Phân tích thành phần axit amin và vitamin e trong nấm linh chi (ganoderma microporum r s hseu) nuôi cấy trên môi trường lỏng bằng phương pháp hplc

- Trong dung dịch, dạng ion lưỡng cực chuyển một phần nhỏ thành dạng phân tử Công thức cấu tạo tổng quát của axit amin: R: được gọi là mạch bên hay nhóm bên, các axit amin chỉ khác nhau

TRẦN THI MAI

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN AXIT AMIN VÀ VITAMIN E

TRONG NẤM LINH CHI (Ganoderma Microporum) NUÔI CẤY

TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

NGHỆ AN - 2014

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN AXIT AMIN VÀ VITAMIN E

TRONG NẤM LINH CHI (Ganoderma microporum R.S.Hseu)

NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƯỜNG LỎNG BẰNG PHƯƠNG

“Phân tích thành phần axit amin và vitamin E trong nấm linh chi

(Ganoderma microporum R.S.Hseu) nuôi cấy trên môi trường lỏng bằng

phương pháp HPLC”

2 Nhiệm vụ nghiên cứu:

Mát tự nhiên và phân lập

của nấm

(Ganoderma microporum) bằng phương pháp HPLC

3 Họ tên cán bộ hướng dẫn : PGS TS.Trần Đình Thắng

4 Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng 9 năm 2013

5 Ngày hoàn thành đồ án : Ngày tháng 01 năm 2014

Chủ nhiệm bộ môn Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên)

1 Nhiệm vụ nghiên cứu :

Mát tự nhiên và phân lập

của nấm

(Ganoderma microporum) bằng phương pháp HPLC

(Ký, ghi rõ họ, tên)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP- TỰ DO- HẠNH PHÚC - -

BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Họ và tên sinh viên: Trần Thị Mai Mã số sinh viên: 0952040395

Ngành : Công nghệ thực phẩm Cán bộ hướng dẫn: PGS TS.Trần Đình Thắng Cán bộ duyệt: …………

1 Nhiệm vụ nghiên cứu :

Mát tự nhiên và phân lập

của nấm

(Ganoderma microporum) bằng phương pháp HPLC

(Ký, ghi rõ họ, tên)

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh, phòng Hóa thực phẩm và Trung tâm Phân tích – Chuyển giao Công nghệ và Môi trường, Trường Đại học Vinh

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn đến thầy giáo

PGS TS.Trần Đình Thắng - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận

tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán bộ trong khoa Hoá, trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học, giúp cho tôi có những kiến thức vững vàng trước khi bước vào đời

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài

Vinh, ngày 9 tháng 1 năm 2014

Sinh viên thực hiện

Trần Thị Mai

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG, HÌNH v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chi Ganoderma 3

1.1.1 Đặc điểm chung 3

1.1.2 Vị trí phân loại [1, 2] 4

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái của nấm linh chi 4

1.1.4 Thành phần hóa học của nấm Linh chi 5

1.1.4.1 Thành phần hóa học trong nấm 5

1.1.4.2 Thành phần các chất hoạt tính ở nấm 5

1.1.4.3 Hàm lượng các nguyên tố trong nấm 6

1.1.5 Mục đích sử dụng 7

1.2 Nuôi cấy nấm 8

1.2.1 Môi trường rắn 8

1.2.2 Môi trường lỏng 8

1.3.Tổng quan về axit amin, vitamin E 8

1.3.1 Axitamin 8

1.3.1.1 Cấu tạo 8

1.3.1.2 Phân loại axit amin 9

1.3.1.3 Tính chất 10

1.3.1.4 Vai trò của axit amin 11

1.3.2.1 Cấu tạo 12

1.3.2.2 Tính chất 13

1.3.2.3 Vai trò 14

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

1.4.1 Cơ sở lý thuyết 14

1.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 15

1.4.3 Phân loại 16

1.4.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC 16

1.4.4.1 Bình chứa dung môi 17

1.4.4.2 Bộ khử khí (Degasse) 18

1.4.4.3 Bơm (Pump) 18

1.4.4.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection) 18

1.4.4.5 Cột sắc ký 18

1.4.5.6 Đầu dò (Detector) 18

1.4.5.7 Bộ phận ghi tín hiệu 19

1.4.5.8 In kết quả 20

1.4.5 Chọn điều kiện sắc ký 20

1.4.5.1 Lựa chọn pha tĩnh 20

1.4.5.2 Lựa chọn pha động 21

1.4.6 Tiến hành sắc ký 22

1.4.6.1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 22

1.4.6.2 Chuẩn bị dung môi pha động: 22

1.4.6.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 22

1.4.6.4 Cách đo HPLC 23

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 24

2.1 Phương pháp 24

2.2 Thực nghiệm 24

2.2.1 Thực nghiệm về nuôi cấy 24

2.2.1.1 Vật liệu thí nghiệm 24

2.2.1.2 Môi trường dinh dưỡng 24

2.2.1.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 25

2.2.2 Phân tích 26

2.2.2.1 Axitamin 26

2.2.2.2 Vitamin E 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1.Nuôi cấy 34

3.1.1 Kết quả nuôi cấy trên môi trường rắn 34

3.1.2 Kết quả nuôi cấy trên môi trường lỏng 35

3.2.Phân tích 36

3.2.1 Axit amin 36

3.2.1.1.Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ 36

3.2.1.2 Xử lý kết quả 44

3.1.4 Hàm lượng axit amin sau khi thủy phân 44

3.2.2.Vitamin E 44

3.2.2.1 Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn của Vitamin E 45

3.2.2.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn α- tocopherol 47

3.2.2.3 Xử lý kết quả 49

3.2.2.4 Xác định độ lặp lại của phương pháp 49

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1 Kết luận 51

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

DANH MỤC BẢNG, HÌNH

BẢNG:

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của nấm Linh chi 5

Bảng 1.2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi 5

Bảng 1.3: Hàm lượng các nguyên tố trong nấm 6

Bảng 1.4: Phân loại axit amin theo khả năng tổng hợp trong cơ thể 9

Bảng 3.1: Tốc độ phát triển của hệ sợi nấm linh chi (Ganoderma microporum) theo ngày 35

Bảng 3.2: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của axit Aspartic: 39

Bảng 3.3: Giá trị LOD và LOQ của Aspartic qua 3 lần đo chuẩn 42

Bảng 3.4: Giá trị LOD và LOQ 43

Bảng 3.5: Hàm lượng axit amin trong mẫu nấm linh chi (Ganoderma microporum) 45

Bảng 3.6: Diện tích pic của vitamin E tương ứng với từng nồng độ chuẩn 46

Bảng 3.7: Giá trị LOD và LOQ 47

Bảng 3.8: Kết quả phân tích hàm lượng vitamin E trong nấm linh chi (Ganoderma microporum) 49

Bảng 3.9: Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của mẫu nấm linh chi (Ganoderma microporum) 50

HÌNH: Hình 1.1: Các loại nấm Linh chi 3

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 17

Hình 3.1: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm linh chi (Ganoderma microporum) 34

Hình 3.2: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm linh chi (Ganoderma microporum) sau 3 và 4 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 34

Hình 3.3: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm linh chi (Ganoderma microporum) sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 35

Hình 3.4: Đồ thị tốc độ lan của hệ sợi nấm trên 2 môi trường Khoáng và ME 36

Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 10 pmol/µl 37

Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 25 pmol/µl 37

Hình 3.7: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 100 pmol/µl 38

Hình 3.8: Phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng axit amin Aspartic 39

Hình 3.9: Sắc đồ hỗn hợp các axit amin trong mẫu nấm linh chi (Ganoderma microporum) 44

Hình 3.10: Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được và nồng độ các chuẩn vitamin E 46

Hình 3.11: Sắc đồ dung dịch chuẩn α- tocopherol ở nồng độ 4 ppm 47

Hình 3.12: Sắc đồ dung dịch chuẩn α-tocopherol ở nồng độ 10 ppm 48

Hình 3.13: Sắc đồ dung dịch chuẩn α-tocopherol ở nồng độ 20 ppm 48

Hình 3.14: Sắc đồ dung dịch chuẩn α- tocopherol ở nồng độ 40 ppm 48

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT

UV – VIS: ultraviolet – spectrophotometer

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Trong những năm gần đây ngành nuôi trồng nấm phát triển mạnh mẽ ở trên

cả nước, tổng các loại nấm ăn và nấm dược liệu trong năm 2006 ước tính đạt khoảng 1,5 triệu tấn Nghề trồng nấm ra đời góp phần giải quyết công ăn việc làm tăng thu nhập cho nhiều người nông dân và nhiều hộ gia đình Với nguồn nguyên liệu chủ yếu là phế thải từ công nghiệp và nông nghiệp, do đó ngành nuôi trồng nấm góp phần giải quyết nạn ô nhiễm môi trường xảy ra trên toàn cầu

Ngày nay xu hướng sử dụng các thảo dược thiên nhiên để trị bệnh đã trở nên phổ biến, việc tìm kiếm những khả năng chữa trị từ các loại thảo dược đã được tiến hành ở nhiều nơi trên thế giới: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Malaysia, Thái Lan Trong đó, nấm Linh chi là đối tượng nghiên cứu của nhiều quốc gia Đặc biệt là các nước vùng Châu Á, vì nó có nhiều tiềm năng về nguồn dược liệu Trung Quốc là một quốc gia có lịch sử phát triển lâu đời, đồng thời đây là chiếc nôi của các bài thuốc cổ truyền nổi tiếng trên thế giới Ở Trung

Quốc, Ganoderma đã được nghiên cứu rất nhiều và sử dụng như là thảo dược

quý để trị bệnh và có tác dụng bổ dưỡng, điều hoà huyết áp, chống lão hóa, kéo dài tuổi thọ,…Tác dụng của Linh chi đã được khẳng định và xếp vào hàng

“thượng dược” trị được bách bệnh

Đặc biệt hơn nữa, các nghiên cứu dược học hiện đại đã chứng minh Linh chi chứa tới 120 chất, bao gồm các hợp chất hữu cơ, các nguyên tố vi lượng và các vitamin Trong số đó có một số loài đã được biết rõ về thành phần dinh dưỡng

Đặc biệt là thành phần axit amin và vitamin Chính vì vậy, chúng tôi chọn đề tài:

“Phân tích thành phần axit amin và vitamin E trong nấm linh chi

(Ganoderma microporum R.S.Hseu) nuôi cấy trên môi trường lỏng bằng

phương pháp HPLC”

2 Nhiệm vụ nghiên cứu Trong khóa luận này, tôi có các nhiệm vụ sau:

Mát tự nhiên và phân lập

của nấm

(Ganoderma microporum) bằng phương pháp HPLC

Tôi hi vọng rằng luận văn sẽ góp phần bổ sung và làm đa dạng thêm bộ sưu tập các loại nấm linh chi có giá trị

3 Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của tôi là loài nấm linh chi (Ganoderma

microporum) được thu nhận từ vườn Quốc gia Pù Mát

Nấm được phân lập và bảo quản tại phòng thí nghiệm Vi sinh, trường Đại học Vinh

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Ganoderma 1.1.1 Đặc điểm chung

Nấm Linh chi được xếp vào “Thượng Dược”, trong sách “Thần nông bản thảo” cách đây khoảng 2000 năm thời nhà Châu và sau đó được nhà dược học nổi tiếng Trung Quốc Lý Thời Trân phân ra thành “Lục Bảo Linh Chi” thời nhà Minh với các khái quát công dụng dược lý khác nhau, ứng theo từng màu

Theo Lý Thời Trân thì nấm Linh chi có 6 màu khác nhau:

- Xích chi (Linh chi đỏ còn gọi Hồng chi)

- Hắc chi (Linh chi đen còn gọi Huyền chi)

- Thanh chi (Linh chi xanh còn gọi Long chi)

- Bạch chi (Linh chi trắng còn gọi Ngọc chi)

- Hoàng chi (Linh chi vàng còn gọi Kim chi)

- Tử chi (Linh chi tím)

Nấm Linh chi có nhiều tên gọi khác nhau như Bất lão thảo, Vạn niên thảo, Thần tiên thảo, Chi linh, Đoạn thảo, Nấm lim,… [8]

1.1.2 Vị trí phân loại [1, 2]

Giới : Fungi Ngành : Basidiom mycota

Loài : Garnodema microporum

1.1.3 Đặc điểm phân bố và sinh thái của nấm linh chi

Các nhóm nấm dược quý cổ truyền ngày nay xác định là thuộc họ

Ganodermataceace, bao gồm 150 – 200 loài: trong đó nổi bật là Ganoderma

(trên 100 loài) và chi Amauroderma (trên 30 loài) [7]

Chi Ganoderma Karsten có khoảng vài chục loài trên thế giới, phân bố

chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á, châu Đại Dương và châu Mỹ Ở Việt Nam có 26 loài và 1 dưới loài, trong đó một số loài được dùng làm thuốc

Nấm linh chi thuộc nhóm nấm lớn, thường hoại sinh trên gỗ mục hoặc trên

đất ngay ở nơi có gốc cây gỗ đã mục, thuộc đại diện của các họ Caesalpiniaceae (lim, lim xẹt, muồng đen, me ) và Fagaceae ( một số loài thuộc các chi

Quercus, Lythocarpus, Castanopsis ) Môi trường sống của nấm thường ở rừng

kín xanh ẩm, độ cao từ vài chục mét đến 1500 m Có thể tìm thấy nấm linh chi ở hầu hết các tỉnh vùng núi, từ Lào Cai (Sa Pa) đến Lâm Đồng (Lang Biang) Ở các vùng rừng trước kia đã bị khai thác, trên gốc hoặc phần thân cành còn lại đều có thể thấy nấm này mọc vào mùa mưa ẩm, như vùng rừng thuộc lâm trường Hương Sơn, tỉnh Hà Tĩnh; vùng rừng thuộc Vườn Quốc gia Bến En, tỉnh Thanh Hóa và Tam Đảo (Vĩnh Phúc)

Nấm linh chi sinh sản chủ yếu bằng bào tử nằm ở mặt dưới của quả thể

Phần có chức năng sinh dưỡng chính là hệ sợi của nấm mọc ẩn trong gỗ mục

hoặc đất Hiện nay ở Trung Quốc, Nhật Bản và Việt Nam người ta chủ động nghiên cứu trồng được nấm linh chi trên giá thể nhân tạo để dùng làm thuốc [5]

1.1.4 Thành phần hóa học của nấm Linh chi 1.1.4.1 Thành phần hóa học trong nấm

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của nấm Linh chi

Bảng 1.2: Các hoạt chất sinh học và dẫn xuất trong nấm Linh chi

D-6 Tăng tổng hợp protein, tăng

chuyển hóa axit nucleic

Axit lanosporeric A lanosterol

Ức chế sinh tổng hợp cholesterol

Triterpenoit

Axit ganoderic B, D, F, H,

K, S, Y … Ganodermadiol

Hạ huyết áp, ức chế ACE

giãn cơ, giảm đau

miễn dịch

1.1.4.3 Hàm lƣợng các nguyên tố trong nấm

Hàm lượng các nguyên tố trong nấm được trình bày ở bảng 1.3 sau:

Bảng 1.3: Hàm lượng các nguyên tố trong nấm

Linh Chi được xếp vào loại “Thượng dược”, có tác dụng bồi dưỡng cơ thể

và chữa bệnh xếp trên Nhân sâm Đầu thời nhà Minh (1595), dựa vào màu sắc, Linh Chi được phân làm 6 loại (Lục Bảo Linh Chi) và chỉ có vua chúa, nhà giàu mới được dùng Qua nhiều biến động của thiên nhiên, Linh Chi vẫn giữ được vai trò “Thượng dược” trong các loại thuốc Y học cổ truyền, có tác dụng tốt trong chữa bệnh, chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cho con người

Hiện nay không chỉ có Việt nam mà tất cả các nước trên thế giới đều công nhận giá trị khoa học của Nấm Linh Chi trong việc điều trị bệnh Theo Thông Tấn Xã Thái Lan, Bộ Y tế Thái Lan được khuyến khích bệnh nhân ung thư uống nước nấm Linh Chi kết hợp với Tây Y để tăng cường hệ miễn dịch và chống lại các tế bào ung thư là phương pháp hiệu quả nhất

Tiến sĩ Somchai Nichpanit, Tổng giám đốc của Cục Phát triển các bài thuốc truyền thống và thay thế của Thái Lan, cho biết, các nghiên cứu mới nhất về nấm Linh Chi và tác dụng của nấm linh chi trong điều trị ung thư cho thấy rằng

nó có hợp chất polysaccharides rất lớn Đây là loại hợp chất mà có thể giúp tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể

Nấm Linh Chi cũng được tìm thấy có chứa hợp chất triterpene, có thể ngăn chặn các tế bào ung thư Chiết xuất nấm và các chất chiết xuất từ bào tử của nó còn có khả năng tăng cường miễn dịch và không làm tổn hại tới các tế bào bình thường

1.2 Nuôi cấy nấm 1.2.1 Môi trường rắn

Trong quá trình nuôi cấy, tôi đã sử dụng môi trường rắn là: PDA

 Môi trường PDA ( potato destrose agar )

Khoai tây : 200 gr D-glucose : 20 gr Agar : 20 gr

Nước cất vừa đủ : 1000 ml

1.2.2 Môi trường lỏng

Khoai tây : 200 gr D-glucose : 20 gr

Pepton : 6 gr

KH2PO4 : 2 gr

MgSO4 : 2 gr Nước cất vừa đủ : 1000 ml

Axit amin là hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử có

ion lưỡng cực Vì vậy axit amin kết tinh tồn tại ở dạng ion lưỡng cực

- Trong dung dịch, dạng ion lưỡng cực chuyển một phần nhỏ thành dạng phân tử Công thức cấu tạo tổng quát của axit amin:

R: được gọi là mạch bên hay nhóm bên, các axit amin chỉ khác nhau ở mạch R

Đa số các protein được cấu tạo từ các α – axitamin

1.3.1.2 Phân loại axit amin

- Dựa vào khả năng tổng hợp protein trong cơ thể, người ta chia axit amin

làm hai loại: axit amin thiết yếu và axit amin không thiết yếu

Bảng 1.4: Phân loại axit amin theo khả năng tổng hợp trong cơ thể

Axit amin thiết yếu ( không thể thay thế)

Axit amin không thiết yếu ( có thể thay thế )

- Cơ thể không thể tổng hợp được chúng để tạo protein

- Hoàn toàn phụ thuộc vào sự cung cấp từ thức ăn bên ngoài đưa vào cơ thể

- Có 10 loại axit amin thiết yếu:

Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenillalanin, Threonin, Tryptophan

và Valin

- Cơ thể có thể tổng hợp chúng với số lượng đầy đủ từ các phân tử khác trong

cơ thể

- Không bắt buộc hiện diện trong chế

độ ăn

- Các loại axit amin không thiết yếu:

Alanin, Glycin, Serin, Tyrosin, Prolin, Cystein, Cystin

Dựa vào cấu tạo gốc R để phân 20 axit amin cơ bản thành các nhóm Một trong các cách phân loại là 20 axit amin được phân thành 5 nhóm như sau:

Nhóm 1: các axit amin có gốc R không phân cực kị nước, thuộc nhóm này có 6

axit amin: Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), ILe (I), Pro (P)

Nhóm 2: các axit amin có gốc R là nhân thơm, thuộc nhóm này có 3 axit amin:

Phe (F), Tyr (Y), Trp (W)

Nhóm 3: các axit amin có gốc R bazơ, tích điện dương, thuộc nhóm này có 3

axit amin: Lys (K), Arg (R), His (H)

Nhóm 4: các axit amin có gốc R phân cực, không tích điện, thuộc nhóm này có 6

axit amin: Ser (S), Thr (T), Cys (C), Met (M), Asn (N), Gln (Q)

Nhóm 5: các axit amin có gốc R axit, tích điện âm, thuộc nhóm này có 2 axit

amin: Asp (D), Glu (E)

Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl –

ở cấu tạo mạch bên R

1.3.1.3 Tính chất

a Tính chất vật lí

Các axit amin là các chất rắn không màu, vị hơi ngọt, dễ tan trong nước vì chúng tồn tại ở dạng ion lưỡng cực (muối nội phân tử), nhiệt độ nóng chảy cao (vì là hợp chất ion)

b Tính chất hóa học

- x = y thì axit amin trung tính, quỳ tím không đổi màu

- x > y thì axit min có tính bazơ, quỳ tím hóa xanh

- x < y thì axit amin có tính axit, quỳ tím hóa đỏ b) Tính chất lưỡng tính:

- Tác dụng với dung dịch bazơ (do có nhóm COOH)

- Tác dụng với dung dịch axit (do có nhóm NH2)

axit hiđroxiaxetic

- Trong phản ứng này, OH của nhóm COOH ở phân tử axit này kết hợp với

H của nhóm NH2 ở phân tử axit kia tạo thành nước và sinh ra polime

- Ví dụ:

H2N-[CH2]5-COOH (- NH- [CH2]5-CO-)n + n H2O Axit ε - aminocaproic nilon – 6 (tơcapron)

1.3.1.4 Vai trò của axit amin

Axit amin là cấu tử cơ bản của protein Vai trò cụ thể của một số axit

amin như sau :

nhớ, tác động trực tiếp đến não bộ, tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da

đường trong máu; tốt cho bệnh nhân mắc chứng “hyperglycemia” hoặc những người mong muốn đốt cháy chất béo nhanh chóng Hơn nữa, loại axit amin này còn có chức năng duy trì lượng hormone tăng trưởng để

thúc đẩy quá trình phát triển mô cơ

khỏe sau thời gian luyện tập thể dục thể thao Đồng thời giúp điều tiết lượng đường glucose trong máu, hỗ trợ quá trình hình thành hemoglobin

và đông máu

hoạt động gan, tăng cường hệ miễn dịch và thúc đẩy cơ thể hấp thụ mạnh các dưỡng chất

mới, đồng thời giúp cân bằng nitơ cần thiết Ngoài ra, nó còn phân hủy

đường glucose trong cơ thể

chuyển hóa thành niacin (vitamin B3), hai là cung cấp tiền chất của serotonin, một chất dẫn truyền thần kinh giúp cơ thể điều hòa sự ngon miệng, giấc ngủ và tâm trạng

gan, chống nhiễm độc Methionine còn được dùng như một yếu tố ngăn

ngừa tế bào gan thoái hóa mỡ

1.3.2 Vitamin E

Vitamin E được khám phá vào năm 1922 bởi các nhà khoa học Evans- Bishop, khi họ phát hiện thấy chuột cống được nuôi dưỡng với một chế độ ăn thiếu vitamin E sẽ nảy sinh các vấn đề liên quan đến sinh sản

Khi vitamin E được công nhận như là một hợp chất tác dụng phục hồi khả năng sinh sản, các nhà khoa học đặt cho nó tên hóa học là tocopherol, từ tiếng

Hi Lạp có nghĩa là “sinh con”

Năm 1936, tách được vitamin E từ mầm lúa mì và dầu bông

Năm 1938, tổng hợp được bốn loại dẫn xuất của benzopiran là: α – tocopherol, β – tocopherol, γ – tocopherol, δ – tocopherol gọi là nhóm vitamin

E Trong đó dạng α là có hoạt lực cao nhất

H3

O H

CH3

1.3.2.2 Tính chất

- Tính chất vật lý

Tocoferol là chất lỏng không màu, hòa tan tốt trong dầu thực vật, trong rượu etylic, ete etylic và ete dầu hỏa

α- Tocoferol thiên nhiên có thể kết tinh chậm trong rượu metylic ở nhiệt

Trong số các tính chất hóa học của tocopherol, tính chất quan trọng hơn

quan trọng được tạo thành là chất α – tocopherylquinon

Vai trò của vitamin E là bảo vệ cơ thể chống những tác dụng độc hại của những gốc tự do

Sự hiện diện của nó giúp cho mỡ trong tế bào được bảo vệ, bởi vì màng tế bào được cấu tạo bởi các axit béo có nhiều nối đôi, rất dễ bị oxy hóa

Ngoài chức năng ngăn chặn sự tạo thành những gốc tự do nơi tế bào, vitamin E còn bảo vệ những chất tạo nên tế bào như protein và axit nucleic

1.3.2.3 Vai trò

Vitamin E có các chức năng sau đây:

- Chống oxi hóa sinh học trong cơ thể và trong thức ăn: dùng vitamin E để

bảo quản thức ăn khi thức ăn có chứa nhiều caroten, vitamin E và lipid, ngăn

chặn sự hình thành peroxyt và bảo vệ các axit béo chưa no

- Ngăn ngừa ung thư: vì nó kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan

trọng làm chậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư

- Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm các cholestrol xấu và làm tăng sự tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch

- Hệ thống miễn dịch: vitamin E kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường bằng việc bảo vệ các tế bào, hoặc tăng cường sức mạnh hệ miễn dịch khi có dịch bệnh tấn công

- Chống vô sinh: nó đảm bảo cơ năng sinh dục được bình thường vì vitamin E có liên quan đến sự kích thích tiết tố sinh dục (Gonadotropin) ở tuyến yên

- Chống lão hóa: do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc tự do, nên người ta dùng nó để sản xuất các chế phẩm dưỡng da hoặc làm trẻ hóa

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 1.4.1 Cơ sở lý thuyết

HPLC là viết tắc của 4 chữ cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký

lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (rây phân tử)

Đây là phương pháp phổ biến nhất để xác định axit amin Sau khi thủy phân các axit amin sẽ được dẫn suất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang Các dẫn

suất này được tách nhờ hệ thống HPLC, được phát hiện và định lượng bằng detecter UV và detecter huỳnh quang

Ưu điểm của phương pháp HPLC là tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt,

độ nhạy cao, độ lặp lại tốt và có thể phân tích đồng thời nhiều chất Riêng đối với việc phân tích axit amin, phương pháp HPLC còn có một số ưu điểm mà ít

có phương pháp khác có thể được, đó là quá trình tách và xác định là một hệ thống kín, quá trình dẫn xuất có thể sử dụng dẫn suất trước hoặc sau cột, dung môi chạy chủ yếu là đệm, quá trình thủy phân mẫu và hòa tan mẫu là các axit vô

cơ không tốn kém

1.4.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký

và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chúng ta cần có một pha động Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3

Chất phân tích A + B + C

Pha tĩnh F3 Pha động

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở đây

phân tích ra khỏi cột Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau

Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

1.4.3 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

a Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

b Sắc ký phân bố (partition chromatography)

c Sắc ký ion (ion chromatography)

d Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000) SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động:

- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo (RP)

1.4.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

trợ

 Phần phát hiện và xử lý số liệu: phần này bao gồm các detecter, phần khuếch tán, máy tính và phần mềm xử lý số liệu, bộ phận ghi tín hiệu

Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC Trong đó:

1- Bình chứa dung môi pha động 2- Bộ phận khử khí

3- Bơm cao áp 4- Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay tự động) 5- Cột sắc ký (pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt) 6- Đầu dò nhận tín hiệu (Detector)

7- Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC

8- In dữ liệu

1.4.4.1 Bình chứa dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp

Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ

lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%

Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa là 2 đến 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn, để quá trình

1.4.4.2 Bộ khử khí (Degasse)

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động

1.4.4.3 Bơm (Pump)

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký

Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at đến 500 at (1at =0.98 Bar) và bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999 ml/phút (hiện nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar)

Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar

Tốc độ dòng: 0.1- 9.999 ml/phút

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 pittong để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

1.4.4.4 Bộ phận tiêm mẫu (injection)

Dùng để đưa mẫu vào cột phân tích Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột:

Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample)

1.4.4.5 Cột sắc ký

Có rất nhiều nhãn hiệu cột khác nhau hiện bán trên thị trường Chúng được chia làm nhiều loại theo mục đích sử dụng, trong đó chủ yếu là: cột pha đảo RP - C18, cột pha thường C8, các loại cột chuyên dụng cho từng nhóm chất

Cột C18 và C8 được sử dụng cho phần lớn các hợp chất thông thường

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30 cm, đường kính trong 1-10 mm

Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận) hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm Oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column)

1.4.5.6 Đầu dò (Detector)

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các

chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

A = k.C Trong đó: A: là tín hiệu đo được

K: là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất

- Detector huỳnh quang dễ phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang và là loại detector có độ chọn lọc cao nhất

- Loại hiện đại hơn có Detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất

Ngoài ra còn có một số loại detector khác là:

- Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng…

- Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ (thông thường dùng đo các chất đường)

- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt…

1.4.5.7 Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang Trong các máy thế hệ

cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của

pic, chiều cao…

Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính Nó có thể lưu tất cả các thông số của pic như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá

trình phân tích, đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người

- Pha tĩnh: Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân cực hay

ít phân cực Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm OH phân cực ưa

nước

- Pha động: dùng cho lọai này là các dung môi không phân cực hay ít

phân cực như: Methanol, Benzen, Acetonitril, Chlorofoc

- Pha tĩnh: Dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất

phân cực có thể tạo cặp ion Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch cacbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay các mạch cacbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít

- Pha Động:

Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như:

Methanol, Acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi-đệm

Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích dược phẩm Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu

Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các loại pha tĩnh trên nền oxit nhôm, trên nền chất hữu cơ cao phân tử, trên nền mạch cacbon

1.4.5.2 Lựa chọn pha động

Dựa vào các tài liệu, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của pic đã trình bày, đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị

Pha động có thể làm thay đổi: độ chọn lọc, thời gian lưu, hiệu năng tách của cột, độ phân giải, tính đối xứng của pic Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc

ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích Chính vì vậy pha động cần

có cầu yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học

- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng (đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm kết tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột)

- Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là chúng không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao: hoá chất tinh khiết dùng cho phân tích HPLC

- Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phải phù hợp với loại detector: vd UV - VIS thì dung môi không được hấp thụ quang (vd axit acetic ở bước sóng thấp < 220 nm) Detector huỳnh