8% đ ố i v ớ i r if a m p ic in e

Những công trình phân tích p-lactam ờ Việt nam rất ít, gần đây ờ Trường Đại học Khoa học Tự nhicn có các nghiên cứu phân tích bàng các phương pháp sắc ký, phưcmg pháp điện di mao quán [4,5,6] Tuy nhiên việc đánh giá các phương pháp một cách hệ thống, lựa chọn được phương pháp phân tích có độ nhạy cao, phù hợp với điều kiện của đa số các phòng thí nghiệm chưa có.

2.1 CÁC KỸ T H U Ậ T TÁ CH VÀ ĐẩNH LƯỢNG p-LACTAM B Ằ N G SẮC KÝ LỎNG

HIỆU N Ă N G CAO - HPLC

2.1.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC

Săc ký lỏng là m ộ t k ỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ h ợ p c ủa nhiều quá trình vừa

có tính chất ho á học lại v ừ a có tính chất lý học Nó là n h ữn g c ân b ằ n g động xảy ra trong

cột săc ký giữa pha tĩnh và pha động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các

chất tan (hỗn h ợp m ẫ u p h â n tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đên cuôi cột tách, T r o n g quá trình đó chất tan luôn luôn d ượ c ph â n bố lại giữa hai pha, trong khi pha đ ộ ng c h ả y liên tục qua cột tách với mộ t tốc độ và thành p hần pha

đ ộng nhát định, hay gradient Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trinh săc ký, nó luôn c h u y ể n từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầ u cột đèn cuối cột sắc ký Mặt khác c ũn g vì c ấu trúc và tính chất của mỗ i p hâ n tử chất tan là khác nhau nên tốc độ

di c h u y ể n trung binh c ủ a m ỗi chất tan là khác nhau Q u á trình sắc ký có thể xảy theo 3

cơ chế sau:

- Tương tác hấp phụ

- Tương t á c trao đổi ion

- Tương tác theo cơ chế rây phân tử

Tương tác với 3 cơ chế trên có 3 phương pháp tiến hành tách khác nhau:

- Sắc ký hấp phụ (chất hấp phụ pha thường NP-H PLC) và hấp phụ pha ngược RP- HPLC).

- Sắc ký trao đổi ion (EX-H PLC)

- Sắc ký rây phân tử (G el-H PLC )

Sơ đô tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt như sau:

Trong RP-HPLC thì pha tĩnh là vật liệu kém phân cực, thông thường chất mang trong pha tĩnh là các loại silica trung tính đã được thế hoá bề mặt bàng các loại họp chất kém phân cực như Ci8 , Cg, Pha tĩnh này thường dùng để tách các hợp chất hữu cơ có độ phân cực khác nhau Khi tiến hành chạy sắc ký trên bề mặt pha tĩnh xảy ra các cân bằng động như sau:

MXj chất phân tích trên pha động.

N goài bản chất của nền pha tĩnh, kích thước hạt nhồi và chiều dài cột tách cũng ảnh hường rất lớn đến khả năng phân tách các chất D o vậy, trong điều kiện phân tích thực

tế chúng ta phải nghiên cứu, khảo sát chọn pha tĩnh có cỡ hạt, chiều dài cột tách như thế nào để đạt được độ phân giải theo yêu cầu phân tích T hông thường đối với một hỗn hợp chất phân tích nhất định, yếu tố quyết định đến hiệu quả tách ờ đây là các điều kiện

về bản chất của pha tĩnh và thành phần pha động trong hệ HPLC.

Sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC) là phương pháp được dùng phổ biến nhất trong quá trình tách phân tích và điều chế các hợp chất đang được quan tâm trong các đối tượng sinh học, hoá học, dược học và y học Hệ RP-HPLC có các ưu điểm nổi trội sau:

1 Có độ linh động và độ chọn lọc cao

2 Có khả năng cân bằng cột nhanh, cột có hiệu lực cao, các pic cân đối.

3 Pha động là nước hay hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thân thiện với m ôi trường.

Nói chung, hệ RP-HPLC có độ linh hoạt và độ chọn lọc cao, dung môi làm pha động có thể là dung m ôi hữu cơ hoà tan tốt trong nước như methanol, acetonitril, hay có thêm những đung dịch đệm pH được trộn với Iihau theo tỷ lệ nhất định Trong nhiều trường hợp nước là thành phần chính của pha động.

- Pha động trong R Ị’- HPLC

Pha động là yêu tô thứ hai sau pha tĩnh quyết định đến hiệu quả tách của quá trình sắc

ký Pha động thường là các dung m ôi phân cực như H20 , M eOH, A C N , h a y hồn hợp của 2 hay 3 dung môi này theo những tỷ lệ nhất định Các dung môi hữu cơ trên có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ axit hay bazơ hữu cơ.

Pha động có độ phân cực gần giống với độ phân cực của chất phân tích thì thời gian lưu của chât càng ngăn Chính vì điều này mà cần phải lựa chọn pha động sao cho phù hợp Các yếu tô cần được quan tâm và lựa chọn cho mỗi hệ pha đó là:

1 Bàn chất pha động.

- Thành phần của chất tạo ra pha độne

- Loại dung môi sử dụng

- pH cùa pha độnơ

2 T ốc độ pha động:

Khi pha động đã có một thành phần phù hợp mà tốc độ rửa giải khôns phù hợp thì cũng chưa có kết quả tách sắc ký hoàn toàn tốt Khi tốc độ pha động tăng, thời gian lưu của chất giảm, đồng thời diện tích píc cũng giảm D o đó cần tiến hành lựa chọn tốc độ pha động cho phù hợp để vừa tách hoàn toàn các chất, vừa đỡ tốn dung môi mà vần đảm bảo tăng độ nhạy của phép phân tích.

