GIÁO D C VÀ ÀO T O B Y T TR NG I H C Y D C C N TH TR N TH KI U HÂN KH O SÁT N NH C A VIÊN NÉN N I CURCUMIN 100MG LU N V N T T NGHI P D C S I H C NG I H NG D N KHOA H C Ths LÊ TH MINH NG C N TH – 2015[.]
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
cô Ths Lê Thị Minh Ngọc, Ths Huỳnh Thị Mỹ Duyên và thầy Ths Lữ Thiện Phúc
đã tận tình hướng dẫn, góp ý, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp này
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu nhà trường cùng quý Thầy, Cô các bộ môn, đặc biệt là các Thầy Cô, anh chị kỹ thuật viên liên bộ môn Bào Chế - Công Nghiệp Dược, liên bộ môn Kiểm Nghiệm – Hóa Phân Tích – Độc Chất, đã tận tình giảng dạy cho em những kiến thức quý báu trong những năm học qua cũng như tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp
Con xin cảm ơn mẹ, gia đình đã luôn động viên, khích lệ con trong suốt quá trình học tập tại trường, đây là nguồn động lực to lớn giúp con vượt qua những khó khăn trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong nhóm làm đề tài Bào Chế - Công Nghiệp Dược, Kiểm Nghiệm và các bạn lớp Dược K36, đặc biệt là bạn Nguyễn Dương Thảo Ngân, bạn Mai Lan Thanh, bạn Huỳnh Lâm Tú Anh đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác
Cần Thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2015
Trần Thị Kiều Hân
Trang 4MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1.Tổng quan curcumin 3
Công thức cấu tạo 3
1.1.1 Tính chất lý hóa 3
1.1.2 Tính chất dược lý của curcumin 4
1.1.3 Sinh khả dụng, phức chất curcumin và viên nén nổi chứa phức chất 1.1.4 curcumin 5
Dạng thuốc nổi trong dạ dày 5
1.1.5 Một số nghiên cứu về hệ thống phân phối thuốc nổi cho curcumin và phức 1.1.6 chất curcumin 7
1.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7
Định nghĩa 7
1.2.1 Ứng dụng 8
1.2.2 1.3.Thẩm định qui trình phân tích 9
Khái niệm 9
1.3.1 Các yêu cầu cần thực hiện để thẩm định qui trình phân tích 9
1.3.2 Một số nghiên cứu về định lượng curcumin bằng HPLC 11
1.3.3 1.4.Độ ổn định và tuổi thọ của thuốc 12
Định nghĩa 12 1.4.1
Trang 5Tốc độ phân hủy thuốc và các yếu tố ảnh hưởng 121.4.2.
Phương pháp nghiên cứu độ ổn định và tuổi thọ của thuốc 151.4.3
Một số nghiên cứu liên quan đến độ ổn định của curcumin 171.4.4
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 182.1.Đối tượng – trang thiết bị 18
Đối tượng nghiên cứu 182.1.1
Chất chuẩn 182.1.2
Dung môi – Hóa chất 192.1.3
Thiết bị 192.1.4
2.2.Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19
Ổn định công thức viên nén nổi curcumin 100mg 192.2.1
Xây dựng qui trình định lượng curcumin trong viên nén nổi và trong môi 2.2.2
trường thử độ hòa tan bằng phương pháp HPLC 23Khảo sát độ ổn định của viên nén nổi curcumin 100mg 292.2.3
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 323.1.Ổn định công thức viên nén nổi curcumin 100mg 32
Thăm dò công thức 323.1.1
Kết quả kiểm tra các thông số trong quá trình xát hạt và dập viên 343.1.2
Kết quả đo độ hòa tan 343.1.3
3.2.Xây dựng qui trình định lượng curcumin trong viên nén nổi và trong môi trường thử độ hòa tan bằng phương pháp HPLC 35Thăm dò pha động 353.2.1
Đánh giá qui trình phân tích 373.2.2
Xác định hàm lượng curcumin trong viên nén nổi curcumin 100mg 453.2.3
Định lượng curcumin trong môi trường thử độ hòa tan 463.2.4
3.3.Khảo sát độ ổn định của viên nén nổi curcumin 100mg 48
Ứng dụng qui trình định lượng vào nghiên cứu độ ổn định của viên nén 3.3.1
nổi curcumin 100mg 48Kết quả đánh giá mẫu thử 493.3.2
Trang 6Kết quả độ ổn định của viên nén nổi curcumin 100mg 503.3.3.
Ước tính tuổi thọ của viên nén nổi curcumin 100mg 533.3.4
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 574.1.Ổn định công thức viên nén nổi curcumin 100mg 574.2.Xây dựng qui trình định lượng curcumin trong viên nén nổi và môi trường hòa tan bằng phương pháp HPLC 59Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng viên nén nổi curcumin 100mg 594.2.1
Định lượng curcumin trong môi trường thử độ hòa tan 634.2.2
4.3.Khảo sát độ ổn định của viên nén curcumin 100mg 64
Ứng dụng qui trình đã thẩm định vào việc khảo sát độ ổn định của viên 4.3.1
nén nổi curcumin 100mg 64Khảo sát độ ổn định của viên nén nổi curcumin 100mg 664.3.2
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 7DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT Chữ tắt Chữ nguyên Nghĩa tiếng việt
1 ACN Acetonitril
3 DĐVN IV Dược Điển Việt Nam IV
4 HPLC High Performance Liquid
Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao
5 HPMC Hydropropyl methylcellylose
6 HPTR Hệ phân tán rắn
7 LOD Limit of dectection Giới hạn phát hiện
8 LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng
10 mtb Khối lượng trung bình
11 NaHCO3 Natri bicarbonat
12 PEG Polyethylen glycol
13 PDA Photodiode Array Detector Đầu dò đi diod quang
15 PVP Polyvinyl pyrrolidon Giá trị trung bình
17 RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối
Trang 8DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Qui trình thẩm định theo ICH 9
Bảng 1.2 Giá trị của hệ số tương quan k ứng với nhiệt độ thực nghiệm (ttn) và nhiệt độ trung bình (ttb = 200C) khi A = 2 16
Bảng 1.3 Điều kiện thử nghiệm theo hướng dẫn hồ sơ đăng kí thuốc 2014 16
Bảng 2.1 Các lô thuốc nghiên cứu độ ổn định 18
Bảng 2.2 Danh mục dung môi-hóa chất được sử dụng trong đề tài 19
Bảng 2.3 Danh mục các trang thiết bị được sử dụng trong đề tài 19
Bảng 2.4 Thành phần công thức đánh giá sự ảnh hưởng của lactose 20
Bảng 2.5 Điều kiện và tần số thử nghiệm trong nghiên cứu độ ổn định 30
Bảng 2.6 Các chỉ tiêu đánh giá, yêu cầu và số lượng viên nén nổi curcumin 100 mg dùng trong nghiên cứu độ ổn định 30
Bảng 2.7 Giá trị của K ứng với nhiệt độ thực nghiệm (ttn)và nhiệt độ trung bình (ttb = 200C) khi A = 2 31
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của lactose lên tính chất của viên nén nổi 32
Bảng 3.2 Kết quả thăm dò tỉ lệ các polyme tạo khung 33
Bảng 3.3 Thành phần công thức viên nén nổi curcumin 100mg 33
Bảng 3.4 Kết quả kiểm nghiệm bán thành phẩm 34
