ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Tâm Sen phơi khô được thu mua tại thị trấn Mỹ Thọ, thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp, đảm bảo nguyên liệu đạt chất lượng cao Sau đó, Tâm Sen tiếp tục được sấy khô, loại bỏ tạp chất cơ học để đảm bảo tiêu chuẩn Nguyên liệu được kiểm tra độ ẩm phù hợp theo quy định của DĐVN IV, sau đó tiến hành xay thành bột mịn theo kích cỡ quy định, đảm bảo chất lượng sản phẩm cuối cùng.
- Dịch chiết nước acid tâm Sen từ đề tài trước.
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Liên bộ môn Hóa Phân Tích – Kiểm Nghiệm – Độc Chất, khoa Dược, trường Đại học Y Dược Cần Thơ
- Liên bộ Bộ môn Thực vật dược – Dược liệu – Dược cổ truyền, khoa Dược, trường Đại học Y Dược Cần Thơ.
HÓA CHẤT, DUNG MÔI, TRANG THIẾT BỊ
- Dung môi, hóa chất dùng cho chiết xuất phân lập đạt tiêu chuẩn phân tích: ethyl acetat, chloroform, methanol, n-hexan, aceton, benzen, acid sulfuric, natri hydroxid, ammoniac…
- Hóa chất dùng cho HPLC đạt tiêu chẩn HPLC: acetonitril, methanol, triethylamin, acid formic
- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck), hạt silicagel dùng cho sắc ký cột 40-63 àm (Trung Quốc), gel Sephadex – LH 20
- HPLC Dionex Ultimate 3000, đầu dò VWD–3400RS, bộ phận thu hứng mẫu tự động AFC 3000
- HPLC Hitachi Elite L-2000, đầu dò DAD, L-2455
- Đèn UV Spectroline Model CM-10, máy bơm chân không Today Rochker 300
- Máy khuấy từ HJ-3, bếp điện Alma (Japan), bể siêu âm Sonorex RK – 1028H
- Máy cô quay chân không Ilmvac, tủ sấy chân không Jeuio Tech OV-112
- Cân phân tích Ohaus Explorer Pro, d=0,1mg, max 210g
- Cân phân tích đo độ ẩm AND, model MX50 P1009675, Nhật Bản.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.1 Phân lập flavonoid tâm Sen
2.4.1.1 Chiết xuất cao flavonoid toàn phần tâm Sen
Nghiên cứu đánh giá quy trình chiết xuất flavonoid toàn phần từ tâm sen phù hợp bằng hai phương pháp chính là chiết ngấm kiệt với cồn acid và chiết hỗ trợ bằng siêu âm Các phương pháp này giúp tối ưu hóa hiệu quả chiết xuất flavonoid, đảm bảo tiết kiệm thời gian và nâng cao năng suất thu hồi hoạt chất sinh học quan trọng từ tâm sen phù Việc so sánh giữa hai phương pháp cho thấy chiết ngấm kiệt với cồn acid và chiết siêu âm đều phù hợp, mang lại những lợi ích riêng biệt trong quá trình tinh chế và ứng dụng trong ngành dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng.
Trong nghiên cứu này, quá trình chiết xuất flavonoid toàn phần được thực hiện trên cùng một lượng mẫu nhỏ (10g) bằng hai phương pháp đã được trình bày trong sơ đồ hình 2.1 và 2.2 Mỗi phương pháp được thực hiện ba lần để đảm bảo tính khách quan của kết quả, sau đó lấy trung bình các số liệu thu được Hiệu quả của phương pháp chiết xuất được đánh giá dựa trên hai yếu tố chính là tổng lượng cao flavonoid toàn phần thu được và thành phần, hàm lượng flavonoid trong cao, thông qua số lượng vết bắt màu với thuốc thử tannin.
FeCl3, VS và cường độ màu của vết)
- Từ kết quả khảo sát, tiến hành chiết xuất trên lượng lớn nguyên liệu bột tâm Sen thu cao toàn phần flavonoid (cao TF)
Hình 2.1 Quy trình chiết cao toàn phần flavonoid bằng ngấm kiệt với cồn acid
1 Làm ẩm, ngấm kiệt với cồn 70 O có 0,5% H 2 SO 4
2 Chỉnh pH 5 – 6 bằng NaOH 10%, cô loại cồn
Dịch chiết nước acid đã loại tạp
Chỉnh pH về 1 – 2, lắc với n-hexan (1:1), 10 – 15 lần
1 Chỉnh pH về 1 – 2, chiết kiệt bằng ethylacetat
Cao toàn phần ngấm kiệt (TF)
Hình 2.2 Quy trình chiết cao toàn phần flavonoid bằng chiết hỗ trợ siêu âm
2.4.1.2 Thu các phân đoạn flavonoid từ cao TF bằng sắc ký cột pha thuận có hỗ trợ chân không (VLC)
Cao TF được nạp lên cột sắc ký pha thuận sử dụng pha tĩnh silica gel hỗ trợ áp suất giảm nhằm thu được các phân đoạn flavonoid F1 – F4 có thành phần đơn giản hơn Các điều kiện sắc ký được tối ưu để đảm bảo hiệu quả phân lập cao, giúp cô lập và phân tích các hợp chất flavonoid một cách chính xác Quá trình này mang lại kết quả rõ ràng, thuận tiện trong việc nghiên cứu và ứng dụng các flavonoid từ cao TF trong các lĩnh vực y học và dược phẩm.
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, được xử lý sạch và sấy khô
- Pha tĩnh: 160g silicagel 60, cỡ hạt 40-63àm, phương phỏp nạp cột khụ
- Mẫu: 8g cao TF, phương pháp nạp mẫu khô
- Hệ dung môi khai triển: khảo sát hệ EtOAc – MeOH với tỉ lệ thay đổi
- Tốc độ dòng: 10ml/phút
- Thể tích hứng: 30ml/phân đoạn, hứng vào ống nghiệm
- Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, phát hiện vết bằng cách soi UV 254,
365nm và nhúng TT FeCl3, VS
- Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp chung, cô thu hồi dung môi, cân khối lượng thu được
Bột tâm Sen đã loại tạp
1 Làm ẩm với cồn acid pH 1-2
2 Chiết kiệt hỗ trợ siêu âm với n-hexan
Cao toàn phần hỗ trợ siêu âm
1 Làm ẩm với cồn acid pH 1-2
2 Chiết kiệt hỗ trợ siêu âm với ethylacetat
2.4.1.3 Phân lập flavonoid từ phân đoạn flavonoid F3, F4 bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử
Các phân đoạn flavonoid F3 (853mg) và F4 (611mg) sau quá trình VLC chứa hàm lượng flavonoid cao và có tính tạp tương đối đơn giản Quá trình phân lập flavonoid tiếp tục được thực hiện bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử để từng bước tinh sạch các hợp chất quan trọng này Điều kiện sắc ký được tối ưu hóa nhằm đảm bảo hiệu quả phân lập cao, giúp xác định chính xác các hợp chất flavonoid trong mẫu, phù hợp với các tiêu chuẩn phân tích và tối ưu hóa quá trình nghiên cứu.