2.1.3 Detector ƯV-VIS

Detector loại này thực chất là các máy đo phổ hấp thụ phân tử vùng tử ngoại (ƯV) và khả kiến (V is) N hưng ở đây buồng đặt cuvet đo được thay thế bằng cuvet đo dòng chảy (flow cell) V iệc đo để phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất ở trong dung dịch tại một bước sóng nào đó, nhưng dung dịch ở đây là pha động của quá trình sắc ký, nó chứa chất phân tích và chảy liên tục qua buồng đo (flow cell) Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trực tiếp cùa chính nó Như vậy, tất cả các chất phân tích hay họp chất của nó đối với m ột thuốc thử phân tích theo phản ứng có tính chất định lượng mà có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóng nào đó trong vùng U V -V is đều có thể được phát hiện

và xác định hằng loại detector này N guyên tắc của việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo quy luật hấp thụ ánh sáng.

Ax = lg Y = e l.c

Trong đó:

A \ - là độ hấp thụ quang của chất phân tích hay hợp chất phức của nó với

thuốc thử p h â n tích tại mộ t X xác định.

£ - hệ sổ độ hấp thụ quang phân tử của chất đó (độ tắt phân tử)

1 - là bề dày của lớp hấp thụ (flo w ce ll)

Vê nguyên tăc cấu tạo, loại detector này bao gôm các phân chính sau:

• N guồn điểm sáng S: là đèn D 2 (cho vùng phổ Ư V ), hay đèn W -H alid (cho vùng phổ Vis).

• Buồng mẫu và m ôi trường hấp thụ (flow cell)

• B ộ đơn sắc gồm cách tử để tán xạ ánh sáng và bộ phận thu chùm sáng ở các góc độ nhất định, chọn tia sáng có bước sóng nhất định cần đo.

• B ộ phận điện tử thu nhận, khuyểch đại tín hiệu đo

• B ộ p h ậ n c h i th ị k ế t q u ả

Trong thực tế rất nhiều chất hữu cơ và hợp chất phức của kim loại với một thuốc thử phân :ích đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detector này Loại này hiện nay đang lược dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật HPLC V ì nó có độ nhạy tương đối cao, đơn giản,

iễ dùng và không quá đắt.

2.1.4 Detector huỳnh quang

Một số chất phân tích hay sản phẩm của chất phân tích với một chất khác (phản úmg có tính định lượng) có tính chất huỳnh quang thì xác định bàng detector huỳnh quang.

N guyên nhân sinh ra phổ huỳnh quang phân tử là do các điện tử hóa trị tự do cùa nguyên tử hay điện tử hóa trị nằm trong liên kết hóa học (n, liên hợp ơ - n ) cùa phân

tử bị thay đổi mức năng lượng, chúng nhận năng lượng và ở mức năng lượng cao, trạng thái này không bền, nó bị suy biến và sau đó phát ra bức xạ N hư vậy, quá trình sinh ra phổ huỳnh quang là tổ hợp của hai quá trình hấp thụ bức xạ của phân tử và quá trình phát xạ huỳnh quang của nó M ặc dù tín hiệu huỳnh quang là phát ra m ọi hướng, nhưng chi có chùm tia phát xạ huỳnh quang nằm vuông g ó c với chùm tia sáng kích thích là chùm phát xạ huỳnh quang có cường độ lớn và có ý nghĩa Chùm phát xạ huỳnh quang này đặc trưng cho m ỗi loại phân tử.

Nguyên tắc của detector huỳnh quang', dựa trên nguyên nhân sinh ra phổ huỳnh quang Chiếu một chùm tia sáng kích thích có bước sóng xác định ( /^1) phù hợp vào cuvet chứa mẫu phân tích, để chất phân tích phát ra chùm tia phát xạ huỳnh quang của

nó (/[, ). Sau đó nhờ hệ quang học thu, phân tách lấy tia phát xạ huỳnh quang thích hợp cần đo hướng vào nhân quang điện để đo chúng, khuyếch đại và biểu diễn chúng.

V iệc định lượng chất phân tích dựa trên sự phụ thuộc tuyến tính giữa cường độ của tia phát xạ huỳnh quang của chất với nồng độ của chất đó trong mẫu.

Iq= kCL Trong đó:

k : Hằng số L: Bề dày của cuvét (cm) C: N ồng độ của chất trong mẫu (m ol/lít) Iq: Cường độ chùm sáng kích thích.

Như vậy, detector huỳnh quang gôm hai bộ đơn sắc, hai hệ quang Một hệ quang cung cấp chùm tia kích thích, một hệ quang thu nhận chùm tia phát xạ huỳnh quang của chất mẫu, vuông góc với chùm tia kích thích Detector huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao.

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích khối và bộ phận phát hiện Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau

đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Các tín hiệu thu được

sẽ chuyển vào m áy tính để xử lí và lưu trữ.

H ìn h 2.3 Sơ đồ cấu tạ o th iế t b ị k h ố i p h ổ

a) Nguồn ion

Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và dược ion hóa nguyên tử Một số kĩ thuật ion hóa được sử dụng phổ biến trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử (electrospray ionization - ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (atmospheric-pressure chem ical ionization - APCI).

Ion hóa phun điện tử - ESI

Kĩ thuật này ESI có độ nhay cao, ứng dụng phân tích các chất không phân cực như: protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen gly co co l, và các chất phân cực

co khôi lượng phân tử nhỏ.

