Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen phương nam ở việt nam

Tuynhiên, dochưa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán cây bịnhiễmSRBSDV đều được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR sửdụngcặp mồi từ Trung Quốc hoặc tự thiết kế dựa trên trình tự phân

BỘGIÁO DỤCVÀĐÀOTẠOB Ộ

N Ô N G NGHIỆPVÀPTNTVIỆNKHOAHỌCNÔNGNGHIỆ PVIỆTNAM

ĐỖTHỊHẠNH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN

VÀPHÁTTRIỂNKỸTHUẬTCHẨNĐOÁNVIRUS LÚALÙNSỌCĐENPHƯƠNGNAMỞVIỆTNAM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh

TÓMTẮTLUẬNÁNTIẾNSĨ NÔNGNGHIỆP

Hà Nội–2017

Phảnbiện2:……….

Phảnbiện3:……….

LuậnánsẽđượcbảovệtrướcHộiđồngchấmluậnáncấpnhànướchọpt ại:ViệnkhoahọcnôngnghiệpViệtNam

Cóthểtìmhiểuluậnántạithưviện:

- ThưviệnQuốcgiaViệtNam

- ThưviệnViệnKhoahọcNôngnghiệpViệtNam

và táibùngphát dịchsau mộtkhoảngthờigian nhấtđịnh.

Virus lúa lùn sọc đen Phương Nam (Southern rice streakeddwarf virus-SRBSDV)gây bệnh lúa lùn sọc đen được phát hiện lầnđầu tiênvàonăm

black-2001 tạicácvùng trồng lúat h u ộ c t ỉ n h Q u ả n g Đông, phía Nam

Trung Quốc Virus này là thành viên mới thuộcnhómFijivirus-2, họReoviridae.Triệu chứng chủ yếu của cây lúanhiễm bệnh thường

thấy là cây lúa tương đối thấp lùn, lá xanhđậm,lábịxoănởđầuláhoặctoànbộlá,ráchméplávàđặcbiệtcónhữngu sápmàu trắng đến đen chạy dọc các đường gân ở mặt sau lá, bẹ láhoặc các đốt thân Bệnh chủyếu nhiễm trên các cây thuộc dạng thựcvật thân cỏ như: lúa, ngô,

cỏ Môi giới truyền bệnh của SRBSDVlàrầylưngtrắngvàrầynâunhỏnhưngchỉcórầylưngtrắngmớicókhảnăng truyềnSRBSDV từ lúa sang ngô Hệ gen virus có chiều dài29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNAsợi đôi có kích thước từ 1,8 đến4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từS1 đến S10 nhưnghầu hết đềuchưa được xác định chức năng Dựa

2protein,phânđoạnS9vàS10cómứcđộbảothủcao,mãhóachoproteinvỏ

của virus, do vậy thích hợp để nghiên cứu chẩn đoán Phân đoạnS7cũng có mức bảo thủ cao vàm ã h ó a p r o t e i n P 7 1 c ó

v a i t r ò q u a n trọng trong tiến hóa, do vậy thích hợp để nghiêncứu mức độ biếnđộngtrongquầnthể virus

Ở Việt Nam, dịch bệnh lúa lùn sọc đen được phát hiện thấylầnđầu tiên trên lúa mùa năm 2009 tại 20 tỉnh miền Bắc và miềnTrungvới diện tích lúa nhiễm bệnh lên tới 42.000 ha Vì là virus mới

và lầnđầu tiên xuất hiện ở Việt Nam nên công tác chẩn đoán gặp rấtnhiềukhó khăn Hai kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus hiện đại và phổbiếnnhấthiệnnay làk ỹ t h u ậ t R T - P C R v à E I S T r o n g

