1357 nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư dạ dày của curcumin và phức chất curcumin trên chuột nhắt trắng

NGUYỄN DƯƠNG THẢO NGÂN NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CURCUMIN VÀ PHỨC CHẤT CURCUMIN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

NGUYỄN DƯƠNG THẢO NGÂN

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ DẠ DÀY CỦA CURCUMIN VÀ PHỨC CHẤT CURCUMIN

TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

ThS HUỲNH THỊ MỸ DUYÊN

Cần Thơ – 2015

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu nhà trường cùng quý Thầy, Cô các bộ môn, đặc biệt là các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, Dược lý đã tận tình giảng dạy cho em những kiến thức quý báu trong những năm học qua cũng như tạo những điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn Kiều Hân, Lan Thanh trong nhóm làm đề tài Bào chế, bạn Kim Thu chung nhà trọ và các bạn lớp Dược B K36 đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi, đây là nguồn động lực lớn giúp tôi vượt qua những khó khăn trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác

Cần Thơ, ngày 14 tháng 06 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Dương Thảo Ngân

MỤC LỤC

Trang LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC i

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC HÌNH v

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Tổng quan về ung thư dạ dày 3

1.1.1.Các yếu tố bệnh sinh 3

1.1.2 Giải phẫu bệnh 4

1.1.3 Các giai đoạn tiến triển bệnh 5

1.1.4 Chẩn đoán 6

1.1.5 Điều trị 7

1.2 Curcumin và phức chất curcumin 8

1.2.1 Tính chất lý hóa của curcumin 8

1.2.2 Tính chất dược lý của curcumin 8

1.2.3 Sinh khả dụng và dược động học của curcumin 10

1.3 Tổng quan các nghiên cứu liên quan 10

1.3.1 Các nghiên cứu kháng khối u dạ dày của curcumin trên chuột 10

1.3.2 Các nghiên cứu kháng ung thư khác của curcumin trên chuột 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu 14

2.1.1 Nguyên liệu và hoá chất 14

2.1.2 Trang thiết bị 15

2.1.3 Dụng cụ 15

2.2 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2.1 Động vật thí nghiệm 15

2.2.2 Bột thuốc thử nghiệm 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Bố trí thí nghiệm 16

2.3.2 Khảo sát khối lượng của chuột ở các lô 19

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng khối u về mặt đại thể 19

2.3.4 Đánh giá hoạt tính kháng khối u về mặt vi thể 19

2.3.5 Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê 20

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 Khảo sát sự thay đổi khối lượng chuột 21

3.2 Phân tích đại thể 23

3.3 Phân tích vi thể 29

Chương 4 BÀN LUẬN 36

4.1 Kết quả khảo sát khối lượng chuột giữa các lô 38

4.2 Kết quả phân tích đại thể 39

4.3 Kết quả phân tích vi thể 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

5-FU

AOM

5-fluorouracil Azoxymethane AJCC American Joint Committee of Cancer (Ủy ban Hợp nhất Hoa

Kỳ về Ung thư) B(a)P

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Tổ chức Y tế Thế giới năm

2000 5

Bảng 2.1 Các nguyên liệu, hóa chất và dung môi sử dụng 14

Bảng 2.2 Các trang thiết bị sử dụng trong bào chế và thử nghiệm 15

Bảng 3.1 Số chuột chết ở các lô trong quá trình thí nghiệm 21

Bảng 3.2 Khối lượng chuột trung bình ở các lô từ ngày 18 đến ngày 104 22

Bảng 3.3 Số lượng khối u và kích thước khối u ở các lô 23

Bảng 3.4 So sánh kết quả đại thể giữa các lô 26

Bảng 3.5 Kết quả phân tích vi thể đoạn trên dạ dày của chuột ở các lô 29

Bảng 3 So sánh kết quả vi thể ở các lô 35

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc của curcumin 8

Hình 1.2 Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin 9

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư dạ dày của phức chất cucumin trên chuột 18

Hình 3.1 Đại thể dạ dày lô 1 27

Hình 3.2 Đại thể dạ dày lô 2 27

Hình 3.3 Đại thể dạ dày lô 3 27

Hình 3.4 Đại thể dạ dày lô 4 28

Hình 3.5 Đại thể dạ dày lô 5 28

Hình 3.6 Đại thể dạ dày lô 6 28

Hình 3.7 Đại thể dạ dày lô 7 29

Hình 3.8 Vi thể đoạn trên dạ dày bình thường 32

Hình 3.9 Vi thể khối u đoạn trên dạ dày của chuột ở lô 2 32

Hình 3.10 Vi thể tâm vị dạ dày của chuột ở lô 3 33

Hình 3.11 Vi thể khối u đoạn trên dạ dày của chuột ở lô 4 33

Hình 3.12 Vi thể đoạn trên dạ dày của chuột ở lô số 5, 7 34

Hình 3.13 Vi thể khối u đoạn trên dạ dày của chuột ở lô 6 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư dạ dày là loại ung thư phổ biến thứ tư và là nguyên nhân tử vong do ung thư cao thứ hai trên thế giới sau ung thư phổi Trên khắp thế giới với số ca mắc mới là 989.600 và 738.000 người chết được ước tính đã xảy ra trong năm 2008, chiếm 8% tổng số ca và 10% tổng số trường hợp tử vong [13] Việt Nam thuộc khu vực nguy cơ ung thư dạ dày trung bình cao, với tỷ lệ mắc mới chuẩn hóa theo tuổi

là 21,8 ở nam và 10,0 ở nữ mỗi 100.000 dân [3] Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong chẩn đoán, điều trị nhưng tiên lượng ung thư dạ dày hiện nay vẫn còn xấu, đặc biệt

là ung thư dạ dày tiến triển, với tỷ lệ sống thêm 5 năm chỉ khoảng 28% [3] Các liệu pháp hóa trị là cần thiết ở đa số bệnh nhân ung thư dạ dày tiến triển, nhưng chúng chỉ cải thiện tiên lượng ở một số ít bệnh nhân có chọn lọc với thời gian sống thêm tối đa không quá 12 tháng và độc tính cao do những hoá chất tổng hợp tấn công không đặc hiệu cả tế bào ung thư và tế bào thường [28] Vì vậy, việc hướng tới tìm các hợp chất có nguồn gốc dược liệu có hiệu quả điều trị đồng thời an toàn cho người sử dụng đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu

Nghệ vàng (Curcumin longa L Zingiberaceae) là loài dược liệu được trồng

và sử dụng nhiều ở vùng nhiệt đới Nam và Đông Nam Á có thành phần chính trong thân rễ là curcumin - một polyphenol trọng lượng phân tử thấp Nhiều nghiên cứu

đã chứng minh curcumin có tác dụng rất nhiều tác dụng trong đó đáng chú ý là hoạt tính kháng viêm, làm lành vết loét dạ dày tá tràng, đặc biệt là khả năng kháng ung thư trong đó ung thư dạ dày đang rất được quan tâm Bên cạnh đó, các thử nghiệm lâm sàng cũng đã chứng minh curcumin thật sự an toàn ngay cả khi dùng với liều cao Với sự an toàn và hiệu quả, curcumin là hợp chất thiên nhiên có nhiều tiềm năng ứng dụng trong điều trị và phòng ngừa các bệnh [11] Cho đến nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về tác dụng phòng chống ung thư dạ dày của Nghệ trên chuột mà thành phần chính có tác dụng là curcumin nhưng ở Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể nào Vì vậy, để góp phần nghiên cứu hiệu quả sử dụng của

curcumin cũng như phức chất curcumin có độ hoà tan được cải thiện, chúng tôi thực

hiện đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng ung thư dạ dày của curcumin và phức

chất curcumin trên chuột nhắt trắng” với mục tiêu như sau:

1) Gây mô hình ung thư dạ dày bằng Benzo (a) pyrene trên chuột nhắt trắng suy giảm miễn dịch

2) Đánh giá hoạt tính kháng ung thư dạ dày của curcumin và phức chất curcumin trên chuột nhắt trắng qua phân tích đại thể và phân tích vi thể

Ý nghĩa khoa học

Cung cấp thêm các luận chứng khoa học về tác dụng kháng ung thư dạ dày

của curcumin và phức chất có độ hòa tan cao của curcumin

Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu thành công sẽ tiến hành thử tiền lâm sàng và lâm sàng trên người tình nguyện của các dạng bào chế chứa curcumin và phức chất curcumin Góp phần sản xuất ra các chế phẩm mới có nguồn gốc từ dược liệu có hiệu quả điều trị cao nhưng ít tác dụng phụ không mong muốn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về ung thư dạ dày

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cách

vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cách phát

triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn) Hiện có khoảng

200 loại ung thư

Ung thư dạ dày là một căn bệnh đi kèm với sự xuất hiện của một khối u ác tính được hình thành trên cơ sở của biểu mô của niêm mạc dạ dày

1.1.1 Các yếu tố bệnh sinh

Chế độ ăn nhiều muối có liên quan chặt chẽ với hiện tượng gia tăng nguy cơ mắc ung thư dạ dày (UTDD) Nghiên cứu trên động vật phát hiện thấy chế độ ăn nhiều muối sẽ tạo hiện tượng viêm teo niêm mạc dạ dày và do đó tạo điều kiện thuận lợi phát sinh UTDD khi kết hợp với nhiễm Helicobacter pylori Các nitrites cũng được coi là vai trò trong bệnh sinh UTDD thông qua các nghiên cứu dịch tễ học [1]

Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ UTDD lên 1,56 lần [16] Theo Gonzalez, xấp xỉ 18% trường hợp UTDD được quy cho hút thuốc lá Nguy cơ UTDD tăng theo thời gian hút thuốc và giảm đi sau 10 năm cai thuốc [1]

Do Helicobacter pylori, là xoắn khuẩn gram âm, ký sinh trong lớp chất nhày của niêm mạc Tổ chức Y tế thế giới đã xếp Helicobacter pylori vào nhóm tác nhân chính gây UTDD Helicobacter pylori có khả năng gây tổn thương niêm mạc từ đó viêm niêm mạc dạ dày kết hợp cùng các yếu tố khác dẫn tới dị sản, loạn sản và ung thư [14]

Yếu tố di truyền: ước tính UTDD có tính chất gia đình chiếm tỷ lệ 1% đến 15% trong tổng số bệnh nhân mắc UTDD [1] Tiền sử bệnh lý ở dạ dày: viêm teo dạ dày, vô toan, thiếu máu ác tính, dị sản ruột, u tuyến dạ dày (polyp có kích thước

>2cm) là một số bệnh lý được coi là nguy cơ cao gây UTDD [17]

1.1.2 Giải phẫu bệnh

1.1.2.1 Đại thể

a Hiệp hội Ung Thư Dạ dày Nhật Bản chia UTDD sớm thành 3 thể như [19]

- Týp I (thể lồi): tổ chức ung thư lồi lên trên niêm mạc, có hình nấm, hình giống polyp, chạm vào dễ chảy máu

- Týp II (thể phẳng hay thể bề mặt) gồm 3 phân týp như sau:

+ IIa (phẳng gồ): tổ chức ung thư phát triển gồ cao hơn niêm mạc xung quanh

+ IIb (phẳng dẹt): tổ chức ung thư phát triển tạo thành mảng chắc không nổi cao hơn niêm mạc dạ dày

+ IIc (phẳng lõm): tổ chức ung thư hơi lõm xuống thấp hơn so với niêm mạc xung quanh, đôi khi có thể hoại tử, xuất tiết

- Týp III (dạng loét): tổn thương có độ sâu rõ rệt Ung thư dạng loét thường nông, bờ gồ ghề, bẩn, niêm mạc quanh ổ loét không đều, các nếp niêm mạc có thể tập trung, riêng rẽ hay cắt cụt

b Đối với các trường hợp UTDD tiến triển gồm các typ sau[1]:

- Týp I (dạng polyp): là những tổn thương lồi vào lòng dạ dày, không có hoại

1.1.2.2 Vi thể

Bảng 1.1 Phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Tổ chức Y tế Thế giới năm

2000 [36]

Loại mô học

Tân sản nội biểu mô tuyến

Ung thư biểu mô (UTBM) tuyến

UTBM tuyến vảy

UTBM tế bào vảy

UTBM tế bào nhỏ

UTBM không biệt hoá

Các loại khác Carcinoid (u nội tiết biệt hoá cao) Ung thư không phải biểu mô Sacom cơ trơn

Ung thư mô đệm đường tiêu hoá Sacom Kaposi

U lympho ác tính

U lympho tế bào B vùng ria của MALT

U lympho tế bào Mantle

U lympho tế bào B lan toả

1.1.3 Các giai đoạn tiến triển bệnh

Có rất nhiều cách phân loại giai đoạn bệnh khác nhau trên thế giới, tuy nhiên phân loại giai đoạn theo UICC và AJCC được sử dụng rộng rãi nhất và giá trị nhất

để chẩn đoán, điều trị và tiên lượng UTDD [19]

Căn cứ vào TNM (Tumor: u –Node: hạch –Metastasis: di căn) theo UICC và AJCC có thể xếp các giai đoạn bệnh UTBMDD như sau:

- Giai đoạn 0: TisN0M0

- Giai đoạn IA: T1N0M0

- Giai đoạn IB: T1N1M0, T2N0M0

- Giai đoạn II A: T1N2M0, T2N1M0, T3N0M0

- Giai đoạn II B: T1N3M0, T2N2M0, T3N1M0, T4aN0M0

- Giai đoạn IIIA: T3N2M0, T2N3M0, T4aN1M0

- Giai đoạn IIIB: T4aN2M0, T3N3M0, T4bN0–1M0

- Giai đoạn IIIC: T4bN2M0, T4bN3M0, T4aN3M0

- Giai đoạn IV: T bất kỳ N bất kỳ M1

T: Ung thư nguyên phát (căn cứ vào chiều sâu hơn là chiều rộng)

- Tx: không thể đánh giá được u nguyên phát

- To: chưa rõ ràng có u nguyên phát

- Tis: u ở lớp trong biểu mô chưa xâm lấn ra lớp màng đáy

- T1: u xâm nhập mô đệm hoặc dưới niêm mạc

- T2: u xâm nhập lớp đệm, cơ

- T3: u xâm nhập lớp dưới thanh mạc

- T4a: u xâm nhập qua thanh mạc

- T4b: u xâm nhập vào các cấu trúc lân cận

N: hạch bạch huyết vùng:

- Nx: hạch không thể đánh giá được

- No: không có di căn hạch vùng

- Thiếu máu là triệu chứng toàn thân thường gặp trong UTDD, với tỷ lệ thường dao động trong khoảng 20-40%

Hầu hết các triệu chứng cơ năng và toàn thân của UTDD là không đặc hiệu

và có thể gặp trong nhiều bệnh lý ống tiêu hóa khác Trên thực tế lâm sàng, đa số bệnh nhân khi có các triệu chứng này thì UTDD đã ở giai đoạn tiến triển

1.1.4.2 Cận lâm sàng [1]

- Chụp dạ dày hàng loạt có thuốc cản quang

- Nội soi dạ dày ống mềm và sinh thiết

Xạ trị là phương pháp dễ bị đề kháng, hiệu quả của xạ trị đơn thuần hoặc phối hợp với hóa trị (hóa xạ trị liệu) chỉ giới hạn ở một số bệnh nhân, nhưng vẫn chưa thực sự rõ ràng và cần phải được nghiên cứu thêm [3]

Hóa trị giữ vai trò khá quan trọng trong điều trị UTDD nhằm giảm tỷ lệ tái phát sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm Có khá nhiều liệu pháp hóa trị được áp dụng trong điều trị UTDD Tuy nhiên, hầu hết các phác đồ này chỉ cải thiện tiên lượng ở một ít bệnh nhân có chọn lọc và thời gian sống thêm chỉ dao động từ 9-

13 tháng Độc tính cao, thời gian đáp ứng ngắn, tỷ lệ đáp ứng thấp là những hạn chế chính của hóa trị [28]

1.2.1 Tính chất lý hóa của curcumin

Curcumin là bột tinh thể màu vàng cam, không tan trong nước ở pH trung tính

và acid, tan trong môi trường kiềm, methanol, ethanol, aceton và dimethylsulfoxid

Hệ số phân bố và độ tan của curcumin trong nước lần lượt là 3,2 và 0,6µg/ml [7] Curcumin kém bền với ánh sáng, không ổn định trong môi trường kiềm Ở pH

> 7,5 curcumin bị chuyển thành màu đỏ Trong môi trường acid tốc độ phân hủy của curcumin trong 1 giờ giảm đi dưới 20% Điều này giải thích tính ổn định của curcumin trong ống tiêu hóa ở những nơi có pH 1-6 [6]

1.2.2 Tính chất dược lý của curcumin

Nhiều công trình đã nghiên cứu hoạt tính và tác dụng dược lý của curcumin Kết quả cho thấy, curcumin có hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng, bao gồm: hoạt tính chống viêm, chống ung thư, chống đột biến, chống đông máu, chống vi khuẩn, chống nấm, chống virus, làm lành vết thương, giảm cholesterol; chữa một số bệnh như: Alzheimer, đái tháo đường, viêm khớp, HIV-AIDS … [10], [11], [15], [18] Vì hoạt tính của curcumin khá đa dạng và phong phú, nội dung của luận văn này chỉ quan tâm tới hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư và chống oxy hóa của curcumin

1.2.2.1 Hoạt tính kháng viêm

Curcumin có hoạt tính kháng viêm nhờ khả năng ức chế enzym cyclooxygenase-2 giảm sự hình thành của những hợp chất gây viêm và ngăn chặn đáp ứng viêm Hoạt tính kháng viêm tự nhiên của curcumin được xem là ngang tầm với các thuốc kháng viêm steroid và non-steroid như indomethacin và phenylbutazon mà không có nhiều tác dụng phụ [35]

1.2.2.2 Hoạt tính chống oxy hóa

Tính chống oxy hóa của curcumin thể hiện gián tiếp thông qua các enzym chống oxy hóa như superoxid dismutase, glutathion peroxid, catalase Trong thực

tế, curcumin được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa gấp ít nhất 10 lần so với vitamin E Trong phân tử curcumin, nhóm hydroxy, methoxy trên vòng phenyl và

hệ thống 1,3-diceton là những đặc tính cấu trúc quan trọng tạo nên khả năng chống oxy hóa của curcumin Curcumin tinh khiết có hoạt tính kháng các ion oxy hóa mạnh hơn demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [23], [35]

1.2.2.3 Hoạt tính kháng ung thư

Một số nghiên cứu chỉ ra rằng curcumin là một tác nhân kháng ung thư mạnh Curcumin có khả năng ngăn chặn các loại ung thư dạ dày, da, tuyến vú, miệng, phổi, gan, thực quản, ruột non, ruột già…Curcumin tác động đến hầu hết các giai đoạn quá trình hình thành và phát triển khối u (hình 1.2.)

Hình 1.2 Quá trình hình thành và di căn khối u và tác động của curcumin [23]

Cơ chế kháng ung thư của curcumin

- Ức chế các isoenzym cytochrom P450

- Cảm ứng hoạt tính của enzyme glutathion S-transferase (GST)

- Thúc đẩy tế bào ung thư đi vào chu trình chết tự nhiên

- Ức chế tăng sinh mạch máu tế bào ung thư

- Ức chế các protein liên quan đến chu trình tế bào như NF-kB,…[9]

1.2.3 Sinh khả dụng và dược động học của curcumin

Nhiều nghiên cứu cho thấy curcumin có hoạt tính nội tại mạnh và do đó curcumin có vai trò như một tác nhân điều trị cho nhiều loại bệnh khác nhau Tuy nhiên, những nghiên cứu trong suốt ba thập niên qua liên quan đến các quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ của curcumin đã cho thấy sụ hấp thu kém, chuyển hóa nhanh và thời gian bán thải ngắn (0,39 giờ) là những nguyên nhân chính làm giảm sinh khả dụng của curcumin [6]

Trong những phương pháp làm tăng độ tan của curcumin thì việc tạo phức chất thường được sử dụng rộng rãi Curcumin được tạo phức với nhiều chất mang khác nhau như β-cyclodextrin, PVP K-30, PEG, xylitol,…bằng phương pháp nung chảy, dung môi, sấy phun…Phức curcumin tạo thành giúp làm tăng độ tan trong nước, độ ổn định trong môi trường kiềm cũng như độ ổn định quang hóa của curcumin [33]

1.3 Tổng quan các nghiên cứu liên quan

1.3.1 Các nghiên cứu kháng khối u dạ dày của curcumin trên chuột

Mou-Tuan Huang và cộng sự (1994), đã gây khối u dạ dày trên dòng chuột nhắt A/J bằng benzo (a) pyrene (B(a)P) với liều 1,5 mg trong 100µl dầu bắp 1 lần/1 tuần trong 4 tuần Mỗi nhóm chuột có chế độ ăn uống với hàm lượng curcumin khác nhau và thời gian khác nhau Sau 24 tuần từ liều cuối cùng B(a)P tiến hành giải phẫu ghi nhận kết quả cho thấy nhóm chuột với chế độ ăn có 0,5% và 2% curcumin dùng 2 tuần trước liều B(a)P đầu tiên kéo dài đến 1 tuần sau liều cuối cùng giảm 53% và 51% số khối u trên chuột, về thể tích khối ung thư tế bào vảy giảm 79% và 86% Ở nhóm chuột cũng dùng chế độ ăn có 0,5% và 2% curcumin nhưng bắt đầu 1 tuần sau từ liều cuối cùng chất gây ung thư thì giảm lần lượt 47% và 67% số khối u trung bình, về thể tích khối u thì giảm 22% và 66% một cách có ý nghĩa [24]

Shailesh S Deshpande và cộng sự (1997), cũng dùng chất gây ung thư dạ dày

là B(a)P với liều 1 mg, 2 lần / tuần và trong 4 tuần trên dòng chuột Swiss thì nhóm

chỉ dùng B(a)P và không được điều trị thì số khối u trung bình trên chuột là 5,92/con, tỉ lệ xuất hiện khối u là 100%, trong khi các nhóm còn lại được điều trị với dịch chiết nước có curcumin tự do từ rễ như nguồn nước uống, dịch chiết ethanol và bột nghệ trong chế độ ăn với nồng độ khác nhau trong khoảng thời gian khác nhau Kết quả cho thấy dịch chiết nước có curcumin tự do có nồng độ 0,2%, 1%, 5% có tác dụng tốt nhất làm giảm lần lượt 92%, 98%, 97% số khối u và 54%, 86%, 80% tỉ lệ chuột có khối u khi dùng trong thời gian 2 tuần trước liều B(a)P đầu tiên và kéo dài đến 2 tuần sau liều cuối cùng, trong khi đó nếu chỉ dùng 48 giờ sau liều B(a)P cuối cùng cho đến hết tiến trình thí nghiệm đối với dịch 5% thì chỉ giảm 46% số khối u còn tỉ lệ xuất hiện khối u vẫn là 100% [12]

Shishu, Neeta Gupta và Nidhi Aggarwal (2008), cũng đã tiến hành thử nghiệm tác dụng kháng khối u của viên nén nổi chứa phức chất curcumin với beta-cyclodextrin trên dòng chuột Balb/ C được gây ung thư bằng 2 liều B(a)P 3mg cách khoảng thời gian 2 tuần Các nhóm chuột được chia thành nhóm không được điều trị và điều trị bằng 3 loại thuốc khác nhau là viên nén nổi chỉ chứa curcumin, viên nén nổi chứa phức chất curcumin với beta-cyclo dextrin và viên chỉ có curcumin với beta cyclodextrin nghiền trộn vào dầu bắp cho uống liều 100mg/kg sau liều B(a)P

và kéo dài đến hết tiến trình, thời gian là 20 tuần Kết quả cho thấy rằng nhóm không được điều trị xuất hiện 100% có khối u với số khối u là 2, còn các nhóm được điều trị bằng viên nén nổi chỉ chứa cur, viên nén nổi chứa phức cur và beta-cyclodextrin và viên chỉ có cur tinh khiết và beta-cyclodextrin tỉ lệ xuất hiện khối u giảm lần lượt là 25%, 50% và 35%, số khối u trung bình trên chuột là 1; 5; 1 và 1,32 Điều này chứng tỏ hệ thống phân phối thuốc qua viên nén nổi chứa phức chất cur và beta-cylcodextrin giảm số lượng khối u có ý nghĩa thông kê [32]

Shishu, Kamalpreet Mann và Nidhi Aggarwal (2011), tiếp tục nghiên cứu hạt nổi lưu lại dạ dày của phức curcumin β-cyclodextrin để điều trị các khối u dạ dày Các nhóm chuột gồm nhóm chứng uống hạt nổi placebo, nhóm uống cur tinh khiết, nhóm uống hạt nổi chứa phức cur với β-cyclodextrin (liều 75mg/kg trong 5 ngày liên tiếp cách khoảng 2 ngày đến hết tiến trình) và nhóm không được điều trị Tỉ lệ

xuất hiện khối u ở nhóm dùng curcumin tinh khiết và hạt nổi chứa phức curcumin β-cyclodextrin giảm tương ứng là 25% và 50% và số khối u trên mỗi con chuột mang khối u cũng đã giảm 38,29% và 71,42% [31]

Duangporn Thong-Ngam và cộng sự (2012), đã tiến hành nghiên cứu tác dụng giảm ung thư dạ dày gây ra bởi N-metyl-N-nitroureas (MNU) và natri clorua (NaCl) bão hoà của curcumin trên chuột cống đực Wistar Chuột được chia thành các nhóm: nhóm đối chứng và đối chứng curcumin: được cho uống đệm citrat pH=4,5 vào ngày đầu tiên và ngày thứ 14, dung dịch NaCl 30% 2 lần/tuần trong 3 tuần (1ml/con) sau đó nhóm đối chứng được cho uống dầu hàng ngày trong suốt tiến trình (2,5ml/kg) còn đối chứng curcumin (CC) uống dầu trộn cur hàng ngày trong suốt tiến trình (200 mg/kg); nhóm thử (MNU+NaCl 30%); nhóm 1(MNU + NaCl 30% + cur 3 tuần); nhóm 2 (MNU + NaCl 30% + cur 20 tuần) cho uống MNU hoà tan trong đệm citrat pH=4,5 vào ngày đầu tiên và thứ 14 (100mg/kg) + NaCl 30% 2 lần /tuần trong 3 tuần (1ml/con) tiếp tục do nhóm thử uống dầu hàng ngày, nhóm 1uống cur trộn với dầu hàng ngày trong 3 tuần (200mg/kg) còn nhóm 2 thì uống trong 20 tuần Kết quả cho thấy rằng tỉ lệ ung thư ở các nhóm 1, 2 giảm lần lượt 40%, 50% so với không được điều trị là 100% [20]

1.3.2 Các nghiên cứu kháng ung thư khác của curcumin trên chuột

Limtrakul và cộng sự (1997), đã tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khối u của curcumin trong chế độ ăn Chuột chia thành 2 lô, lô chứng vào tuần thứ 6 được cho ăn với chế độ AIN-76, lô thử chế độ có thêm 1% curcumin cho đến cuối tiến trình Vào tuần thứ 8 lô chứng và lô thử được thoa 100µg 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) trong 100µl aceton Một tuần sau đó các chuột được thoa lên cùng vị trí đã từng thoa DMBA yếu tố thúc đẩy khối u là 2,5µg 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) 2 lần/tuần trong 26 tuần Kết quả cho thấy tỉ lệ mang khối u ở nhóm thử là 75% giảm không có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng là 90% nhưng có khả năng giảm số lượng khối u (p < 0,05) và thể tích khối u (p < 0,01) một cách có ý nghĩa [29]

Toshihiko Kawamori và cộng sự (1999), tiến hành gây mô hình ung thư đại tràng bằng cách tiêm bắp AOM vào tuần thứ 7, 8 liều 15mg/kg thể trọng các chuột được chia thành 6 lô: lô đối chứng âm, lô đối chứng (có 0,6% cur trong khẩu phần ăn), lô chứng bệnh (tiêm AOM), lô thử 1 (0,2% cur trong khẩu phần ăn bắt đầu từ 2 tuần trước liều ung thư đầu tiên), lô thử 2 (chứa 0,2% cur trong khẩu phần nhưng bắt đầu muộn sau 14 tuần kể từ liều cuối AOM), lô thử 3 ( có 0,6% cur trong chế độ

ăn và bắt đầu sau 14 tuần kể tử liều cuối AOM) Thử nghiệm nhằm đánh giá tác dụng kháng ung thư của cur ở giai đoạn xúc tiến, tiến triển Kết quả cho thấy rằng ở

lô thử 2 và 3 tuy bắt đầu điều trị muộn nhưng vẫn giảm tỉ lệ mắc khối u và mức độ khối u một cách có ý nghĩa thông kê so với lô chứng bệnh và không có sự khác biệt với lô thử 1 [34]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu và hoá chất

Các nguyên liệu, hóa chất và dung môi dự kiến sử dụng trong bào chế, gây mô hình được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các nguyên liệu, hóa chất và dung môi sử dụng STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

16 Cyclophosphamid (Endoxan® 500 mg) Đức Nhà sản xuất

17 5-fluorouracil (Ebewe® 500 mg/10 ml) Áo Nhà sản xuất

2.1.2 Trang thiết bị

Bảng 2.2 Các trang thiết bị sử dụng trong bào chế và thử nghiệm

Các chuột ở các lô khác nhau sẽ được nuôi ở các lồng riêng biệt, mỗi lồng tối

đa 10 con trong điều kiện nhiệt độ phòng, chế độ chiếu sáng tự nhiên, được cho ăn theo chế độ ăn của viện Pasteur thông thường 15g/100g trọng lượng cơ thể/ngày, uống nước tự do, cùng điều kiện chăm sóc trong suốt quá trình nghiên cứu Vệ sinh lồng chuột hàng ngày bằng cồn và thay trấu mới

curcumin sẽ được trộn với tá dược dự kiến cho công thức viên sau này Vậy thành phần nguyên liệu thử nghiệm gồm các bột sau [4], [5]:

- Bột thuốc chứa phức chất cur nguyên liệu Merck có 75mg cur I

- Bột thuốc chứa phức chất cur nguyên liệu toàn phần có 75mg cur I

- Bột thuốc chứa phức chất cur nguyên liệu toàn phần có 75mg cur

- Cân curcumin (nếu có), PEG 6000 và PVP K30

- Hòa tan hỗn hợp curcumin, PEG 6000 và PVP K30 trong hỗn hợp ethanol tuyệt đối: nước 50:50, khuấy từ trong 24 giờ gia nhiệt ở 500C Sau đó cho bốc hơi dung môi trên bếp khuấy từ có gia nhiệt ở nhiệt độ 50-600C Trộn bột kép acid citric, gôm xanthan và HPMC K15M sau đó cho hỗn hợp hỗn hợp phức đã cô bớt dung môi, trộn đều Sấy ở 600C, nghiền, rây qua rây 0,2mm trộn với tá dược trơn bóng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm tiến hành trên 104 con chuột được chia ngẫu nhiên thành 7 lô như sau:

- Lô 1 (lô sinh lý) (6 con): tiêm phúc mô (ip) dung dịch NaCl 0,9%, thể tích tiêm 0,1ml/10g vào ngày 1, 3 Ngày thứ 5, 19 cho mỗi con uống 0,25ml dầu bắp Tiếp tục cho mỗi con uống 0,2ml dầu bắp từ ngày 20 trở đi cho tới ngày 103

- Lô 2 (lô chứng bệnh) (20 con): tiêm ip dung dịch Cyclophosphamide (CYP) liều 100mg/kg vào ngày thứ 1, 3 Ngày thứ 5, 19 cho mỗi con uống 3mg B(a)P trong 0,25ml dầu bắp Tiếp tục cho uống 0,2ml dầu bắp kể từ ngày 20 cho đến ngày

103

- Lô 3 (lô thử bột chứa phức chất cur nguyên liệu Merck có 75mg cur I) (15 con): tiêm ip CYP liều 100mg/kg vào ngày thứ 1, 3 Ngày thứ 5, 19 cho mỗi con uống 3mg B(a)P trong 0,25ml dầu bắp Từ ngày thứ 20 cho uống hỗn dịch bột thuốc chứa phức chất cur I nguyên liệu Merck liều 75mg/kg/ngày trong dầu bắp tới ngày

103

- Lô 4 (lô thử bột thuốc chứa phức chất cur nguyên liệu tp có 75mg cur I) (15 con): tiêm ip dung dịch CYP liều 100mg/kg vào ngày thứ 1, 3 Ngày thứ 5, 19 cho mỗi con uống 3mg B(a)P trong 0,25ml dầu bắp Từ ngày thứ 20 cho uống hỗn dịch bột thuốc chứa phức chất cur I nguyên liệu toàn phần liều 75 mg/kg/ngày trong dầu bắp tới ngày 103

- Lô 5 (lô thử bột thuốc chứa phức chất cur tp 75mg) (16 con): tiêm ip dung dịch CYP liều 100mg/kg vào ngày thứ 1, 3 Ngày thứ 5, 19 cho mỗi con uống 3mg B(a)P trong 0,25ml dầu bắp Từ ngày thứ 20 cho uống hỗn dịch bột thuốc chứa phức chất cur tp 75mg/kg/ngày trong dầu bắp tới ngày 103

- Lô 6 (lô tá dược) (20 con): tiêm ip dung dịch CYP liều 100mg/kg vào ngày

1, 3 Ngày thứ 5, 19 cho mỗi con uống 3mg B(a)P trong 0,25ml dầu bắp Từ ngày thứ 20 cho uống hỗn dịch bột tá dược trong dầu bắp tới ngày 103

- Lô 7 (lô chứng dương) (12 con): tiêm ip dung dịch CYP liều 100mg/kg vào ngày thứ 1, 3 Ngày thứ 5, 19 cho mỗi con uống 3mg B(a)P trong 0,25ml dầu bắp Tiếp tục cho uống nhũ tương 5-FU trong dầu bắp (20mg/kg/ngày) từ ngày thứ 20, uống 5 ngày xen kẻ nghỉ 2 ngày cho tới ngày 103

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư dạ dày của

phức chất cucumin trên chuột Với:

2.3.2 Khảo sát khối lượng của chuột ở các lô

Cân khối lượng từng con chuột ở mỗi lô vào một giờ cố định trong ngày mỗi 2 ngày, từ khi bắt đầu đến ngày 104 Tính khối lượng trung bình từng lô, so sánh sự khác nhau khối lượng trung bình giữa các lô trong cùng một ngày

2.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng khối u về mặt đại thể

Đến ngày 104 sau khi mỗ, dạ dày được cắt dọc loại bỏ thức ăn, rửa bằng dung dịch NaCl 0,9% rồi ngâm trong đệm formol 10% Sau một ngày tiến hành đếm số lượng khối u có kích thước lớn hơn 0,5mm và đo kích thước khối u từng con mỗi lô bằng thước kẹp

Trong đó: a, b lần lượt là đường kính lớn nhất và nhỏ nhất (mm)

Kích thước khối u trung bình = tổng kích thước khối u của các con/ số con mang khối u

2.3.4 Đánh giá hoạt tính kháng khối u về mặt vi thể

Dạ dày chuột ngâm trong dung dịch formol 10% sau khi tiến hành đếm, đo ghi nhận số lượng khối u, kích thước khối u từng con ở mỗi lô bằng thước kẹp Gửi mẫu đến b Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh nhuộm hematoxylin-eosin (HE)

để phân tích vi thể Vi thể khối u được quan sát, đánh giá hình thái tế bào, cấu trúc

mô, sự hoại tử, viêm… dưới kính hiển vi quang học

Quy trình xử lý khối u và nhuộm HEMATOXYLIN – EOSIN

- Giai đoạn 1: xử lý mô bằng máy xử lý tự động gồm các bước:

+ Cố định và khử nước mô

 Formol 10%: 2 bình, mỗi bình ngâm 1h

 Cồn 80%: 1 bình, ngâm 1h

 Cồn 95%: 2 bình, mỗi bình ngâm 1h

 Cồn tuyệt đối: 2 bình, mỗi bình ngâm 1h30

+ Làm trong sáng mô: Xylen 2 bình, mỗi bình ngâm 1 giờ

+ Ngấm paraffin: Parraffin 2 bình, mỗi bình ngâm 1h30 Vùi mô tạo block

để cắt mỏng Sau khi cắt để mô lên lam và nhuộm HE

- Giai đoạn 2: nhuộm Hematoxylin-Eosin (HE)

+ Trước khi nhuộm để lam trong tủ sấy 56oC khoảng 20 phút để làm tan parafin

+ Sau đó, lần lượt ngâm lam vào xylen (10 phút x 2 lọ), cồn tuyệt đối (1 phút), cồn 90%(1 phút), cồn 80%(1 phút) rồi rửa lại với nước

+ Nhuộm nhân tế bào với hematoxylin trong khoảng 5 phút (tùy theo thuốc còn mới hay cũ) rồi rửa lại bằng nước Những mẫu nhuộm quá mức sẽ được tẩy bớt màu bằng cách nhúng nhanh vào dung dịch acid alcohol 1% (HCl), rửa lại bằng nước

+ Ngâm tiếp mẫu trong ammoniac 0,5%, rửa lại bằng cách ngâm 5 phút trong nước

+ Nhuộm tế bào chất với eosin khoảng 3 phút rồi rửa nhanh với nước Loại nước bằng cách ngâm mẫu vào cồn nồng độ tăng dần: cồn 80%(30 giây), cồn 95%(30 giây x 2 lọ), cồn tuyệt đối (30 giây x 2 lọ) và xylen (5 phút x

2 lọ)

+ Sau đó dán lamelle để bảo vệ mẫu

2.3.5 Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê

Kết quả được xử lý bằng phần mềm Excel, trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM) và được đánh giá ý nghĩa thống

kê trên SPSS 20.0 Với các biến số tuân theo luật phân phối chuẩn, sử dụng phép kiểm Student’t test, cụ thể dùng test 2-sample t để kiểm định sự khác nhau có ý nghĩa giữa các lô Với các biến số không theo luật phân phối chuẩn, sử dụng phép kiểm Mann - Whitney để kiểm định sự khác nhau có ý nghĩa Sự khác nhau có ý nghĩa khi giá trị p < 0,05 Để kiểm tra các tỉ lệ các nhóm sử dụng kiểm định χ2 Thời gian nghiên cứu: từ 11/2014 đến 4/2015

Địa điểm nghiên cứu: Trường Đại học Y Dược Cần Thơ