N guyên tắc của ESI là chuyển hóa các ion từ dung dịch lỏng thành các ion ở

u điện thế cao 4kV Tại đây, dung dịch mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và

ỵc hút t ĩn h điện t ớ i l ố i vào của thiết bị phân tích khối phổ Các giọt nhỏ trước khi vào

ĩt bị phân tích khối phổ sẽ được kết hợp với dòng khí khô để làm bay hơi dung môi.

2 chế độ bắn phá: bắn phá với chế độ ion dương và ion âm

APCI được sử dụng để phân tích các chất có khối lượng phân tử trung bình K ĩ lật này có thể bẳn phá ở 2 chế độ: ion âm và ion dương.

Chất phân tích và dung m ôi ở dạng lỏng được chuyển thành các giọt nhỏ rồi hóa

i ở nhiệt độ cao khoảng 5 0 0 ° c M ột điện thế cao từ 3 - 5kV tạo ra các electron và ion

a chất phân tích.

APCI là m ột k ĩ thuật ion hóa mạnh, nó không bị ảnh hưởng khi thay đổi đệm

Ịy và nồng độ đệm.

b) Bộ phận phân giải phổ khối

Sau khi được ion hóa, chất phân tích được đưa vào bộ phận phân tích khối Tai

y, các ion được tách ra khỏi nhau theo tỉ số m /z B ộ phận phân tích khối được chia inh 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tó cự c, bộ phân tích bẫy ion tứ cực và bộ

ân tích thời gian bay Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser) và bộ

ân tích bẫy ion tứ cự c (Q uadrupole Ion-Trap M ass A nalyser) được sử dụng phổ biến.

Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng trổng các ion bay qua M ột trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một iều (D C ) và điện thế tần số radio (RF) Các tứ cực được đóng vai trò như m ột bộ lọc

ổi Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động

ụ thuộc vào tỉ số giữa m /z và trường RF Chỉ những ion có tỉ số m /z phù hợp mới có

I đi qua được bộ lọc này B ộ phân tích tứ cực được phát triển và cho ra đời bộ phận

ân tích khối phổ ba tứ cự c (Triple Quadrupole).

-Pump 1 Single 3-stage tuttoo pump 1

-H ìn h 2 3 S ơ đ ồ b ộ o h â n t í c h k h ố i p h ổ b a t ử c ự c

Bộ phân tích khối khổ ba tứ cực gồm một buồng va chạm (co llisio n cell, dược xem

à ứ cực thứ hai Q 2) dặt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q 3) [10].

o ơ buông Q 1 : ơ các ion được tách.

o ơ buông Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly đo va chạm với khí trơ có mặt như nitơ, argon, heli nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ion con).

o ơ buông Q3: làm nhiệm vụ tách các ion con.

Bẹ p hản tích bây ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng ( r i n g electrode) với nhiều điện cực

ba) xung quanh, điện cực đầu cột (end-cop electrode) ở trên và ở dưới Trái với lại thiết

bị ử cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đường co n g ổn định được bẫy lại cho đẽn khi một điện áp RF được dặt trên điện cực vòng Các ion khác nhau m/z sau (lótrờ nên không ôn định và sẽ có hướng đi về phía detector D o điện áp RF khác nhau troig hệ thống này mà thu được một phồ khối lirợnẹ đầy đù.

Các ion tôn tại trong bẫy có thể được chọn riêng và phân tích theo sự khác nhau

về tl / z , đông thời có thê chọn riêng và thực hiện quá trình ban phá để thu được các máih ion con, từ đó thực hiện phân tích theo m /z cùa ion con (khối phổ 2 lần), v ề

nguyên tắc các ion có thể tồn tại trong bẫy thời gian đủ lâu có thể thực hiện đến MS n lần tuy nhiên trong thực tế thường chì có khả năng thực hiện đến khối phổ 3 lần.

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất, có

độ ìhạy cao Các ion đập vào bề mặt đinot làm bật ra các electron Các electron thứ cấp sau đó được dẫn tới các dinot tiếp theo và sẽ tạo ra electron thứ cấp nhiều hơn nữa, tạo thàih dòne các electron.ơ

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng ?iông như thiết bị nhân electron, các ion ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron Khác với detector nhân electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chan phôtpho và giải ph ónẹ ra các photon Các phcxon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron

Ưu iiể in của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trons; chân không nên loại bỏ được các khả năn^ nhiễm bẩn.

> Các thône số trong LC -M S/M S.

+ IS (IonSpray Voltage): Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phân phân tích ion The ion hóa quyết định loại ion ch uyên đèn bộ phận phàn tích khối Dối với loại ion dương, IS = 4 0 0 0 -f 55 0 0 V , ion âm IS = -3 0 0 0 -f -4000V

+ GS1 (Ion Source G as 1): Á p suất khí hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho sự

h thành nên các giọt được dễ dàng hơn T ốc độ khí cùa G as 1 thường cao hơn so với

s 2.

+ G S2 (Ion Source G as 2): Á p suất cùa luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay dung môi.

+ TEM ( Tem perature): N h iệt độ của nguồn khí nóng thổi vào (G as2) N hiệt độ

3 phần thúc đẩy quá trình hóa hơi các giọt chất phân tích khi đi ra khỏi đầu phun + CUR (Curtain Gas): L uồng khí mang N 2 tinh khiết được thổi vào khe giữa 2 màn

in của bộ phận ion hóa và bộ phận phân tích phổ N ó có tác dụng đẩy các giọt dung

li và các phân tử trung hòa, để giữ ch o nguồn ion m ẹ sạch hơn.