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, kích thước 3cm x 100cm, được xử lý sạch và sấy khô
- Pha tĩnh: 50g gel sephadex LH-20 trương nở trong MeOH, thể tích gel sau trương nở khoảng 300ml
- Mẫu: F3 (853mg) và F4 (611mg) hòa tan trong MeOH
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Thể tích hứng: 10ml/phân đoạn, hứng vào ống nghiệm
- Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, phát hiện vết bằng cách soi UV 254, 365nm và nhúng TT FeCl3, VS
- Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp chung, cô thu hồi dung môi, cân khối lượng thu được
2.4.1.4 Phân lập flavonoid trong các phân đoạn F3-5, F4-4 từ sắc ký rây phân tử bằng kỹ thuật sắc ký lỏng bán điều chế
Các phân đoạn flavonoid F3-5 (32mg) và F4-4 (40mg) có hàm lượng flavonoid cao, thu được sau quá trình sắc ký rây phân tử, đồng thời chứa ít tạp chất Những phân đoạn này tiếp tục được tinh chế flavonoid bằng kỹ thuật sắc ký lỏng bán điều chế để nâng cao độ tinh khiết Điều kiện sắc ký chi tiết được áp dụng giúp tối ưu hóa quá trình chiết xuất và tinh chế flavonoid hiệu quả.
- Hệ thống máy HPLC DIONEX Ultimate 3000, bộ phận thu hứng mẫu tự động AFC 3000
- Pha tĩnh: cột Acclaim TM 120 C18 (5àm, 4,6 x 250mm)
- Pha động: chương trình gradient, khảo sát hệ dung môi ACN – HCOOH 0,1% với tỉ lệ thay đổi
- Mẫu: F3-5 (32mg) và F4-4 (40mg) hoà tan trong MeOH, lọc qua màng lọc milipore 0,22àm
- Bước sóng phát hiện: 210, 254, 275, 400 nm
Để kiểm tra các đỉnh quá tải, tiến hành thu hứng mẫu bằng bộ phận hứng mẫu và phân tích thành phần qua phương pháp HPLC/PDA Đồng thời, sử dụng SKLM để phát hiện vết bằng UV 254, 365nm và thực hiện nhúng TT FeCl3, VS để xác định chính xác các mẫu thử Các bước này đảm bảo đánh giá hiệu quả và độ chính xác trong phân tích thành phần mẫu.
- Cô bốc hơi dung môi và cân khối lượng tủa hay kết tinh thu được
2.4.2 Phân lập alkaloid tâm Sen
2.4.2.1 Chiết xuất cao alkaloid pH 10 từ dịch chiết nước acid tâm Sen bằng phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng
Dựa trên các đề tài trước, chúng tôi tiến hành chiết phân bố lỏng - lỏng để thu cao alkaloid từ tâm Sen với môi trường có pH 10 Quy trình này được thực hiện dựa trên sơ đồ hình 2.3 và hình 2.4, nhằm tối ưu hóa quá trình thu hồi alkaloid hiệu quả và đảm bảo tính chính xác của phương pháp chiết.
Hình 2.3 Quy trình chiết xuất dịch chiết nước acid từ nguyên liệu tâm Sen
Dịch chiết nước acid Dịch chiết đậm đặc
Làm ẩm, chiết ngấm kiệt với cồn 70% có chứa acid tartric 0,5%, chỉnh pH 2-3
Trung hoà dịch chiết với Na 2 CO 3 10% về pH 5-6, bay hơi loại cồn thu dịch đậm đặc
Thêm H 2 SO 4 2%, chỉnh về pH 1-2, để lắng tủa ở 5 O C, lọc
Hình 2.4 Quy trình chiết xuất cao alkaloid pH 10 tâm Sen (cao TA)
2.4.2.2 Thu các phân đoạn akaloid từ cao TA bằng sắc ký cột pha thuận có hỗ trợ chân không (VLC)
Cao TA được phân tích bằng phương pháp sắc ký cột pha thuận, sử dụng pha tĩnh silica gel với áp suất giảm để tối ưu quá trình phân đoạn Quá trình này cho phép tách thành công 5 phân đoạn alkaloid A1 – A5, giúp đơn giản hóa thành phần của mẫu Các điều kiện sắc ký đã được tối ưu để đảm bảo hiệu quả phân tách cao nhất, góp phần nâng cao độ chính xác và độ tin cậy của phân tích.
- Cột thủy tinh trung tính, thành dày, được xử lý sạch và sấy khô
- Pha tĩnh: 160g silicagel 60, cỡ hạt 40-63àm, phương phỏp nạp cột khụ
- Mẫu: 5g cao TA, phương pháp nạp mẫu khô
- Hệ dung môi khai triển: khảo sát hệ Cf – MeOH với tỉ lệ thay đổi
- Tốc độ dòng: 10ml/phút
- Thể tích hứng: 30ml/phân đoạn, hứng vào ống nghiệm
- Kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, phát hiện vết bằng UV 254, 365nm và nhúng TT Dragendorff
- Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp chung, cô thu hồi dung môi, cân khối lượng thu được
2.4.2.3 Tinh chế phân đoạn A3 bằng lắc phân bố lỏng – lỏng với pH thay đổi
Phân đoạn A3 (80mg) được loại bớt tạp bằng phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng với pH thay đổi được trình bày trong sơ đồ hình 2.5
Dịch chiết nước acid đã loại tạp
1 Chỉnh pH về 10, chiết kiệt bằng chloroform
Cao alkaloid pH 10 (cao TA)
Hình 2.5 Quy trình lắc phân bố lỏng – lỏng với pH thay đổi tinh chế A3
2.4.2.4 Phân lập alkaloid EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế bằng kỹ thuật sắc ký lỏng bán điều chế Điều kiện sắc ký:
- Hệ thống máy HPLC DIONEX Ultimate 3000, bộ phận thu hứng mẫu tự động AFC 3000
- Pha tĩnh: cột Acclaim TM 120 C18 (5àm, 4,6 x 250mm)
- Pha động: chương trình gradient, khảo sát hệ dung môi ACN – TEA 0,1% chỉnh pH 9 bằng HCOOH với tỉ lệ thay đổi
- Tốc độ dòng: 0,8-1,2ml/phút
- Mẫu: A3 tinh chế (20mg) hoà tan trong MeOH, lọc qua màng lọc milipore
- Bước sóng phát hiện: 225, 254, 272, 284nm
Kiểm tra các đỉnh quá tải bằng cách thu hứng mẫu bằng bộ phận hứng mẫu, sau đó phân tích thành phần bằng phương pháp HPLC/PDA để đảm bảo chất lượng Đồng thời, sử dụng phương pháp kiểm tra bằng SKLM để phát hiện các vết bất thường qua kỹ thuật soi UV ở bước sóng 254nm và 365nm, kết hợp nhúng mẫu trong dung môi Dragendorff để xác định chính xác các chất có trong mẫu.
- Cô dung môi, cân khối lượng tủa hay kết tinh thu được, kiểm tra độ tinh khiết của chất
1 Hoà trong acid H 2 SO 4 5% về pH 1-2
2 Để lắng, lọc bỏ tủa Đe
1 Chỉnh pH về 10, chiết kiệt bằng chloroform
Cao phân đoạn A3 tinh chế
2.4.3 Phương pháp tinh chế các chất tinh khiết thu được
2.4.3.1 Phương pháp rửa kết tinh
Kết tinh hoặc tủa thu được thường chứa tạp chất có thể được loại bỏ bằng phương pháp rửa với dung môi thích hợp để tăng độ tinh khiết Quá trình rửa diễn ra trên phễu thủy tinh xốp, sử dụng dung môi có khả năng hòa tan tạp chất mà không làm hòa tan kết tinh hoặc tủa, hoặc sử dụng dung môi lạnh để đảm bảo an toàn và hiệu quả Quá trình rửa được lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi đạt được độ tinh khiết mong muốn Cuối cùng, kết tinh hoặc tủa sau khi rửa được sấy khô trong tủ sấy chân không để loại bỏ hoàn toàn hơi ẩm và đảm bảo chất lượng sản phẩm cao nhất.
2.4.3.2 Phương pháp kết tinh lại
Sử dụng một lượng tối thiểu dung môi phù hợp ở nhiệt độ cao để hòa tan hoàn toàn kết tinh hoặc tủa thu được giúp tối ưu quá trình tinh chế Sau đó, làm lạnh dung dịch để chất tinh khiết kết tinh hoàn toàn và tạp chất tích tụ ở bề mặt, dễ dàng loại bỏ Tiếp theo, lọc qua phễu thủy tinh xốp, rửa bằng dung môi lạnh để loại bỏ tạp chất còn bám trên kết tinh, và sấy đến khô trong tủ sấy chân không nhằm đảm bảo vệ sinh và độ tinh khiết của mẫu.
2.4.4 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được
2.4.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi tiến hành sắc ký lớp mỏng để phân lập hoạt chất using 3 hệ dung môi với độ phân cực khác nhau, tạo ra 3 vết có Rf lần lượt thấp, trung bình và cao trên sắc ký đồ Các vết này được quan sát dưới ánh sáng UV 254nm và 365nm để xác định đặc điểm quang học của phân đoạn Ngoài ra, chúng tôi nhúng các dung dịch phản ứng như TT FeCl3 và VS để xác định flavonoid, đồng thời sử dụng TT Dragendorff với dung môi phù hợp để phát hiện alkaloid, đảm bảo tính chính xác trong phân tích hóa học.
Nếu chỉ có một vết sắc ký của chất phân lập xuất hiện trên cả ba hệ dung môi, điều này cho thấy chất phân lập có khả năng tinh khiết cao trên phương pháp sắc ký lớp mỏng Đây là một tiêu chí quan trọng để đánh giá chất lượng của mẫu phân lập, giúp xác định độ tinh khiết của hợp chất một cách đáng tin cậy Việc quan sát sự xuất hiện duy nhất của vết trên nhiều hệ dung môi càng tăng độ chính xác trong kết luận về tính tinh khiết của mẫu phân lập.
Thăm dò điều kiện sắc ký tối ưu
Pha mẫu được thực hiện bằng phương pháp hòa tan chất phân lập trong dung dịch methanol Merck để tạo thành dung dịch có nồng độ khoảng 1000 ppm Sau đó, dung dịch được lọc qua màng lọc Milipore 0,45 µm để loại bỏ các tạp chất rắn Tiếp theo, quá trình sắc ký được tiến hành dưới các điều kiện thích hợp nhằm phân tích chính xác mẫu phân lập.
+ Hệ thống máy HPLC Hitachi L-2000, đầu dò DAD L-2455
+ Pha tĩnh: Cột RP C-18, Phenomenex Gemini, Lunar hay Synergi
+ Tốc độ dòng: 0,8-1,5 ml/phút
+ Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
+ Pha động: khảo sát pha động phù hợp cho chất phân lập được là alkaloid hay flavonoid theo kiểu isocratic hay gradient Độ tinh khiết
- Pha mẫu: cân chính xác khoảng 1mg chất phân lập được cho vào bình định mức
1ml, hoàn tan bằng MeOH, bổ sung MeOH đến vạch, lọc qua màng lọc milipore
0,45àm, được mẫu chuẩn nồng độ khoảng 1000ppm
Để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập, ta sử dụng phương pháp quy về 100% diện tích đỉnh bằng chức năng total peak purity và chế độ maxplot trên đầu dò Phương pháp này giúp xác định chính xác độ tinh khiết của chất phân lập dựa trên phân tích diện tích đỉnh và độ tinh khiết tổng thể Việc sử dụng chế độ maxplot hỗ trợ visual hóa điểm đỉnh và phát hiện các tạp chất hay thành phần phụ không mong muốn trong mẫu phân lập Đây là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và độ tin cậy trong phân tích hóa học, giúp xác định chính xác mức độ tinh khiết của mẫu.
2.4.5 Phương pháp xác định cấu trúc các chất phân lập được
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
PHÂN LẬP FLAVONOID TÂM SEN
3.1.1 Thăm dò điều kiện chiết xuất flavonoid toàn phần tâm Sen phù hợp nhất và tiến hành chiết xuất cao toàn phần flavonoid tâm Sen
3.1.1.1 Thăm dò điều kiện chiết xuất flavonoid toàn phần tâm Sen
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.1 (SKLM tham khảo hình PL-1.1)
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện chiết xuất flavonoid toàn phần tâm Sen
Phương pháp ngấm kiệt với cồn acid
Phương pháp chiết hỗ trợ siêu âm
Lượng cao flavonoid toàn phần
Thành phần cao flavonoid toàn phần Flavonoid, tạp
Lượng cao flavonoid thu được bằng phương pháp chiết xuất hỗ trợ siêu âm vượt trội so với phương pháp ngấm kiệt với cồn acid Tuy nhiên, trên bản mỏng, cao flavonoid ngấm kiệt với cồn acid cho các vết hiện màu vàng rõ rệt hơn, ảnh hưởng đến chất lượng và thẩm mỹ của sản phẩm.
Trong nghiên cứu, phương pháp chiết xuất bằng cồn acid đã được sử dụng để tối ưu hóa việc trích xuất các hợp chất từ nguyên liệu bột tâm Sen, nhằm khai thác các hợp chất có khả năng tạo phản ứng với FeCl3 như VS và xanh đen, được cho là flavonoid Các kết quả từ nhiều lần thực hiện cho thấy sự chênh lệch giữa các lần do số bước thực hiện khác nhau, dẫn đến sai số khá cao Tuy nhiên, việc tiến hành ít nhất ba lần và lấy trung bình các kết quả đã giúp phản ánh chính xác hơn hiệu quả của phương pháp chiết xuất này.
3.1.1.2 Chiết xuất cao toàn phần flavonoid tâm Sen bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn acid
Chúng tôi tiến hành chiết 5kg bột tâm Sen đã qua xử lý bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn acid để thu nhận các hợp chất chứa hoạt tính Kết quả quá trình chiết được trình bày rõ ràng trong sơ đồ hình 3.1, giúp minh họa quy trình và hiệu quả của phương pháp Thông qua phương pháp này, khả năng chiết xuất các thành phần quý giá từ tâm Sen đã được nâng cao, đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn (Tham khảo sơ đồ hình PL-1.2 để biết thêm chi tiết về quá trình và kết quả).
Hình 3.1 Quy trình chiết xuất cao toàn phần flavonoid (cao TF)
Thành phần của cao toàn phần flavonoid tâm sen chứa nhiều flavonoid, trải dài từ dạng kém phân cực đến phân cực, dễ dàng bắt màu với dung dịch FeCl3 và dung dịch VS Ngoài ra, phân tích quang phổ UV 254nm cho thấy trong cao còn xuất hiện nhiều thành phần tạp chất, trong đó một số có hàm lượng cao và bắt màu cam khi phản ứng với dung dịch VS, thể hiện sự phức tạp trong thành phần hóa học của cao.
3.1.2 Phân lập cao flavonoid toàn phần bằng phương pháp sắc ký cột pha thuận có hỗ trợ chân không (VLC)
Cao TF được phân tách thành các phân đoạn đơn giản hơn thông qua phương pháp sắc ký cột pha thuận có hỗ trợ chân không (VLC) Quá trình tách này đã thành công tạo ra 4 phân đoạn flavonoid chính (F1 – F4), được trình bày rõ trong bảng 3.2 và tham khảo hình 3.2 của tài liệu.
Bảng 3.2 Các phân đoạn flavonoid sau cột VLC cao toàn phần flavonoid
STT Tên STT ống Khối lượng Dung môi khai triển Thành phần
Bột tâm Sen khô (5Kg)
Dịch chiết nước acid (5 lít)
1 Làm ẩm, ngấm kiệt với cồn 70 O có 0,5% H 2 SO 4
2 Chỉnh pH 5 – 6 bằng NaOH 10%, cô loại cồn
Dịch chiết nước acid đã loại tạp
Chỉnh pH về 1 – 2, lắc với n-hexan (1:1), 10 – 15 lần
1 Chỉnh pH về 1 – 2, chiết kiệt bằng ethylacetat
UV 254nm UV 365nm TT FeCl 3 TT VS
Hình 3.2 SKLM các phân đoạn VLC cao TF với hệ EtOAC – MeOH – H2O –
Nhận xét: Phân đoạn F3, F4 có các vết hiện màu vàng với TT VS và xanh đen với
TT FeCl3 chứa một số vết đậm có hàm lượng cao đồng và lượng tạp chất tương đối thấp, do đó, hai phân đoạn này được chọn để phân tích tiếp bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử nhằm đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
3.1.3 Phân lập flavonoid từ phân đoạn flavonoid F3 bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử
Kết quả: thu được 5 phân đoạn flavonoid F3 sau Sephadex (F3-1 đến F3-5) được trình bày trong bảng 3.3 (SKLM tham khảo hình 3.3)
Bảng 3.3 Các phân đoạn flavonoid F3 sau Sephadex
STT Tên TT ống Khối lượng Dung môi khai triển Thành phần
UV 254nm UV 365nm TT FeCl 3 TT VS
Hình 3.3 SKLM các phân đoạn sau sắc ký rây phân tử của phân đoạn F3 với hệ
Nhận xét: Phân đoạn F3-3 tới F3-5 có các vết flavonoid bắt màu với TT FeCl3 và
TT VS Tuy nhiên F3-3 và F3-4 có thành phần phức tạp và nhiều tạp trên UV 254 nên tiến hành chọn F3-5 để tiếp tục phân lập flavonoid
3.1.4 Phân lập flavonoid từ phân đoạn flavonoid F4 bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử
Kết quả: thu được 5 phân đoạn flavonoid F4 sau Sephadex (F4-1 đến F4-5) được trình bày trong bảng 3.4 (SKLM tham khảo hình 3.4)
Bảng 3.4 Các phân đoạn flavonoid F4 sau Sephadex
STT Tên TT ống Khối lượng Dung môi khai triển Thành phần
UV 254nm UV 365nm TT FeCl 3 TT VS
Hình 3.4 SKLM các phân đoạn sau sắc ký rây phân tử của phân đoạn F4 với hệ
Các phân đoạn F4-2 đến F4-5 chứa các vết flavonoid quan trọng phản ứng với TT FeCl3 và TT VS, xác nhận sự hiện diện của flavonoid trong mẫu Trong đó, phân đoạn F4-4 nổi bật với ít tạp hơn trên tia UV 254 và 365nm so với các phân đoạn khác, cho thấy độ tinh khiết cao và chứa hai vết flavonoid xanh đen rõ rệt Kết quả này cho thấy phân đoạn F4-4 phù hợp để phân tích chi tiết hơn về thành phần flavonoid trong mẫu.
TT FeCl3 và vàng với TT VS nên được chọn tiếp tục tiến hành phân lập flavonoid
3.1.5 Phân lập TF-6 từ phân đoạn F3-5 bằng kỹ thuật sắc ký lỏng bán điều chế
- Điều kiện sắc ký phù hợp (tham khảo bảng PL-2.1, 2.3)
- Kết quả hứng các đỉnh quá tải được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả thu hứng TF-6 từ phân đoạn F3-5
Peak Thời gian thu hứng mẫu Thành phần trên SKLM Kết quả
Bắt đầu (phút) Kết thúc (phút)
SKĐ 6 lần tiêm mẫu thu hứng TF-6 từ F3-5 được trình bày trong hình 3.5.
PHÂN LẬP ALKALOID TÂM SEN
3.2.1 Chiết xuất cao alkaloid pH 10 từ dịch chiết nước acid tâm Sen bằng phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng
Tiến hành chiết xuất cao alkaloid pH 10 (cao TA) như sơ đồ hình 2.4, thu được 5g cao TA (SKLM tham khảo hình 3.6)
UV 254nm UV 365nm TT Dragendorff
Hình 3.6 SKLM cao TA với hệ Cf – MeOH – NH4OH (90:10:5)
Cao TA chứa nhiều alkaloid bắt màu cam với phản ứng Dragendorff, phân bố từ cực kém phân cực đến cực phân cực mạnh, thể hiện thành phần tạp tắt quang rõ nét.
UV 254nm và phát quang trên UV 365nm tương đối ít
3.2.2 Thu phân đoạn akaloid từ cao TA bằng VLC
Kết quả: Thu được 5 phân đoạn alkaloid A1 – A5 được trình bày trong bảng 3.6
Bảng 3.6 Các phân đoạn alkaloid sau khi chạy cột VLC cao TA
STT Tên STT ống Khối lượng Dung môi khai triển Thành phần
UV 254nm UV 365nm TT Dragendorff
Hình 3.7 SKLM VLC cao TA với hệ Cf – MeOH – NH4OH (90:10:5)
Phân đoạn A2, A3 và A5 đều chứa hàm lượng alkaloid cao, nhưng phân đoạn A2 và A5 có thành phần tạp phức tạp trên UV 254 và 365 nm, trong khi đó phân đoạn A3 chỉ có một thành phần tạp nhỏ trên UV 254 Do đó, việc lựa chọn phân đoạn A3 để tiếp tục xử lý và phân lập alkaloid là phù hợp để đảm bảo hiệu quả và độ chính xác trong quá trình phân tích.
3.2.3 Tinh chế phân đoạn A3 bằng phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng với pH thay đổi
Phân đoạn A3 được tiến hành tinh chế bằng cách lắc phân bố lỏng – lỏng với pH thay đổi với quy trình loại tạp như hình 2.5, lặp lại 3 lần
Kết quả: từ 80mg phân đoạn A3 ban đầu, sau khi tiến hành tinh chế, thu được 20mg phân đoạn A3 đã tinh chế
3.2.4 Phân lập EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế bằng kỹ thuật sắc ký lỏng bán điều chế
- Điều kiện sắc ký phù hợp (tham khảo bảng PL-2.1, 2.2)
- Kết quả thu hứng các đỉnh quả tải được trình bày trong bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả thu hứng alkaloid từ phân đoạn A3 tinh chế
Peak Thời gian thu hứng mẫu Thành phần trên SKLM Kết quả
Bắt đầu (phút) Kết thúc (phút)
Sắc ký đồ 6 lần tiêm mẫu thu hứng EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế được trình bày trong hình 3.8
Hình 3.8 SKĐ 6 lần thu hứng EN-11 từ phân đoạn A3 tinh chế
KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CỦA EN-11 VÀ TF-6
Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của EN-11 trên SKLM được trình bày trong hình PL-
3.3.1.2 Trên HPLC/PDA Điều kiện sắc ký tối ưu và các SKĐ kiểm tra độ tinh khiết EN-11 (tham khảo phụ lục 4)
Kết quả phân tích SKĐ trên HPLC/PDA của EN-11 cho thấy có một peak hoạt chất chính với diện tích đỉnh lớn nhất, cùng với một peak tạp và một peak dung môi Độ tinh khiết của sản phẩm đạt yêu cầu, đảm bảo chất lượng và hiệu quả của hoạt chất chính trong công thức Phân tích này khẳng định tính đồng nhất và độ tinh khiết cao của EN-11 theo tiêu chuẩn HPLC/PDA.
- Diện tích đỉnh peak tạp: 516866
- Diện tích đỉnh peak EN-11:17849983
- Độ tinh khiết của EN-11:
Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của EN-11 trên SKLM được trình bày trong hình PL-
XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA EN-11 VÀ TF-6
Hình 3.9 Phổ UV-Vis của EN-11 trong MeOH
Nhận xét: EN-11 có hai cực đại hấp thu tại 235nm và 281nm trong MeOH và có dạng phổ UV – VIS của alkaloid khung aporphin
Hình 3.10 Phổ MS của EN-11
Kết quả phổ 1D và 2D-NMR của EN-11 được trình bày ở Phụ lục 5
Hình 3.11 Phổ 1 H – NMR của EN-11
Hình 3.12 Phổ 13 C-NMR của EN-11
Hình 3.13 Phổ UV-Vis của TF-6 trong MeOH
Nhận xét: TF-6 có 3 cực đại hấp thu tại 223, 266 và 349nm trong MeOH và có dạng phổ UV – Vis của khung flavonoid isoflavon
Hình 3.14 Phổ MS của TF-6
Kết quả phổ 1D và 2D-NMR của TF-6 được trình bày ở Phụ lục 5
Hình 3.15 Phổ 1 H – NMR của TF-6
Hình 3.16 Phổ 13 C – NMR của TF-6
BÀN LUẬN
THĂM DÒ ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CAO TOÀN PHẦN FLAVONOID VÀ ALKALOID TỪ TÂM SEN THÍCH HỢP NHẤT
FLAVONOID VÀ ALKALOID TỪ TÂM SEN THÍCH HỢP NHẤT
Lá và tâm Sen có thành phần hóa học đa dạng, trong đó lipid, sáp, nhầy, nhựa chiếm tỷ lệ lớn, gây khó khăn trong quá trình lắc phân bố lỏng – lỏng do tạo ra nhiều nhũ khi thu alkaloid toàn phần dạng base cũng như xuất hiện tạp màu lẫn trong cao Do đó, hầu hết các nghiên cứu trước đây thường sử dụng phương pháp lọc cao cồn toàn phần qua màng nhựa chọn lọc resin để loại bỏ tạp màu và lipid kém phân cực, nhằm giảm thiểu nhũ và thu giữ alkaloid sạch hơn trước khi tiến hành các bước phân lập alkaloid tiếp theo.
Tại Việt Nam, việc tìm mua các màng nhựa chọn lọc resin gặp khó khăn do thiếu chủng loại phù hợp hoặc giá thành cao Vì vậy, phương pháp lắc phân bố loại tạp kém phân cực với n-hexan ở môi trường pH 1-2 được lựa chọn để tối ưu hóa quá trình xử lý Tiếp theo, quá trình chiết lỏng - lỏng với EtOAc ở pH 1-2 giúp thu hồi cao flavonoid toàn phần (TF), trong khi kiềm hóa đến pH 10 bằng NH4OH 25% và chiết bằng Cf đảm bảo thu tối đa alkaloid toàn phần (TA) Cuối cùng, phương pháp sắc ký cột chân không pha thuận được áp dụng để tinh chế các hợp chất đã xử lý một cách hiệu quả.
Sephadex được sử dụng để tách phân đoạn toàn phần flavonoid ban đầu thành các phân đoạn có độ phân cực khác nhau, giúp tối ưu quá trình phân lập các hợp chất mong muốn Quá trình này còn giúp loại bỏ tạp màu và các tạp kém phân cực, nâng cao chất lượng và độ tinh khiết của flavonoid thu được Nhờ vào khả năng phân đoạn linh hoạt của Sephadex, việc tách chiết flavonoid trở nên hiệu quả hơn, đáp ứng tốt các yêu cầu phân tích và ứng dụng thực tiễn.
4.1.1 Chiết xuất flavonoid bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn acid
Sau khi ngấm kiệt tâm Sen, dịch chiết cồn acid được thu hồi và dung môi được loại bỏ dưới áp suất giảm, tạo ra dịch chiết nước đậm đặc Tiếp theo, nghiên cứu xác định điều kiện pH tối ưu để chiết xuất cao toàn phần flavonoid bằng phương pháp acid hóa dịch chiết nước về pH 1-2, 3-4, 5-6, sau đó tiến hành phân lập flavonoid bằng kỹ thuật lỏng-lỏng với etyl acetat Kết quả phân tích trên SKLM (hình 4.1) cho thấy sự phân bố flavonoid tối ưu ở các điều kiện pH khác nhau, giúp xác định điều kiện chiết xuất hiệu quả nhất.
- Ở pH 1-2, thành phần flavonoid thu được là tối ưu, lượng tạp tương đối ít
- Ở pH 3-4, thành phần flavonoid ít hơn điều kiện pH 1-2 nhưng thành phần tạp kém phân cực tương đối cao
- Ở pH 5-6, hầu như không chiết xuất được flavonoid, chỉ có tạp qua được lớp ethylacetat
UV 254 UV 365 TT FeCl 3 TT VS
Hình 4.1 SKLM khảo sát pH thích hợp chiết xuất flavonoid từ dịch nước acid với hệ dung môi EtOAc – MeOH – H2O – HCOOH (100:17:13:1)
Vì vậy, tiến hành chọn pH 1-2 là pH chiết xuất flavonoid toàn phần từ dịch chiết nước acid tâm Sen
4.1.2 Chiết xuất flavonoid bằng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm
Kết quả khảo sát cho thấy thành phần cao ethylacetat trên SKLM chứa rất ít flavonoid, chủ yếu là các flavonoid phân cực mạnh có Rf ≤ 0,3 Ngược lại, các tạp kém phân cực xuất hiện nhiều hơn so với phương pháp ngấm kiệt bằng cồn acid, dẫn đến thành phần flavonoid trong cao này nhiều hơn và lượng tạp ít đi.
Hỗ trợ siêu âm trong quá trình chiết xuất flavonoid từ nguyên liệu tâm sen ban đầu cho thấy hiệu quả giảm, có thể do siêu âm không đủ mạnh để thúc đẩy dung môi xuyên qua thành tế bào Điều này làm giảm khả năng chiết xuất tạp lẫn flavonoid một cách tối ưu Do đó, cần xem xét các điều chỉnh về cường độ siêu âm hoặc các phương pháp kết hợp để nâng cao hiệu quả chiết xuất từ nguyên liệu tự nhiên này.
4.1.3 Loại tạp bằng các phương pháp sắc ký
Thành phần tâm Sen chứa nhiều lipid, sáp và các chất nhựa có đặc tính kém phân cực, vì vậy phương pháp sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thuận có thể loại bỏ một phần lớn các tạp này Quá trình khảo sát pha động trên SKLM giúp xác định hiệu quả tinh chế, sau đó tiến hành khai triển cột VLC bằng dung môi nền là dung môi kém phân cực nhất trong hệ pha động ở tỷ lệ 100% Các tạp kém phân cực bị lưu giữ kém sẽ nhanh chóng được rửa giải trong giai đoạn này, nâng cao hiệu quả tinh chế thành phần tâm Sen.
Trong quá trình tách các hợp chất flavonoid và alkaloid, phương pháp sắc ký rây phân tử được đánh giá cao nhờ khả năng phân tách chính xác các nhóm hợp chất có kích thước phân tử nhỏ Sephadex LH-20 là pha tĩnh phổ biến và hiệu quả, giúp tách các tạp màu có kích thước lớn mà không bị giữ lại trong các xoang của pha tĩnh Quy trình nạp mẫu và khai triển với 100% MeOH giúp các tạp màu có phân tử lớn nhanh chóng rửa giải khỏi cột mà không làm ảnh hưởng đến các thành phần còn lại, đảm bảo hiệu quả tách chiết cao.
4.1.4 Loại tạp trong các phân đoạn alkaloid bằng phương pháp lắc phân bố lỏng – lỏng kết hợp chuyển dạng theo pH
Alkaloid tồn tại dưới hai dạng chính là muối và base, với khả năng tan khác nhau trong các dung môi phân cực và kém phân cực Dạng muối tan tốt trong dung môi phân cực như nước, trong khi dạng base lại hòa tan hiệu quả hơn trong dung môi kém phân cực Hai dạng này có thể dễ dàng chuyển đổi lẫn nhau thông qua việc điều chỉnh pH từ vùng axit sang kiềm, giúp dễ dàng loại bỏ tạp chất trong quá trình phân tích và tinh chế alkaloid.
- Hoà tan cao alkaloid trong nước acid, khi đó alkaloid tồn tại ở dạng muối, dễ dàng tan vào nước
- Kiềm hoá nước acid này về pH 9-10 để chuyển phần lớn alkaloid về dạng base kém tan trong nước
- Lắc phân bố dịch nước trên với Cf, alkaloid base sẽ tan vào dịch này Lắc nhiều lần đến khi kiệt alkaloid, cô loại Cf
Thực hiện nhiều lần quy trình tinh chế giúp thu được alkaloid ngày càng tinh khiết hơn Điều này do các tạp chất không có khả năng chuyển đổi pH, do đó chúng không phân bố vào dịch Cf, góp phần nâng cao độ tinh khiết của alkaloid cuối cùng.
4.2 THĂM DÒ HỆ DUNG MÔI KHAI TRIỂN VLC CHO CAO ALKALOID pH 10 VÀ CAO TOÀN PHẦN FLAVONOID TÂM SEN Đặc tính của cao flavonoid toàn phần (TF) và cao alkaloid pH 10 (TA) tâm Sen trên SKLM cho thấy các loại cao này đều có thành phần khá phức tạp, chứa nhiều vết flavonoid và alkaloid trải dài từ phân cực mạnh tới phân cực kém
Để thuận tiện cho nghiên cứu và xử lý sau này, cần đơn giản hóa hai loại cao này bằng cách sử dụng sắc ký cột VLC để phân đoạn dựa trên độ phân cực, bằng cách thay đổi dung môi pha động nhanh chóng Theo nguyên tắc, hệ dung môi pha động phù hợp là hệ làm các vết quan tâm di chuyển với giá trị Rf từ 0,25-0,35, giúp tối ưu hóa quá trình phân tích.
4.2.1 Thăm dò hệ dung môi khai triển VLC cao TA
Cao TA chứa các vết alkaloid phân bố từ dạng phân cực mạnh đến kém phân cực, đòi hỏi phải khảo sát các hệ dung môi phù hợp để tiến hành phân đoạn hiệu quả Quá trình tách cao này sẽ chia thành ba phân đoạn chính gồm: phân cực mạnh, phân cực trung bình và kém phân cực, giúp xác định các hợp chất alkaloid một cách tối ưu và hỗ trợ phân tích chính xác hơn.
Các hệ khảo sát gồm hai thành phần chính là CF và MeOH, bắt đầu từ 100% CF và sau đó dần tăng tỷ lệ MeOH theo các bước nhỏ (3%) để đảm bảo kiểm soát sự thay đổi của hệ Việc bước nhảy tỷ lệ MeOH cần được giới hạn ở mức thấp do MeOH là dung môi phân cực mạnh, dễ làm tăng nhanh độ phân cực của hệ khảo sát Các hệ dung môi đã được khảo sát và kết quả chi tiết đã được trình bày rõ trong Bảng 4.1 nhằm phân tích ảnh hưởng của từng tỷ lệ dung môi đến hiệu suất tách.
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát dung môi khai triển VLC cao TA tâm Sen
Tên Thành phần hệ Khả năng tách phân đoạn kém phân cực
Khả năng tách phân đoạn phân cực trung bình
(-): hệ có khả năng tách phân đoạn
(+): hệ không có khả năng tách phân đoạn
Sắc ký đồ các hệ dung môi có khả năng tách các phân đoạn alkaloid tương ứng được trình bày trong hình 4.2
Hình 4.2 SKLM các hệ S3, S4, S6, S7 với thuốc thử Dragendorff
Kết quả cho thấy, hệ S3 và S4 trên SKLM tách tốt phân đoạn kém phân cực, trong khi hệ S6 và S7 tách hiệu quả phân đoạn phân cực trung bình của cao TA Tuy nhiên, khi triển khai phương pháp VLC, nên chọn hệ S3 và S6 do đặc điểm khác biệt rõ rệt về kích thước hạt của pha tĩnh silica gel giữa VLC và SKLM; silica gel trong VLC có kích thước lớn hơn (40-63 mm) so với trong cột HPLC (50 A), dẫn đến việc lựa chọn hệ có độ phân cực thấp hơn để tránh hiện tượng dồn vết và không tách được khi tiến hành triển khai VLC Sau quá trình khảo sát, quy trình cột VLC được tiến hành theo các bước đã đề xuất để đảm bảo hiệu quả tách tốt nhất.
- Khai triển với 100% Cf để loại các tạp kém phân cực
- Chuyển sang khai triển với hệ dung môi Cf – MeOH (94:6) để thu phân đoạn alkaloid kém phân cực
- Chuyển sang khai triển với hệ dung môi Cf – MeOH (85:15) để thu phân đoạn alkaloid phân cực trung bình
- Cuối cùng, rửa giải với 100% MeOH thu phân đoạn alkaloid phân cực mạnh
4.2.2 Thăm dò hệ dung môi khai triển VLC cao TF
KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT CÁC CHẤT THU ĐƯỢC
Kiểm tra độ tinh khiết của chất EN-11 và TF-6 được thực hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng triển khai với ba hệ dung môi có độ phân cực khác nhau Phương pháp này cho phép phân tích và so sánh các vết nét trên bản mỏng, với các Rf tương ứng lần lượt là 0,3, 0,5 và 0,8 Kết quả này cho thấy các chất phân lập có độ tinh khiết phù hợp, tránh nhiễm tạp rõ ràng Phương pháp sắc ký lớp mỏng giúp xác định tính đồng nhất của mẫu và đảm bảo chất lượng trước khi sử dụng trong các ứng dụng nghiên cứu hoặc sản xuất.
- Trên UV 254, 365nm và các thuốc thử Dragendorff, VS, EN-11 chỉ cho một vết duy nhất Kết luận một cách sơ bộ: alkaloid EN-11 tinh khiết trên SKLM
- Trên UV 254, 365nm và các thuốc thử FeCl3, VS, TF-6 chỉ cho một vết duy nhất Kết luận một cách sơ bộ: flavonoid TF-6 tinh khiết trên SKLM
Kiểm tra độ tinh khiết của đỉnh EN-11 trên HPLC/PDA bằng chế độ mix view giúp xác định mức độ tinh khiết của mẫu bằng chức năng total peak purity Chức năng này hoạt động dựa trên so sánh độ tương đồng phổ UV của các điểm trên đỉnh Peak với phổ UV trung bình lấy từ ba điểm chính (đỉnh Peak, phần lên và phần xuống) Việc đánh giá độ tương đồng này đảm bảo rằng đỉnh Peak không chứa các tạp chất hoặc hợp chất không mong muốn, từ đó xác định độ tinh khiết của mẫu một cách chính xác Các kết quả kiểm tra giúp nâng cao độ tin cậy trong phân tích chất lượng sản phẩm.
990 Kết quả cho thấy EN-11 đạt độ tinh khiết peak là 1,00, chứng tỏ không có sự chồng peak trong EN-11 ở điều kiện sắc ký tiến hành thử tinh khiết
Kiểm tra % tinh khiết của EN-11 ở chế độ max plot với phương pháp quy về 100% diện tích đỉnh giúp xác định độ tinh khiết chính xác của mẫu Trong chế độ này, EN-11 được quan sát trên toàn bộ thang sóng từ 225-400nm, đảm bảo các peak tạp (nếu có) được phát hiện đầy đủ Kết quả cho thấy sự phân tích chi tiết về các peak tạp giúp đánh giá chất lượng và độ tinh khiết của EN-11 chính xác hơn.
11 có độ tinh khiết là 97,19%.
BIỆN GIẢI CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
EN-11 cho vết phân cực trung bình trên hệ dung môi Cf – MeOH – NH4OH (90:10:5), có phản ứng dương tính với thuốc thử Dragendorff thể hiện đặc tính của alkaloid Phổ UV của EN-11 trong MeOH hiển thị dãy hấp thu tại 235 nm và 281 nm, phù hợp với phổ UV của các alkaloid khung aporphin Phổ ESI-MS cho thấy các đỉnh m/z quan trọng như 298,21 [M +H]+, 267,08 [M – OCH3]+ và 235 [M –OH–], hỗ trợ xác định thành phần alkaloid trong mẫu.
EN-11 có khối lượng phân tử 297,21 g/mol và công thức cấu tạo C18H19NO3, với độ bất bão hòa là 10, giúp xác định cấu trúc của hợp chất Việc dự đoán cấu trúc của EN-11 đã được xác nhận nhờ kết quả phân tích phổ 1D và 2D-NMR, được trình bày rõ trong bảng 4.5, đảm bảo tính chính xác của quá trình phân tích và xác định cấu trúc.
Bảng 4.5 Dữ liệu phổ 13 C, 1 H-NMR, COSY, HMBC của EN-11
Vị trí C DEPT δ C δ H m (J, Hz) COSY HMBC
Trong phân tích dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR so sánh với các tài liệu đã công bố [15], [19], chúng tôi đã xác định được EN-11 là apoglaziovin, một alkaloid thuộc họ aporphin lần đầu tiên xuất hiện trong tâm Sen Cấu trúc hóa học của EN-11 và các tương tác xa được trình bày rõ ràng trong hình 4.5, góp phần làm rõ đặc điểm cấu trúc phân tử của hợp chất này.
Hình 4.5 Cấu trúc hóa học và các tương tác xa của EN-11 (apoglaziovin) 4.5.2 TF-6
Hợp chất TF-6 dễ tan trong các dung môi kém phân cực như CCl4 và cho phản ứng màu với thuốc thử FeCl3 5% cùng với dung dịch VS Phổ UV của TF-6 xuất hiện các đỉnh hấp thu cực đại tại các bước sóng 223 nm, 266 nm và 349 nm, thể hiện đặc điểm của cấu trúc isoflavon Phổ ESI-MS negative của TF-6 cho thấy mảnh ion phân tử lớn nhất (100%) ở m/z = 283,23 [M-H]-, xác định khối lượng phân tử của hợp chất là 284,23 và phù hợp với công thức nguyên tử của isoflavon.
TF-6 có công thức phân tử C16H12O5 và được xác định là một isoflavon aglycon Cấu trúc của TF-6 dự kiến sẽ được xác nhận chính xác thông qua kết quả phân tích phổ 1D và 2D-NMR, như đã trình bày trong bảng 4.6.
Bảng 4.6 Dữ liệu phổ 13 C, 1 H-NMR, COSY, HMBC của TF-6
Vị trí C DEPT δ C ppm δ H m (J, Hz) HMBC COSY
Dựa trên phân tích dữ liệu phổ 1D và 2D-NMR so sánh với các tài liệu đã công bố [47], chúng tôi xác định TF-6 là calycosin thuộc nhóm isoflavon, lần đầu tiên được công bố trên tâm sen Cấu trúc hóa học của TF-6 được trình bày rõ ràng trong hình 4.6, góp phần xác định đặc điểm cấu trúc phân tử của hợp chất này.
Hình 4.6 Cấu trúc hóa học của TF-6 (calycosin)
- Đã phân lập được từ tâm Sen một flavonoid tinh khiết TF-6 và một alkaloid tinh khiết EN-11
- Đã kiểm tra độ tinh khiết của TF-6 trên sắc ký lớp mỏng và độ tinh khiết của EN-
11 trên sắc ký lớp mỏng và trên HPLC/PDA với kết quả 97,19%
Đã xác định thành công cấu trúc của các hợp chất TF-6 và EN-11 nhờ các phương pháp phổ học như UV-Vis, MS, và NMR, giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc hoá học của chúng Các kỹ thuật phân tích này đã cung cấp dữ liệu chính xác để giải thích cấu trúc phân tử của TF-6 và EN-11, xác nhận tính chất hóa học của các hợp chất Việc sử dụng kết hợp các phương pháp phổ học hiện đại đã nâng cao độ chính xác trong xác định cấu trúc của các hợp chất này Kết quả nghiên cứu góp phần quan trọng trong việc mở rộng kiến thức về các hợp chất liên quan, phù hợp với các mục tiêu nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực hoá học.
11 lần lượt là calycosin và apoglaziovin , đều là những hợp chất lần đầu tiên được công bố trên tâm Sen
- Tiếp tục khai triển cột VLC alkaloid và flavonoid với dung môi khai triển phân cực hơn để thu các phân đoạn VLC tiếp theo
- Tiếp tục phân lập alkaloid từ các phân đoạn A1, A2, A5
- Tiếp tục phân lập flavonoid từ các phân đoạn VLC F1, F2 và các phân đoạn F3-
3, F3-4 sau Sephadex F3 và F4-2, F4-3, F4-5 sau Sephadex F4
- Xây dựng quy trình định lượng apoglaziovin và calycosin trong dược liệu tâm Sen bằng phương pháp HPLC/PDA
- Ứng dụng quy trình đã xây dựng để kiểm soát chất lượng nguồn dược liệu tâm Sen trên thị trường
1 Đỗ Huy Bích (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II,
NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.[1]
2 Bộ môn Dược liệu, trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (2014),
Phương pháp nghiên cứu dược liệu.[2]
3 Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y học, Hà Nội.[3]
4 Cao Thị Thu Giang, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2012), Nghiên cứu ứng dụng các phương pháp sắc ký phân tích thành phần flavonoid có trong tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae), Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.[4]
5 Lương Thị Thanh Hằng, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2013), Nghiên cứu, chiết xuất, phân lập và phân tích thành phần alkaloid từ phân đoạn kém phân cực dịch chiết lá Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae), Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.[5]
6 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.[6]
7 Huỳnh Phương Thảo, Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2014), Nghiên cứu phân lập alkaloid phân cực có tác dụng sinh học trong lá, tâm Sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) bằng phương pháp sắc ký lỏng bán điều chế, Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.[7]
8 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu thành phần alkaloid trong tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae)”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, tập 15, số 1.[8]
9 Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Nguyễn Đức Tuấn, Trần Hùng (2011), “Xây dựng quy trình quy trình định lượng neferin trong cao chiết alkaloid toàn phần từ tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang”, Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, tập 15, số 1.[9]
10 Ngô Vân Thu, Trần Hùng (2011), Dược liệu học, tập I, NXB Y học.[10]
11 Phạm Thanh Kỳ (2011), Dược liệu học, tập II, NXB Y học.[11]
12 Đỗ Tất Lợi (2010), Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.[12]
Tài liệu tiếng nước ngoài
13 Amersham Biosciences (2011), Gel Filtration Priciples and Methods, pp 81-
14 Atsuko Itoh, Tomomi Saitoh, Kaori Tani, Misaki Uchigaki, Yumi Sugimoto, Jun Yamada, Hiroshi Nakajima, Hideo Ohshiro, Schujian Sun, Takao Takahashi (2011), “Bisbenzylisoquinoline alkaloids from Nelumbo nucifera”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 59(8), pp 947-951.[14]
15 Bruce K Cassels, André Cavé and Michel Leboeuf (1987), “The 13 C-NMR spectra of 1,2,10-trioxygenated aporphines”, Journal of Natural Products,
16 Chao Tse - Yuan, Chou Yun – Lee, Young Pao Tsin, Choi Tsan- Quo (1962),
“Studies on Alkaloids of embryo loti”, Scientia sinica, XI, pp 215-219.[16]
17 Cheng – Huai, CH Geng, Wei-Yu Wy Wang, Miao M Lin, Jian-Nong JN Ye
(2007), “Determination of flavonoids in Plumula Nelumbin by micellar electrokinetic capillary electrophoresis with electrochemical detection”,
Journal of Capillary Electrophoresis and Microchip Technology, volume
18 Chen Yi, Fan Guorong, Wu Huiling, Wu Yutian, Mitchell Annabel (2007),
This study focuses on the separation, identification, and rapid quantification of liensinin, isoliensinine, and neferine extracted from the embryo of Nelumbo nucifera Gaertn using advanced liquid chromatography techniques By employing liquid chromatography coupled with diode array detection and tandem mass spectrometry, the research provides a reliable method for analyzing these bioactive alkaloids The developed method offers high sensitivity and specificity, facilitating efficient quality control and pharmacological studies of Nelumbo nucifera seed embryos This innovative approach advances the understanding of key compounds in Nelumbo nucifera, supporting its application in pharmaceutical and biomedical research.
19 Hélène Guinaudeau, Michael Leboeuf and André Cavé (1979), “Aporphine Alkaloids II”, Journal of Natural Product, 42(4), pp 325-360.[19]
20 Hideo Kohiyama, Hiroaki Ohkuma, Hiroshi Kawaguchi, Hong-Yen Hsu and Yuh-Pan Chen (1970), “Isolation of 1-(p-hydroxybenzyl)-6,7-dihydroxy- 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline (demethylcoclaurin), a active Alkaloid from
Nelumbo nucifera”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 18(12), pp 2564-
21 Hiroshi Furukawa (1965), “On the Alkaloids of Nelumbo nucifera Gaertn
NMR spectra of Liensinine type Alkaloid”, Yakugaku Zasshi, 86(10), pp 883- 886.[21]
22 Hiroshi Furukawa (1966), “On the Alkaloids of Nelumbo nucifera Gaertn XII Alkaloids of Loti Embryo”, Yakugaku Zasshi, 86(1), pp 75-77.[22]
23 Hiroshi Tanahashi, Yamada Sugimoto (2007), “Benzylisoquinoline derivative
- or bisbenzylisoquinoline derivative - containing psychotropic agent, analgesic and/or antiphlogistic, and health food”, European Patent Application.[23]
24 Jian Yang and Kailan Zhou (2003), “NMR spectroscopic analysis of Neferine and Isoliensinine”, Magnetic Resonance In Chemistry, 42, pp 994-997.[24]
25 Jian Yang (2005), “NMR spectrocopic analysis of lotusine”, Magnetic Resonance In Chemistry, 43, pp 184-185.[25]
26 John Dolan, A guide to HPLC and LC – MS buffer selection, Advanced
27 J Wang, Q Kan, J Li, X Zhang and Y Qui (2011), “Effect of neferine on liver ischemia – reperfusion infury in rats”, Transplantation Proceedings,
28 Katsumi Nishimura, Shinji Horii, Takao Tanahashi, Yumi Sugimoto, Jun Yamada (2013), “Synthesis and pharmacological activity of alkaloids from embryo of lotus, Nelumbo nucifera”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin,
29 K R Sridhar and Rajeev Bhat (2007), “Lotus – a potential nutraceutical source”, Journal of Agricultural Technology, 3(1), pp 143-155.[29]