k h i k ỹ t h u ậ t chẩn đoán bằng RT-PCR cho kết quả có độ chínhxác cao thì kỹ thuậtchẩnđoánbằng ELISA chokếtquảtương đối chínhxác,k ỹ t h u ậ t đơn giản, giá thành rẻ nên rất phù hợp với điều kiện Việt Nam Tuynhiên, dochưa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán cây bịnhiễmSRBSDV đều được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR sửdụngcặp mồi từ Trung Quốc hoặc tự thiết kế dựa trên trình tự phânđoạnS10 của một số mẫu bệnh Ngoài ra, các virus thực vật vốn cótốc độđột biến rất cao do đặc tính mắc lỗi sao mã của enzyme RdRP(RNAdependent RNA polymerase) của virus, sự thay đổi nhanhchóng cáclực tiến hóa như ký chủ và vector cũng như bản chất bộgen phânđoạn nên khả năng hình thành các chủng/loài virus mới rấtcao Chođến nay, chúng ta vẫn chưa có một nghiên cứu nào về đánhgiá đadạng di truyền SRBSDV gây bệnh ở các vùng sinh thái trồnglúakhác nhau ở Việt Nam cũng như nghiên cứu chuẩn hóa quytrìnhchẩn đoán SRBSDV Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến

hành đềtài:“Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn

đoánviruslúalùnsọcđen Phương NamởViệtNam”.

2 Mụctiêu nghiêncứu

- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở các vùng sinh tháitrồnglúa khác nhau của Việt Nam dựa trên kết quả giải trình tựphânđoạn S7, S9 và S10

- Pháttriểnkỹ thuậtchẩn đoánSRBSDVởViệtN a m b ằ n g

á nh giá đa dạngditruyền

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại ViệtNambằngkỹthuậtRT-PCR

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại ViệtNambằngELISA

4 Tínhmớicủaluậnán

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiênc ứ u

c h u y ê n sâu và có hệ thống về đa dạng di truyền virus lúa lùn sọcđen phươngNam và bước đầu chứng minh chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệdi truyềngầngũihơn vớimẫu SRBSDVQuảngĐông

Luận án đã phát triển thành công kỹ thuật chẩn đoánSRBSDVbằng RT-PCR cho kết quả chính xác 100% với các mẫulúa nhiễmbệnh đã biểu hiện rõ triệu chứng và có thể phát hiện sớmmẫu lúanhiễmbệnhchưabiểu hiệnrõtriệu chứng

Luận án cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên tạo thànhcôngkháng thể đa dòng kháng virus lúa lùn sọc đen Phương Nambằngprotein/peptide tái tổ hợp; kháng thể đa dòng có tính đặc hiệucao, cóthểpháthiện virusởcả mẫu lúavà rầynhiễmvirus.

5 Ý nghĩakhoa họcvàthựctiễncủa đềtài

Luận án cung cấp các cơ sở dữ liệu, thông tin khoa học mới vềđadạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam, cung cấp tư liệu khoa học mớivề cơ sở khoa học vàkhả năng áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tửtrongchẩnđoánSRBSDVởViệtNam

Kết quả đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam làmcơsở cho nghiên cứu chẩn đoán, diễn biến phát dịch và đề xuất cácbiệnpháp phòng trừ hiệu quả giúp giảm thiểu tổn thất mùa màngchongười nôngdân

Kỹ thuậtchẩnđoánSRBSDVbằng RT-PCR cóđ ộ c h í n h

x á c cao, phát hiện được sự có mặt của virus trong những cây lúachưabiểu hiện rõ triệu chứng và chẩn đoán virus bằng ELISA pháthiệnnhanh sự có mặt của virus trong mẫu lúa và mẫu rầy nhiễmvirus rấtcó ý nghĩa trong công tác chẩn đoán sớm và chính xác tácnhân gâybệnh

6 Cấu trúccủa luận án

Luận án dày 152 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 6 bảngsốliệu, 49 hình Luận án gồm 5 phần: Mở đầu 4 trang; Tổng quantàiliệu3 4 t r a n g ; V ậ t l i ệ u , n ộ i d u n g v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê

n c ứ u 2 2 trang;Kết quả nghiên cứu và thảo luận 71 trang;Kết luận vàkiếnnghị 02 trang Đã tham khảo 125 tài liệu bao gồm 23 tài liệutiếngViệt và 102tàiliệutiếngAnh

đã có 16 loại virus gây hại trên lúa đượcpháthiện.