+ D P (D eclu sterin g Potential): T hế đầu vào, thế áp vào màn chắn của bộ phận

ìn tích khối N ó c ó tác dụng bẻ gẫy cụm ion [M +H 30 +]+ và khử nhiễu hóa học tạo nh, làm tăng độ nhạy của phép phân tích T uy nhiên, thế này cũng được quá cao, vì

sẽ bẻ gẫy luôn cả cấu trúc của phân tử ion mẹ.

+ EP (Entrance Potential): T hế áp vào nguồn ion mẹ.

+ CE (C o llisio n Energy): T hế áp vào Q 2, tạo ra năng lượng để phân mảnh ion mẹ + CXP (C ollision C ell E xit Potential): Thế áp giữa Q2 và Q 3.

]AD (Collision Gas Pressure): Kiểm soát áp suất khí N2 trong Q2, thúc đẩy quá trình phân

nh thứ cấp, ngoài ra còn có tác dụng làm mát các ion con và hướng chúng đến Q3.

.6 K ỹ th u ậ t p h â n tích b ằ n g đ iện d i m a o qu ản v ù n g

Sự tách các chất bàng điện di mao quản vùng dựa trên cơ sờ tốc độ di chuyển khác nhau

1 các chất (các ion) cần tách trong ống mao quản trên nền dung dịch đệm pH và chất điện

■i phù hợp, dưới tác dụng của từ trường E thích hợp.

Tốc độ di chuyển của các chất (các ion) phân tích được tính theo biểu thức sau:

Vi = P iE

Trong đó:

-E: Từ trường điện đặt vào hai đầu ổng mao quản.

-Vj: Tốc độ di chuyển của ion chất tan i trong ổng mao quản.

-Ịjj: Độ điện di của ion chất tan.

Từ trường điện E phụ thuộc vào điện thế đặt vào hai đẩu ổng mao quản và được tính theo vol/cm chiều dài Trong thực tế của kỹ thuật CE, điện thế này thường trong vùng

từ 200V/cm đến 600V/cm Trong các điều kiện nhất định, thì độ di động điện di ỊJ,on (electrophoresis mobility) gọi ngắn gọn là độ điện di của mỗi phẩn từ chất tan (ion chất tan)

là một hằng số đặc trimg Độ điện di này được xác định bởi lực của điện trường E đặt vào hai đầu ổng mao quản tác động lên các phần tử đó Song lực này tối thiểu phải bang và thắng được lực càn của mao quản Nghĩa là giá trị ỊJt phụ thuộc vào ti số:

Pe = f ( F e /F f )

Trong đó:

fE : Lực điện di (Electrophoresis Force), và

ff : Lire cản trở (Frictional Force).

Và trong các định luật vê điện, chúng ta có: Lực diện gây ra chuyển động của chàt trong mao quàn:

-rị: Độ nhớt của dung dịch trong ống mao quản.

Khi cân bằng thi hai lực F e và Ff này là bàng nhau, nhưng ngược chiều nhau (tức là trái dấu nhau), theo quy ước, lực di chuyên E e là dương, lực F| là âm Do đó ta có:

Với z là hoá trị và e là điện tích cùa ion, N ià sổ Avogadro.

Biểu thức (2 1 ) cho ta thấy độ lớn của đại lượng |ie phụ thuộc:

- Tỷ lệ thuận với điện tích cùa chất phân tích (các ion).

- Tỷ lệ nghịch với:

+ Độ nhớt của dung dịch đệm điện di rị.

+ Độ lớn (bán kính n) của ion chất phân tích và 6n.

Nghĩa là trong một điện trường E nhất định, thì phân tử nào có điện tích lớn và kích thước nhò thi sẽ di chuyển nhanh Các ion có cùng điện tích, thì ion nào có kích thước nhỏ thì di chuyên nhanh hon Các ion có cùng bán kính, thì ion nào có điện tích lớn thì di chuyển nhanh hơn.

Độ điện di |_ie cùa các chất được xác định bằng thực nghiệm trong các điều kiện chuẩn và phần lớn đã được chỉ ra trong các sách về các hằng số hoá lý của các chất đó là giá trị Ịie chuẩn tuyệt đối, dược ký hiệu là ị i e° Nhưng trong thực tế của các dung dịch thực trong ổng mao quản của các hệ CEC, thì không phái là trong các điều kiện chuẩn và chi duy nhất một chất nghiên cứu Nèn người ta phải xác định và thêm vào khái niệm độ điện di hiệu lực Per (efective electrophoresis mobility) Chính giá trị Hef này mới có ý nghĩa đúng và phù hợp với thực tế kỹ thuật CEC Giá trị cùa đại lượng ụ cf này ngoài yếu tố bản chất, độ lớn, điện tích của chất phân tích, nó còn được quyết định bởi thế (hay điện từ trường E) đặt vào hai đầu ống mao quàn và cũng phụ thuộc cả vào một số yếu tố sau:

Giá trị pH cùa dung dịch đệm điện giải trong mao quản.

Thành phần cùa chất điện giải và chất đệm.

Hằng sổ điện ly Ka ( hay Kb) cùa chất tan là axit hay bazơ yếu hay phức trong mao

quàn.

Chất hoạt dộnsỉ bề mặt, chất phụ gia trung tính.

Dung môi hữu cơ thêm vào pha động diện di

Trong kỹ thuật HPCEC người ta cũng dùng khái niệm tôc độ điện di tuyên tính u (mm/s)

ại lượng này cho chúng ta biết trong một đơn vị thời gian thì vùng chất mẫu trong mao quản [ chuyển được một đoạn là bao nhiêu minimet và nhờ đại lượng này chúng ta dễ dàng so sánh lất nào được điện di nhanh, chất nào điện di chậm.