Bảng 3.5 Độ hòa tan của curcumin từ viên nén nổi chứa phức β-cyclodextrin, viên nén nổi chứa phức PVP và phức chất curcumin-PVP 34
Bảng 3.6 Các điều kiện thăm dò 35
Bảng 3.7 Giá trị trung bình các thông số sắc ký của mẫu chuẩn curcumin ở các pha động khảo sát (n=6) 36
Bảng 3.8 Tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn curcumin 37
Bảng 3.9 Tính tương thích hệ thống trên mẫu thử viên nén nổi chứa curcumin 37
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng 39
Trang 9Bảng 3.11 Khảo sát độ chính xác định lượng curcumin trong viên nén nổi 40
Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian 41
Bảng 3.13 Sự tuyến tính giữa diện tích đỉnh theo nồng độ định lượng 44
Bảng 3.14 Giá trị trung bình các thông số sắc ký của mẫu hòa tancurcumin tại thời điểm 30 phút (n=6) 46
Bảng 3.15 Tính tương thích hệ thống trên mẫu curcumin trong môi trường thử độ hòa tan ở thời điểm 24 giờ 47
Bảng 3.16 Giá trị các thông số sắc ký ứng với mẫu chuẩn và các mẫu phân hủy 48
Bảng 3.17 Kết quả kiểm nghiệm viên nén nổi curcumin 100mg từ 3 lô trước khi đưa vào nghiên cứu độ ổn định 49
Bảng 3.18 Kết quả kiểm nghiệm viên nén nổi curcumin 100mg của lô 1 qua các thời điểm nghiên cứu 50
Bảng 3.19 Kết quả kiểm nghiệm viên nén nổi curcumin 100mg của lô 2 qua các thời điểm nghiên cứu 51
Bảng 3.20 Kết quả kiểm nghiệm viên nén nổi curcumin 100mg của lô 3 qua các thời điểm nghiên cứu 52
Bảng 3.21 Kết quả ước tính tuổi thọ của lô 1 55
Bảng 3.22 Kết quả ước tính tuổi thọ của lô 2 55
Bảng 3.23 Kết quả ước tính tuổi thọ của lô 3 56
Trang 10DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của curcumin 3
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của curcumin từ viên nén nổi chứa phức β-cyclodextrin, viên nén nổi chứa phức PVP và phức chất curcumin-PVP 35
Hình 3.2 Sắc ký đồ curcumin chuẩn ở điều kiện 6 36
Hình 3.3 Overlay sắc ký đồ mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu trắng, dung môi pha mẫu và dung môi pha động 38
Hình 3.4 Overlay sắc ký đồ độ chính xác trên mẫu thử curcumin 40
Hình 3.5 Overlay sắc ký đồ độ chính xác trung gian của mẫu thử viên nén nổi trên hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000 42
Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu trắng của viên nén nổi curcumin 43
Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu thử viên nén nổi curcumin ở nồng độ 0,05µg/ml 43
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu thử viên nén nổi curcumin ở nồng độ 0,16 µg/ml 43
Hình 3.9 Đồ thị tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ curcumin chuẩn 44
Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu curcumin hòa tan ở thời điểm 30 phút 46
Hình 3.11 Overlay sắc ký đồ mẫu thử, mẫu chuần, dung môi pha mẩu, dung môi pha loãng và dung môi pha động 47
Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn hàm C theo t 53
Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn hàm logC theo t 53
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn hàm (1/C) theo t 54
Trang 11ĐẶT VẤN ĐỀ
Chất lượng thuốc là mối quan tâm hàng đầu của nhà sản xuất vì nó liên quan trực tiếp đến sức khỏe của người sử dụng Vì vậy ở bất kì nước nào, khi đưa ra thị trường một chế phẩm thuốc bên cạnh các nghiên cứu có liên quan như nghiên cứu chiết xuất, tổng hợp, bào chế, thử dược lý… các nhà sản xuất phải nghiên cứu
độ ổn định của thuốc, để xác định tuổi thọ, đưa ra hạn dùng và điều kiện bảo quản phù hợp cho các cơ sở phân phối thuốc Theo qui chế đăng kí lưu hành thuốc của
Bộ Y Tế Việt Nam, một trong những điều kiện để thuốc được lưu hành là phải có đề cương và kết quả nghiên cứu độ ổn định của thuốc, tuổi thọ của thuốc phải dài hơn hạn dùng thuốc
Nghệ vàng (Curcuma longa L Zingiberaceae) là loài dược liệu được trồng
và sử dụng rộng rãi ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Á Nhân dân ta bao đời nay vẫn sử dụng Nghệ như vị thuốc quý trong Y học cổ truyền như giải độc gan, viêm loét dạ dày, chống ung thư và phục hồi sức khỏe, hoạt chất đem lại tác dụng cho Nghệ là curcumin với hàng nghìn nghiên cứu lâm sàng Curcumin được công nhận rộng rãi trên toàn cầu như một loại dược chất triển vọng trong tương lai vì khả năng tuyệt vời cho việc ngăn ngừa và điều trị nhiều bệnh mãn tính, nan y bao gồm chống oxi hóa, chống vơ vữa thành mạch, giảm cholesterol máu, kháng ung thư đặc biệt là ung thư dạ dày đang rất được quan tâm [13], [22],[ 25],[ 29],[ 38] Tuy nhiên, độ tan thấp và không ổn định trong môi trường tiêu hóa là những bất lợi trong việc ứng dụng curucmin vào dạng bào chế đường uống [22],[ 29] Từ năm
2000 đến nay, trên thế giới đã có hàng trăm nghiên cứu các dạng bào chế mới nhằm cải thiện độ hấp thu của curcumin Trong đó, dạng viên nén nổi trong dạ dày chứa curcumin và phức chất curcumin được các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều hơn Chính vì vậy, để đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm cũng như khảo sát độ ổn định của
dạng bào chế mới này, chúng tôi thực hiện đề tài: ―Khảo sát độ ổn định của viên nén nổi curcumin 100mg‖
Trang 12Với mục tiêu:
1 Ổn định công thức viên nén nổi chứa phức chất curcumin 100mg
2 Xây dựng qui trình định lượng curcumin trong viên nén nổi và trong môi trường thử độ hòa tan bằng phương pháp HPLC
3 Khảo sát độ ổn định của viên nén nổi curcumin 100mg
Trang 13CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN CURCUMIN
Curcuminoids là một nhóm hoạt chất tạo màu vàng đặc trưng cho Nghệ
(Curcuma longa L Zingiberaceae) Trong đó, curcumin là curcuminoids quan trọng
nhất trong Nghệ, còn được gọi là curcumin I Curcumin được phân lập đầu tiên vào năm 1815, thu được dạng kết tinh năm 1870 Đến năm 1910, curcumin được tổng hợp hóa học bởi Lampe [28] Ngoài ra còn có hai loại curcuminoids khác là desmethoxycurcumin và bis-desmethoxycurcumin [14],[ 28] Cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng trị liệu của curcumin, trong đó đặc biệt quan tâm đến tác dụng kháng ung thư, kháng viêm, chống oxi hóa
Công thức cấu tạo
1.1.1.