Các virus phát hiện (vàng lùn, lùn xoắn lá, tungro, lùn sọcđenphương Nam ) ở Việt Nam đều có tầm quan trọng kinh tế vàlantruyền qua rầy Việc chẩn đoán các virus trên lúa thường khó dotriệuchứng có thể bị nhầm lẫn do sử dụng thuốc trừ cỏ hoặc các nguyênnhân sinh lý Phát hiệnvirus trên rầy buộc phải sử dụng các kỹ thuậtchẩnđoánnhưEISh o ặ c PCR

1.2 ĐẶCĐIỂMCÁCFIJIVIRUSTHUỘCHỌREOVIRIDAE

CácvirusthuộchọReoviridaeđượcđặctrưngbởibộgenRNsợi

kép (dsRN ), phân đoạn, bao gồm 9 đến 12 phân tử RNA sợi

képmạch thẳng ChiFijiviruscó hệ gen phân đoạn gồm 10 phân tử

RNAsợi kép, mạch thẳng (S1-S10) Các phân tử RNn à y c ó

k í c h t h ư ớ c dao độngtừ1,4 kb đến 4,5kb

mãhóahaip r o t e i n (40,5kDa và 36,4 kDa ); phâ nđoạ n S9dà i 1899bp, chứaha i ORF mã hóa hai protein (39,9 kDa và 24,2 kDa); phân đoạn S10 dài1797bp,c h ứ a m ộ t O R F m ã h ó a p r o t e i n ( 6 2 6 k D a ) h ì n h t h à

n h l ớ p v ỏ ngoài của phân tử virus SRBSDV có sự tương đồng về triệu chứng,phổký chủ,hình tháihọc phântửvirus,huyếtthanh họcvớic á c thành viên khác

trong chiFijivius,đặc biệt là RBSDV Hai kỹ thuậtchẩn đoán

SRBSDV phổ biến nhất là thử nghiệm miễn dịch liên kếtmen(EIS)vàphản ứngtrùnghợpchuỗi(RT-PCR)

1.4 VIRUSLÚALÙNSỌCĐENPHƯƠNGNMỞVIỆTNAM

SRBSDV lần đầu tiên xuất hiện vào tháng 8 2009, tại NghệAn,sau đó lan ra tại 20 tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ với diện tíchbịhại tới 42.000 ha Do tính chất nghiêm trọng của SRBSDV,ngoàiviệcxác định tác nhângây bệnh,nhiều nghiên cứu vềb ả n c h ấ t

h ệ gen và đa dạng di truyền của SRBSDV ở Việt Nam được nghiêncứutrong thời gian qua Năm 2010 và 2011, bệnh có xu hướng mởrộngra nhiều địa bàn trồng lúa khác nhau và có tới 34 tỉnh có diệntíchtrồnglúa bịbệnh

RRSV lây nhiễm nhân tạo được cung cấp bởi Trung tâmbệnhcâynhiệtđới, Học việnNôngnghiệp ViệtNam

Bảng2 1 M ẫ u l ú a nhiễmSRBSDVdùng trongnghiên cứu

mẫu

10 QuangTri-1 Nhịưu986 Vụxuân2010 QuảngTrị

2.1.2 Chủngvisinhvật

Chủngvi k h u ẩ n E c o l i D H 5α α m u a c ủ a hãngInvitr oge n, E coli

2.1.3 Vectorvàoligonucleotide

Vector pET28a/P10 do phòng Bệnh học phân tử, Viện ditruyềnNông nghiệp cung cấp; pET32a mua của hãng Novogen;pGEM-Tmạchthẳngcó đầuTmua của hãngPromega

Các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu đặt mua từhãngInvitrogenvà Sigma

- Phương phápkháng nguyênkháng thể:KỹthuậtWesternb l o t củaSambrook&Rusel(2001);kỹthuậtDot-

Mowat&Dawson(1987)

Chương3.K Ế T QUẢNGHIÊNCỨUVÀTHẢOLUẬN

3.1 NGHIÊNCỨUĐADẠNGDITRUYỀNSRBSDV ỞVIỆTNAM

Mục tiêu của phần nghiên cứu này là đánh giá đặc điểm phântửvà đa dạng di truyền SRBSDV của Việt Nam dựa trên trình tự 3phânđoạn S7, S9 và S10 của các mẫu virus thu thập từ các vùng sinh tháitrồnglúa ViệtNam

Kết quả giải trình tự cho thấy thấy tất cả các phân đoạn S7,S9và S10 của 13 mẫu SRBSDV phân lập tại Việt Nam đều cókíchthước giống nhau, lần lượt là 2176 bp, 1849 bp và 1798 bp.Mức độtương đồng nucleotide của các mẫu virus Việt Nam với nhaudaođộng từ 97,6-100% và với các chủng Trung Quốc dao động từ97,3 -99,8%.Kếtquả sosánhtrìnhtựaxitamintrêncáckhungđọcmởcho

thấychủng SRBSDVViệtNamcóquanhệditruyềngầngũihơnvớiSRBSDV QuảngĐông(Hình 3.10,Hình 3.11, Hình3.13).

Hình3.10 Sosánhtrìnhtựamino acidcủa proteinP9.1

Hình3.11 Sosánhtrìnhtự amino acid củaproteinP9.2

Hình3.13 Sosánh trìnhtự amino acid củaproteinP10

20 60 100

80

JQ692578.1-VN JN388912.1-TQ ThaiBinh-2

NamDinh Hue-1 EU784841.1-QuangDong-TQ FN563995.1-HaiNam-TQ HQ731498.1-ThuaThienHue

HM998850.1-TQ Hue-2

NinhBinh-1 LaoCai ThaiBinh-1

lý ởcùngmột thời điểm,chƣahình thànhchủngmới

11

66 55

NinhBinh-2 ThaiBinh-1

2Hue-1

SonLa-1 JQ034356-TQ EU784843-QuangDong- TQNamDinh

Ghichú:Cácsốtrênmỗinốtlàgiátrịboostraptínhtheo%(1000lầnlặp).Mẫu

ViệtNam được chỉ rõbằngchấmđen.

GQ472845-TQ SonLa-1

SonLa-ThaiBinh-1

100

100 QuangTri-1 Hue-1

Phản ứng RT-PCR tối ƣu cho quy trình xét nghiệm SRBSDVcóthànhphầnbaogồm8,6µlddH2O,0,6µlmỗiloạimồi(Fw:CACCCCACATCGCGTCATCT,Rv:C C C A T T T G A G C A G G A A C

TTCAC), 0,5 µlRNA khuôn, 1,5 µl đệm 10X, 1,5 µl dNTP 2mM,0,2 µl Taq DNA polymerase 5 U/µl;0,75 µl Reversetranscriptase 4U/µl, 0,75 µl Ribolock Rnase và chu trình nhiệt là:

42oC - 10 phút,94oC - 5 phút, (94oC - 30 giây, 56oC - 20 giây,72oC 1,5 phút) x 35chu kỳ,72oC-7 phút, bảoquản ở4oC

-Tiến hành thử nghiệm quy trình đã tối ưu được đối với 192mẫulúagồm102mẫukhô và90mẫutươi(Bảng3.6).

Kếtquảchẩnđoán Tươi Khô Actin Mồi Mồi đặchiệ

u

Tỉ lệ pháthiện bệnh

tạochưabiểuhiệnbệnh 10 0 Nghi nhiễm 10/10 2/10 20%Lúa thu thập từ

3.3.1 Tạo kháng thể đa dòng khángSRBSDV bằng hạt virustinhchiết

HạtvirusđượctinhchiếttừmẫulúalâynhiễmnhântạoSRBSDVđểgây

t i n h sạchđ ƣ ợ c k i ể m tr a b ằ n g P T A

-E L I S A K ế t q u ả t hu đ ƣ ợ c c h o t h ấ y

kháng thể IgG tinh sạch có hiệu giá là 1/200 (Hình 3.30) và pháthiệnchínhxácsựcómặtcủa SRBSDVtrongmẫu câybệnh (Hình 3.31).

Hình 3.30 Xác định hiệu giá kháng thể IgG bằng PTA-

ELISAGhic h ú : M ẫ u k h á n g t h ể I g G t i n h s ạ c h đ ư ợ c p h a l o ã n g t h e o

t ỉ l ệ : 1 / 1 0 0 , 1/200,1/5α00,1/1000,mẫudịchchiếtcâybệnh(cộtmàuxanh)v àcâykhỏe(cộtmàuđỏ).ĐồthịthểhiệnOD A405α trungbình3lầnxétnghiệm.

ProteintáitổhợpđƣợcbiểuhiệntrongvikhuẩnE.coliRossettavàtin

hsạchbằngcộtsắckíáilựcNi2+agarose(Hình3.33).Protein

tái tổ hợp tinh sạch đƣợc sử dụng để gây đáp ứng miễn dịchtrênchuột Kháng thể IgG đƣợc tinh sạch từ kháng huyết thanh (đãkiểmtra đáp ứng miễn dịch) bằng cột sắc ký ái lực Protein A-sepharose(Hình3.35).

Hình 3.33 Tinh sạch protein P10bằng cột sắc ký ái lực NTAGhi chú:( A) Dịch chiết tế bào và các phân đoạn tinh sạch protein

Ni-đượcđiện di trên gel SDS-PAGE 12% (B) Protein P10 được phát hiện

bằngkháng thể anti-His-tag pha loãng 1: 5α000 MK: thang chuẩn protein; giếng1: Dịch chiết tế bào; giếng 2: dịch không gắn cột; giếng 3,4: phân đoạn rửacột;giếng5α-8: cácphânđoạnđẩycộtbằngimidazol25α0mM.

Hình3.35.Kiểmtra khángthể IgGtinhsạch

Ghi chú: (A) Kháng thể tinh sạch qua cột Protein A-Sepharose được điện

ditrên gel SDS-PAGE 12% Giếng Mk: Thang chuẩn protein; giếng 1:phânđoạn rửa giải (B) Khả

năng phát hiện protein P10 của kháng thể IgG tinhsạch pha loãng 1: 2000; Giếng Mk: Thang chuẩn Protein; Giếng 1: ProteinP10 tinh sạch; Giếng 2: Dịch chiết vi khuẩn mang pET28a (Đối chứng âm);Giếng 3: DịchchiếtvikhuẩnmangpET28a/P10.

1: 50 1: 100 1: 200

Hiệu giá của kháng thể đƣợc xác định kĩ thuật Dot-blot.Kếtquả thu đƣợc cho thấy kháng thể IgG sau đƣợc tinh sạch pháthiệnđƣợc protein P10 tái tổ hợp ở nồng độ pha loãng 1:6000 (Hình3.36Acột 2) và SRBSDV trong mẫu dịch chiết lúa và ngô bệnh ở nồng độphaloãng1:5000(Hình 3.36B)

quảchot h ấ y k há ng t h ể ở n ồ n g độp h a l o ã n g 1: 5000 c ó khả n ă n g

n hậ n biết đặc hiệu SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh lùn sọc đen (Hình3.37), ngoài ra,kháng thể sau tinh sạch cũng có khả năng phát hiệnsớm sự có mặtcủa SRBSDV trong trong mẫu xét nghiệm có tỉ lệ rầynhiễm

SRBSDV cao hơn 50% (bằng phương pháp lây nhiễm nhântạo)(Hình 3.38).

Hình 3.37 Đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể bằng

ELISAGhichú:MẫukhángthểIgG

tinhsạchđượcphaloãngtỉlệ1/5α000vàđượckiểmtrabằng EL ISA với m ẫ u dịc hchi ết câykhỏe (cột màuxanh dư ơng), câynhiễmSRBSDV(cộtmàuđỏ)và câynhiễmRRSV(cộtmàuxanhlá)phaloãng tỉ lệ 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/5α0 và 1/60 Đồ thị thể hiện giá trị

OD A492 trung bìnhcủa3lầnxétnghiệm.