1.7 Kỹ thuật phân tích bằng điện di mao quản điện động học mixen

Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen là một kiểu cùa kỹ thuật tách leo bản chất của sự điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất cùa kỹ thuật điện di mao quàn Zapillary Electrophoresis) và sắc ký lòng (LC) có pha tĩnh Nó là một trong các kiểu tách sắc

ý (separation mode) cùa kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược,

íó là một kiểu kỹ thuật điện di mao quàn có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách

ì các chất phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion) Vì thế nó bổ ang và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử Mixen (tiểu phân lixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt và đóng góp khả ăng của quá trình tách sắc ký điện di các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện ly ong ống mao quản Sự tách sắc kí của các phân tử chất'tan trung hoà bàng kỹ thuật MEKC ược điều chinh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch MP điện di Khi chất hoạt ộng bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC:

’ritial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có

!MC = 9 mM, thì một tổ hợp của các phần từ tiểu phân cùa chất hoạt động bề mặt được tích tụ

ũ và chúng hình thành (hay tạo ra) trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS Nó hình là các Mixen (pha tĩnh giả) Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị nước cùa chất hoạt ộng bề mặt, định hướng vào trung tâm cùa Mixen và để cho đầu ưa nước cùa nó ra ngoài và sẽ Iơng tác với ion chất đệm, hay ion chất tan Nghĩa là đầu mang điện tích cùa chất hoạt động bề lặt sẽ hướng ra chất đệm cấu trúc tiêu biểu cùa Mixen được mô tả trong hình 2.2 Các Mixen

■ đây hoạt động như một pha tĩnh Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào rong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số hân bố Ki xác định, trong những điều kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất

an Xj sẽ có một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó Neu các Ki của các chất tan

à khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt.

Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có điện ích Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyên động hoặc là cùng chiều hoặc là

Igược c h iề u v ớ i d ò n g EOF, là tu ỳ t h u ộ c v à o đ iệ n tíc h c ủ a c h ấ t h o ạ t đ ộ n g b ề m ặ t v à c ấ u trúc

ùa Mixen Các chất hoạt động bề mặt Aniônic, ví dụ như SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực

dương), nghĩa là ngược chiều với hướng cùa dòng EOF Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn tốc độ cùa Mixen , thì sự điện di thực (net movement) cùa Mixen là theo hướng cùa dòng EOF Trong khi dì chuyên nhu thê, các Mixen có thể tưưng tác với các phần từ chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bô cùa săc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo

ra quá trình sắc ký cùa các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quàn trong quá trình điện di.

Hình 2.4 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC

Đối với các phần từ chất tan trung tính, nó chi là sự phân bố của chất tan vào trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bàng động học có hàng số phân bố K| nhất định trong điều kiện đã chọn Chính sự phân bố theo kiểu cân bàng động học này gây ra (tạo ra) sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh già Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hem) sự

di chuyển cùa nó, khi các Mixen mang nó (các chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF.

Khi mà các chất tan lại không tươne tác với các Mixen, thì nó được dòng EOF mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng thời gian lưu giữ của chất tan

Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MEKC về cơ bàn vẫn là kiểu tương tác phân bô của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp phụ, nhưng lại dược điêu khiên bới lục điện trường E của thế cao V giữa hai đầu mao quản tạo ra, mà không phải hăng áp suât đây pha động như trong HPLC Trong kỹ thuật phân tích MEKC, các tính toán về hệ số dung tích k ,\

sổ đĩa N của cột mao quàn, độ phân giải R, cũng dựa trên cơ sở tươnơ tự với các tính toán của

: Sắc kí cột LC, và tất nhiên có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn cho

1 pha MEKC.

Đ ối tượng mẫu phân tích trong nghiên cứu này là các loại mẫu sinh học, có nền

ẫu phức tạp D o đó, chúng tôi đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn (SPE) để tách ìiết và làm giàu mẫu đồng thời giảm ảnh hường của nền mẫu, tránh làm bẩn detector,

ng khả năng phát hiện.

Chiết pha rắn là m ột phương pháp chuẩn bị mẫu để là giàu và làm sạch mẫu phân

ch từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn Sau đó chất phân tích được

ra giải bàng một lượng nhỏ dung m ôi thích hợp Các chất ảnh hường được loại bỏ [4] Cột SPE được nhồi chặt bằng những vật liệu xốp, hạt nhỏ có các nhóm chức khác hau Chất lỏng qua cột dưới tác dụng của áp suất hoặc chân không.

Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Rửa giải các chất ảnh hường

C h ấ t p h ầ n t í c h

H ình 2.5 Các bước cùa quá trình chiết pha rắn

1 Hoạt hoá chất hấp phụ pha ran

• Làm ướt vật liệu nhồi, solvat hoá các nhóm chức của chất hấp phụ

• Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ

• Không được để chất hấp phụ bị khô

2 Mau và chất p h â n tích được chảy qua cột

• Chất phân tích được làm giàu trên chất hấp phụ

• Một vài thành phần ảnh hưởng khác cũng có thổ bị giữ lại

• Các thành phân không bị hâp phụ bị loại ra làm sạch chât phân tích

3 Loại hò các chát gây ảnh hường ra khỏi cột

• Giữ lại chất phân tích

• Neu mẫu là dung dịch nước, sử dụng dung dịch đệm hoặc hỗn hợp dung môi hữu cơ

nước-• Nêu mẫu bị hoà tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng chính dung môi đó

4 Giai háp chát phân tích băng dung môi thích hợp

• Dung m ôi được chọn đặc trưng để phá vỡ tương tác giữa chất phân tích và chât hấp phụ với mục đích rửa giải được chất phân tích với hiệu quả cao

• Dung môi sử dụng lửa giải đông thời càng ít chất gây ảnh hường tới phép phàn tích càng tốt.

Chát hàp phụ chiết pha rắn thường được sử dụng gồm các loại:

Chât hâp phụ pha thường: Các silica trung tính, oxit nhôm

- Chât hấp phụ pha ngược: Các silica đã được ankyl hoá nhóm OH

- Chất có khả năng trao đổi ion

- Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước

- Chất hấp phụ pha khí-rắn

Hiện nay, phương pháp chiết pha rắn ngày càng được sử dụne rộng rãi và phổ biến do những ưu điểm vượt trội sau:

- Hiệu suất thu hồi cao

Khả năng làm giàu, làm sạch chất phân tích lớn

- Giảm lượng dung m ôi sử dụng

- Có khả năng kết hợp các phương pháp phân tích

- An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng và khảo sát 3 loại cột SPE gồm: HLB Oasis, Polym eric và C l 8.

.1 NGHIÊN CỨU ĐIÊU KIỆN PHÂN TÍCH p - LACTAM BẢNG PHƯƠNG HÁP HPLC VỚI DETECTOR ƯV-VIS

.1.1 Nghiên cứu điều kiện đo các kháng sinh bằng phương pháp HPLC-ƯV/VIS

Sau khi khảo sát các điều kiện đo H P L C gồm chọn bước sóng hấp thụ, cột tách, lành phần và tốc độ pha động; từ các kết quả thực nghiệm, thu được các điều kiện tối

u để tách các p-lactam như sau:

1 Pha tĩnh: Cột Supelcosil R P - C 18 với kích thước hạt nhồi 5 |im của hãng Sulpenco-Autralia

T ừ c á c đ iều k iệ n tối ưu đã k h ả o sát, tiến hành tìm k h o ả n g tu y ế n tính c ủ a p h ép đo với

c á c đ iều k iệ n sau:

Màu gôc ban đâu được pha vào trong metanol, các dung dịch loãng được pha từ (lung dịch gôc với dung môi là pha dộng nham tránh các pic ảo do sự sai khác dung môi trong quá trình chạy sắc ký gây ra, tiến hành siêu âm loại khí, sau đó bơm vào H P L C Két quả trung binh thu được sau 3 lần lặp lại: (bàng 3.1)

Do lượng mẫu thực có hàm lượng thấp nên chúng tôi chọn khoảng nồng độ từ O.lOppm đến 2.00ppm để lập đường chuẩn Dựa vào số liệu trên, sử dụng phần mềm Origin version 7.5 xây dựng dường chuẩn Ket quả thu được như sau:

V ớ i khoảng nồng độ đã khảo sát thì pic sắc ký có độ phân giải khá tốt, độ nhạy tương đối, không có hiện tượng chen lấn píc trên sẳc đồ quan sát tương đối dễ dàng.

3 1 2 2 G iớ i h ạ n p h á t h iệ n ( L O D ) và g iớ i h ạ n đ ịn h lư ợ n g ịL O Q )

- G iớ i hạn phát hiện (L O D ) đ ư ợ c định nghĩa là nồng độ ch ất phân tích n h ỏ nhất mà

hệ th ô n g phân tíc h c ò n c h o tín h iệ u p h ân tích khác c ó n g h ĩa v ớ i tín h iệ u củ a m ẫu trăng

hay tín hiệu nền Như vậy pic sắc ký của chất phân tích phải có chiều cao H thoả mãn

đ iều k iện sau: H > 3 5 n, T r o n g đó: H là c h iề u c a o p ic , ô là độ lệ c h c h u ẩ n củ a tín h iệ u

nền Đây là một thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân tích Neu chât

nào nhạy hơn thì có giới hạn phát hiện nhỏ Đe Xác định LOD của cácị3-lactam chúng tôi tiến hành xác định LOD dựa vào dường chuẩn.

L O D = 3* —

b

T rong đó: b là h ệ s ố g ó c tron g p h ư ơ n g trình h ồi quy; Sy là đ ộ lệ c h ch u ẩ n củ a m ẫu trấng ,

dược xác định theo phương trình của đường chuẩn.

- Giới hạn phát hiện (LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà

hệ th ô n g p h ân tích đ ịn h lư ợ n g đư ợ c VỚI tín h iệ u phân tích k h á c c ó ý n g h ĩa định lư ợ n g

với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu đường nền.

ký không măc sai sô hệ thông Vì vậy với mục tiêu nghiên cứu là các mẫu dược phẩm

và sinh học chúng tôi chọn các điều kiện nghiên cứu này.

3.1.2.3 Độ chính xác cùa phép đo

Đe đánh giá độ đúng của phép đo, chọn các mẫu phân tích có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính tại điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối cùa khoảng tuyến tính đã khảo sát Chúng tôi tiến hành chuẩn bị 3 mẫu chuẩn có nồng độ 0 ,15ppm; 0,40ppm; 0,80ppm.với các điều kiện như điều kiện khoả sát khoảng tuyến tính, mồi mẫu tiến hành phân tích 6 lần, độ đúng được biểu diễn qua sai sổ tương đối cùa mẫu tự tạo, tính theo công thức: % x = ——— * 100%; Trong đó: s, là diện tích pic tính từ đường chuẩn; S[ là diện tích pic đo được trong sắc đồ Qua kết quả, phân tích và tính toán trên nhận thấy đối với dải nồng độ cao thì sai số tương đối nhỏ hơn 10% Mau có nồng độ nhỏ thì sai

số có cao hơn Tuy nhiên tất cả các sai sổ đều nhò, nằm trong giới hạn cho phép.