Curcumin chiếm tỷ lệ khoảng 75% trong các curcuminoids
Danh pháp diene-3,5-dione (Diferuloylmethane) [22],[ 28],[ 29],[ 42]
Curcumin là bột tinh thể màu vàng cam, thực tế không tan trong ether, nước
ở pH acid và trung tính, tan trong methanol, ethanol, dimethylsulfxid, dimethyl
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của curcumin
Trang 14formamid với độ tan khoảng 1mg/ml và aceton là 20mg/ml Hệ số phân bố và độ tan trong nước của curcumin tương ứng là 3,2µg/ml và 0,6µg/ml Curcumin có cực đại hấp thu trong methanol là 430nm Điểm chảy là 1830
C
Curcumin có thể tồn tại ở những dạng hỗ biến bis-ceton và enol.Trong dung dịch, curcumin tồn tại chủ yếu ở dạng enol Ở các giá trị pH, curcumin tồn tại ở các dạng khác nhau
Thông thường, curcumin bền vững trong môi trường acid, nhưng kém bền trong môi trường kiềm và trung tính, dưới điều kiện này, curcumin bị phân hủy thành acid ferulic và feruloylmethane Ngược lại, chất chuyển hóa chính của curcumin (tetrahydrocurcumin) khá ổn định trong môi trường trung tính, kiềm và vẫn giữ được hoạt tính oxi hóa
Curcumin ổn định trong dịch sinh học, không quá 20% curcumin bán thải trong 1 giờ và khoảng 50% trong 8 giờ Sản phẩm phân hủy chính của curcumin là trans-6-(40-Hydroxy-30-metoxyphenyl)-2,4 dioxo-5-hexenal, các sản phẩm thoái hóa nhỏ gồm: vanillin, acid ferulic và feruloylmethane [22],[ 25],[ 28],[ 29],[ 38]
Tính chất dược lý của curcumin 1.1.3.
Hoạt tính kháng ung thư
Curcumin là một tác nhân kháng ung thư mạnh, có khả năng ngăn chặn các loại ung thư dạ dày, da, tuyến vú, miệng, phổi, gan, thực quản, ruột non, ruột già… Một số cơ chế kháng ung thư của curcumin được đề nghị bao gồm: ức chế sự sinh sản của tế bào, ức chế các isoenzym cytochrom P450, ngăn chặn các gen gây ung thư, ức chế các protein liên quan đến chu trình của tế bào, ức chế sự hình thành khối
u, ức chế sự chuyển hóa sinh học của các chất gây ung thư, cảm ứng hoạt tính của enzyme glutathion S-transferase (GST) [13],[ 22],[ 27],[ 29],[ 42]
Một số tác dụng dược lý khác
Ngoài những tác dụng dược lý nêu trên, curcumin còn có hoạt tính trên tim mạch, chống xơ vữa thành mạch, ức chế tăng sinh cơ trơn mạch máu, giảm cholesterol máu, chống kết tập tiều cầu, hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer, kháng viêm, kháng virut và nấm, chống oxi hóa [14], [ 31]
(A)
Trang 15Sinh khả dụng, phức chất curcumin và viên nén nổi chứa phức chất 1.1.4.
curcumin
Sinh khả dụng của curcumin rất thấp, nhiều nghiên cứu chỉ ra những nguyên nhân làm giảm sinh khả dụng của curcumin là do sự hấp thu kém, chuyển hóa nhanh và thời gian bán thải ngắn (0,39 giờ) Do đó, sinh khả dụng của curcumin dùng theo đường uống thường không cao Vì vậy, để cải thiện sinh khả dụng của curcumin, cần làm tăng độ tan của curcumin trong đường tiêu hóa Trong những phương pháp làm tăng độ tan của curcumin, việc tạo phức chất thường được sử dụng rộng rãi, curcumin được tạo phức với nhiều chất mang khác nhau như: PVP K-30, PEG, xylitol… Phức curcumin tạo thành giúp làm tăng độ tan trong nước, trong môi trường acid, độ ổn định trong môi trường kiềm cũng như độ ổn định quang hóa của curcumin [38], [29], [25]
Bên cạnh đó, sự hấp thu kém còn làm giảm thời gian lưu lại dạ dày của curcumin Theo nhu động, curcumin vận chuyển xuống ruột và bị enzym, pH kiềm phá hủy Đây cũng là một trong những nguyên nhân khiến sinh khả dụng của curcumin thấp Vì vậy, để góp phần tăng sinh khả dụng của curcumin, cần giữ thuốc lâu dài trong dạ dày, phóng thích curcumin một cách từ từ và có kiểm soát Trong bào chế hiện đại, có thể điều chế curcumin dưới các dạng khác nhau như thuốc nổi trong dạ dày (hệ thống tạo khí, vi hạt hay khối xốp có tỉ trọng nhỏ), hệ thống dính lên bề mặt niêm mạc, màng nhày, các thiết bị hay thuốc làm trì hoãn nhu động dạ dày… Trong số này, các dạng bào chế nổi được sử dụng phổ biến nhất [10],[ 38], [29]
Dạng thuốc nổi trong dạ dày
1.1.5.
1.1.5.1 Định nghĩa dạng thuốc nổi trong dạ dày
Dạng thuốc nổi trong dạ dày hay còn gọi là hệ thống phân phối thuốc tại dạ dày là dạng thuốc có tỉ trọng thấp hơn dịch dạ dày (≈1,004 g/cm3) nên có khả năng nổi trong dạ dày mà không bị tác động bởi tốc độ làm rỗng dạ dày trong thời gian dài Khi thuốc nổi trong dạ dày thì dược chất được phóng thích từ từ với tốc độ mong muốn và sau đó phần còn lại của thuốc sẽ được đẩy ra khỏi dạ dày Nhờ vậy,
Trang 16thuốc lưu lại dạ dày trong thời gian lâu hơn và duy trì nồng độ thuốc ổn định hơn trong cơ thể [23],[ 40],[ 45]
1.1.5.2 Ưu và nhược điểm của dạng thuốc nổi trong dạ dày
Ưu điểm
Tăng sinh khả dụng
Dạng thuốc nổi có lợi cho những chất hấp thu tốt ở dạ dày, có tác động tại chỗ ở dạ dày
Thuốc được hòa tan trong dịch tiêu hóa nên dược chất có sẳn dạng phân
tử tại ruột non để hấp thu
Tăng sự hấp thu ở những thuốc có cửa sổ hấp thu hẹp ở ruột non
Dạng thuốc nổi giúp hấp thu hoạt chất tốt hơn trong bệnh lý tiêu chảy khi
mà nhu động ruột tăng, thời gian lưu thuốc ở đường tiêu hóa bị hạn chế
Nhiều thuốc dùng một lần/ngày thì sự hấp thu dưới ngưỡng cực đại do phụ thuộc thời gian thuốc trong cơ thể, dạng thuốc nổi kéo dài thời gian lưu thuốc tại dạ dày nên cũng khắc phục được điều này [41],[ 45]
Nhược điểm
Đòi hỏi phải có một lượng dịch đủ trong dạ dày để thuốc nổi
Không thích hợp bào chế dạng thuốc nổi với những dược chất gây kích ứng hay kém ổn định trong dạ dày
Những thuốc được hấp thu đồng đều trên toàn bộ ống tiêu hóa hay chịu hiệu ứng vượt qua lần đầu cũng không thích hợp bào chế dạng thuốc này
Hệ đòi hỏi một lượng chất lỏng đủ lớn trong dạ dày để có thể nổi và phát huy tác dụng Tuy nhiên nhược điểm này có thể được khắc phục bằng cách bao hệ với một polyme kết dính sinh học, khi đó hệ sẽ được dính lên thành
dạ dày Hơn nữa có thể uống thuốc với một cốc nước lớn (200-250ml) [41],[ 45]
Trang 17Một số nghiên cứu về hệ thống phân phối thuốc nổi cho curcumin và 1.1.6.