Hình 3.38 Đánh giá khả năng phát hiện SRBSDV trong mẫu

rầynhiễmSRBSDVbằng ELISA

Ghi chú:Mẫu kháng thể IgG tinh sạch được pha loãng tỉ lệ 1/5α000 và

đượckiểm tra bằng ELISA với mẫu rầy được trộn theo tỉ lệ [số rầy bệnh (B)]:[sốrầy khỏe (K)] là 0B:5αK, 1B:4K, 2B:3K, 3B:2K, 4B: 1K và 5αB:0K.

Đồ thị thểhiệngiátrịOD A492 trungbìnhcủa3lầnxétnghiệm.(ĐC)đốichứngâm.

3.3.3 NghiêncứutạokhángthểđadòngSRBSDVbằngpolypeptide giàutínhkháng nguyên

Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo ra kháng thể kháng P10từpolypeptidegiàutínhkhángnguyênnhằmtăngtínhđặchiệuchoxét

Đoạn polypeptide giàu tính kháng nguyên trên protein vỏP10đượclựachọnbằngcácphầnmềmtinsinh

Kếtquảphântíchtínhưanước,khảnăngnằmtrênbềmặtvàcấutrúc khônggian của các vùng polypeptide trên P10 bằng phần mềmIEDB cho thấy 2 vùngpolypeptide ở vị trí 259-425 và vị trí 365-557được dự đoán là giàutính kháng nguyên (Hình 3.39 và 3.40) và đảmbảo tính bảo thủ trêntất cả các mẫu SRBSDV đã phân lập ở ViệtNam

A

B Hình3.39 Dựđoántínhkháng nguyêntrên proteinP10

Ghi chú:Biểu đồ dự đoán tính ưa nước (A) và khả năng nằm trên bề

mặtphân tử (B) của các vùng polypeptide trên P10 Vùng màu vàng: vùngpolypeptide ưa nước và nằm trên bề mặt phân tử; vùngmàu xanh: vùngpolypeptidekỵnướcvà khôngnằmtrên phân tử.Threshold:giá trịngưỡng.

Hình 3.40 Dự đoán vùng polypeptide có cấu trúc không gian

cókhảnăng tạo epitope

Ghi chú: Các vùng polypeptide có cấu trúc không gian có khả năng

tạoepitopenằmở vịtrí 1-166 (A),235α-415α(B), 446-5α5α7(C)trênP10.

2 đoạn nucleotide mã hóa chuỗi axit amin ở vị trí 259-425

và365-557 (đặt tên làP10.1vàP10.2) đƣợc phân lập bằng kỹ thuậtPCR

(Hình 3.41, giếng 1 và 3) Sản phẩm PCR sau đó đƣợc nhândòngvàovector pGEM-T

Hình3.41 NhânbảnđoạngenP10.1vàP10.2bằngPCR

Ghichú:Gi ếngMk:Thang chuẩnDNA1kb;gi ếng1 và2:PC Rvới cặp

mồi S10-P1-Fw/ S10-P1-Rv ; giếng 3 và4: PCR với cặp mồi S10-P2-Fw/S10-P2-Rv; giếng

1 và 3: khuôn là pGEM/S10; giếng 2 và 4: Đối chứng âm(khuôn làH 2 O) Tiếp theo, đoạn genP10.1vàP10.2đƣợc cắt và ghép nối vàovector

biểu hiện pET32a Vector tái tổ hợp đƣợc kiểm tra bằng PCRvà cắtbằng enzyme giới hạn Kết quả thu đƣợc trên hình 3.45 chothấy

đoạn genP10.1 và P10.2đã đƣợc ghép nối thành công

vàovectorbiểuhiệnpET32a.CácvectorpET32a/P10.1vàpET32a/P10.2