nghiên cứu ảnh hưởng của một sô chất phytohormone lên qua trình vi nhân giông một số dòng lúa bất dục đực (phục vụ cho công tác lúa lai)

nghiên cứu ảnh hưởng của một sô chất phytohormone lên qua trình vi nhân giông một số dòng lúa bất dục đực (phục vụ cho công tác lúa lai)

ĐẠI HỌC Q U Ố C GIA HÀ NỘI

I Tinh hình Iighiõn cứu nuôi CÁV mô-tô hào trên thô

£>iới và Irong nước

II Các nhân tô anh hướng lèn qua 1 rình phát sinh 4hình thái m ô-le hào Ihưc vãi in v itio

2 Môi trưởng, nuôi cây

3 Điổu kiện nuôi cấy

I K hả nàng tạo 111Ô SCO

I Khá năng tạo mô sẹo từ phôi

2 T ạo m ô sẹo lừ các lớp m ỏng thế bào

3 T ạo m ô sẹo lừ hao phấn Fl của tổ hợp lai

o l\ĩiai 6 4 s X C) l 225

II Tái sinh chồi :

I I I N hân chồi

1 Ánh hưởng của kinetin lên hệ sô nhân chổi

2 ánh hưởng cùa NAA lên hệ số nhân chổi

IV T ạo cAy hoàn chinh

V Tái tạo cây lúii lừ hao phấn Fl của lổ hợp lai

Ọ I Vmì 6 4s X ()’ 1 2 2 5.

: T à i liệu t h a m kliỉio : IMìịi lục

H cliir viêl tát sử (lụiif» I r o n g llíio cáo Iiỉíy

MS: Murashi^e Skoog, l')62

LS: Linsmaiet and Skooịỉ, 1965

NAA: a - Naphthalcne íKdie ỉicid

2,4- D: 2.1- Pidiloiophenoxy acclic acid

I A A : I n c l o l e - ' - A c e l i e A i i(l

BAP: Ren/.yl A m in o 1’urinc

IRRI: International Rice keseaeli Instiluie

MỞ ĐẦULúa lai đã trở thành vấn đề thời sự trong nông nghiệp không chỉ ở nước ta mà ở khắp các nước trổng lúa trên thê giới Nhờ đưa lúa lai vào sản xuất mà sản lượng lúa của Trung quốc tăng lên gấp bội, Trung quốc

đã giảm được 50% đất trổng lúa để trổng các cãy nông nghiệp khác Lúa lai cũng nhanh chóng được nhập nội vào nước ta vì năng xuất của lúa lai vượt trội hơn so với lúa thường từ 20 -30% ; Do vậy việc nghiên cứu và tạo

ra các dòng lúa lai là vấn đề cấp thiết Nhà nước ta đã chi hàng nhiều tý đồng để nghiên cứu, tạo ra các dòng lúa lai của v i ệ t nam; Kết quá về vấn

để này chưa nhiều

Vấn đề đặt ra là tại sao công nghệ lúa lai lại tiến bộ chậm trễ như vậy ? Lý do vì tạo ra các dòng mẹ bất dục đực và các con lai F1 có nhiều khó khăn, năng suất của chúng quá thấp Tuy vậy trong những năm qua các nhà khoa học Việt nam cũng đã thu được một số kết quả trong ITnh vực này; Đã chọn tạo được một số dòng TGMS bất dục đực do gen nhãn nhạy cảm với nhiệt độ gây ra; phục vụ cho công nghệ lúa lai hai dòng Đã chuyển các gen TGM S vào các giống lúa thường có nhiều đặc điểm tốt; Kết hợp với nuôi cấy bao phấn đê tạo ra các dòng TGM S mới có nhiều ưu việt hem Nếu chọn tạo theo phương pháp thông thường phái trải qua nhiều

th ế hệ chưa chắc đã nhận được các dòng theo ý muốn, hơn nữa dòng vừa nhận được không hoàn toàn thuán chủng

K hí hậu ở miền bắc nước ta chỉ cho phép sản xuất hạt chứa gen TGM S vào hai thời vụ ( vụ xuân sớm và vụ thu đông ) Thời tiết lại luôn thay đổi nên sản xuất hạt dòng mẹ gặp không ít khó khăn

Đê rút ngắn thời gian chọn tạo dòng TGMS, chúng tôi sử dụng phương pháp nuôi cấy m ô như nuôi cấy phôi, phôi non; nuôi cấy lớp mỏng

tế bào và nuôi cấy bao phấn của con lai F1 để nhăn nhanh và tạo ra các dong TGM S mới làm dòng mẹ phục vụ cho các tổ hợp lúa lai hai dòng

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài “ Nghiên cứu ảnh hương của m ột sô phytohorm one lên quá trình vỉ nhân giống một sỏ dòng lúa bát dục đực ( phục vụ cho còng tác lúa l a i )

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của các phytohorm one lên các giai đoạn nuôi cây; từ đó có thê rút ra được quy trình nhân nhanh các dòng bất dục đực TGMS

Bằng phương pháp này người ta đã bảo quản được nhiều loài củy quý hiếm có nguy cơ bị tuyệt chủng do những biến đối của điều kiện sinh thái.

Năm 1964 G uha và Mahesvvari đã tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn cà độc dược; đã m ở ra một hướng nghiên cứu mới Kỳ thuật nuôi cấy bao phấn đã được nhiều nước sử dụng, đặc biệt là Trung quốc, Pháp ứng dụng trên nhiều đối tượng khác nhau như lúa Người ta đã nhận được các dòng đom bội hay các dòng đồng hợp tử trong một thời gian ngắn Đ ến nay đã có hàng trăm giống cãy trổng trong đó có cây lúa đựoc tạo ra và đã được đưa vào sản xuất

K ỹ thuật nuôi cấy mô có ý nghĩa đặc biệt trong việc cứu phôi; Đối với những con lai khác loài do tính bất hoà hợp vể tổ chức nên thường bất thụ, và phôi sẽ bị chết non; Băng phương pháp nuôi cấy phôi người ta đã nhận được những cây từ các hợp tử lai này

Phương pháp này rất có ý nghĩa khi tiến hành lai xa khác loài giữa các loài cây trồng với các loai hoang dại, những con lai thường có sức sống cao, chống chịu với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường Ngoài

ra bằng công nghệ nuôi cấy mô các nhà khoa học có thể phá ngủ của một

số cây khó nẩy mầm

Từ năm 1965 - Nickell đã thành công trong việc nuôi cấy các tế bào đơn trong dịch huyền phù của cây đậu trong thời gian dài Năm 1960 Bergman dùng phương pháp lọc dịch huyền phù, được những tế bào đơn độc lập, những tế bào này tiếp tục phân chia, tạo ra mô sẹo ú ng dụng kỹ thuật này Váil và haberlandt (1965) đã nhận được cây thuốc lá hoàn chỉnh

từ các tế bào đơn nuôi cấy

Vào đầu những năm 70 các nhà khoa học Nhật bản Nagata và Tanaka đã tách và nuôi cấy thành công tế bào trần (protoplast) của cây thuốc lá Từ đó m ở ra một lĩnh vực cực kỳ quan trọng trong công nghệ sinh học là lai xa giữa các tế bào soma Bằng phương pháp dung hợp tế bào trần của các loài rất xa nhau Nhờ phương pháp dung hợp tế bào trần người ta có thê chuyển các gen, đoạn gen m ong nuốn từ tế bào này sang tê bào khác Tê bào trần đã trở thành một công cụ không thể thay thế để nghiên cứu vai trò của ADN trong các cơ quan tử và quan hệ giữa chúng với A D N trong nhân

Trong những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần gắn chặt với các nghiên cứu về công nghệ di truyền thực vật Đê chuyển các gen từ tế bào này sang tế bào khác, người ta thường dùng các plasmid của vi khuẩn làm vật chuyển vận; Người ta lắp ghép các gen định chuyển vào plasmid của vi khuẩn và nuôi các ci khuẩn này với mô của cây cần nhận gen Bằng phương pháp này các nhà khoa học đã thành công trong việc chuyển các gen mong muốn vào nhiều cây quan trọng như bông, thuốc lá, dưa chuột

lượng không đầy đủ (Bhojwani và Razdan 1983) Vì vậy người ta thường phải bổ sung vào môi trường một sô vitamin như Thiamin, piridoxin, nicotinic axit, pantotenic axit (vitamin bs); Tuỳ theo giai đoạn, và đôi tượng nuôi cấy.

Vitamin c đôi khi được bổ sung vào môi trường với hàm lượng cao ( 1-lOOmg/l) không có nghĩa là cãy đòi hỏi nhu cầu lớn như vậy, mà nó

có vai trò như một anti-oxitdant có tác dụng bảo vệ các axit amin vitamin

và các thành phán khác trong môi trường cần thiết cho cây khỏi bị huỷ hoại do tác dụng của điểu kiện nuôi cấy (Pierik 1987)

Các axit amin được sử dụng trong môi trường nuôi cấy như một nguồn nitơ hữu cơ, thường bổ sung vào môi trường khi tỷ lệ N O ? /N H 4+

m ất cân bằng Nguồn nitơ hữu cơ được dùng phổ biến nhất là L-glutamin, mặc dù asparagin cũng có thê được sử dụng (Pierik 1987) Các chất điều hoà sinh trưởng là thành phần quan trọng nhâ't trong môi trường nuôi cấy mô- tế bào, được dùng phổ biến là các nhóm chất auxin và xitokinin Nhờ

có các chất này, các nhà khoa học có thê chủ động điều khiển các quá trình phát sinh, phát triển trong mô nuôi cấy invitro

Người ta thấy răng auxin thường có tác dụng kéo dài tế bào làm tăng khả năng phân chia tế bào ( tạo mô sẹo) và tạo các rễ phụ, auxin còn

có tác dụng kích thích sự phát sinh phôi vô tính trong dịch huyền phù tế bào nuôi cấy (Pierik 1987) Tuy nhiên trong một số trường hợp các tê bào trong m ô nuôi cây tự nó có thể sản sinh ra auxin đủ để kích thích sự sinh trưởng của tế bào trong mô mà không cần auxin ngoại sinh Theo Kohlenback (1977) một sô mẫu sau khi nuôi trong trong auxin rồi cấy chuyển sang môi trường không có auxin, thấy chúng vẫn có khả năng tạo

rễ như ở lúa mỳ, cà độc dược (Street^ỌTỌ).

Nhưng trong đại đa số trường hợp quá trình tạo rễ của mẫu nuôi cấy đòi hỏi phải có sự kích hoạt của các auxin có sẵn trong môi trường như ở m ô cẩm chướng ( Bhojwani và Razdan 1983), lúa mỳ ( Street 1979) Môi trường có hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự tạo rễ bất định trong

mô nuôi cấy, trái lại với nồng độ auxin cao, các mô nuôi cấy sẽ không có khả năng tạo rễ, m à chủ yếu tạo ra các mô sẹo ( Street 1979) Nếu trong môi trường không có auxin hoặc với hàm lượng thấp sẽ kích thích m ô phát sinh phôi hoặc cơ quan ( Ammirato 1983) Trong một số trường hợp auxin lại là kích thích tạo chồi như ở cây anh thảo ( Heide 1972), hoa loa kèn, cây lan dạ hương (Pierik( 1979)

Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu thường sử dụng môi trường có các

tổ hợp các chất auxin/ xitokinin cao sẽ kích thích m ô phát triển rễ, trái lại

tý lệ này thấp sẽ gây phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức trung gian mô sẽ phát triển thành mô sẹo Hiện tượng này thường gặp trong nuôi cấy mô thuốc lá (Street,, 1979), đậu hà lan (H arvinder,l990)(8)

Người ta thấy xitokinin tham gia điều hoà sinh trưởng ở tất cả các pha phát triển của cây từ khi hạt bắt đầu nảy mám đến khi cây hoá già ( Heiđe,! 972) Nó kích thích sứ tạo chồi nách bằng việc làm giảm tính trội

5

chồi cao nhất Đặc biệt trong môi trường nuôi cấy rễ củ sâm ks sự có m ặt của nước dừa đã làm cho tác dụng của các hoimone sinh trưởng tăng lên

rõ rệt Tác dụng của nước dừa có lẽ là do ảnh hưởng của hỗn hợp các chất tham gia điều hoà sinh trướng lên m õ nuôi cấy

2 Điều kiện nuôi cấy ;'

a Ả nh sáng

Ánh sáng có tác dụng mạnh mẽ lên sự phát sinh hình thái trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy invitro Sự phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tô như: chu kỳ, cường độ và thành phần quang phổ của ánh sáng

Một chu kỳ xác định (16 giờ sáng/ 8giờ tối) tương phán với sự nuôi cấy liên tục trong ánh sáng hoặc trong tối hoàn toàn là cần thiết cho

sự tái sinh chổi ở các mẫu mô phong lữ (Ammirato 1986) Chu kỳ chiếu sáng cũng có vai trò quan trọng trong quá trình tạo hoa và tạo củ trong nuôi cây invitro Sự có mặt của ánh sáng hay khồng cũng ánh hưởng mạnh

mẽ lên sự phát sinh và phát triển của phôi sôma Nuôi cấy hoàn toàn trong tối đả làm giám thấp tần sô biến dị của phôi cây cà rốt 0 cà rốt và cây cần nước nuôi trong tối sẽ làm phôi bị vàng úa, trái lại trong ánh sáng, phôi sôm a của chúng sẽ tái sinh cây hoàn chỉnh( Am mirato 1986)

Ảnh hưởng của ánh sáng đơn sắc lên sự phát sinh hình thái cũng được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu; người ta thấy rằng ánh sáng đỏ

có tác dụng kích thích sự tạo chồi phụ ở mô cây hướng dương, cây tùng núi cao, rau cải(Pierik 1987) Ánh sáng xanh da trời có ảnh hưởng tốt lên

sự sinh trưởng của m ô sẹo cây Pelargonium; ánh sáng tím kích thích sự tạo chồi phụ ở m ô sẹo thuốc lá; trái lại ánh sáng đỏ gây tạo rễ phụ Ánh sáng đỏ cũng kích thích sự tạo rễ phụ ở m ô cây đỗ quyên Ánh sáng trắng (đa sắc) thường ức ch ế tạo rễ phụ và kích thích tạo chồi phụ, ánh sáng đỏ

và hồng ngoại có vai trò quan trọng trong sự tạo chồi và rễ phụ( Pierik 1987)

Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng mạnh mẽ lên sự phát triển của

mô nuôi cấy; cường độ chiếu sáng cao thì sẽ kích thích sự tạo m ô sẹo, cương độ ánh sáng thấp sẽ kích thích sự tạo chồi (Ammirato 1986)

b N h iệt độ

Tuỳ thuộc vào xuất sứ của loài cây mà người ta điều chỉnh nhiệt

độ phòng nuôi sao cho thích hợp; Các cây vùng ôn đới thường cần nhiệt

độ thấp hơn các cây xuất sứ từ vùng nhiêt đới Trong nuôi cấy mô tế bào thì việc sử lý nhiệt độ vào các mẫu trước khi nuôi cấy cũng rất quan trọng Nếu sơ bộ sử lý bao phấn trước khi nuôi cấy ở nhiệt độ lạnh hoặc là nóng cũng tăng tần số hạt phấn tạo mô sẹo hoặc phát triển thành cây( Ammirato 1986) Nhiệt độ lạnh cũng được sử dụng trong quá trình đặc biệt như tạo chổi, hoa, phá ngủ và nảy mầm của hạt( Pierik 1987) hoặc cho nhu cầu lạnh của phôi sôma được tạo ra trong môi trường invitro( Ammirato 1986)

Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng bao phấn con lai F1 của tổ hợp lúa lai o Peiai 64S X 0*1225 để thu nhận các dòng TGM S thuần chủng mới.

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u (í

1 Xử lý mẫu vật í '

Các mẫu vật được đưa vào nuôi cấy đều được rửa sạch bằng nước cất, khử trùng sơ bộ bằng cồn 75% trong vòng một phút, tiếp theo khử trùng bằng H20 2 iO% trong 15-20 phút hay bằng HgC12 0,1% trong vòng 3-5 phút Sau đó mẫu được rửa sạch bằng nước cất vô trùng và đưa vào môi trường nuôi cấy thích hợp

2 Môi trường nuôi cấy ó

Môi trường gốc dùng cho các thí nghiệm là môi trường thạch rắn (0,8% thạch) được chuẩn bị theo công thức của Murashige-Skoog (1962) viét tắt là MS và môi trường LS (Linsmaier-Skôg 1965)

Trong đó thành phần nồng độ các chất phytohormone thuộc nhóm auxin và xitokinin và các chất phụ gia được thay đôỉ tuỳ vào mục đích của từng bước thí nghiệm

3 Điều kiện nuôi cấy é

Nhiệt độ trong phòng nuôi cấy luôn được duy trì khoảng từ 22- 25°c, chiếu sáng 10 giờ/ngày đêm bằng hệ thống giàn đèn neon Riêng việc nuôi cấy tạo mô sẹo được nuôi trong buồng tối

9

Phần III

K ẾT Q U Ả VÀ T H Ả O LUẬN

I KHẢ NĂNG TẠO MỎ SẸO c

1 T ạ o m ỏ sẹo từ phôi chín và phói n o n ^

Chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên khả năng tạo mô sẹo ở phôi chínỊHạt gạo) và phôi non (hạt đang còn sữa) của các dòng VN.01 ; 40s có chứa gen TGMS gây bất dục đực nhạy cảm với nhiệt độ Các hạt gạo và phôi non đã vô trùng của hai dòng lúa trên được cấy lên môi trường

MS có liểu lượng 2,4D thay đổi từ : 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0mg/l Mẫu vật được nuôi trong phòng tối cho các tế bào phân biệt tạo mô sẹo

Sau 3 tuần theo dõi, kết quả thu được trình bày ở bảng 1 Qua bảng này ta thấy 2,4D có ánh hướng rõ rệt lê khá năng tạo mô sẹo của cả 2 dòng lúa nuôi cấy Khi liều lượng 2,4D tăng lên từ 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0mg/l tương ứng : 83,33% và 87,67% Riêng đối với phôi non chúng tôi chi thử nghiệm được đối với dòng VN.01 và thấy rằng tỷ lệ tạo mô sẹo rất cao : 91.33%

2 T ạo mò sẹo từ các lớp mỏng tế b ‘ảO ff

Sau khi xác định ở nồng độ 2mg/l 2,4D cho hiệu quá tạo m ô sẹo cao nhất, chúng tôi sử dụng kết quả này vào các thí nghiệm tiếp theo Chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy lớp m ỏng tế bào của các dòng lúa TGMS : VN.01 ; 8S; 9s và dòng Zs.67A chứa gen CMS (bất dục đực do tế bào chất gây nên) Các cây mạ vô trùng của các dòng này có tuổi từ 3-51á thật được cắt thành những lát mỏng (0,5-0,7m m) cấy lên môi trường MS có bổ sung 2mg/l 2,4D Các mẫu vât được nuôi trong phòng tối đế cho chúng tạo mô sẹo

Trong thí nghiêm này chúng tôi muốn tìm hiểu ảnh hưởng của 2,4D lên khả năng tạo mô sẹo ở các tuổi m ạ khác nhau, thấy rằng ở tất cả các

dòng đã nghiên cứu thì ở tuổi mạ 3 lá thật cho tỷ lệ tạo mô sẹo cao nhất

tương ứng 37,5 ; 34,6 ; 28,2 ; 30% Ở tuổi m ạ 5 lá thật là thấp nhất (31,1 ; 30,0 ; 26,3 ; 30,3%) Điều đó nói lên rằng các cơ thê càng trẻ càng nhạy cảm với các yếu tố môi trường (Xem kết quả ở bảng 2)

3 Tạo mò sẹo từ bao phán F1 của tổ hợp lai o Peiai 64s X ( ý 1225/5»

Chúng tôi còn tiến hành nuôi cấy bao phấn của con lai F! của tổ hợp lúa lai Ọ Peiai 60s X o 1225 nhằm mục đích thu nhận các dòng đổng hợp

tử chứa gen TGMS mới Các bao phấn cũng được nuôi trên môi trường MS

có bố sung 2mg/l 2,4D ; sau 3 tuần nuôi trong tối, có 36,6% bao phấn tạo

m ô sẹo

Mô sẹo của tất cả các thí nghiệm trên đểu có đặc điểm là chííng gồm 2 loại mô: Mô sẹo cứng và mô sẹo xốp (Embryogenic callus và Non- Embryogenic callus) Mô sẹo cứng có màu trắng, sữa, khô, khi cấv chuyển lên môi trường tái sinh, nó dính chặt trên mặt thạch Còn mô xốp

Chúng tôi nghiên cứu anh hường của các tỷ lệ Xitokinin/auxin lên khá năng tái sinh chổi Các khối m ô sẹo có kích thước bằng nhau được cấy lên các môi trường MS2, MS3, MS4 (xem phụ lục) có bổ sung nồng

độ xitokinin/auxin tương ứng với các tỷ lệ sau : 2/1 ; 2,5/1 ; 12/1 Sau đó các m ẫu được nuôi trong phòng nuôi

Sau 3 tuần nuôi cấy, kết quá thu được trình bày ở báng 3:

Hảng 3 : Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khá năng tái sinh cây từ

Sô mô sẹo đemcấy

Tỷ lệ tái sinh(%)

Sô mô sẹo đem cấy

Tỷ lệ tái sinh(%)

Số m ô sẹo đem cấy

Tỷ lệ tái sinh(%)

Các dòng VN.01, 8S tỷ lệ tái sinh ở tất cả các môi trường chúng đềuxấp xỉ bằng nhau, đều cao hơn tỷ lê tái sinh chổi của 2 dòng kia 9S và Zs.97A trong các môi trường tương ứng

Theo tiến sĩ Hoàng Tuyết Minh cho biết 2 dòng VN.01 và 9 S bản thân chúng có khả năng đẻ nhánh cao Điều đó lý giải về khả năng tái sinh chồi cao trong nuôi cấy chúng

Trong môi trường MS.2 ; MS.3 ; MS.4 có bổ sung nồng độ xitokinin/auxin khác nhau là 2/1 ; 2,25/1 ; 12/1, các tỷ lệ này có ảnh hưởng rõ rệt lên khả năng tái sinh chổi của các dòng

Môi trường MS.3 (2,25 xitokinin/lauxin) cho tỷ lệ tái sinh chổi tốt nhất đối với tất cả các dòng lúa nghiên cứu Còn môi trường MS.2 ; MS.4 cho tỷ lệ tái sinh chồi thấp hơn nhiều Có lẽ trong các môi trường này nồng độ xitokinin quá cao ở môi trường MS.4 và quá thấp ở môi trường MS.2 không thích hợp cho việc tái sinh chồi Vì vậy việc tìm ra tỷ lệ xitokinin trên auxin thích hợp cho việc tái sinh, nhân chồi là hết sức cần thiết