Shishu Goindi, Kamalpreet Mann, Nidhi Aggarwal (2011), nghiên cứu hạt nổi lưu lại dạ dày của phức curcumin β-cyclodextrin để điều trị các khối u dạ dày Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy 50% curcumin được phóng thích từ hạt nổi sau 5 giờ và sau 12 giờ là 90% Với các kết quả nghiên cứu trên động vật, số khối u trên mỗi con chuột mang khối u đã giảm 71,42% và 38,29% tương ứng với sử dụng curcumin tinh khiết và hạt nổi chứa phức curcumin β-cyclodextrin [43]
Sobhita Rani, Neelima Rani, Jayanth, Lavanya Reddy (2014), nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứa curcumin bằng cách sử dụng Psyllium kết hợp với HPMC K15M Kết quả nghiên cứu cho thấy sự kết hợp này giúp tăng thời gian nổi và duy trì sự ổn định trong quá trình nổi, không cho thấy sự tương tác nào giữa curcumin
và các polyme Viên nén nổi bào chế được phóng thích hoạt chất theo động học Higuchi là loại khuếch tán qua khung matrix [45]
1.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Định nghĩa
1.2.1.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích thước ≤ 10µm, do vậy phải dùng một bơm có áp suất cao ≈ 300atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ cỡ 20µg [2] [4]
Ưu điểm của HPLC:
Độ nhạy và độ chính xác cao
Trang 18 Áp dụng cho hầu hết các hợp chất không bay hơi chịu nhiệt hay dễ bị phân hủy bởi nhiệt…
Thời gian phân tách nhanh, độ tách tốt và kết quả phân tích ít phụ thuộc vào các thao tác kỹ thuật nên tránh được sai số
Cột sắc ký có thể sử dụng nhiều lần mà không phải tái sinh, mẫu phân tích có thể thu lại được vì đa số các detector không phân hủy mẫu
Được xem là phương tiện định tính và định lượng hiệu quả trong các Dược Điển hiện đại USP, BP, EP… trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích hóa hợp chất tự nhiên [2], [4]
Chiều cao pic là khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic Các pic có đường nền bị nhễu, việc xác định chiều cao sẽ dễ dàng hơn xác định diện tích
Diện tích đỉnh của một chất là tương ứng với tổng lượng chất đó Việc tính toán diện tích đỉnh sẽ gặp khó khăn khi pic có cường độ quá cao hay bị giãn, không đối xứng và detector bị nhiễu
Nồng độ chất tan được tính theo công thức:
c c
Trang 19Các yêu cầu cần thực hiện để thẩm định qui trình phân tích [3], [33]
1.3.2.
Theo tài liệu Q2(R1) validation of Analytical Procadures: Text and methodology (International Conference on Harmonization, ICH, tháng 11-2005) qui định các yêu cầu thẩm định đƣợc trình bày ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Qui trình thẩm định theo ICH
Trang 201.3.2.1 Tính tương thích hệ thống (System Suitability)
Là một phần tính toán cần thiết khi tiến hành các phương pháp phân tích bằng sắc ký nhằm mục đích xác định độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống phân tích sắc ký thích hợp với phương pháp phân tích đang thực hiện
1.3.2.2 Tính đặc hiệu (Specificity)
Đối với qui trình định lượng, cần đảm bảo rằng kết quả thu được của hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu là chính xác, tránh sự ảnh hưởng của các thành phần khác trong mẫu đến kết quả định lượng
Khi đế cập đến độ chính xác, người ta quan tâm đến:
Độ lặp lại (Repeatability): việc thực hiện phương pháp được tiến hành bởi cùng một người trong cùng một điều kiện phòng thí nghiệm trên cùng một dụng cụ máy móc trong cùng một thời gian
Độ chính xác trung gian (Intermediate Precision) biểu thị độ chính xác của phương pháp theo các biến số của phòng thí nghiệm tại nhiều ngày khác nhau, nhiều kiểm nghiệm viên với các dụng cụ khác nhau
Độ sao chép lại (Reproducibility) biểu thị độ chính xác của nhiều phòng thí nghiệm
Trang 211.3.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Giới hạn phát hiện của một qui trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử trong mẫu còn có thể phát hiện được nhưng không nhất thiết định lượng được
Giới hạn định lượng của một qui trình phân tích là lượng thấp nhất của chất cần thử có trong mẫu thử còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác thích hợp
LOD=3Hmax F (1.3)LOQ=10Hmax F = 3,3 LOD (1.4)
Trong đó:
Hmax : biên độ dao động lớn nhất của chuỗi tín hiệu của mẫu trắng
trong khoảng 20 lần bề rộng giữa chiều cao của đỉnh chất thử
F : yếu tố đáp ứng (nồng độ/chiều cao)
1.3.2.6 Tính tuyến tính (Linearity)
Tính tuyến tính của một qui trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được (y) và nồng độ là một đường thẳng (x) Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan (R2)
Một số nghiên cứu về định lượng curcumin bằng HPLC
1.3.3.
Theo USP 35, curcumin được định lượng bẳng HPLC với cột Luna C18 (4,6mm x 20cm, 5µm) Pha động là tetrahydroguran : acid citric 1% trong nước (4 : 6) thu được sắc ký đồ gồm 3 curcumin có thời gian lưu là 1,0; 1,2; 1,4 phút [48] Nguyễn Thị Mạc Phượng (2008), nghiên cứu điều kiện tách , tinh chế dẫn xuất crucumin từ củ Nghệ vàng Tác giả đã xây dựng qui trình định lượng và thử tinh khiết dẫn xuất curcumin bằng phương pháp HPLC với cột sắc ký RP-C18 (250
x 4,6mm, 5cm), nhiệt độ cột 400C Pha động là ACN : H3PO4 0,05% (55 : 45), có thời gian lưu ở 10,63 phút [14]
Mark Tracy (2013), nghiên cứu tách các curcumin từ Nghệ trên cột Polar Premium Cho kết quả rằng, methanol và acetonitril cho khả năng rửa giải tốt, pic
Trang 22đạt Acid formic và acid phosphoric cả hai đều có hiệu quả nhưng acid phosphoric được chọn vì kinh tế hơn Với hệ pha động methanol : 10mM phosphoric (80 : 20) cho các pic curcumin I, II, III lần lượt là 1,1; 1,5 và 2,1 phút [35]
Phạm Thị Phương và cộng sự (2014), nghiên cứu điều kiện định lượng đồng thời curcumin và piperin bẳng phương pháp HPLC với cột Germini C18 (250 x 4,6mm, 5mm) Pha động là ACN : đệm phosphat 50mM (điều chỉnh đến pH 3,5 bằng acid phosphoric) tỷ lệ 60 : 40, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, curcumin có thời gian lưu là 8,1 phút [16]
1.4 ĐỘ ỔN ĐỊNH VÀ TUỔI THỌ CỦA THUỐC
Định nghĩa
1.4.1.
Độ ổn định của thuốc là khả năng của thuốc (nguyên liệu hoặc thành phẩm) bảo quản trong điều kiện xác định giữ được những đặc tính vốn có về vật ký, hóa học, vi sinh, tác dụng dược lý và độc tính trong giới hạn qui định của tiêu chuẩn chất lượng thuốc [1], [12], [ 21]
Tuổi thọ của thuốc là khoảng thời gian tính từ khi thuốc sản xuất đến khi còn giữ được những chỉ tiêu trong giới hạn qui định của tiêu chuẩn đặt ra Tuổi thọ của thuốc được xác định trên cơ sở theo dõi về độ ổn định của thuốc bằng thực nghiệm, cần được xem xét trong từng điều kiện cụ thể Thường mức hàm lượng còn 90% so với hàm lượng ghi trên nhãn được dùng để qui định tuổi thọ của một thuốc [1],[ 12],[ 18]
Tốc độ phân hủy thuốc và các yếu tố ảnh hưởng
1.4.2.
1.4.2.1 Phương trình động học của tốc độ phân hủy thuốc [1],[ 13]
Tốc độ phân hủy thuốc (v) là độ giảm hàm lượng dược chất (dc) theo thời gian (t):
n m n
k dt
dc
v ( ) (1.5) Trong đó:
v : tốc độ phân hủy thuốc
c : nồng độ chất tham gia phản ứng
t : thời điểm
Trang 23k : hằng số tốc độ
n + m : bậc phản ứng
Các công trình nghiên cứu cho thấy đa số các dược chất bị phân hủy theo phản ứng bậc 1, không có nhiều phản ứng bậc 0, hiếm khi xảy ra phản ứng bậc cao Trong phản ứng bậc 1, sự thay đổi hàm lượng dược chất theo thời gian như sau:
kt D
D : hàm lượng % của thuốc tại thời điểm t
D0 : hàm lượng % của thuốc tại thời điểm t = 0
độ rã và khả năng giải phóng hoạt chất, phá vỡ sự ổn định của hỗn dịch, nhũ tương Mối liên hệ giữa nhiệt độ và tốc độ phản ứng là cơ sở của phương pháp lão hóa cấp tốc, mối liên hệ này về mặt lý thuyết được thể hiện bởi phương trình Arrhenius:
RT
E A
k Ae
Ea
303,2)log(
)log(
Trang 24Bằng thực nghiệm, Van’ Hoff đã chứng minh tốc độ phản ứng tăng lên từ
2-3 lần khi nhiệt độ tăng lên 100C Từ đó xuất hiện nhu cầu xác định nhiệt độ cần thiết
để bảo quản thuốc [1],[ 12], [18]
b Ánh sáng
Ánh sáng cũng có những tác động khác nhau đối với dược phẩm, thúc đẩy quá trình phân hủy thuốc làm thuốc dễ bị chuyển màu, thay đổi hình dạng tinh thể Một thuốc có thể bị ảnh hưởng về mặt hóa học bởi bức xạ ở một độ dài sóng nhất định mà nó hấp thụ có mức năng lượng vượt quá ngưỡng bền của nó, khiến nó trở nên nhạy cảm và tự phân hủy Đó là các hợp chất có nhân: phenothiazin, hydrocacrbon nhân thơm, các dị vòng có nhóm chức aldehyd, ceton Bức xạ tử ngoại có mức năng lượng cao nhất là nguyên nhân gây phân hủy của nhiều thuốc Tia tử ngoại có bước sóng từ 50 – 400nm, đặc biệt các tia có bước sóng ngắn có thể tách phân tử oxy thành oxy nguyên tử và hình thành phân tử ozon Ozon có khả năng oxi hóa mạnh hơn oxy nên dễ dàng oxi hóa các chất ngay ở nhiệt độ thường,
có khi ở nhiệt độ thấp, ở nhiệt độ cao tác động của ozon càng mạnh
Ánh sáng mặt trời có năng lượng rất cao trong vùng khả kiến từ 400 đến 800nm và trong vùng hồng ngoại từ 800 đến 3200nm Điều quan trọng là bức xạ hồng ngoại có thể tích lũy, làm cho sản phẩm nóng lên và hoạt hóa sự nhiệt phân Vùng khả kiến có tác động đáng kể lên màu hiện diện trong chế phẩm
Do đó, việc bảo quản thuốc đúng cách là không bao giờ được phơi trực tiếp dưới ánh sáng mặt trời, có ý nghĩa rất quan trọng trong việc giữ ổn định cho thuốc Chính vì vậy mà các nhà sản xuất thường bao gói tránh ánh sáng, lọ đựng bằng thủy tinh màu có khả năng ngăn cản ánh sáng, bao film viên nén bằng màng bao polyme
có thành phần hấp thụ tia tử ngoại là biện pháp chống lại sự quang phân hủy [1], [19]
c Độ ẩm
Độ ẩm của không khí là tác nhân chính hạ thấp tính ổn định của thuốc Độ
ẩm trong không khí giảm làm giảm hàm lượng kết tinh trong thuốc, độ ẩm không khí tăng ảnh hưởng đến lý tính của các dược phẩm làm tăng quá trình thủy phân tạo
Trang 25ra các sản phẩm phân hủy như các sản phẩm khô bị hút ẩm, các dạng bột đông khô, sủi bọt, làm phai màu viên bao, làm thuốc bột bị vón, tạo điều kiện cho sự xuất hiện
và tăng trưởng các vi sinh vật, làm giảm hoạt tính [1], [12]
Theo một số nghiên cứu cho thấy, điều kiện lý tưởng để bảo quản thuốc là nhiệt độ 20oC và độ ẩm tương đối là 60% đến 65% [19]
Việt Nam thuộc vùng khí hậu IV- khí hậu nhiệt đới gió mùa mang tính chất nóng ẩm, có nhiệt độ trung bình hằng năm khoảng 270C và độ ẩm trung bình là 75% Do đó có rất nhiều trở ngại trong công tác bảo quản thuốc, đặc biệt trong các tháng hè, nhiệt độ có thể lên tới 370C
Phương pháp nghiên cứu độ ổn định và tuổi thọ của thuốc
1.4.3.
Hiện nay có hai phương pháp xác định tuổi thọ của thuốc: phương pháp theo dõi tự nhiên và phương pháp lão hóa cấp tốc
1.4.3.1 Phương pháp theo dõi tự nhiên (Long Term Stability Study)
Còn được gọi là phương pháp dài hạn Đây là phương pháp đánh giá toàn diện và tin cậy hơn cả về nghiên cứu độ ổn định của thuốc Thực chất của phương pháp này là bảo quản thuốc lâu dài ở nhiệt độ phòng (điều kiện bình thường về nhiệt
độ, độ ẩm…) Sau từng thời gian định kỳ đánh giá chất lượng theo tiêu chuẩn qui định (tiêu chuẩn cơ sở hay tiêu chuẩn Dược Điển) Dựa trên phân tích thống kê kết quả để xác định tuổi thọ của thuốc Hoặc theo dõi sự giảm hàm lượng hoạt chất dưới 90% theo thời gian trong điều kiện bảo quản dự kiến mà sản phẩm sẽ lưu hành [1],[ 21],[ 32]
1.4.3.2 Phương pháp lão hóa cấp tốc (Accelerated Stability Study)
Đây là phương pháp thử sức chịu đựng của thuốc nghiên cứu ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quản trung bình
Nguyên tắc: ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bảo quản trung bình, các quá trình lý hóa trong thuốc xảy ra nhanh hơn dẫn tới những thay đổi bất lợi cho chất lượng thuốc Xác định các chỉ tiêu chất lượng ở các nhiệt độ thực nghiệm trong một thời gian nhất định cho phép giảm đáng kể thời gian cần thiết khi theo dõi tuổi thọ ở nhiệt độ bảo quản trung bình Phương pháp cho phép sử dụng nhiệt độ cao nhất để
Trang 26đảm bảo xác định tuổi thọ của thuốc trong thời gian ngắn nhất, nhưng nhiệt độ này không được vượt quá nhiệt độ làm thay đổi trạng thái tập hợp, cấu trúc cơ lý và cơ chế phân hủy của thuốc [1],[ 21],[ 32] Cơ sở của phương pháp:
Dựa vào qui tắc Van’ Hoff
Qui tắc Van’ Hoff: khi nhiệt độ tăng lên 100C thì tốc độ phản ứng hóa học có thể tăng từ 2-4 lần Qui tắc chỉ đúng khi khoảng chênh lệch nhiệt độ không quá lớn [5] [18]
Tuổi thọ của thuốc = k × tuổi thọ ở điều kiện già hóa (1.9)
10 10
)
A A
Trong đó: A là hệ số nhiệt của tốc độ phản ứng trong qui định này: A = 2
Bảng 1.2.Giá trị của hệ số tương quan k ứng với nhiệt độ thực nghiệm (ttn) và nhiệt
độ trung bình (ttb = 200C) khi A = 2
Phương pháp cấp tốc theo hướng dẫn của hồ sơ đăng kí thuốc 2014 [7]
Bảng 1.3 Điều kiện thử nghiệm theo hướng dẫn hồ sơ đăng kí thuốc 2014
Trang 27 Bất kỳ tạp chất liên quan (sản phẩm phân hủy) nào vượt quá giới hạn cho phép
đồ Ở mẫu chế phẩm bị sấy ở nhiệt độ cao, pic curcumin hầu như không có gì thay đổi, nhưng độ tinh khiết pic giảm [37]
Dalapathi B Gugulothu and Vandana B Patravale (2012), đã nghiên cứu sự
ổn định của chế phầm chứa đồng thời curcumin và celecoxib Tác giả tiến hành gây sốc chế phẩm trong điều kiện khắc nghiệt như: tiếp xúc với tác nhân oxi hóa, sự chiếu sáng, môi trường acid, kiềm và nhiệt độ cao Các mẫu phân hủy được tiêm vào hệ thống HPLC, thu được các sắc ký đồ cho thấy có sự suy giảm nồng độ curcumin 8% [24]
Trang 28CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG – TRANG THIẾT BỊ
Đối tượng nghiên cứu
2.1.1.
HPTR của curcumin với PVP-K30 và PEG 6000
Viên nén nổi chứa phức chất curcumin (tương ứng 100mg curcumin)
Bảng 2.1 Các lô thuốc nghiên cứu độ ổn định
Trang 29Dung môi – Hóa chất
2.1.3.
Bảng 2.2 Danh mục dung môi-hóa chất được sử dụng trong đề tài
STT Tên hóa chất, dung môi Tiêu chuẩn Hãng & nước sản xuất
3 Acid phosphoric Dùng cho HPLC Merck - Đức
5 Acid hydroclodrid Công nghiệp Trung Quốc
Thiết bị
2.1.4.
Bảng 2.3 Danh mục các trang thiết bị được sử dụng trong đề tài
STT Tên trang thiết bị Xuất xứ
4 Máy đo độ cứng PHARMA TEST PTB 311E Đức
2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Ổn định công thức viên nén nổi curcumin 100mg
2.2.1.
Từ những kết quả thăm dò và nghiên cứu từ đề tài ―Nghiên cứu bào chế viên nén nổi chứa phức chất curcumin 100mg‖, Lê Minh Phương (2014) [15], chúng tôi
Trang 30tiến hành thay đổi tỷ lệ một số thành phần trong công thức với mục tiêu cải thiện độ hòa tan và độ nổi của viên nén nổi curcumin 100mg
2.2.1.1 Thăm dò công thức
a Khảo sát sự ảnh hưởng của lactose lên tính chất của viên nén nổi
Lactose là một tá dược độn thường được sử dụng trong viên nén Ngoài tác dụng độn, lactose còn giúp viên rã nhanh chóng, góp phần tăng sự phóng thích hoạt chất ra khỏi viên Tuy nhiên, trong viên nén nổi, sự có mặt của lactose ảnh hưởng lên sự bắt khí và độ bền vững của khung gel Nên tiến hành đánh giá sự ảnh hưởng của lactose lên tính chất của viên nén nổi
Bảng 2.4 Thành phần công thức đánh giá sự ảnh hưởng của lactose
b Polyme tạo khung (HPMC K15M và Gôm xanthan)
Sau khi loại lactose khỏi công thức làm khối lượng viên giảm, tỉ lệ các thành phần bị thay đổi nên cũng ảnh hưởng đến tiềm thời nổi Dựa vào các tài liệu tham khảo, thành phần polyme giữ vai trò quan trọng quyết định khả năng nổi của viên Đồng thời, sự phối hợp giữa gôm xanthan và HPMC K15M là cần thiết để giúp bào chế được viên vừa có tiềm thời nổi ngắn, vừa duy trì tính nguyên vẹn của viên Để viên có khả năng nổi tốt thì gôm xanthan và HPMC K15M phải có một tỉ lệ thích hợp Các công thức sau được bào chế với sự phối hợp giữa gôm xanthan và HPMC K15M với các tỉ lệ 1:3, 1:5, 1:7, 1:9
Trang 312.2.1.2 Đánh giá tiềm thời nổi và thời gian nổi
Tiềm thời nổi là thời gian tính từ lúc viên tiếp xúc với dung dịch đệm HCl
pH 1,2 đến khi nổi trên bề mặt dung dịch
Thời gian nổi là thời gian tính từ khi viên nổi lên trên bề mặt môi trường đến khi viên bắt đầu chìm xuống đáy cốc
Mỗi công thức thử 6 viên, thử trong 200ml môi trường đệm HCl pH 1,2 trong bercher 250ml Quan sát, ghi nhận thời gian viên nổi lên hoàn toàn và đến khi viên bắt đầu chìm xuống
Yêu cầu: thời gian nổi > 8 giờ
2.2.1.3 Phương pháp đo độ hòa tan
Điều kiện thử độ hòa tan
Sử dụng máy đo độ hòa tan ERWEKA DT-800, loại cánh khuấy với các thông số như sau:
Xử lý mẫu
Lọc dịch hòa tan qua giấy lọc thường, rút 2ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng MeOH, lắc đều Tiếp tục rút 2ml cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ACN, lắc đều, lọc qua lọc 0,45µm Tiêm lần lượt các mẫu vào hệ thống HPLC để xác định nồng độ curcumin có trong mẫu thử
Cách tính kết quả
Trang 32Nồng độ curcumin chưa hiệu chỉnh tại lần rút mẫu thứ n được tính theo đường hồi quy tuyến tính đã xây dựng
Nồng độ curcumin sau khi hiệu chỉnh ở lần hút thứ n được tính theo công thức:
V : thể tích môi trường hòa tan (V = 900ml)
Phần trăm curcumin hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức:
% curcumin= Cn 900
m 1000 100 (2.2)
Cn : nồng độ hiệu chỉnh ở lần thứ n (µg/ml)
m : hàm lượng curcumin trong mẫu (mg)
2.2.1.4 Các thông số cần kiểm soát trong quá trình bào chế
a Độ ẩm: lấy mẫu khoảng 2g bột và đo độ ẩm bằng cân hồng ngoại ở 1050C
b Góc nghĩ: cân 30 g bột, cho chảy liên tục qua phễu có kích thước xác định
Đo chiều cao h và đường kính d của khối bột Góc nghỉ α được xác định theo công
thức:
d
h
tan (2.3) Nếu:
α ≤ 300 : bột chảy tốt
α ≥400
: bột chảy kém
Trang 33c Hình thức viên : nhận xét cảm quan về hình dạng, kích thước, màu sắc, bề
mặt viên,…
d Độ cứng: xác định độ cứng của 20 viên trên máy đo độ cứng Tính độ cứng
trung bình, sai số tương đối (RSD%)
e Độ đồng đều khối lượng của viên: cân chính xác 20 viên bất kỳ và xác định
khối lượng trung bình của viên Cân riêng khối lượng từng viên Không được quá
2 viên có khối lượng chênh lệch quá giới hạn của khối lượng trung bình và không
được có viên nào lệch gấp 2 lần
Xây dựng qui trình định lượng curcumin trong viên nén nổi và trong 2.2.2.
môi trường thử độ hòa tan bằng phương pháp HPLC
2.2.2.1 Thăm dò pha động chạy sắc ký
Dung dịch mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 10mg curcumin chuẩn hòa tan
trong bình định mức 50ml với MeOH, siêu âm trong 10 phút, bổ sung vừa đủ bằng MeOH Hút chính xác 0,5ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng ACN, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm thu được dung dịch curcumin chuẩn có nồng độ 10µg/ml (10ppm)
Dung dịch mẫu thử định lượng: cân 20 viên nén nổi curcumin, xác định khối
lượng trung bình của viên, nghiền thành bột mịn và trộn đều Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 10mg curcumin cho vào bình định mức 50ml, siêu
âm trong 10 phút, bổ sung đến vạch bằng MeOH Lọc dung dịch qua giấy lọc, bỏ khoảng 10ml dịch lọc đầu Hút chính xác 0,5ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng ACN, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm thu được dung dịch curcumin có nồng độ 10µg/ml (10ppm)
Hệ dung môi pha động: tiến hành khảo sát thành phần pha động, pH, độ phân
cực dung môi Các điều kiện sắc ký được lựa chon khảo sát bao gồm:
ACN : dung dịch acid formic 0,2% (pH = 2,7)
ACN : dung dịch acid phosphoric pH = 3,0
Thay đổi độ phân cực của hệ pha động ACN : đệm
Điều kiện 1: ACN : đệm = 90 : 10
Trang 34Điều kiện 2: ACN : đệm = 70 : 30
Điều kiện 3: ACN : đệm = 50 : 50
Điều kiện 4: ACN : đệm = 40 : 60
Điều kiện sắc ký dự kiến:
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Dionex UltiMate 3000
Hệ pha động : Các pha động khảo sát
Cột sắc ký : Cột Phenomenex Germini RP18 (250 × 4,6mm, 5µm) Thể tích tiêm mẫu : 10µl
Nhiệt độ cột : 500C
Bước sóng phát hiện : 428nm
Tốc độ dòng : 1ml/phút
Tiến hành thăm dò trên các hệ pha động: trên từng hệ pha động tiến hành sắc
ký 6 lần cho mỗi dung dịch mẫu thử Tiêu chí lựa chọn điều kiện sắc ký: tR ngắn, chiều rộng pic hẹp, pic có hình dáng cân đối (đánh giá thông qua hệ số bất đối) Với điều kiện được lựa chọn yêu cầu của qui trình phân tích phải tách và định lượng
được hoạt chất curcumin ngay cả khi có sự hiện diện của sản phẩm phân hủy
2.2.2.2 Đánh gía qui trình định lượng viên nén nổi curcumin 100mg
a Xác định tính tương thích hệ thống
Cách tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử định lượng như mục 2.2.2.1
Tiến hành sắc ký 6 lần cho mẫu chuẩn, mẫu thử định theo điều kiện sắc ký tối ưu đã xác định ở mục 2.2.2.1
Tính tương thích hệ thống được khảo sát với các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh, chiều cao đỉnh, hệ số bất đối, số đĩa lý thuyết, hệ số dung lượng
Yêu cầu: qui trình đạt tính tương thích hệ thống khi giá trị RSD qua 6 lần tiến
hành sắc ký của các thông số trong cả mẫu chuẩn và mẫu thử không quá 2%
b Tính đặc hiệu
Cách tiến hành
Dung dịch mẫu chuẩn (10µg/ml): chuẩn bị như mục 2.2.2.1
Trang 35Dung dịch mẫu thử định lượng (10µg/ml): chuẩn bị như mục 2.2.2.1
Dung dịch mẫu thử thêm chuẩn: dung dịch mẫu thử thêm khoảng 100µl dung dịch chuẩn nồng độ 100µg/ml
Dung môi pha mẫu: MeOH
Dung môi pha động (pha sẵn): hệ pha động đã khảo sát ở mục 2.2.2.1
Mẫu trắng: cân chính xác khoảng 80mg tá dược viên nén nổi cho vào bình định mức 50ml, bổ sung đến vạch bằng MeOH, siêu âm trong 10 phút Lọc dung dịch qua giấy lọc, bỏ khoảng 10ml dịch lọc đầu Lọc tiếp dịch lọc qua màng lọc 0,45µm Hút chính xác 0,5ml dung dịch cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa
đủ đến vạch bằng ACN, lắc đều
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, mẫu trắng, dung
môi pha động, dung môi pha mẫu trong cùng điều kiện và overlay các sắc ký đồ
Yêu cầu:
Thời gian lưu của các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn phải tương đương nhau Diện tích đỉnh của mẫu thử thêm chuẩn phải tăng hơn so với mẫu thử trước khi thêm chuẩn
Mẫu trắng, dung môi pha động, dung môi pha mẫu không có pic trùng với pic hoạt chất
Độ tinh khiết pic phải lớn hơn 99%
c Độ đúng
Cách tiến hành
Chuẩn bị mẫu placebo thêm chuẩn: lần lượt thêm vào mẫu placebo lượng nguyên liệu tương ứng với 80%, 100%, 120% so với mức nồng độ định lượng ghi trong qui trình và nằm trong khoảng tuyến tính Xử lý mẫu như mục 2.2.2.1
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Tính tỷ lệ phục hồi lượng chất chuẩn đã thêm và so sánh với tỷ lệ phục hồi lý thuyết
Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi nằm trong khoảng 98% - 102%
d Độ chính xác
Độ lặp lại
Trang 36Cách tiến hành
Chuẩn bị 6 mẫu thử khác nhau như mục 2.2.2.1
Tiến hành sắc ký cho mỗi mẫu thử để xác định độ lệch chuẩn tương đối
Yêu cầu: kết quả định lượng hàm lượng hạt chất có trong mẫu RSD ≤ 2,0 %
Độ chính xác trung gian
Cách tiến hành:
02 kiểm nghiệm viên, mỗi kiểm nghiệm viên phân tích trên 6 mẫu thử khác nhau được chuẩn bị như mục 2.2.2.1
Tiến hành sắc ký trên 02 hệ thống HPLC khác nhau một cách độc lập
Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD của hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu do mỗi kiểm nghiệm viên phân tích và giữa hai kiểm nghiệm viên
Xác định mức độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên
Độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên khác nhau không có
ý nghĩa (đánh giá bằng test F-Fisher và test t)
e Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Cách xác định: tiến hành xác định nồng độ tương ứng của chất cần thử có tín hiệu đo được gấp 3 lần tín hiệu đường nền đối với LOD và 10 lần đối với LOQ
f Tính tuyến tính và miền giá trị
Cách tiến hành
Dung dịch chuẩn gốc (100µg/ml): cân chính xác khoảng 10mg curcumin chuẩn, hòa tan trong bình định mức 100ml với ACN thu đươc dung dịch curcumin chuẩn gốc có nồng độ 100µg/ml
Pha giai mẫu có nồng độ trong khoảng 0,05 – 15µg/ml Lọc các dung dịch thu được qua màng lọc 0,45µm
Trang 37Tiến hành sắc ký các mẫu theo điều kiện sắc ký đã thiết lập ở mục 2.2.2.1 Xác định mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các dung dịch
Vẽ đường biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh: y = ax + b bằng phần mềm Microsoft Excel 2010, biểu thị bằng hệ số tương quan R2
Sử dụng ―phân tích hồi quy‖ với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ
số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy
Yêu cầu: đường thẳng y= ax + b với 0,9980 ≤ R2≤ 1,000
2.2.2.3 Xác định hàm lượng curcumin trong viên nén nổi curcumin 100mg
Cách tiến hành
Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử như trình bày ở mục 2.2.2.1 Tiêm lần lượt các mẫu dung dịch chuẩn và thử vào hệ thống HPLC, xác định diện tích đỉnh curcumin của mẫu chuẩn và thử rồi tính hàm lượng curcumin trong 1 viên
Hàm lượng curcumin trong 1 viên được tính theo công thức:
d a m
m D
D S
S
c t c
(2.4) Trong đó:
Sc,St : diện tích pic curcumin trong mẫu chuẩn và mẫu thử
Dc,Dt : độ pha loãng mẫu chuẩn và mẫu thử
a : khối lượng cân của curcumin chuẩn (mg)
m : khối lượng cân của bột thuốc (mg)
d : độ tinh khiết của mẫu chuẩn
Đánh giá kết quả: So sánh hàm lượng curcumin trong chế phẩm với mẫu
chuẩn Hàm lượng curcumin phải đạt từ 95,0% - 105,0%, so với hàm lượng ghi trên
nhãn, tính theo khối lượng trung bình của viên
Trang 382.2.2.4 Định lượng curcumin trong môi trường thử độ hòa tan
a Điều kiện sắc ký
Để ứng dụng điều kiện sắc ký tối ưu vào định lượng curcumin trong môi trường thử hòa tan Tiến hành hòa tan viên nén nổi trong điều kiện đã xác lập và rút mẫu tại thời điểm 30 phút Mẫu thử được xử lý và tiêm 6 lần vào hệ thống HPLC
b Tính tương thích hệ thống
Cách tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử định lượng như mục 2.2.2.1
Tiến hành sắc ký 6 lần cho mẫu chuẩn, mẫu thử định theo điều kiện sắc ký tối ưu đã xác định ở mục 2.2.2.1
Yêu cầu: qui trình đạt tính tương thích hệ thống khi giá trị RSD qua 6 lần tiến
hành sắc ký của các thông số trong cả mẫu chuẩn và mẫu thử không quá 2%
c Tính đặc hiệu
Cách tiến hành
Dung dịch mẫu chuẩn (10µg/ml): chuẩn bị như mục 2.2.2.1
Dung dịch mẫu thử hòa tan (10µg/ml): chuẩn bị như mục 2.2.2.1
Dung môi pha mẫu: dung dịch đệm pH 1,2
Dung môi pha loãng: MeOH
Dung môi pha động (pha sẵn): hệ pha động đã khảo sát ở mục 2.2.2.1
Mẫu trắng: cho viên placebo vào cốc chứa 900ml đệm pH 1,2 ở 37 ± 0,50C trên bếp khuấy từ có gia nhiệt Rút mẫu ở các thời điểm 30 phút, 12 giờ và 24 giờ Lọc dịch hòa tan qua giấy lọc thường, rút 2ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng MeOH, lắc đều Tiếp tục rút 2ml cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ bằng ACN, lắc đều, lọc qua lọc 0,45µm
Pha động: hệ dung môi pha động được lựa chọn ở mục 2.2.2.1
Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu hòa tan, mẫu trắng, dung môi pha mẫu, dung môi pha loãng, dung môi pha động trong cùng điều kiện và overlay các sắc ký
đồ
Trang 39Yêu cầu: thời gian lưu của các dung dịch mẫu chuẩn, mẫu thử phải tương
đương nhau Mẫu trắng, dung môi pha động, dung môi pha mẫu, dung môi pha loãng không có pic trùng với pic hoạt chất Độ tinh khiết pic phải lớn hơn 99%
Khảo sát độ ổn định của viên nén nổi curcumin 100mg
2.2.3.
2.2.3.1 Ứng dụng qui trình định lượng vào nghiên cứu độ ổn định của viên nén
nổi curcumin 100mg
Chuẩn bị mẫu các mẫu phân hủy
Mẫu viên nén nổi curcumin được chiếu sáng liên tục trong 8 giờ: chuẩn bị như mục 2.2.2.1
Mẫu được phân hủy bởi NaOH 1N trong 8 giờ và mẫu phân hủy bởi H2O230% trong 6 giờ: Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 25mg curcumin cho vào bình định mức 25ml, điền đủ bằng dung dịch NaOH 1N hoặc H2O2 30%, siêu âm trong 10 phút rồi để yên trong thời gian qui định Lọc dung dịch qua giấy lọc, bỏ khoảng 10ml dịch lọc đầu Hút chính xác 2ml dịch lọc cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng methanol, lắc đều Hút 2ml dung dịch cho vào bình định mức 10ml, bổ sung vừa đủ đến vạch bằng ACN, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm thu được dung dịch curcumin phân hủy bởi tác nhân kiềm và oxi hóa
Tiến hành sắc ký với điều kiện đã xác định ở mục 2.2.2.1
Yêu cầu: thời gian lưu của pic curcumin ở dung dịch mẫu chuẩn và các mẫu
phân hủy phải tương đương nhau Độ tinh khiết pic phải lớn hơn 99%
2.2.3.2 Kế hoạch theo dõi độ ổn định
Thuốc được đóng gói với hình thức: 80 viên nén có gói silicagel chống ẩm trong 1 gói bao chì
Sau mỗi khoảng thời gian nhất định, tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên và kiểm nghiệm theo các tiêu chí đề ra
Việt Nam được xếp vào vùng khí hậu IV, do đó điều kiện bảo quản và tần số dùng để thử nghiệm trong nghiên cứu độ ổn định được trình bày ở bảng 2.5
Trang 40Bảng 2.5 Điều kiện và tần số thử nghiệm trong nghiên cứu độ ổn định
Phương pháp Điều kiện bảo quản Thời điểm lấy mẫu
Lão hóa cấp tốc Nhiệt độ: 40 ± 2
Bảng 2.6 Các chỉ tiêu đánh giá, yêu cầu và số lượng viên nén nổi curcumin 100 mg
dùng trong nghiên cứu độ ổn định
6 Độ nổi Thời gian tiềm nổi< 4 phút
Thời gian nổi > 8 giờ
7 Hàm ẩm
8 Định tính Thời gian lưu của mẫu thử phải tương đương thời gian lưu
của mẫu chuẩn
9 Định lượng
Hàm lượng curcumin phải đạt từ 90,0% - 110% so với hàm lượng ghi trên nhãn, tính theo khối lượng trung bình của viên
2.2.3.4 Ước tính tuổi thọ của thuốc
Có nhiều phương pháp để xác định tuổi thọ của thuốc, đề tài này áp dụng phương pháp tính tuổi thọ của thuốc dựa theo ước tính bằng phương pháp lão hóa cấp tốc theo phương trình Van’s Hoff
Các mẫu khảo sát tăng tốc sẽ được xác định tuổi thọ bằng cách theo dõi sự thay đổi nồng độ của mẫu ở nhiệt độ và thời gian khảo sát
t90 ở điều kiện bảo quản được xác định theo qui tắc Van’s Hoff:
