ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol; ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin
- Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn thêm nội chuẩn norfloxacin (IS-1) cho nhóm quinolone và nội chuẩn cloramphenicol-d5 (IS-2) cho nhóm phenicol
- Mẫu trắng giả lập: mẫu nước thải không chứa các kháng sinh cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol; ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin
- Mẫu thử giả lập: mẫu hỗn hợp chuẩn thêm vào mẫu trắng giả lập
- Mẫu thử :15 mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản ở các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh
+ Thời gian lấy mẫu nước thải: 05/2018-06/2018
+ Địa điểm lấy mẫu nước thải: Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Phòng nghiên cứu liên bộ môn Hóa phân tích- Kiểm nghiệm - Độc chất, khoa Dược, trường Đại Học Y Dược Cần Thơ
Phương tiện nghiên cứu
N-hexan đạt tiêu chẩn phân tích sắc ký MeOH, ACN, acid formic đạt tiêu chuẩn HPLC gradient của JT Baker, Mỹ Nước cất đạt tiêu chuẩn MS của Merck, Đức
2.3.2 Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn
Các chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn dự kiến được trình bày trong Bảng 2.1
Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn được dùng trong nghiên cứu
Tên chất Mã số, quy cách đóng gói
Hàm lượng Hãng cung cấp
Cloramphenicol (CLOR) QT014 090617- 120 mg 99,6% VKN TP Hồ Chí
Minh Florfenicol (FLOR) 73231-34-2 100mg 99,4% Sigma-Aldrich
Thiamphenicol (THI) 15318-45-3 – 100 mg 99,26% Sigma-Aldrich
(nội chuẩn CLOR-d5) 329756147 – 100 mg 99, 45% Sigma-Aldrich
Ofloxacin (OFL) QT079 090617-120 mg 99,2% VKN TP Hồ Chí
Ciprofloxacin (CIP) QT012 111116- 120 mg 94,3% VKN TP Hồ Chí
Minh Enrofloxacin (ERF) 93106-60-6 – 100 mg 99,1% Sigma-Aldrich
NOR) QT068 050316-120 mg 99,54% VKN TP Hồ Chí
Bảng 2.2 Thông tin về các chất chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu
Tên dụng cụ, thiết bị Nước sản xuất
Máy sắc ký lỏng ACQUITY UPLC H-CLASS SYSTEM Waters, Xevo
TQĐ ghép detector khối phổ 3 lần tứ cực
Cân Phân Tích ABT 220-5DM,d=0,1mg/0,01mg, max 220g Đức Cân Phân Tích OHAUS Explorer Pro, d=0,1mg, max 210g Mỹ
Bể siêu âm Wisd WUC-D22H Hàn Quốc
Máy cô quay chân không HEI-VAP Value của Heidolph Đức
Tủ lạnh sâu (-80 o C), Sanyo MDF-236 Nhật
Micropipet eppendorf 1-10μl,10-100μl, 100-1000μl Đức Bình định mức, dụng cụ thủy tinh dùng trong phân tích Đức
Máy đo pH WTW-INOLAB pH720 Đức Điện cực kép Ag/AgCl-thủy tinh, số hiệu HI 1131 Đức
Máy khuấy từ IKA C-MAG HS10 Đức
Vial loại 1,8mL Isolab Đức
Máy lọc hút chân không
Màng lọc 0,45μmvà 0,2μm Cellulose acetat, Sartorius Đức Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 ( 4,6 x 150 mm, 3,5 àm) Mỹ
Hình 2.1 Hệ thống UPLC-MS/MS Xevo-TQD của Waters
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu dung dịch chuẩn gốc của các chất phân tích như CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF cùng với nội chuẩn NOR (IS-1) và CLOR-d5 (IS-2) đều có nồng độ 1000 µg/mL Các mẫu này được pha trong dung môi gồm MeOH và nước axit formic 0,1% theo tỷ lệ 50:50, đảm bảo độ hòa tan và độ ổn định phù hợp cho quá trình phân tích.
- Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các dung dịch chuẩn làm việc của chất phân tích có nồng độ từ 10 ng/mL đến 200 ng/mL
Dịch nội chuẩn gốc được pha loãng thành các dung dịch nội chuẩn làm việc, sử dụng nội chuẩn NOR và CLOR-d5, với nồng độ từ 10 ng/mL trở lên để đảm bảo độ chính xác trong phân tích Quá trình pha chế này giúp tối ưu hóa độ nhạy và độ chính xác của phương pháp phân tích, đáp ứng các yêu cầu về tiêu chuẩn chất lượng và độ lặp lại Việc chuẩn bị các dung dịch nội chuẩn này là bước quan trọng trong quy trình phân tích, giúp kiểm soát và hiệu chỉnh kết quả đo lường chính xác hơn.
Mẫu thử giả lập là mẫu hỗn hợp chuẩn của chất phân tích và nội chuẩn, được thêm vào mẫu trắng giả lập với nồng độ thích hợp (ng/mL) để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích Việc sử dụng mẫu giả lập giúp đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích trong quá trình kiểm nghiệm Đây là bước quan trọng trong quá trình phát triển phương pháp để xác định nồng độ chất phân tích một cách chính xác.
2.4.2 Xây dựng quy trình định lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp LC- MS/MS
2.4.2.1 Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn
Dựa trên tính chất hóa lý của CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và đề xuất dựa trên tài liệu, CLOR-d5 được lựa chọn làm nội chuẩn cho nhóm phenicol nhằm nâng cao độ chính xác trong phân tích Đồng thời, NOR và lomefloxacin được chọn làm nội chuẩn cho nhóm quinolon để giảm thiểu sai số và đảm bảo độ lặp lại cao trong phương pháp định lượng Các kháng sinh phân tích cùng các chất dự kiến làm nội chuẩn được pha chế thành dung dịch có nồng độ phù hợp, giúp tối ưu hóa quá trình phân tích và nâng cao độ chính xác của kết quả.
Trong quy trình phân tích, dung dịch có nồng độ 500 ng/mL được bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ ở tốc độ 20 μL/phút Phương pháp ion hóa điện tử (ES) được tối ưu hóa theo chế độ dương (ES +) hoặc âm (ES -) phù hợp với loại kháng sinh phân tích Các điều kiện khối phổ cũng được điều chỉnh để đảm bảo độ nhạy và chính xác cao trong việc xác định ion mẹ và ion phân mảnh, giúp nâng cao hiệu quả và độ tin cậy của quá trình phân tích kháng sinh.
2.4.2.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu
Sử dụng chế độ Auto-tune để khảo sát các thông số khối phổ nhằm thu được tín hiệu tối ưu cho các hợp chất như CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF, IS-1 và IS-2 Chất phân tích và nội chuẩn được hòa tan trong hỗn hợp dung môi MeOH: nước acid formic 0,1% theo tỷ lệ 50:50 (tt/tt) với nồng độ khoảng 500 ng/mL, sau đó được bơm trực tiếp vào máy khối phổ để tối ưu hóa các điều kiện phân tích.
- Xác định ion mẹ cho CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và IS-1, IS-2;
- Xác định phân mảnh ion con của của chất phân tích và nội chuẩn có cường độ tín hiệu cao và ổn định
Các thông số khối phổ dự kiến khảo sát:
- Kiểu ion hóa ESI: dương (ES + ) hay âm (ES - )
- Thế mao quản (capillary voltage): 2-4 kV
- Thời gian chờ ghi nhận tín hiệu (dwell time): 0,025-0,2 giây
- Năng lượng buồng va chạm (collision cell energy): 10-80eV
- Tốc độ dòng khí phun (nebulizer gas flow)
- Nhiệt độ khí bay hơi (desolvation temp): 250-500 0 C
- Tốc độ dòng khí bay hơi (desolvation gas flow): 800-1000 L/giờ
2.4.2.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp
Các chất như CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn có đặc tính lý hóa với mức độ phân cực từ trung bình đến phân cực, do đó phương pháp sắc ký lỏng pha đảo phù hợp để phân tích chúng Hệ dung môi phân cực sử dụng trong phương pháp này gồm ACN, MeOH, nước và có thể bổ sung các chất điều chỉnh pH như axit acetic, axit formic (0,1%) hoặc triethylamin (
