Nhiệm vụ nghiên cứu
Trong luận văn này, chúng tôi có nhiệm vụ :
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất từ quả cây thảo đậu (Alpinia kadsumadai Hayt)
- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất quả cây thảo đậu (Alpinia kadsumadai Hayt).
Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tƣợng nghiên cứu là dịch chiết quả cây thảo đậu (Alpinia kadsumadai
Hayt) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt Nam
TỔNG QUAN
Khái quát về chi Alpinia
Các cây thuộc chi Alpinia (chi Riềng) thuộc loại thân thảo thẳng, cao từ
Thân rễ của cây dài từ 0,4 đến 2,5 mét, khỏe mạnh, bò dưới đất Lá hình mác hẹp hoặc hình xoan, thường có mũi nhọn, không có cuống hoặc cuống ngắn, bẹ lá và lưỡi bẹ cuộn kín và dài Cụm hoa dạng bông hoặc hình trụ, các nhánh gần như không có hoặc rất ngắn, mỗi nhánh mang một hoa, ít khi có nhánh nhỏ Lá bắc của các nhành lớn như lá bắc con của hoa, hình ống, lồng vào nhau, có dạng phẳng hoặc lõm, thường lớn hơn lá bắc bọc ngoài, cuống hoa thường ngắn hơn lá bắc của hoa Hoa tạo thành tràng nhiều màu sắc kết hợp trắng, đỏ hoặc hồng; đài hoa hình ống, tràng hoa dạng ống ngắn, các thùy hoa hình trứng, lõm, kiểu tù Bao phấn hình thuẫn và trung đới dày có mào; nhị hai, ngắn, hình răng hoặc hình dùi, lồng vào giữa chỉ nhị và cách môi hoặc không cách môi, dài hơn hoặc ngắn hơn nhị Các thuỳ của tràng hoa thường chia thành ba, rất lõm, có dạng thuyền Hoa có hương thơm nhẹ hơn so với các chi khác trong họ Gừng (Zingiberaceae) Noãn sào có số lượng không xác định và quả gồm một quả mọng khô, mở đều hoặc không mở, chứa nhiều hạt, có ba góc do sức ép, được bao bọc bởi một lớp áo hạt.
Thân rễ của chi Alpinia có khả năng sinh trưởng nhanh, từ một chồi giống ban đầu có thể phân nhánh, đâm chồi và tăng sinh khối để phát triển thành một bụi lớn chỉ trong vài năm Ở Việt Nam, chi Alpinia rất phong phú và sinh trưởng chủ yếu trong các khu rừng núi trên toàn bộ các tỉnh từ Bắc vào Nam Một số loài Alpinia được coi là đặc hữu, như Alpinia phuthoensis Gagnep và Alpinia tonkinensis Gagnep., góp phần làm phong phú hệ thực vật của khu vực.
Chi Alpinia (chi Riềng) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), là một trong những chi lớn có nhiều loài phân bố rộng rãi Theo Phạm Hoàng Hộ, Việt Nam hiện có hơn 20 loài Alpinia khác nhau, đa dạng về chủng loại và đặc điểm sinh học Các loài này được liệt kê đầy đủ trong Bảng 1.1, phản ánh sự phong phú của chi Alpinia trong hệ thực vật Việt Nam.
Bảng 1.1: Các loài Alpinia ở Việt Nam [1-4]
STT Tên khoa học Tên Việt Nam Vùng phân bố
Riềng bẹ, Riềng dài lông mép
Tuyên Quang, Ninh Binh, Lâm Đồng
Riềng mép ngắn, Riềng lưỡi ngắn Cả nước
Kontum, Lâm Đồng, Lạng Sơn,
Hà Tây, Hà Tĩnh, Thừa Thiên -Huế
Griff Riềng rừng Đồng Nai
Schum Riềng Ganepain Hà Nam Ninh
Willd Riềng nếp Các tỉnh miền Bắc
(Lour.) Horan Sẹ, Mè tré
Cao Bằng, Lạng Sơn, Lai Châu, Vĩnh Phúc
Schum Riềng Henry Hà Nam Ninh
Gagnep Riềng Lào, Kiền Hà Tiên, Quảng Trị
(Burm F.) Roscoe Riềng Malacca Hà Giang, Hà Tây,
11 Alpinia mutica Roxb Riềng không múi Sài Gòn, Đồng Lai
Hance Riềng, Riềng thuốc Các tỉnh phía Bắc
Gagnep Riềng Phú Thọ Phú Thọ
(Vieill) K Schum Riềng tía Sài Gòn
K Schum Riềng Xiêm Bình Trị Thiên, Bà
Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình
17 Alpinia venlutina Ridl Riềng lông
(Pers.), Alpinia speciosa (Wall.) Schum Burtt et Sm., Alpinia nutans Roscoe
Các tỉnh miền Bắc, Thừa Thiên-Huế,
Các cây thuộc chi Alpinia trong dân gian không chỉ là gia vị quen thuộc mà còn được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian để điều trị các bệnh như đau dạ dày, đau bụng, đầy hơi, khó tiêu, tiêu chảy, sốt rét, sốt nóng, nôn mửa và giúp làm ấm tì vị, kích thích tiêu hoá Ngoài ra, chúng còn được dùng để chữa các vết thương, vết loét, mang lại hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tật và tăng cường sức khỏe.
Các loài Alpinia đƣợc sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền Việt Nam là Alpinia bracteata Roxb., Alpinia breviligulata Gagnep., Alpinia chinensis
(Retz.) Roscoe., Alpinia conchigera Griff., Alpinia galanga (L.) Willd., Alpinia globosa (Lour.) Horan., Alpinia malaccensis (Burm F.) Roscoe., Alpinia officinarum Hance., Alpinia zerumbet (Pers.) Burtt et Sm., Alpinia oxyphylla
Miq., Alpinia kadsumadai Hayt., Alpinia japonica Miq [3]
1.1.3 Thành phần hóa học 1.1.3.1 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic từ Alpinia officinarum Hance
Seven compounds have been isolated from Alpinia officinarum Hance, including β-sitoterol, 1,7-diphenyl-5-ol-3-hepton, 1-phenyl-7-(3'-methoxy-4'-hydroxy)phenyl-5-ol-3-heptanon, glandin, kaempferol-4'-methylether, and 3,4-dihydroxybenzoic acid Notably, 3,4-dihydroxybenzoic acid was identified for the first time from Alpinia officinarum, marking a significant discovery in the plant's phytochemical profile.
A new compound, 7-hydroxyphenyl-5-ol-3-hepton, has been identified alongside 1,7-diphenyl-3,5-heptandiol-phenyl-7-(3′-methoxyl-4′-hydroxyl) phenyl-3,5-heptadiol, both derived from the reduction of 1,7-diphenyl-5-ol-3-heptanon and 1-phenyl-7-(3′-methoxyl-4′-hydroxyl) phenyl-5-ol-3-heptanon This chemical transformation enhances our understanding of these compounds' synthesis pathways, which are significant in pharmaceutical and chemical research.
(1) Diarylheptanoit 7-(4'-hydroxy-3'-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3 - on (5) (HMP) là một chất hóa học có nguồn gốc thực vật đƣợc tìm thấy trong
Alpinia officinarum có tính chất chống viêm được nghiên cứu trên dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 và các tế bào đơn nhân máu người ngoại vi (PBMC) trong môi trường in vitro Các hợp chất từ loại cây này cho thấy khả năng giảm viêm hiệu quả, góp phần tiềm năng trong điều trị các bệnh viêm nhiễm Nghiên cứu này giúp làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng của Alpinia officinarum trong y học, đặc biệt trong việc phát triển các thành phần tự nhiên chống viêm an toàn và hiệu quả.
Hoạt tính nhị chức của diarylheptanoit 5-hydroxy-7-(4''-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon (6) được phân lập từ cây Alpinia officinarum, cho thấy khả năng ức chế và diệt khuẩn Escherichia coli (EPEC) Đồng thời, hợp chất này còn hiệu quả trong việc ức chế quá trình viêm do lipopolysaccharid của EPEC gây ra trong các tế bào máu đơn nhân người Các phân tử có hoạt tính nhị chức như vậy có tiềm năng trở thành các chất điều trị mới cho các bệnh nhiễm khuẩn.
Research has identified that an 80% aceton-water extract from the rhizome of Alpinia officinarum effectively inhibits melanogenesis in 4A5-B16 tumor cells Among the isolated compounds, four diarylheptanoids—namely 5-hydroxy-1,7-diphenyl-3-heptanon, 7-(3'',4''-methoxyphenyl)-1-phenylhept-4-en-3-one, 5-hydroxy-7-(4''-hydroxy-3''-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon, and 3,5-dihydroxy-1,7-diphenylheptane—show potential as natural agents for skin pigmentation regulation.
Flavonols kaempferol and galangin have been shown to inhibit melanogenesis with IC50 values ranging from 10 to 48 μM These compounds possess specific structural features that are essential for their bioactivity, and their inhibitory mechanisms have been thoroughly elucidated, highlighting their potential as effective agents in skin pigmentation regulation.
Phân tách theo định hướng thử nghiệm sinh học phần chiết metanol có hoạt tính gây độc tế bào từ thân rễ Alpinia officinarum Hance đã phân lập đƣợc
2 diarylheptanoit mới alpinoid D (13) và E (14), cùng với 15 diarylheptanoit đã
Các diarylheptanoit đã được đánh giá về hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào u nguyên bào thần kinh người IMR-32, cho thấy các hợp chất này thể hiện hoạt tính mạnh nhất với các giá trị IC50 lần lượt là 0,83, 0,23 và 0,11 ìM, khẳng định tiềm năng của chúng trong nghiên cứu điều trị ung thư thần kinh.
Hai diarylheptanoit mới, (5S)-5-hydroxy-7-(3,4-dihyđroxyphenyl)-1- phenyl-3-heptanon (15) và (5R)-5-hydroxy-7-(3-methoxy-4,5-dihydroxyphe- nyl)-1-phenyl-3-heptanon (16), cùng với hai chất tương tự đã biết khác (17 và
Hợp chất 18, đã được phân lập từ thân rễ của cây Alpinia officinarum, thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào như HepG2, MCF-7 và SF-268 Trong khi đó, các hợp chất 15-17 không cho thấy hoạt tính đáng kể, cho thấy hợp chất 18 có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực chống ung thư.
(18) Phân tách định hướng bằng thử nghiệm sinh học phần chiết ete của
Alpinia officinarum Hance đã phân lập đƣợc 2 hợp chất mới, 6-hydroxy-1,7- diphenyl-4-en-3-hep-tanon (19) và 6-(2-hydroxyphenyl)-4-methoxy-2-pyron
(20) và 3 hợp chất đã biết, 1,7-diphenyl-4-en-3-heptanon (21), 1,7-diphenyl-5-
Nghiên cứu cho thấy các diaryheptanoit 19, 21 và 22, bao gồm 10 methoxy-3-heptanon và apigenin, đều thể hiện hoạt tính ức chế mạnh đối với hoạt tính liên kết thụ cảm PAF (yếu tố hoạt hoá tiểu cầu), với giá trị IC50 lần lượt là 1,3, 5,0 và 1,6 µM Các kết quả này cho thấy các diaryheptanoit là một lớp chất đối kháng PAF mới và tiềm năng trong y học, mở ra cơ hội phát triển các hợp chất chống viêm, chống huyết khối và các bệnh liên quan đến PAF.
A novel diarylheptanoit has been isolated from the rhizome of Alpinia officinarum, alongside five previously known diarylheptanoit compounds The structure of this new compound has been identified as trans,trans-1(3′-methoxy-4′-hydroxyphenyl)-7-phenyl-5-ol-4,6-dien-3-heptanon This discovery adds valuable insights into the chemical constituents of Alpinia officinarum and highlights its potential in pharmacological research.
Trong nghiên cứu thành phần glycozit từ thân rễ Alpinia officinarum
Hance, a glycoside ester, along with a known compound, n-butyl-β-D-fructopyranoside (26), has been successfully isolated Alpinoside A (25) is a newly identified compound, while n-butyl-β-D-fructopyranoside (26) was first isolated from the Alpinia genus This discovery highlights the ongoing research and potential of natural products within the Alpinia plants.
Các hợp chất flavonoit
Flavonoit là nhóm các hợp chất tự nhiên phong phú, có bộ khung cacbon C6-C3-C6 giống như flavon, thường xuất hiện trong các loài thực vật Chúng thường có màu vàng, xuất phát từ từ "flavus" nghĩa là màu vàng, nhưng cũng có một số hợp chất màu khác phù hợp với khung cơ bản flavonoit Nhóm hợp chất này không chỉ đa dạng về màu sắc mà còn đóng vai trò quan trọng trong sinh trưởng và phát triển của thực vật.
Flavon có cấu trúc gồm hai vòng thơm và một dị vòng pyran Trong đó, vòng thơm bên trái được gọi là vòng A, còn vòng thơm bên phải gọi là vòng B Đặc biệt, vòng thơm B của flavon liên kết với vòng pyran tại vị trí số 2 Tuy nhiên, khi vòng thơm B liên kết với vòng pyran tại vị trí số 3, hợp chất đó được gọi là isoflavon.
Tùy thuộc vào cấu tạo của phần mạch 3C trong bộ khung C 6 - C 3 - C 6 , flavonoit đƣợc chia thành các nhóm khác nhau:
1.2.1 Các hợp chất kiểu chalcon Đây là loại flavonoit có cấu tạo ở mạch 3C trong cấu trúc C 6 - C 3 - C 6 ở dạng mạch hở, chúng là những hợp chất có màu, chỉ tồn tại với lường ít trong thực vật Cấu tạo của một số hợp chất chalcon đƣợc trình bày nhƣ sau:
1.2.2 Các hợp chất kiểu flavon và flavonol
Flavon và iso-flavon đã được đề cập ở phần trước, trong khi flavonol là loại flavonoid chứa nhóm hyđroxyl trong dị vòng pyran Cấu tạo của các hợp chất flavon và flavonol thể hiện rõ đặc điểm cấu trúc chung của chúng, giúp nhận diện và phân loại các hợp chất này trong nhóm flavonoid Các hợp chất flavon và flavonol đóng vai trò quan trọng trong thực phẩm và dược phẩm nhờ tính chống oxi hóa và lợi ích sức khỏe, theo đó cấu trúc của chúng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học.
1.2.3 Các hợp chất kiểu flavonon và dihydro flavonol
Flavonon có cấu trúc tương tự flavon nhưng đặc trưng bởi vòng pyran không chứa liên kết đôi, trong đó vị trí số 3 của vòng pyran có thể gắn nhóm hydroxyl Khi hợp chất này có nhóm hydroxyl tại vị trí số 3, chúng được gọi là dihydroflavonol Cấu tạo của hợp chất loại này gồm vòng pyran và nhóm chức hydroxyl, đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh học và tính chất hóa học của chúng.
1.2.4 Các hợp chất flavan – 3 – ol
Flavan-3-ol là một loại polyphenol chứa vòng pyran có nhóm hydroxyl ở vị trí thứ 3, không có nhóm C=O ở vị trí thứ 4, giúp tăng cường hoạt tính chống oxy hóa cho cơ thể Một ví dụ điển hình của flavan-3-ol là catechin, một hợp chất nổi bật trong các loại trà và thực phẩm tự nhiên Cấu trúc của các hợp chất flavan-3-ol đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tác dụng sinh học và lợi ích sức khỏe của chúng.
Nhiều loài cây có lá, vỏ hoặc gỗ chứa các hợp chất không màu như leucoantoxyanin hoặc leucoantoxyanidin, khi tác dụng với dung dịch vô cơ sẽ chuyển thành màu đỏ hoặc màu giống antoxyanidin Các hợp chất này có cấu tạo đặc biệt, đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện và phân loại các loại cây có chứa hợp chất hữu cơ màu sắc này Hiểu biết về hợp chất leucoantoxyanin giúp các nhà nghiên cứu và các lĩnh vực liên quan nâng cao kiến thức về thành phần hoá học của thực vật.
Cây nghiên cứu
Còn gọi là thảo khấu nhân, ngẫu tử Tên khoa học : Alpinia kadsumadai Hayt Thuộc họ Gừng (Zingiberaceae)
Thảo đậu khấu (Semen Alpinia kadsumadai là hạt phơi hay sấy khô lấy từ quả gần chín của cây thảo đậu (Alpinia kadsumadai )
Thảo đậu khấu là một loại cỏ sống lâu năm, cao 1-2 m Thân rễ màu đỏ
Lá mọc so le, hình mác, dài từ 30 đến 55 cm, rộng 2-9 cm Cụm hoa dạng chùm dài khoảng 30 cm, nằm ở đầu cành, với hoa màu trắng, hình ống dài 1,2 cm và có đốm màu tím đỏ nhạt bên trong Quả mọc dạng hình cầu, đường kính khoảng 3,5 cm, còn đài tồn tại, và khi chín có màu vàng, giúp nhận diện dễ dàng loại cây này.
Có rất nhiều nghiên cứu khoa học đã đƣợc thực hiện với các loài Alpinia
Chi Alpinia thuộc họ Zingiberaceae đã được nhóm nghiên cứu của Phan Minh Giang và Phan Tống Sơn tổng kết trong một bài báo khoa học, trình bày tổng quan về kết quả nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi này trong giai đoạn 1999-2009 Các nghiên cứu trong thời gian này đã mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng của chi Alpinia trong lĩnh vực y học cổ truyền và dược phẩm, đồng thời góp phần mở rộng kiến thức về thành phần hoạt chất có lợi trong các loài trong chi Những phát hiện mới về hoạt tính sinh học của các hợp chất chiết xuất từ Alpinia hứa hẹn mang lại nhiều triển vọng trong việc phát triển các sản phẩm điều trị tự nhiên Tổng quan này là tài liệu tham khảo quan trọng giúp định hướng nghiên cứu trong tương lai về chi Alpinia và các ứng dụng của nó trong y học hiện đại.
1.3.2 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất phenolic từ Alpinia kadsumadai
Các hợp chất ba chất liên hợp monoterpen-chalcon, bao gồm rubrain (50), isorubrain (51) và sumadain C (52), đã được phân lập từ hạt của cây Alpinia kadsumadai Cấu trúc và cấu hình của các hợp chất này đã được xác định chính xác bằng phương pháp phổ NMR và quang phổ X-ray Các nghiên cứu đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này trên các dòng tế bào HepG2, MCF-7 và MAD-MB-435, trong đó 5-hydroxy-7-(4''-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1-phenyl-3-heptanon cho thấy hoạt tính gây độc tế bào rõ ràng, tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu về thuốc chống ung thư.
(51) Tám hợp chất đã đƣợc phân lập từ phần chiết etanol của Alpinia kadsumadai Hayata, 1,7-dipheny-5-hydroxy-4,6-heptadien-3-on (52), 1,7- diphenyl-1,4,6-heptadien -3-on (53), pinocembrin, cardamomin (54), alpinetin
(55), 7,4-dihydroxy-5-methoxy flavanon (56) và β-sitosterol (57) Trong đó 2 hợp chất đầu và (58) đã đƣợc phân lập lần đầu tiên từ loài thực vật này [22]
(58) Tổng kết lại, các hợp chất phenolic mới vẫn tiếp tục đƣợc phân lập từ các loài
Alpinia officinarum, Alpinia galanga, Alpinia kadsumadai và Alpinia oxyphylla
Các hợp chất này cho một tỷ lệ cao các hoạt chất chống viêm, kháng virut và chống ung thƣ
PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
Phương pháp nghiên cứu
Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm phù hợp trong năm để đảm bảo chất lượng Sau khi thu hái, mẫu tươi được rửa sạch, để ở nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở nhiệt độ 40°C nhằm giữ gìn dược tính Tiếp đến, mẫu được xử lý bằng phương pháp chiết xuất chọn lọc sử dụng các dung môi phù hợp nhằm thu thập các hợp chất hoạt tính phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách cũng nhƣ phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230 - 400/mesh
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích đƣợc tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F 254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm
Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn
2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ khối lƣợng (EI - MS)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR
Hoá chất, dụng cụ và thiết bị
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều cần sử dụng loại tinh khiết (pure) để đảm bảo độ chính xác trong quá trình phân tích Khi thực hiện các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột, thường sử dụng dung môi tinh khiết phân tích (PA) để đạt hiệu quả tối ưu Các loại dung môi phổ biến được sử dụng gồm hexan, metanol, butanol, etylaxetat, axeton và nước cất, đảm bảo tính sạch và phù hợp cho các phương pháp phân tích hóa học phức tạp.
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3
Phổ khối lƣợng EI-MS đo trên máy LC-MS-Trap-00127
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13 C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC đƣợc đo trên máy Bruker 125 MHz.
Nghiên cứu các hợp chất
2.3.1 Phân lập các hợp chất
Mẫu quả cây thảo đậu (Aplinia kadsumadai Hayt) thu hái tại Quỳ Hợp, Nghệ An vào tháng 4 năm 2011 và được TS Trần Huy Thái từ Viện Sinh Thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam xác định Tiêu bản mẫu vật hiện đang được lưu giữ tại khoa Sinh, Trường Đại học Vinh, góp phần phục vụ nghiên cứu và nhận diện loài thực vật này.
Quả cây thảo đậu (10,8 kg) được phơi khô, xay nhỏ rồi ngâm chiết với methanol tại phòng thí nghiệm trong vòng 7 ngày Dịch chiết sau đó được cất để loại bỏ dung môi, thu được 986g cao methanol Tiếp theo, cao methanol được phân bố trong nước và lắc lần lượt với các dung môi hữu cơ như hexan, etyl axetat và butanol để tách các hợp chất Quá trình cất loại dung môi cho kết quả là thu được các cặn dịch chiết tương ứng là 138g, 269g và 192g.
Cao etyl axetat được phân tách trên cột silica gel với dung môi rửa giải là hexan và axeton theo các tỷ lệ khác nhau như 100:0, 25:1, 15:1, 9:1, 4:1, và 2:1, tạo thành 12 phân đoạn chính Trong đó, phân đoạn số 6 được phân tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi hexan và axeton theo tỷ lệ 19:1, thu về 62 mg chất A Ngoài ra, phân đoạn số 10 cũng được tách lại bằng sắc ký cột nhỏ với dung môi hexan và axeton theo tỷ lệ 9:1, thu về 50 mg chất B.
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập hợp chất trong quả cây thảo đậu
2.3.2 Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập
Quả cây thảo đậu (10,8kg)
- Chiết lần lƣợt với hexan, etyl axetat, butanol
Sắc kí cột Hexan: axeton ( 15:1)
- Sắc kí cột hexan:axeton (19:1)
- Sắc kí cột hexan:axeton (9:1)
Hợp chất A: Tinh thể màu vàng, đ.n.c 112-113 0 C
1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) (ppm): δ 14,38 (1H, s, HO-2’), 7,79 (2H, s, H- và H-), 7,57 (2H, d, J=8,5 Hz, H-2 và H-6), 6,92 (2H, d, J=8,5 Hz, H-3 và H-5), 6,11 (1H, d, J=2,0 Hz, H-3’), 5,96 (1H, d, J=2,5 Hz, H-5’), 3,91 (3H, s, 6’-OCH 3 ), 3,85 (3H, s,-OCH 3 ), 3,83 (3H, s, 4’-OCH 3 )
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) (ppm): xem bảng 3.1
Hợp chất B: Tinh thể hình kim màu trắng, đ.n.c 245 o C
IR max KBr cm -1 : 3455 (OH), 1628, 1521, 1259, 1144, 1091, 795
1 H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) (ppm): δ 6,88(1H, d, J=1,5 Hz, H-2’),
6,67 (cụm pic, H-6’), 6,63 (cụm pic, H-5’), 5,88 (1H, d, J= 4 Hz, H-8), 5,71
13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD) (ppm): xem bảng 3.2.
KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN
Phân lập
Từ dịch chiết etyl axetat của quả cây thảo đậu, các phương pháp sắc ký cột trên silicagel đã phân lập thành công 2 hợp chất flavonoit A và B Cấu trúc của chúng được xác định chính xác nhờ các phương pháp phổ khối lượng EI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HMBC và HSQC Những phát hiện này góp phần mở rộng kiến thức về thành phần hóa học của cây thảo đậu và tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm và y học cổ truyền.
Xác định cấu trúc hợp chất A
Hợp chất A là tinh thể màu vàng với nhiệt độ nóng chảy từ 112°C đến 113°C Phổ khối lượng EI-MS của hợp chất cho thấy, đỉnh ion phân tử proton hóa ở m/z 315 [M+H]+, phù hợp với công thức phân tử C18H18O5.
Phổ 1 H-NMR 7,79ppm (2H, s, H- và H-), 7,57 ppm(2H, d, J=8,5 Hz,
H-2 và H-6), 6,92ppm (2H, d, J=8,5 Hz, H-3 và H-5), 6,11ppm (1H, d, J=2,0
Hz, H-3’), 5,96ppm (1H, d, J=2,5 Hz, H-5’), các tín hiệu ở H 3,91, 3,85 và 3,83 ppm là của 3 nhóm OCH 3 Phổ 1 H-NMR cho thấy 2 tín hiệu tương tác doublet ở
6,11 (1H, d, J = 2,0 Hz) và 5,96 (1H, d, J = 2,5 Hz) đƣợc thừa nhận là H-3’ và
Trong phổ 1H-NMR, tín hiệu kiểu A 2 B 2 xuất hiện tại δ 7,57 ppm (2H, d, J = 8,5 Hz) và δ 6,92 ppm (2H, d, J = 8,5 Hz), được gán cho H-2, -6 và H-3, -5, phản ánh cấu trúc aromatic của hợp chất Ngoài ra, phổ còn cho thấy một tín hiệu singlet rõ nét của một proton nằm trong nhóm hydroxy, hình thành liên kết cầu hydro nội phân tử với nhóm carboxyl, với δ H ở mức 14,38 ppm.
Phổ 13 C-NMR cho thấy tín hiệu 18 cacbon, trong đó có các tín hiệu CH của vòng C bị chập với cường độ cao gấp đôi các tín hiệu CH khác, tín hiệu của
3 nhóm metoxy ( 55,4, 55,6 và 56,8 ppm), hai nhóm CH ( 125,2 và 145,2) tại hai vi trí và và nhóm cacbonyl tại ’ ( 192,6) rất điển hình của một
27 chalcon Vị trí còn lại của 3 nhóm metoxy tại các vị trí 4, 4 ’ và 6 ’ đƣợc xác định chính xác nhờ phân tích phổ 2D (HSQC và HMBC)
Bảng 3.1: Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất A
C 13 C-NMR C (ppm) C * (ppm) theo tài liệu [16,17]
Dựa trên dữ liệu phổ EI-MS, ¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và so sánh với tài liệu tham khảo [10, 17], cấu trúc của chất A được xác định là 2'-hydroxy-4,4',6'-trimetoxy chalcon (flavokawain A) Chất này đã được phát hiện trong các loài Piper methysticum (kava), Dahlia tenuicaulis và nhựa của Xanthorrhoea preissi, và có khả năng ức chế tế bào ung thư bàng quang [11].
Hình 3.1: Phổ khối lƣợng EI-MS (negative) của hợp chất A
Hình 3.2: Phổ khối lƣợng EI-MS (positive) của hợp chất A
Hình 3.3: Phổ 1 H-NMR của hợp chất A
Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của hợp chất A
Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất A
Hình 3.6: Phổ 13 C-NMR của hợp chất A
Hình 3.7: Phổ DEPT của hợp chất A
Hình 3.8: Phổ DEPT của hợp chất A
Hình 3.9: Phổ HMBC của hợp chất A
Hình 3.10: Phổ HMBC của hợp chất A
Hình 3.10: Phổ HMBC của hợp chất A
Hình 3.11: Phổ HMBC của hợp chất A
Hình 3.12: Phổ HSQBC của hợp chất A
Hình 3.13: Phổ HSQC của hợp chất A
3.3 Xác định cấu trúc của hợp chất B
Hợp chất A là tinh thể màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 245 o C
Phổ khối lƣợng (EI-MS) của hợp chất B cho pic ion phân tử m/z 290
[M] + , ứng với công thức C 15 H 14 O 6 Phổ 13 C-NMR và DEPT của B xuất hiện tín hiệu tương ứng của 15 nguyên tử C thuộc khung flavon (7 nhóm CH, 1 nhóm
Dữ liệu từ phổ H-NMR cho thấy hai tín hiệu tại δ H 5,71 ppm (1H) và 5,88 ppm (1H), cùng với phân tích trong phổ HSQC xác nhận rằng hai nguyên tử H này tương tác với các nguyên tử C có tín hiệu tại δ C 94,07 ppm và 95,07 ppm, chính là H-6 và H-8 của vòng A Ngoài ra, các tín hiệu δ H ở 6,88 ppm, 6,67 ppm và 6,63 ppm thể hiện sự tương tác xa với các tín hiệu của 13 C-NMR tại các điểm δ C phù hợp, giúp xác định cấu trúc vòng và liên kết trong hợp chất.
Dưới đây là những câu phản ánh nội dung chính của đoạn văn, phù hợp với quy tắc SEO và đảm bảo tính mạch lạc: Tín hiệu 144,87 ppm (C-4’) thể hiện các nguyên tử H-2’, H-6’ và H-5’ của vòng B, lần lượt xuất hiện trong phổ NMR Các tín hiệu tại δ H 2,49 ppm và 2,68 ppm tương tác với tín hiệu trên phổ 13C-NMR tại δ C 28,15 ppm, đại diện cho H-4a và H-4b Tín hiệu ở δ H 4,00 ppm và 4,73 ppm phản ánh sự hiện diện của hai nguyên tử H-3 và H-2 Trong phổ HMBC, H-4a cho thấy sự tương tác xa với C-2 ở δ C 79,8 ppm, trong khi H-4a và H-4b tương tác xa với các C có giá trị δ C 98,48 ppm (C-10), còn các tín hiệu H-8, H-6 liên kết với các C có δ C 155,73 ppm và 156,20 ppm, là của C-7 và C-5.
Phổ 13 C-NMR của hợp chất B cho thấy tín hiệu 16 cacbon, trong đó có các tín hiệu cọng hưởng của các nguyên tử cacbon thơm có δ C từ 94,07 đến 156,49 ppm; nguyên tử C của nhóm CH 2 có độ chuyển dịch thấp 28,15 ppm; các nguyên tử C của hai nhóm –CHO- và –CHOH có δ tương ứng 78,03 và 64,89 ppm
Bảng 3.2: Số liệu phổ 13 C-NMR của hợp chất B
C 13 C-NMR C (ppm) C * (ppm) theo tài liệu[ 23]
Dựa trên dữ liệu phân tích phổ EI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và so sánh với tài liệu tham khảo [23], đã xác định cấu trúc của chất B là 3,3’,4’,5,7-flapentol (catechin).
Hình 3.14: Phổ MS của chất B
Hình 3.15: Phổ 1 H-NMR của chất B
Hình 3.16: Phổ 1 H-NMR của chất B
Hình 3.17: Phổ 13 C-NMR của chất B
Hình 3.18: Phổ 13 C-NMR của chất B
Hình 3.19: Phổ DEPT của chất B
Hình 3.20: Phổ DEPT của chất B
Hình 3.21: Phổ HSQC của chất B
Hình 3.22: Phổ HSQC của chất B
Hình 3.23: Phổ HSQC của chất B
Hình 3.24: Phổ HMBC của chất B
Hình 3.25: Phổ HMBC của chất B
Hình 3.26: Phổ HMBC của chất B
Hình 3.28: Phổ HMBC của chất B
Hình 3.29: Phổ HMBC của chất B