3 1 2 4 Đ ỏ lặ p l ạ i c ủ a p h é p đ o

Một phép phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ chính xác của phép đo người ta còn chú

ý đến độ lặp lại c ủ a p h é p đ o Đ e đánh g iá đ ộ lặp lại c ủ a p h ép đo, c h ú n g tôi tiến hành

kháo sát độ lặp lại cùa 3 nồng độ trên (0,15ppm ; 0,40ppm ; 0,80ppm) Dựa vào kết quả thực nghiệm của phần trước, tiến hành tính độ lặp lại theo công thức sau:

Đ ô lêch chuẩn: s - — ; Hê số biến đông: C-V(%) - - - - ; Trong đó: Sị

là g iá trị củ a tín h iệ u p h ân tích ở lần đ o thứ i (m A u s); Stb là g iá trị tín hiệu; trung bình

la i lân đo (mAu.s); n là sô thí nghiệm lặp lại; s là độ lệch chuân; CV(%) là hệ sô biên )ng cùa pháp đo Kết quả phân tích và tính toán được trình bày qua bảng 3.2.

Bảng 3.2: Đánh giá phương pháp theo độ lặp lại của phép đo theo diện tích pic

ỉ.1.3 Phân tích mẫu thực

3.1.3.1 Phăn tích mâu dược phâm

a, Thu thập và xử lý sơ bộ mâu phân tích

Mầu thuốc được thu nhập từ hiệu thuốc về ghi lại thông tin về mẫu bao gồm: Nhà sản xuất, ngày sản xuất, số đăng ký kiểm soát, ngày hết hạn và thành phần của thuốc gồm Penicillin G, CTCP Hoá-Dược phẩm MEKOPHAR; Savixin, CTCPDP Hà Tây;

Ampicillin, Cty CPDP TIPHARCO; Cloxacillin, Aegis Ltd, Nicosia, Cyprus, Europe; Clopencil, Xí nghiệp dược phẩm trung ương, I Pharbaco.

Các mẫu thuốc thu về nếu dưới dạng bột thì đem trộn đều và nghiền mịn (PEN G), còn thuốc dưới dạng viên nén, mỗi loại lấy 5 viên đem cân, ghi lại chính xác khôi lượng rồi nghiền mịn và trộn đều Các mẫu được cân một lượng thích hợp để phân tích Các mẫu thuốc còn lại được bảo quản cất trong tủ lạnh, các mẫu đem khảo sát các điêu

kiện định lượng Kết quà dược so sánh và đánh giá theo phương pháp thống kê đế kiểm

tra độ lặp và h iệu su ấ t thu hồi.

Đ ô i v ớ i c á c m ẫ u phàn tích th êm ch u ẩ n thì lư ợ n g c h ấ t c h u â n đ ư ợ c th êm v à o n g a y

từ đầu trước khi lọc Quá trình xử lý cũng được tiến hành trone các điều kiện tương tự các mẫu phân tích không thêm

Xác định hàm lượng kháng sinh tronẹ mẫu thuốc theo phương pháp thêm chuẩn, thông qua phương trình hồi quy của đường thêm chuẩn dạng y = a + bx

Trong đó: C x = —; C x - Nồng đô chất phân tích có trong dung dich mẫu; a, b là hê sổ

b

trong phương trình hồi quy

Khối lượng chất phân tích có trong a(mg) mẫu cân ban đầu là:

m = V * C X* F * 1 0 3 (m g)Trong đó: m - K h ố i lượng chất phân tích có trong a (m g) mẫu; V - Th ể tích dung dịch được pha từ a (m g); F - Hệ số pha loãng; C x - Nồng độ của chất phân tích xác định từ phương trình hồi quy; 10'3 - Hệ số chuyển đổi từ Ịj.g sang mg với m thUôc = £ 4 viên thuốc

Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả in trên nhãn: c% = — - —

m „

Trong đó: in, là khỏi lượng xác định theo phương pháp phân tích, m n là khỏi lượng thuốc ghi trên nhãn thuốc

* Đ án h g iá đ ộ thu h ồ i th eo p h ư ơ n g p h áp th ê m c h u ẩ n

T a c ó C x là n ồ n g đ ộ ban đầu khi ch ư a th êm c h ấ t c h u ẩ n P -L a c ta m ; C s: n ồ n g độ đ ư ợ c

thêm vào lượng dung dịch chuẩn A C ; S x và S s là chiều cao trung bình của các dung dịch

ổảrtg 3.3 / / íệ u xwdf thu h ô i fi-L a c ta m theo phirơng p h á p th êm ch u â n trong m âu th u ô c

H ìn h 3.3 Đ ô t h ị x á c đ ịn h c á c c h á t theo

p h ư ơ n g p h á p thêm c h u â n tro n g m â u th u ô c

Khôi lượng thuốc đo được trong lviên, m,

Sai số so với hàm lượng in trên nhãn (C%)

a) X ử lý mẫu

Mầu nước tiểu được lấy từ 2 người tình nguyện độ tuổi từ 20 đến 25, cách 2 tuần trước khi uống thuốc không dùng bất kỳ loại thuốc nào khác M ỗi người tình nguyện uống 3 viên/ngày vào các buổi sáng, trưa, tối và uống liên tiếp trong 3 ngày Viên cuôi cùng của ngày thứ 3, sau khi uống 4 giờ thì lấy mẫu.

Lấy từ 1,5 đến 2ml lượng mẫu vào các ống ependorf Ly tâm 15 phút ờ 10.000 vòng /phút để tách riêng phần protein và được bảo quản trong tủ lạnh.

Trước khi phân tích lẫy mẫu ra khỏi ngăn đá và để ở nhiệt độ phòng cho mẫu tan

iá Hút 50 |il nước tiểu vào on e ependorf thể tích 10 ml Thêm khoảng 200 -3 0 0 ^1

C a o ( m g f l )

0 000 vòng/phút để kết tủa protein và tách chất béo D ịch chiết thu được lọc qua giấy

ọc 0.45 ^im Hút 200 nl dịch lọc làm bay hơi bằng kh í N 2 sạch đến hết dung môi Cặn íược hòa tan bằng hỗn hợp dung môi chạy mẫu Trộ n đều bằng cách đặt vào bể siêu âm rong 2 phút Dung dịch được đem đi đo bằng phương pháp thêm chuẩn M ỗi mẫu đo íược bơm lặp lại 3 lần

)) Điều kiện tối ưu cho quá trình chạy sắc ký:

1 Pha tĩnh: Cột Supelcosil R P - C18 với kích thước hạt nhồi 5 |im

2 Pha động:

Nồng độ đệm lO m M ; pH = 3 ,5 ; T ỷ lệ ACN /M eO H /đệm là 10/20/70; Chạy đẳng dòng, tốc độ 0,8ml/phút

3 Nhiệt độ cột tách 30°c

4 Thể tích mẫu 20|J.l

5 Detector đo ở bước sóng tại 225nm

c) X ử lý kết quả

T ừ sắc đồ đo được các mẫu nước tiểu, xử lý bằng phần mềm thống kê origin 7.5

Bảng 3.5 Hiệu suất thu hỏi của mẫu nước tiếu

H ình 3.4 Đ ồ th ị x á c định các chấ t C EP và A M P theo p h ư ơ n g p h á p thêm chuân

d) Đ ánh giá phưong pháp phân tích :

- X â y d ự n g đ ư ờ n g c h u ẩ n c á c k h án g sin h tron g k h o ả n g 0 ,1 0 - 2 ,0 0 p p m , hệ số tuơ ng quan c á c đ ư ờ n g c h u ẩ n R 2 > 0 ,9 9

- Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh từ 0,01ppm đến 0,10ppm Giới hạn đ:nh lư ợ n g L O Q từ 0 ,0 3 p p m đ ến 0 ,3 0 p p m

3.2.1 Nghiên cím dẫn x u ấ t hỏa các ị3-lactam

3.2.1.1 Kháo sát nhiệt độ phản ứng dân xuất hóa với thuốc thứ NBD-F

Nghiên cứu được thực hiện bang phương pháp HPLC kết hợp dẵn xuất hóa Thực hiện phản írng dẫn xuât hóa Ị3-lactam trong thể tích mẫu nhỏ, sau đó bơm vào hệ thống HPLC để định lượng và đánh giá phàn ứng.

Nhiệt độ dẫn xuất hóa là một yếu tố rất quan trọng N hiệt độ thích hợp, chất phân tích phàn ứng hoàn toàn với thuốc thử, làm cho kết quả của phép phân tích chính xác hơn Trong phản ứng của chất phân tích với thuốc thử N B D -F , tham khảo các tài liệu trong nước và trên thế giới, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ từ 5 0 ° c đến 8 0 ° c Điều kiện chạy sắc ký là: bước sóng kích thích Ex = 470nm , bước sóng phát xạ Em = 530nm, thể tích vòng mẫu V=20/J 1, vận tốc pha động v= lm l/phút Cột Supelcosil RP- C18, đệm acetat lOmM (p H = 4,5), A C N /M eO H / đệm = 2 5 /2 5 /5 0 , thu được các kết quả như sau:

3S h D « *c t0 f A ,Ex.<r0fvn.Ẽm.5ỉồfw p -00

Hình 3.5 Sắc ký đồ ở các nhiệt độ phản úng khác nhau (Ăex=470nm, Ẳem=530nm, v=20fil, v= lmưphút Cột RP-C18, đệm acetat lOmM

(pH=4,5), ACN/MeOH/đệm - 25/25/50)

ị p H - 4 , 5 ) , A C N /M e O H /đ ệ m = 2 5 /2 5 /5 0 )

Mhìn vào sắc đồ sắc ký trên, so sánh giữa mẫu B lan k và mẫu phân tích, ta có pic iầutièn là sản phẩm phụ của phản ứng, píc thứ hai là C E P , tiếp theo là C E F và A M P Dựa vào bàng số liệu và đồ thị trên, nhận thấy nhiệt độ phàn ứne ảnh hường rất lớn ớii diện tích píc Nhiệt độ càng nhỏ, Spíc càng nhỏ (nhiệt độ từ 5 0 ° c đến 65°C) Nhiệt độ

|Uiá lcn, Spíc giảm, đồng thời sinh ra nhiều sản phẩm phụ T ạ i nhiệt độ 7 0 °c , diện tích

?ic, Sịíc lớn nhất V ớ i những nhận xét như vậy, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ phản rmgtạ} dẫn xuất là 7 0 °c cho những khảo sát tiếp theo

.'.2.1.1 Kháo sát thời gian phàn ứng dấn xuất hóa

Ih ờ i gian của phản ứng dẫn xuất hóa cũng là một yếu tố rất quan trọng ảnh hường ớii hiỊu suất phản ứng Th ờ i gian thích hợp, phản ứng xảy ra hoàn toàn, kết quả của rhiân lích chính xác hơn Trong phản ứng này, chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian