Đặc điểm di truyền của vi khuẩn neisseria meningitidis gây bệnh viêm màng não mô cầu tại một số tỉnh miền bắc việt nam

Trần Văn Lực ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN Neisseria meningitidis GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO MÔ CẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Nghệ An – 2017... Trầ

Trần Văn Lực

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN

Neisseria meningitidis GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO

MÔ CẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Nghệ An – 2017

Trần Văn Lực

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN

Neisseria meningitidis GÂY BỆNH VIÊM MÀNG NÃO

MÔ CẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.10.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Giang An

TS Nguyễn Minh Hường

Nghệ An - 2017

từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Họ tên tác giả

Trần Văn Lực

Luận văn là một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu sự phân bố và đặc điểm

di truyền của vi khuẩn Neisseria meningitidis gây bệnh viêm màng não mô cầu tại miền Bắc Việt Nam” được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và Công nghệ quốc gia Nafosted (Mã số: 106-NN.02-2015.66, Chủ nhiệm: TS Nguyễn Minh Hường) Hoàn thành luận văn này, tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Giang An - Phó viện Trưởng viện Sư phạm tự nhiên, Trường Đại học Vinh và TS Nguyễn Minh Hường phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ Sinh học, thuộc viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy giáo, cô giáo trong viện Sư phạm tự nhiên, Trường Đại học Vinh đã nhiệt tình giảng dạy và có những ý kiến đóng góp quý báu cho đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi cũng gửi lời cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền và các cán bộ phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài

Xin cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè và những người thân đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Nghệ An, tháng 8 năm 2017

Tác giả

Trần Văn Lực

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Bảng chữ viết tắt v

Danh mục các bảng biểu vi

Danh mục các hình vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Cấu trúc của luận văn 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Vi khuẩn Neisseria meningitidis và bệnh viêm não mô cầu 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Neisseria meningitidis 3

1.1.2 Đại cương về bệnh viêm não mô cầu 5

1.2 Sinh học phân tử của vi khuẩn Neisseria meningitidis 9

1.2.1 Hệ gene của vi khuẩn Neisseria meningitidis 9

1.2.2 Đặc điểm gene đích phát hiện vi khuẩn Neisseria meningitidis 10

1.2.3 Kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn Neisseria meningitidis 12

1.3 Tình hình nghiên cứu Neisseria meningitidis và bệnh viêm não mô cầu trên thế giới 16

1.4 Tình hình nghiên cứu Neisseria meningitidis và bệnh viêm não mô cầu tại Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.3 Dụng cụ, thiết bị 22

2.1.4 Các dung dịch dùng điện di trên gel agarose 22

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Xác định sự có mặt của Neisseria meningitidis trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR 22

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số 23

2.3.3 Định type Neisseria meningitidis trong mẫu bằng phương pháp PCR 23

2.3.4 Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 23

2.3.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 24 2.3.6 Phân tích phát sinh chủng loại và nguồn gốc tiến hoá trên trình tự gene của các

chủng Neisseria meningitidis 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Thu nhận mẫu chứa vi khuẩn Neisseria meningitidis tại một số tỉnh miền Bắc

Việt Nam 25

3.2 Xác định vi khuẩn Neisseria meningitidis bằng phương pháp PCR 26

3.3 Định danh type huyết thanh bằng phương pháp PCR 29

3.4 Phân tích gene porA của 19 chủng Neisseria meningitidis được phân lập ở miền Bắc

Việt Nam 31

3.5 Phân tích gene fHbp của 19 chủng Neisseria meningitidis được phân lập ở miền Bắc

Việt Nam 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Nam

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic CbF Cerebrospinal fluid Dịch não tuỷ

PCR Polymerase Chain

Reaction

Phản ứng thay đổi chuỗi nucleotide

HGT Horizontal gene transfer Chuyển gen ngang LOS Lipo-oligosaccharide Glycolipid màng ngoài fHpb Factor H binding protein Mã hóa kháng nguyên gắn yếu tố H

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Thông tin hệ gene của ba chủng N meningitidis 10

Bảng 1.2 Số liệu điều tra về viêm màng não tại một số quốc gia Châu Á 18

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu 21

Bảng 2.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR 22

Bảng 2.3

Trình tự cặp mồi sử dụng để định type huyết thanh của 19 chủng

Neisseria meningitidis của vi khuẩn Neisseria meningitidis thu

được tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

Bảng 3.1 Thông tin các chủng vi khuẩn viêm não mô cầu - Neisseria

Bảng 3.2 Kết quả đo nanodrop của 19 chủng Neisseria meningitidis thu

Bảng 3.3 Các chủng huyết thanh thu được bằng phương pháp PCR của các

Danh sách so sánh phân tích trình tự nucleotide của gene porA và

mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của 19 chủng nghiên cứu với các

chủng tương đồng trên thế giới

38

Bảng 3.7

Danh sách so sánh phân tích trình tự nucleotide của gene fHbp và

mối quan hệ nguồn gốc tiến hóa của 19 chủng nghiên cứu với các

chủng tương đồng trên thế giới

47

Bảng 3.8 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gene fHbp với các chủng sản

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh tế bào và nhuộm Gram N meningitidis từ dịch não tủy 3

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế vi khuẩn N meningitidis gây nhiễm trùng viêm màng

Hình 1.3 Cấu trúc bề mặt của vi khuẩn Neisseria meningitidis cắt ngang 5

Hình 1.5 Hệ gene của vi khuẩn Neisseria meningitidis chủng MC58 9

Hình 1.6 Đặc điểm gene mã hóa kháng nguyên của N.meningitidis 11

Hình 1.7 Hình ảnh màng tế bào N meningitidis cắt ngang 12

Hình 1.8 Vị trí của các gene porA và fHpb trong bộ gen của vi khuẩn

Hình 3.1 Ảnh chụp vi khuẩn Neisseria meningitidis nuôi cấy trên môi trường

Hình 3.2 Kết quả điện di DNA tổng số của một số chủng trong 19 chủng

Hình 3.3 Điện di PCR một số chủng với mồi CtrA của vi khuẩn Neisseria

meningitidis thu được tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 28

Hình 3.4

Điện di sản phẩm PCR định type một số chủng với mồi synD của

vi khuẩn Neisseria meningitidis thu được tại một số tỉnh miền Bắc

Việt Nam

29

Hình 3.5

Điện di sản phẩm PCR định type một số chủng với mồi synE của

vi khuẩn Neisseria meningitidis thu được tại một số tỉnh miền Bắc

Hình 3.7 Giản đồ một phần trình tự gene PorA của chủng 14156 33

Hình 3.8 Một phần trình tự nucleotide gene porA của 19 chủng Neisseria

meningitidis được phân lập ở miền Bắc Việt Nam 33

Hình 3.9 Kết quả so sánh một phần trình tự nucleotide gene porA của 19

Hình 3.10

Mối quan hệ nguồn gốc chủng loại giữa 19 chủng được nghiên

cứu về thành phần nucleotide của gene porA bằng phần mềm

Mega 7.0

35

Hình 3.11 So sánh trình tự gene porA của chủng 17088 với các chủng tương 37

đồng trên thế giới Hình 3.12 So sánh trình tự gene porA của chủng 17084 với các chủng tương

Hình 3.13 Kết quả so sánh trình tự nucleotide gene porA của 19 chủng phân lập tại Việt Nam và 10 chủng trên thế giới 39

Hình 3.14 Cây phát sinh chủng loại của 19 chủng trong nghiên cứu với 10

chủng trên thế giới đã đăng ký trên ngân hàng gene 40

Hình 3.16 Một phần trình tự nucleotide gene fHbp của 19 chủng Neisseria

meningitidis được phân lập ở miền Bắc Việt Nam 43

Hình 3.17 Kết quả so sánh một phần trình tự nucleotide gene fHbp của 19

Hình 3.18

Mối quan hệ nguồn gốc chủng loại giữa 19 chủng được nghiên

cứu về thành phần nucleotide của gene fHbp bằng phần mềm

Cây phát sinh chủng loại khi so sánh nucleotide gene fHbp của 19

chủng trong nghiên cứu với 18 chủng trên thế giới đã đăng ký trên

ngân hàng gen

49

Hình 3.24 Kết quả so sánh trình tự amino acid gene fHbp của allele 7 với 9

chủng Neisseria meningitidis được phân lập ở miền Bắc Việt Nam 52

Hình 3.25 Kết quả so sánh trình tự amino acid gene fHbp của allele 19 với 9

chủng Neisseria meningitidis được phân lập ở miền Bắc Việt Nam 52

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Viêm não mô cầu (còn được gọi là màng não cầu) là bệnh trên người, do khuẩn não mô cầu gây ra với nhiều bệnh cảnh khác nhau tại nhiều cơ quan như đường hô hấp, máu, hệ thần kinh, khớp, màng tim, mắt, đường niệu và sinh dục.Đây là căn bệnh tuy ít gặp nhưng lây lan rất nhanh qua đường hô hấp Bởi thế chúng có khả năng phát triển thành dịch Mặc dù ít gặp, nhưng đây là một bệnh nguy hiểm có thể xảy ra

ở mọi lứa tuổi Những nhóm có nguy cơ cao nhất là trẻ em dưới 5 tuổi và người trẻ tuổi từ 15 đến 24 tuổi

Cầu khuẩn màng não có tên Neisseria meningitidis thuộc họ Neisseriaceae, giống Nesseria - là song cầu khuẩn hình hạt cà phê Vi khuẩn này có kích thước 0,6

- 0,8 µm, có vỏ polysaccarit, ái khí, không di động, không tạo thành nha bào Vi khuẩn này chỉ mọc ở các môi trường như thạch máu, thạch chocolat

Vi khuẩn Neisseria meningitidis là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây

bệnh viêm màng não mô cầu ở người đặc biệt là trẻ em trên khắp thế giới Cho đến

nay, hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 1,2 triệu ca nhiễm Neisseria meningitidis, với tỷ lệ tử vong lên đến 135 nghìn ca mỗi năm [40] Mặc dù các chiến

lược tiêm chủng vacxin và các liệu pháp kháng sinh đã giảm thiểu và ngăn chặn hiệu quả bùng phát dịch trên diện toàn cầu Một số vùng trên thế giới hiện vẫn là điểm nóng viêm màng não mô cầu với tỷ lệ bùng phát dịch >1 dịch/ năm và tỷ lệ lây nhiễm trong quần thể là >10 ca/ 100 nghìn người [39]

Một trong số những lý do hạn chế sự thành công của các chiến lược vacxin và liệu pháp kháng sinh là sự đa dạng của các serotype/serosubtype và sự biến đổi di

truyền nhanh của Neisseria meningitidis qua tái tổ hợp làm cho vi khuẩn này có thể

kháng lại vacxin và kháng kháng sinh Tại Việt Nam vacxin phòng viêm não mô cầu hiện đều nhập từ nước ngoài, do đó có thể sẽ không có sự tương thích kháng nguyên cao với các chủng vi khuẩn đang lưu hành trong nước và làm giảm hiệu quả phòng bệnh của vacxin

Thực tế này đặt ra yêu cầu cấp thiết cần phải tiến hành những nghiên cứu điều tra dịch tễ học phân tử và đặc biệt là các đặc điểm biến đổi về di truyền và nguồn gốc

tiến hóa của các chủng N meningitidis đang lưu hành trong nước, để có chiến lược

dự phòng và ngăn chặn dịch viêm màng não mô cầu hiệu quả Đề tài nghiên cứu này

có ý nghĩa quan trọng trong việc định hướng cho việc nhập khẩu và sản xuất vacxin trong nước phù hợp với chủng vi khuẩn đang lưu hành ở Việt Nam Thông qua đó

góp phần vào chiến lược phòng dịch viêm màng não mô cầu do N.meningitidis ở Việt

Nam Xuất phát từ những lý luận và thực tiễn nói trên nên chúng tôi chọn đề tài: “Đặc điểm di truyền của vi khuẩn Neisseria meningitidis gây bệnh viêm màng não mô cầu tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

+ Xác định được đặc điểm di truyền, nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền

ở mức độ nucleotide và amino acid của một số gen liên quan đến tính kháng nguyên

bề mặt các chủng N meningitidis đang lưu hành ở miền Bắc Việt Nam

+ Cung cấp cơ sở khoa học và nguyên liệu di truyền cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc phát triển kit chẩn đoán và vacxin phòng bệnh viêm màng não mô cầu

do N meningitidis gây ra tại Việt Nam

3 Nội dung nghiên cứu

+ Thu nhận mẫu chứa vi khuẩn Neisseria meningitidis tại một số tỉnh miền Bắc,

Việt Nam

+ Định danh type huyết thanh vi khuẩn Neisseria meningitidis bằng phương

pháp PCR + Phân tích đặc điểm di truyền, nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền ở mức

độ nucleotide và amino acid gene porA của các chủng Neisseria meningitidis được

phân lập tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

+ Phân tích đặc điểm di truyền, nguồn gốc tiến hóa, sự biến đổi di truyền ở mức

độ nucleotide và amino acid gene fHbp của các chủng Neisseria meningitidis được

phân lập tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

4 Cấu trúc luận văn

Ngoài các mục như trang bìa, mục lục, danh mục bảng biểu và hình ảnh Bài luận văn được cấu trúc thành các phần:

Mở đầu Chương 1 Tổng quan nghiên cứu Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3 Kết quả nghiên cứu và bàn luận Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Vi khuẩn Neisseria meningitidis và bệnh viêm não mô cầu 1.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Neisseria meningitidis 1.1.1.1 Danh pháp khoa học vi khuẩn Neisseria meningitidis

(Theo Albrecht & Ghon 1901, https://en.wikipedia.org/wiki/Neisseria-meningitidis) 1.1.1.2 Hình dạng, cấu trúc và tính chất bắt màu của vi khuẩn Neisseria meningitidis

Trong dịch não tủy N meningitidis có hình thể rất giống lậu cầu, đó là các song

cầu Gram âm, hai mặt lõm quay vào nhau trông giống hình hạt cà phê

Hình 1.1 Hình ảnh tế bào và nhuộm Gram N meningitidis từ dịch não tủy

(Nguồn: Meningococcus are oxidase-positive bacteria (Levinson W 2014))

Kích thước tế bào khoảng 1µm Chúng có thể nằm bên trong hoặc bên ngoài tế

bào bạch cầu Trên các môi trường nuôi cấy N meningitidis có hình dạng và kích

thước dễ thay đổi, tính chất bắt màu Gram cũng không đồng đều giữa các tế bào Nhiều tế bào có xu hướng tăng tính đề kháng với chất tẩy màu Nuôi cấy càng lâu và cấy chuyển càng nhiều lần thì hình dạng tế bào càng mất dần tính chất điển hình

N meningitidis trong dịch não tủy thường có vỏ, tính chất này thể hiện dưới

hình thức một vùng sáng xung quanh tế bào vi khuẩn khi nhuộm bằng các phương pháp thông thường hoặc dễ nhận biết hơn nếu làm phản ứng phình vỏ bằng kháng

huyết thanh tương ứng Khi mới phân lập, N meningitidis có các pili ở bề mặt Những

pili này giúp cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô vùng họng mũi và duy trì tình trạng người lành mang vi khuẩn Trên các môi trường nhân tạo, sự hiện diện của pili phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy [1]

1.1.1.3 Vòng đời của vi khuẩn Neisseria meningitidis

Vi khuẩn N meningitidis khi tiếp xúc với bệnh nhân ban đầu xảy ra ở vòm

họng, nơi vi khuẩn có thể dễ dàng tiếp xúc với niêm mạc của họng (giai đoạn 1 như hình 1.2) Vi khuẩn sẽ vượt qua hệ thống phòng vệ của vật chủ (hàng rào vật lý, miễn dịch tại chỗ, thực bào/đại thực bào) xâm nhập lớp dưới niêm mạc

Khi bề mặt vi khuẩn tiếp xúc thì capsid gắn vào các tế bào biểu mô và sau đó gây đáp ứng miễn dịch với cơ thể (giai đoạn 2 và 3), tại đây các vi khuẩn chưa gây ra các vấn đề nghiêm trọng về sức khoẻ cho người bệnh Sau đó vi khuẩn tiếp tục vào mạch máu (giai đoạn 4) đi đến hệ thần kinh trung ương dẫn đến hậu quả nghiêm trọng

đối với người bệnh N.meningitidis có khả năng vượt qua hàng rào máu-não và đi vào

dịch não tủy não Tại đây, vi khuẩn sinh trưởng và phát triển (giai đoạn 5 và 6) tác động trực tiếp vào các tế bào thần kinh (giai đoạn 9, 10) bằng cách giải phóng các cytokine viêm dẫn đến viêm màng não (Hình 1.2.)

Hậu quả cuối cùng của tương tác mầm bệnh-vật chủ là tổn thương tế bào nội

mô và tăng tính thấm hàng rào máu não, từ đó dẫn đến nhiều thành phần của máu xâm nhập vào trong khoang dưới nhện, góp phần vào hiện tượng phù não nguồn gốc vận mạch và tăng protein dịch não tủy dẫn đến phù não do ngộ độc tế bào

Hình 1.2 Sơ đồ cơ chế vi khuẩn N meningitidis gây nhiễm trùng viêm màng não

(Nguồn: Nature Reviews Neuroscience)

1.1.1.4 Tính chất kháng nguyên bề mặt

N meningitidis có kháng nguyên vỏ là polysaccharid Dựa vào kháng nguyên

này - hiện nay ít nhất có 13 nhóm kháng nguyên đã được biết, trong đó 9 nhóm thường gặp là A, B, C, D, X, Y, Z, W-135 VÀ 29-E; bốn nhóm còn lại là H, I, K và L thì hiếm gặp hơn Các nhóm A, B, C thường gây thành dịch

Các kháng nguyên của N meningitidis, đặc biệt là các kháng nguyên

polysaccharid như các lông đuôi pili; protein PorA; protein porin… có thể tìm thấy trong máu và trong dịch não tủy; người ta đã lợi dụng đặc điểm này để chẩn đoán

nhanh N meningitidis bằng các kỹ thuật miễn dịch [1]

Hình 1.3 Cấu trúc bề mặt của vi khuẩn Neisseria meningitidis cắt ngang

(Nguồn: Nat Rev Neurol doi:10.1038/nrneurol.2011.141)

1.1.2 Đại cương về bệnh viêm não mô cầu 1.1.2.1 Triệu chứng bệnh

Theo tổ chức y tế thế giới, các triệu chứng viêm não mô cầu xuất hiện đột ngột

và phổ biến nhất là: triệu chứng của bệnh gồm sốt cao, nhức đầu, ói mửa Sau đó da nổi những vết thâm tím - tử ban Người bệnh nhiễm trùng huyết thể cấp thường khởi bệnh đột ngột, sốt cao 39 - 400C, ớn lạnh, rét run nhiều lần, nhức đầu, nôn ói, đau khớp, thở nhanh, huyết áp có thể thấp Các triệu chứng thường gặp như: sốt, lạnh run, nổi nhiều chấm đỏ ở chân các điểm xuất huyết ở chân (có đường kính 1 - 5mm) Người bệnh có biểu hiện sốt cao đột ngột, đồng thời phát ban đỏ ở cẳng chân, hai bên hông, mông hay xuất huyết dưới da với mảng xuất huyết to bằng đầu đũa hoặc đầu

ngón tay ở thể nhẹ hơn, vi khuẩn não mô cầu đi vào máu (không gây nhiễm trùng), màng não gây viêm màng não (gọi là viêm não mô cầu) Bệnh phát rất nhanh, chỉ

trong vòng một ngày [1]

1.1.2.2 Cơ chế sinh bệnh

Vi khuẩn não mô cầu khi thâm nhập cơ thể có thể đi đến nhiều cơ quan trong

cơ thể và gây bệnh ở đó Não mô cầu có nhiều thể bệnh như viêm họng do não mô cầu, nhiễm trùng huyết do não mô cầu, viêm màng não do não mô cầu Ở mỗi thể khác nhau, triệu chứng của người bệnh cũng biểu hiện khác nhau Thể thường gặp nhất của bệnh là thể nhiễm trùng huyết và viêm màng não mủ

Nhiễm trùng huyết do não mô cầu có ba thể là nhiễm trùng huyết cấp, tối cấp

và mãn tính Các thể bệnh thường gặp và nguy hiểm là: viêm màng não mủ và nhiễm trùng huyết Đặc biệt, bệnh nhân có thể bị kết hợp giữa viêm màng não mủ và nhiễm trùng huyết Thể nặng nhất là nhiễm trùng huyết tối cấp với 80% bệnh nhân nhiễm

có thể tử vong Bệnh diễn tiến rất nhanh, gây tử vong trong thời gian ngắn (từ 6 - 12 giờ sau khi phát bệnh), ngay cả khi bệnh nhân đã được điều trị tích cực

Thường gặp nhất là nhiễm trùng huyết thể cấp, sau đó là thể tối cấp, thể mãn tính rất hiếm gặp Triệu chứng phân biệt bệnh não mô cầu với những bệnh khác chính

là tử ban (mảng xuất huyết có hoại tử ở trung tâm), tử ban này lan nhanh về số lượng cũng như kích thước Khi tử ban lan nhanh, người bệnh cần thận trọng vì có thể sẽ rơi vào thể tối cấp Nhiễm trùng huyết tối cấp chỉ chiếm 10 - 20% các trường hợp nhiễm trùng huyết do não mô cầu

Triệu chứng ban đầu có thể như thể nhiễm trùng huyết cấp, nhưng những triệu chứng nặng sẽ xuất hiện rầm rộ trong 12 giờ Tử ban xuất hiện sớm và lan tràn rất nhanh về số lượng cũng như kích thước Những trường hợp nhiễm trùng huyết tối cấp có tỉ lệ tử vong rất cao Thể mãn tính thì ít gặp Trong bệnh nhiễm não mô cầu có thể nhiễm trùng huyết đơn thuần hoặc thể nhiễm trùng huyết kèm theo viêm màng não mủ Triệu chứng viêm màng não do não mô cầu lúc khởi bệnh rất khó phân biệt với trường hợp nhiễm trùng toàn thân Tuy nhiên trên một số bệnh nhân, bên cạnh biểu hiện nhiễm trùng huyết và tử ban, dấu hiệu viêm màng não nổi bật với độ nặng gia tăng dần như sốt, ói, nhức đầu, rối loạn tri giác (mê sản), biểu hiện dấu thần kinh khu trú như yếu, liệt, co giật [1]

1.1.2.3 Cách phòng tránh bệnh

Vi khuẩn N meningitidis lây nhiễm qua đường hô hấp nên cách tốt nhất để

phòng bệnh là đeo khẩu trang, tránh tiếp xúc gần với người bệnh và phun xịt hóa chất diệt khuẩn tại ổ dịch Ngăn ngừa sự lây lan cho người khác qua đường hô hấp Nguy

cơ lây bệnh cao nhất thường ở trong tuần lễ đầu tiên khi tiếp xúc với người bệnh

Nên giữ vệ sinh môi trường thông thoáng, sạch sẽ Nếu có biểu hiện bệnh thì phải đến bệnh viện ngay để được điều trị sớm, vệ sinh cá nhân phòng bệnh, khử khuẩn Chloramin B 25%

1.1.2.4 Vacxin phòng chống bệnh viêm não mô cầu

Do hệ gene của vi khuẩn N meningitidis dễ xảy ra biến đổi, nhiều phương pháp

tiếp cận để tiêm phòng đã được khám phá Bộ gene của vi khuẩn liên tục thay đổi do chuyển gene theo chiều ngang, thay đổi độ dài của chuỗi gene lặp đi lặp lại và sự đột biến Ngoài ra, các protein trong và màng ngoài được điều chỉnh một cách dễ dàng bởi cơ thể có sự kéo dài của pili cần thiết cho việc gắn kết Do đó, đây là mục tiêu khi thiết kế vacxin và thuốc kháng sinh Các phương pháp chính xác nhất để xác định

vi khuẩn N meningitidis ở bệnh nhân liên quan đến việc xác định các gene, cụ thể

xác định sự biến đổi của bộ gene Mặc dù có những khó khăn trong điều trị và phòng ngừa, các nhà nghiên cứu đã phát triển các loại vacxin mới có hiệu quả bảo vệ chống lại viêm màng não ở mọi lứa tuổi

Tuy nhiên, việc tiêm phòng cũng đã gặp phải các vấn đề về việc không đặc hiệu

và không gây đáp ứng miễn dịch hoặc tăng tính nhạy cảm của vật chủ đối với các chủng không thể tiêm phòng Một phương pháp tiếp cận trong thiết kế vacxin là nhắm mục tiêu các phức hợp protein ngoài màng (OMP) Thông thường các protein nhắm

mục tiêu là các protein lớp bao gồm porA, porB, hoặc các protein gắn kết transferin,

hoặc protein gắn kết sắt Các protein này đặc hiệu đối với một số serogroups, không

phổ biến trong toàn bộ loài N meningitidis Do đó, mỗi vacxin OMP có thể bảo vệ

chống lại một nhóm huyết thanh cụ thể

Sự phát triển của các vacxin hiện nay đã trở nên quan trọng hơn bao giờ hết do tần suất dịch viêm màng não ở nước đang phát triển cùng với sự gia tăng số lượng dòng kháng kháng sinh Nếu hiệu quả của kháng sinh theo truyền thống được sử dụng

để điều trị nhiễm trùng đang giảm, thì các biện pháp phòng ngừa sẽ là cách tiếp cận chính được sử dụng để ngăn chặn dịch bệnh này Việc phát triển phương pháp chẩn đoán kịp thời cũng cho phép các bác sĩ bắt đầu điều trị viêm màng não một cách nhanh chóng Chẩn đoán sớm và điều trị cũng giúp ngăn chặn sự lây lan của bệnh nhiễm trùng trong các dịch bệnh

Hiện nay, tại Việt Nam đang sử dụng hai loại vacxin để tiêm phòng cho não mô cầu có tên thương mại là vacxin Meningococcal A+C, xuất xứ từ Pháp và VC-Mengoc-BC, xuất xứ từ Cuba Thành phần của vacxin VC-Mengoc-BC là phức hợp màng ngoài tinh khiết nhóm huyết thanh B và polysaccharide vỏ nhóm huyết thanh

C của não cầu Thành phần của vacxin Meningococcal A+C là polysaccharide tinh

khiết đông khô của vi khuẩn Neisseria meningitidis nhóm A và nhóm C

Tuy nhiên, mỗi loại vacxin chỉ phòng ngừa được một số chủng vi khuẩn não mô cầu nhất định nên việc nghiên cứu và đinh type huyết thanh của các chủng đang lưu hành tại Việt Nam để phần nào định hướng được việc ưu tiên sử dụng loại vacxin A+C hay BC Ngoài ra, điều này góp phần định hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất vacxin thế hệ mới - vacxin tái tổ hợp [26]

Ngày nay các tiến bộ nhanh chóng của ngành sinh học, dựa trên kiến thức miễn dịch học đã đặt nền tảng quan trọng cho vacxin thế hệ mới an toàn, hữu hiệu và nhiều ứng dụng Các vacxin hiện đang dùng để phòng bệnh viêm não mô cầu là những loại vacxin đang sản xuất theo phương pháp cổ điển Việc nghiên cứu về những gen quy định độc tố hay những gen kháng nguyên là cơ sở cung cấp cho việc sản xuất vacxin thế hệ mới - đây là hướng đi mới trên thế giới và Việt Nam Trong công nghệ này, người ta nhân bản (cloning) một số trình tự gen quan trọng để tạo protein tái tổ hợp cho vacxin, nên tiến trình làm kháng nguyên nhanh và đơn giản

Hình 1.4 Quy trình sản xuất vacxin thế hệ mới

(Nguồn: https://hoamunich.wordpress.com/2013/08/01/vaccine-the-he-moi/)

Những ưu điểm của phương pháp tạo vacxin thế hệ mới so với vacxin cổ điển như là: độ an toàn cao, tạo kháng thể mạnh và chuyên biệt, thời gian sản xuất nhanh

giải mã, đây là mốc son đánh dấu cho những nỗ lực trong nghiên cứu về bệnh màng não cầu và là bước đệm cho sự phát triển toàn bộ lĩnh vực này Năm 2000 các trình

tự hệ gene của một chủng thuộc serogroup A và một chủng thuộc serogroup B đã được hoàn thành điều này mở ra những con đường mới cho nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng dụng

Cho đến nay hệ gene của một số serogroup của vi khuẩn Neisseria meningitidis

được giải trình tự và công bố trên NCBI như là: Hệ gene serogrop B chủng H44/76 (2011); hệ gene serogrop B chủng MC58 (2000); hệ gene serogroup A chủng NMA510612 (2014)…

Hình 1.5 Hệ gene của vi khuẩn Neisseria meningitidis chủng MC58

(Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term/Neisseria+meningitidis)

Mỗi hệ gene bao gồm một nhiễm sắc thể tròn duy nhất và kích thước hệ gene trung bình vào khoảng 2.193 ± 0.056 Mb với tỷ lệ G + C trung bình 51,63 ± 0.25% [8][43] Cùng với đó, tất cả các dữ liệu khác như nội dung G + C, số operon rRNA, gen tRNA hoặc các trình tự mã hóa (CDS) cũng khá tương đồng cho tất cả các dòng (vận chuyển hoặc cách ly bệnh), phức tạp không xác định hoặc nhóm huyết thanh Đặc biệt, tất cả các chủng chứa khoảng 1971 ± 78 CDS với chiều dài trung bình của CDS là 885 ± 22 bp dẫn đến mật độ mã hóa là 78,7 ± 2,4% Ngoài các CDS này, bộ

gene của N meningitidis cũng chứa một số lượng đáng kể giả bộ [29]

Để thấy được rõ hơn sự tương đồng của các serogroup ta quan sát thông tin hệ gen của các chủng qua bảng 1.1

Bảng 1.1 Thông tin hệ gene của ba chủng N meningitidis

Mặc dù có sự tương đồng về kích thước hệ gene, tuy nhiên vi khuẩn

N.meningitidis lại dễ biến dị và có khả năng kháng lại vacxin Việc dễ biến đổi đó

xảy ra ở các gene kháng nguyên bề mặt Các serosubtype dùng để xác định các epitope được giới hạn bởi hai khu vực của protein PorA là VR1 và VR2, cùng với đó là sự có mặt của các gene mã hóa cho protein PorB và gene mã hóa kháng nguyên gắn yếu tố H

(fHbp) Như vậy, việc đa dạng các serotype/serosubtype và biến đổi di truyền nhanh

xảy ra ở các gene kháng nguyên bề mặt và gen quyết định độc tố

1.2.2 Đặc điểm gene đích phát hiện vi khuẩn Neisseria meningitidis

Một vài vùng gene bao gồm: ctrA, porA, crgA đã được sử dụng rộng rãi trong các thử nghiệm PCR cơ bản [12] [37] Đặc thù hơn nữa gene sacB và siaD đã sử dụng

để định genogroup cho hầu hết các nhóm: A, B, C, W135 và Y [3] [2]

Sự thay đổi vùng gene mã hóa capsule trong choromosome đã tạo ra sự khác nhau trong nhóm huyết thanh Gene mã hóa capsule bao gồm các vùng A, B, C, D

- Vùng C bao gồm 4 gene (ctrA, -B ,-C và –D), cần thiết cho vận chuyển capsule

tới màng [38]

- Vùng D gồm có một loạt các gene (rmlA, -B, và –C, galE), không liên quan tới

biểu hiện capsule, nhưng chịu trách nhiệm tổng hợp LOS (lipo-oligosaccharide) [4]

- Vùng E chỉ có một gene đó là gen tex với chức năng điều chỉnh tổng hợp

CPS[13]

Trình tự gene trong vùng A cho sự khác biệt riêng của từng nhóm huyết thanh,

và vùng B, C, D và E có sự bảo thủ cao giữa Nhóm huyết thanh (A; B; C; Y; W135; X; Z; 29E) [40]

Hình 1.6 Đặc điểm gen mã hóa kháng nguyên của N.meningitidis

(Nguồn: Vũ Thị Xuân Thu, Đại học Quốc gia Hà Nội)

Hai gene đích đặc hiệu cho loài N meningitidis (CtrA và sodC) đây là gene vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào Gene CtrA có tính bảo thủ cao và thường được

sử dụng trong các phản ứng PCR nó là gene trong vùng mã hóa capsule Tuy nhiên,

không dưới 16% mất CtrA ở người mang mầm bệnh không triệu chứng [5] [10][33] Thử nghiệm gene đích không làm biến đổi Cu, Zn và muối Ca đó là gene SodC, không thuộc vùng gene mã hóa capsule, thử nghiệm SodC trực tiếp phát hiện vỏ của cầu

khuẩn (encapsuleated), nhưng nó hoàn toàn được sử dụng cho phát hiện cầu khuẩn

màng não ở người mang mà ở đó không có gene CtrA, đó là lý do cần thiết gene SodC

bổ xung trong phát hiện N meningitidis

1.2.3 Kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn Neisseria meningitidis

Lớp polysaccharide (PS) nang: là kháng nguyên vỏ, có tác dụng tạo kháng thể bảo vệ (ngoại trừ nhóm B) Căn cứ vào tính không đồng nhất về cấu trúc và tính kháng nguyên của PS người ta, đã tìm được 13 nhóm huyết thanh của cầu khuẩn màng não bao gồm: A, B, C, D, 29E, H, I, K, L, W135, X, Y, Z Nhóm huyết thanh

A chứa mannosamine phosphate, trong khi đó nhóm huyết thanh B, C, Y, W135 chứa acid sialic-chất đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại và độc tính Polysaccharide

vỏ của nhóm huyết thanh B và C bao gồm homopolymer của acid N - acetyl - neuraminic liên kết với α - 2,8 và α - 2,9 Sự khác nhau nhỏ trong cấu trúc dẫn đến các đặc tính miễn dịch khác nhau một cách rõ ràng: trong khi cấu trúc α - 2,9 là kháng nguyên mạnh đối với cơ thể và sinh ra kháng thể bảo vệ thì α - 2,8 lại có tính kháng

nguyên rất yếu

Hình 1.7 Hình ảnh màng tế bào N meningitidis cắt ngang[7]

(Nguồn: Vũ Thị Xuân Thu, Đại học Quốc gia Hà Nội)

- Lớp lipo-oligosaccharide (LOS) - Endotoxin:

Cấu tạo của LOS gồm một glycolipid màng ngoài nhưng khác với

lipopolysaccharide (LPS) của Enterobacteriaceae vì thiếu các chuỗi O đặc trưng và

hình thái “xù xì” (ráp) tương tự như của LPS Nó bao gồm 3 thành phần chính: oligosaccharide nhân; lipid A kỵ nước (thành phần gây độc); một chuỗi oligosaccharide

A

nhánh có thể thay đổi (thành phần tạo miễn dịch) Gene glycosytranspherase (lgt) trên

nhiễm sắc thể đảm nhiệm việc sinh tổng hợp của các chuỗi oligosaccharide khác nhau

4 glycosyltranspherase (lgtA, lgtC, lgtD và lgtG), sử dụng để phân loại các chủng thành

12 type miễn dịch khác nhau Type miễn dịch L1 - L8 liên quan chi phối đầu tiên tới não mô cầu nhóm huyết thanh B, C, trong khi đó type miễn dịch L9 - L12 liên quan

đến các chủng não mô cầu nhóm A Gene truyền ngang của các Neisseria hoại sinh chi phối tính đa dạng về gene của vị trí lgt

- Màng ngoài chứa hơn 50% LOS, nó tương tự như polysaccharide của vi khuẩn Gram âm và chứa lipid A

- Lớp protein của màng ngoài (PorA và PorB): đặc hiệu type huyết thanh và

phân type huyết thanh màng ngoài não mô cầu chứa một số protein màng ngoài chính

(OMPs): chức năng của PorB và PorA như porin, cho phép các chất dinh dưỡng đi

vào Giống như hầu hết các kháng nguyên bộc lộ trên bề mặt não mô cầu, độ lớn của kháng nguyên giữa các chủng là khác nhau Do đó, có thể sử dụng chúng để phân loại

não mô cầu thành các nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết thanh Các chủng N meningitidis được phân chia thành trên 20 nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết

thanh khác nhau chủ yếu ở nhóm huyết thanh B, C Nhiều chủng phân lập không thể phân loại được là nhóm huyết thanh hay phân nhóm huyết thanh bằng kháng thể đơn dòng hiện tại

- Cấu trúc kháng nguyên của nhóm huyết thanh và phân nhóm huyết thanh thay

đổi invivo một cách nhanh chóng trên một cá thể người và trong cộng đồng Các vòng

(mạch) có thể thay đổi trên bề mặt lộ diện của cả hai porins, có thể thay đổi về mặt kháng nguyên bằng cách thêm vào hoặc bớt đi amino-acid hoặc truyền ngang các mảnh phụ của các gene đại diện Sự thay đổi này làm cho việc phát triển vắc xin mới hết sức khó khăn

- Kháng nguyên X: kháng nguyên này chung với cầu khuẩn lậu, cầu khuẩn phổi Kháng nguyên này được dùng trong một số kỹ thuật chẩn đoán huyết thanh

Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài này, chúng tôi sẽ phân tích và so sánh trình tự

nucleotide, acid amin của gene porA và gen mã hóa gắn yếu tố H(fHbp) để làm sáng tỏ sự

biến đổi di truyền của các chủng Đây là hai gen đặc trưng và thành phần quan trọng cho việc sản xuất vacxin

1.2.3.1 Đặc điểm của gene porA

Trong số các protein màng ngoài thì protein PorA là một phần không thể tách rời vì

nó đặc trưng cho Neisseria meningitidis Việc xác định các biến thể của gene porA rất quan

trọng vì protein PorA là thành phần gây miễn dịch chủ yếu của một số vacxin màng não

mô cầu đang được phát triển và các đặc tính của porA được sử dụng để cung cấp thông tin

chi tiết về dịch tễ học Một số vacxin phòng bệnh viêm màng não đang được phát triển có chứa protein PorA như một thành phần chính

Dưới đây là vị trí của gene porA và fHpb trong bộ gen của vi khuẩn Neisseria meningitidis (Hình 1.7)

Hình 1.8 Vị trí của các gene porA và fHpb trong bộ gen của vi khuẩn Neisseria

meningitidis (chỗ in đậm)

(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

Trong lịch sử, serosubtypes porA đã được xác định bởi phản ứng kháng thể đơn dòng Tuy nhiên, phân tích trình tự nucleotide của các gene porA đã xác định rằng các

kháng thể monoclonal serosubtyping không đầy đủ và không thể phát hiện nhiều biến thể

porA Vì thế, để so sánh và cung cấp đầy đủ thông tin thì một cơ sở dữ liệu có thể truy cập

và mô tả danh pháp gene porA và mối quan hệ của nó với các trình tự gen tham chiếu đã

được thiết lập (có sẵn tại: http://neisseria.org/nm/typing/pora)

Phân tích chuỗi nucleotide của các gene porA từ nhiều chủng khuẩn cầu màng não

đã xác định rằng meningococci thường chỉ có một phần serosubtyped và số lượng ngày

càng tăng của các chủng biến đổi serosubtypeable, hoặc vì porA không được biểu hiện Các phân lập này có thể được mô tả đầy đủ dựa trên các trình tự axit amin PorA VR1 và

VR2 được rút ra từ dữ liệu trình tự nucleotide

Khi nghiên cứu về sinh học phân tử của gene porA cho thấy porA là gene mã hóa

cho lớp protein lớp màng ngoài có ở hầu hết các chủng được phân lập và chứa hai vùng

biến đổi chính là VR1 và VR2 Trong đó, VR1 có 249 chuỗi peptide và VR2 có 694 chuỗi

peptide và gene porA có chiều dài khoảng 1176 bp [17]

Một số nghiên cứu trên thế giới về việc sử dụng porA làm vacxin như của S.LMartin (2000) [27] đã sử dụng vacxin này có chứa 6 loại porA OMP khác nhau, mỗi đại diện

cho một serosubtype khác nhau Tuy nhiên, biến thể xảy ra ở các vùng biến thiên (VRs) mã hoá các serosubtypes này Như vậy, nghiên cứu này chúng tôi sẽ xem xét

sự biến thể các chủng bằng cách so sánh trình tự nucleotide qua kênh dữ liệu (http://neisseria.org/nm/typing/pora)

1.2.3.2 Đặc điểm của gen fHpb

Các nghiên cứu kết hợp gene gần đây của các nhà khoa học khi nghiên cứu về hệ

gene của vi khuẩn Neisseria meningitidis đã phát hiện trên nhiễm sắc thể có một yếu

tố mã hóa gene H (factor H - fH) (chất điều hòa của hệ thống bổ thể) có liên quan đến

sự nhảy cảm của bệnh viêm não mô cầu

fH có trong huyết thanh và liên kết với bề mặt của tế bào màng trong các polyanion, như glu-cosaminoglycans, fH biểu hiện lên bề mặt tế bào bằng cách gắn

kết với yếu tố H(fHbp) một lipoprotein 27 kDa liên kết amino axit ngắn Trong khi

các carbohydrate tích tụ trên bề mặt của vỏ mạch kết mạch liên kết với fH, các axit

amin tích điện trong fHbp gắn fH ở các vị trí nano trong cùng một vị trí Ngoài ra, nó

đã được chỉ ra rằng fH cũng có thể liên kết với NspA trên bề mặt của một số chủng

viêm màng não cầu khuẩn [18]

Dựa trên sự khác nhau trong trình tự nucleotide và các chuỗi axit amin Gene

fHbp bao gồm hai phân họ (A và B) hoặc ba nhóm biến thể (V1, V2 và V3) [31], với

phân họ A tương ứng với V2 và V3 và phân họ B là V1 (là loài phổ biến nhất) [17][31]

Để so sánh và cung cấp đầy đủ thông tin thì một cơ sở dữ liệu có thể truy cập và mô tả

danh pháp gen fHbp và mối quan hệ của nó với các trình tự gen tham chiếu đã được thiết

lập (có sẵn tại: http://neisseria.org/nm/typing/fHbp)

Nếu không có dãy tín hiệu, khung đọc mở (ORF) của fHbp V1 thường dài từ

765 đến 789 bp và mã hóa một protein bao gồm 255 đến 263 amino axit

fHbp cũng là một kháng nguyên gợi ý đáp ứng kháng thể diệt khuẩn trong huyết

thanh ở những người được phòng ngừa và là thành phần quan trọng của các vacxin

dự phòng để dự phòng bệnh viêm màng não mô cầu, đặc biệt là do serolog nhóm B,

hiện đang được đánh giá trong các thử nghiệm lâm sàng Tiêm chủng chuột có fHbp

từ các biến thể 2 và 3 tạo ra đáp ứng với một số phản ứng miễn dịch chéo [19] Trong một vài phân tích kiểu gene gần đây về các mẫu vacxin tiềm năng, họ đã

xác định các chủng từ những người bị bệnh viêm màng não cầu lây lan, trong đó fHbp

có đột biến thay đổi khung hoặc hoàn toàn vắng mặt; những chủng này có thể sẽ thiếu biểu hiện yếu tố độc lực quan trọng này Ở đây chúng tôi sẽ nghiên cứu trình tự

nucleotide của gen fHbp để thấy được sự đa dạng và tiềm năng sử dụng làm vacxin

của các chủng phân bố tại miền bắc Việt Nam

1.3 Tình hình nghiên cứu Neisseria Meningitidis và bệnh não mô cầu trên thế giới

Năm 1884 Ettore Marchiafava và Angelo Celli lần đầu tiên quan sát được vi khuẩn trong tế bào ở dịch não tủy Năm 1887 Anton Weichselbaum phân lập được vi khuẩn từ

dịch não tủy của bệnh nhân viêm màng não do vi khuẩn và đặt tên là: Diplococcus intracellularis meningitidis Sau đó, năm 1901 Albrecht và Ghon đã đổi thành Neisseria meningitidis để ghi công Albert neisser- nhà khoa học người Đức

Neisseria meningitidis là nguyên nhân chính gây viêm màng não mô cầu ở trẻ

em và trẻ vị thành niên trên quy mô toàn cầu Số lượng người nhiễm viêm màng não

mô cầu hàng năm trên thế giới dao động tùy vào các vùng địa lý, với số ca nhiễm

<0,5 ca/ 100000 người ở Bắc Mỹ, hay <1 ca/ 100000 người ở Châu Âu tới 10 – 1000 ca/ 100000 người ở Châu Phi Trung bình hàng năm trên thế giới ước tính có 1,2 triệu người nhiễm viêm màng não cầu khuẩn/ năm, với tỷ lệ tử vong khoảng 135000 ca/ năm Tại Châu Phi, vi khuẩn này đã gây ra hàng ngàn trường hợp viêm màng não mô cầu mỗi năm, trong đó tiểu vùng Saharan được gọi là “vành đai” của bệnh

Các type huyết thanh của N meningitidis có thể được phân biệt chi tiết hơn thành

các subtype huyết thanh bằng cách sử dụng các protein kháng nguyên bề mặt PorB lớp 2 hoặc 3, và PorA lớp 1 [22] Các kỹ thuật điện di enzyme đa locus và typing đa locus (multilocus sequence typing – MLST) là những kỹ thuật phòng thí nghiệm hữu

ích để phân biệt rõ hơn các chủng N meningitidis gây bệnh có quan hệ gần gũi trên

phạm vi toàn thế giới

N meningitidis có thể lây nhiễm từ người sang người qua đường không khí và

thường cư trú ở hệ hô hấp trên (mũi họng) mà không gây triệu chứng gì Tỷ lệ mang

N meningitidis trung bình trong quần thể là khoảng 10%, tuy vậy tỷ lệ này khác biệt

rất lớn giữa các cấu trúc quần thể Chẳng hạn, các quần bán kín, như các doanh trại

quân đội, có tỷ lệ nhiễm N meningitidis cao hơn trung bình rất nhiều, có trường hợp

> 60% Tỷ lệ mang N meningitidis tạm thời (vài ngày hoặc vài tuần) là khoảng 35% quần thể và khoảng 25% quần thể có thể mang N meningitidis trong vài tháng mà không có biểu hiện triệu chứng bệnh gì Không phải trường hợp nào có N meningitidis

cư trú trong đường hô hấp trên cũng gây ra viêm màng não mô cầu [23]

Để phòng tránh viêm màng não mô cầu, nhiều quốc gia phát triển trên thế giới

đã đưa vacxin viêm màng não vào chương trình vacxin thường niên Trong đó, vacxin

cho Neisseria meningitidis type A đã được triển khai ở một số quốc gia châu Phi

thuộc vành đai viêm màng não trải từ Senegal tới Ethiopia Tại Châu Á việc sử dụng vacxin để ngăn chặn sự bùng phát của bệnh viêm màng não mô cầu được sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, những thông tin về hiệu quả của vacxin vẫn còn hạn chế Thêm vào đó, thông tin về đặc điểm di truyền của các nhóm huyết thanh đang lưu hành còn

vacxin cho Neisseria meningitidis còn tương đối hạn chế ở nhiều quốc gia trên thế

giới do thiếu các số liệu đánh giá thống kê cụ thể về mức độ lây nhiễm viêm màng não mô cầu và các chủng gây bệnh chính cho từng quốc gia [32][24]

Cho đến nay chưa có nghiên cứu hệ thống nào về tình hình viêm màng não mô cầu ở Châu Á, đa số các số liệu về viêm màng não mô cầu là những mô tả các đợt bùng phát dịch ở cấp địa phương hoặc trên diện rộng hơn, các trường hợp phát hiện

Neisseria meningitidis ngẫu nhiên trong các nghiên cứu về các đối tượng gây bệnh khác như Haemophilus influenza nhóm B (Hib) hoặc Streptococcus pneumonia, hay

các nghiên cứu theo dõi từ bệnh viện nhằm ước tính các thiệt hại do viêm màng não

mô cầu gây ra, các pháp đồ điều trị và kết quả thu được Chỉ có một số quốc gia Châu

Á là Nhật Bản, Hong Kong, Hàn Quốc, Philipin, Singapore, Thái Lan và Đài Loan là

có hệ thống điều tra kiểm soát quốc gia bắt buộc dành cho viêm màng não mô cầu,

dù tất cả các hệ thống này chỉ dựa vào các trường hợp được báo cáo thụ động Điều này thể hiện sự thiếu quan tâm của chính phủ đối với viêm màng não mô cầu, và gần như không có đủ thông tin để đánh giá chất lượng hệ thống điều tra kiểm soát quốc gia ở các nước này

Neisseria meningitidis là vi khuẩn tương đối khó nuôi cấy, dễ bị ảnh hưởng bởi

quá trình làm lạnh và làm khô, cùng với thói quen sử dụng kháng sinh tràn lan ở Châu

Á khiến việc phát hiện N meningitidis trong dịch não tủy bằng phương pháp nuôi cấy

là tương đối hạn chế [16] Tỷ lệ vi khuẩn phát hiện được từ các mẫu máu hay dịch não tủy bằng phương pháp nuôi cấy là tương đối thấp ở đa số các công bố từ trước đến nay và có xu hướng giảm dần, lý do chính là do việc lạm dụng kháng sinh Kỹ

thuật PCR khắc phục được các hạn chế của kỹ thuật nuôi cấy trong việc phát hiện N meningitidis ở các bệnh nhân, đặc biệt là các trường hợp đã từng sử dụng kháng sinh,

mặc dù vậy kỹ thuật này chưa được ứng dụng rộng rãi [30]

Ngoài những khó khăn kỹ thuật nêu trên, các yếu tố kinh tế và xã hội cũng gây

trở ngại đáng kể đến việc phát hiện N meningitidis, chẳng hạn các báo cáo ở bệnh

viện ước tính trong 435 trường hợp viêm màng não ở Malaysia, chọc dò tủy sống chỉ được thực hiện ở 71 (16.3%) trẻ em do niềm tin phổ biến ở cộng đồng địa phương rằng chọc dò tủy sống dẫn đến bệnh liệt hoặc liệt dương sau này Tại Pakistan, người

ta ước tính rằng chỉ có 50% trẻ bị viêm màng não có thể đến bệnh viện Kết hợp với các khó khăn về kỹ thuật chẩn đoán, có thể khẳng định, các số liệu có được về viêm màng não ở Châu Á chưa phản ánh hết thực tế tình hình lây nhiễm bệnh hiện nay Số liệu điều tra về viêm màng não tại một số quốc gia Châu Á được tổng kết ở Bảng 1.2

dưới đây [36]

Bảng 1.2 Số liệu điều tra về viêm màng não tại một số quốc gia Châu Á

Quốc gia Năm điều

tra

Týp huyết thanh

Số ca nhiễm

Số ca tử vong (%)

Tỷ lệ nhiễm (/100000 người)

Đài Loan 1933-1946 A Chưa rõ Chưa rõ Chưa rõ

1919-1926 A Chưa rõ Chưa rõ Chưa rõ Việt Nam 1977- 1979 C Chưa rõ 27,4- 34,7 >20

(Tổng hợp theo (Vyse, Wolter và cộng sự 2011))

Mặc dù các nghiên cứu thống kê tình hình dịch tễ viêm màng não mô cầu ở Châu

Á còn rất hạn chế, có thể thấy rõ gánh nặng y tế và kinh tế do viêm màng não mô

cầu gây ra bởi các chủng N meningitidis đang lưu hành trên phạm vi toàn châu lục

với các mức độ khác nhau ở từng quốc gia Các nhân tố chính ảnh hưởng đến mức

độ lây nhiễm và phân bố của N meningitidis tại mỗi quốc gia là yếu tố khí hậu, địa

chính trị, chất lượng dịch vụ chăm sóc sức khỏe, tình hình kinh tế và tôn giáo ở từng

Trung Quốc, Hong Kong, Ấn Độ, Mông Cổ, Nepal, Parkistan, Philippin và Đài Loan

Từ năm 1980 đến nay, đã có 6 dịch viêm màng não mô cầu do N.meningitidis type

A đã được ghi nhận ở Châu Á, bao gồm hai dịch ở Ấn Độ, ngoài ra ở Mông Cổ, Nepal, Parkistan và Philippin, với tổng số gần 10000 ca nhiễm được báo cáo Tỷ lệ

tử vong thống kê được từ 7% đến 33% trong các lần dịch Gần đây, một số type N meningitidis khác đã được phát hiện gây các dịch viêm màng não địa phương tại

Trung Quốc (týp C), Singapore (týp W-135) và Đài Loan (type Y)

1.4 Tình hình nghiên cứu Neisseria Meningitidis và bệnh não mô cầu tại Việt Nam

Các tài liệu nghiên cứu về tình hình dịch tễ viêm màng não mô cầu ở Việt Nam còn rất hạn chế Theo một số tài liệu ban đầu ghi lại dịch viêm màng não mô cầu do

vi khuẩn N meningitidis nhóm C gây ra ở các tỉnh miền nam của Việt Nam từ năm

1977 đến 1979, tỷ lệ tổng thể của bệnh viêm màng não trong dịch tăng từ <5 ca nhiễm /100000 người trong những năm trước đến >20 ca /100000 người Tỷ lệ tử vong ước tính khoảng từ 27,4% đến 34,7% Bảy mươi phần trăm trường hợp xảy ra ở trẻ em từ

3 đến 15 tuổi Sau đại dịch viêm màng não năm 1977, bốn nghiên cứu theo dõi theo thời gian của bệnh viêm màng não đã được tiến hành từ năm 1993 đến 2005 Trong

đó, viêm màng não mô cầu chiếm 0,5% các trường hợp dương tính xác định bằng phương pháp nuôi cấy từ mẫu máu và khoảng 4 – 8,5% các trường hợp viêm màng não do vi khuẩn với nguyên nhân đã được xác định Từ năm 2000 đến năm 2002, ước tính tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não mô cầu ở Hà Nội, Việt Nam là 21,8 ca nhiễm /100000 trẻ em từ 7 – 11 tháng tuổi (95% CI 5.0-94.4) và 2,6 ca nhiễm /100000 trẻ

em dưới 5 tuổi (95% CI 0.8-8.5) (DD 2006) Tuy vậy, không có dữ liệu về các nhóm huyết thanh gây bệnh trong nghiên cứu này [22]

Nghiên cứu đầy đủ gần đây nhất về tình hình viêm màng não mô cầu và nhiễm

Neisseria meningitidis ở trẻ em Việt Nam được công bố bởi Kim và cộng sự, theo

điều tra khảo sát thu mẫu trên 700 trẻ dưới 5 tuổi tại Hà Nội, sử dụng kỹ thuật PCR

đặc hiệu, phát hiện tỷ lệ nhiễm N meningitidis ở nhóm đối tượng này là 14,2% [21] Bên cạnh N meningitidis, Hib và S pnemoniae là hai nhóm vi khuẩn chính gây viêm

màng não mô cầu ở trẻ em Việt Nam trong điều tra nói trên Các triệu chứng bệnh ở

trẻ Việt Nam nhiễm N meningitidis gồm sốt và nhiễm trùng máu (74,5%), động kinh (46,4%) Trong 44 mẫu dương tính với N.meningitidis thu được, có 20 (91%) mẫu

dich não tủy từ Việt Nam thuộc nhóm huyết thanh C và 2 (9%) thuộc nhóm huyết thanh B[21]

Một số công trình nghiên cứu của các tác giả gần đây như là: Vũ Thị Xuân Thu

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính kháng kháng sinh Neisseria Meningitidis tại

các ổ dịch lưu hành trong quân đội” năm 2015 tại đại học Quốc gia Hà Nội Tuy nhiên, công trình này chỉ dừng lại ở mức độ tìm hiểu đặc điểm sinh học và tính nhảy

cảm của vi khuẩn Neisseria Meningitidis kháng kháng sinh Như vậy, theo tìm hiểu

của chúng tôi, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào được tiến hành nhằm đánh giá các biến đổi di truyền hoặc các gen quy định độc lực của các nhóm huyết thanh gây

bệnh của N meningitidis tại các tỉnh miền Bắc, Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là chủng vi khuẩn phân lập từ các bệnh phẩm dịch não tuỷ hoặc dịch nhầy họng của bệnh nhân mắc bệnh viêm não mô cầu được chuẩn đoán bằng các triệu chứng lâm sàng và các trường hợp nghi nhiễm tại viện Phòng dịch quân đội Dưới đây là danh sách các mẫu mà chúng tôi thu được nghiên cứu phục vụ cho nghiên cứu này (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

- Vi khuẩn Neisseria Meningitidis gây bệnh viêm não mô cầu

- Gen porA và gen fHpp của vi khuẩn Neisseria Meningitidis

+ Bộ Pipetman (10 lµ , 20 lµ ,100 lµ , 200 lµ , 1000 lµ ) + Máy tính và các phần mềm tin học

- Các vật tư tiêu hao: dao, kéo, panh, kẹp, phiến kính, đĩa petri, các loại Eppendorf, các loại đầu côn, lọ đựng môi trường, ống nuôi vi khuẩn

2.1.4 Các dung dịch dùng để điện di trên gel agarose

- Dung dịch đệm TAE đặc 50X (100ml): Tris-kiềm: 24,2%; Axit axetic 5,71ml;

EDTA 0,5M (pH=8,0): 10ml

- Dung dịch đệm TAE 1X: pha loãng 50 lần từ TAE 50X

- Đệm tra mẫu 6X (loading dye): Bromophenol blue: 0,25%; Xylen cyaanol FF 0,25%; Glycerol: 30%

- Dung dịch nhuộm gel: Ethidium bromide (Etbr) : 0,5 mg/ml

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thu mẫu tại viện Phòng dịch quân đội (21 Trung Liệt, Đống Đa, Hà Nội)

- Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam (18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội)

- Thời gian nghiên cứu: 10/ 2016 – 06/ 2017

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định sự có mặt của Neisseria meningitidis trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR

- Mẫu bệnh phẩm được xử lý tại phòng thí nghiệm viện phòng dịch quân đội bằng các phương pháp vi sinh và hóa sinh tiêu chuẩn để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

- Các mẫu sau khi phân lập được đưa về phòng vi sinh phân tử của viện Công nghệ Sinh học để tiến hành tách chiết và giải trình tự DNA

- Để nhận biết được sự có mặt vi khuẩn Neisseria meningitidis chúng tôi sử dụng

phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu như CtrA; crgA (dựa trên sự tham khảo các nghiên cứu trước đó)

2.3.2 Tách chiết DNA tổng số

Mẫu vi khuẩn được giữ trong NaCl 0.9% Bổ sung đệm chiết với nồng độ cuối cùng 4% SDS, 10 mM EDTA vào ống và trộn đều bằng máy vortex Bổ sung tiếp 10ul Proteinase K vào mẫu và ủ ở 60ᴼC trong 2 tiếng Chiết DNA 2 lần với một tỉ lệ tương đương của Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol (25:24:1) và sau đó là Chloroform: Isoamyl Alcohol (24:1) Tiếp đó tủa DNA với Isopropanol với tỉ lệ tương đương, để qua đêm Thu tủa và rửa tủa DNA với EtOH lạnh 70% bằng ly tâm 12.000 rpm trong 15 phút Cô mẫu DNA trong điều kiện chân không với máy miVac trong 3 phút DNA được hòa lại vào đệm TE và bảo quản ở tủ -20ᴼC để dùng cho các

thí nghiệm tiếp theo

2.3.3 Định type Neisseria meningitidis trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp PCR

Type Neisseria meningitidis được xác định bằng việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu allele cho gen siaD và mynB tham khảo từ công bố trước đó và các cặp mồi

được thiết kế mới

Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi sử dụng để định type huyết thanh của vi khuẩn

Neisseria meningitidis thu được tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

N.meningitidis B

synD F737

R882

GCTACCCCATTTCAGATGATTTGT ACCAGCCGAGGGTTTATTTCTAC

N.meningitidis C

synE F478

R551

CCCTGAGTATGCGAAAAAAATT TGCTAATCCCGCCTGAATG

Các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự chuỗi nucleotide của

các chủng Neisseria meningitidis đã được đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tế sử

dụng các phần mềm tin sinh chuyên dụng như Bioedit, Primer3

2.3.4 Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên thạch agarose

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên thạch agarose 0,8 - 1%

- Chuẩn bị thạch agarose 1%: lấy 0,4g bột thạch agarose nguyên chất cho vào cốc đong thuỷ tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40ml đệm TAE 1 lần Cho vào lò vi sóng

đặt nóng chảy trong 3 phút sao cho agarose tan chảy hết Bổ sung 4 lµ ethidium bromide vào Đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào

và đổ ngập răng lược khoảng 5cm và để nguội ở nhiệt độ phòng Khi nguội, các răng lược sẽ tạo thành các giếng để chúng ta cho mẫu vật kiểm tra

- Dìm ngập khay có thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1 lần (đệm cung cấp ion cho điện trường hoạt động)

- Tra mẫu: lấy 5 lµ sản phẩm, trộm chỉ thị màu với mẫu và kiểm tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch

- Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 10 lµ chỉ thị phân tử (ADN marker)

- Chạy điện di ở 100 - 120V trong 25 - 30 phút

- Nhuộm thạch trong dung dịch nhuộm Ethidium bromide

- Rửa sạch thạch bằng nước cất, sau đó soi qua cực tím và chụp ảnh

2.3.5 Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm DNA cần được tinh sạch để loại bỏ các thành phẩm khác chỉ giữ lại DNA càng tinh khiết càng tốt Tinh sạch sản phẩm sử dụng bộ QIAquick PCR purification kit, như sau:

- Thêm 200 lµ PB vào 40 lµ sản phẩm, trộn đều

- Chuyển cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới

- Thêm 750 lµ PE, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới

- Ly tâm tiếp 13000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch bên dưới

- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới

- Thêm 30 lµ Eb, ly tâm 13000 vòng /phút trong 1 phút Sản phẩm PCR tinh sạch thu nhận, được kí hiệu mẫu và giữ ở - 200C cho đến khi sử dụng

2.3.6 Phân tích phát sinh chủng loại và nguồn gốc tiến hóa dựa trên trình tự

gene của các chủng Neisseria meningitidis

Các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn và các trình tự tham chiếu có sẵn trên GenBank sẽ được sử dụng cho việc phân tích trình tự trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) sử dụng công cụ nucleotide-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)

Bảng 2.4 Trình tự cặp mồi sử dụng để thu nhận gene fHbp của 19 chủng vi khuẩn

Neisseria meningitidis thu được tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

Gene f Hbp

CDC3UNI forward primer CDC5UNI reverse primer

GTCCGAACGGTAAATTATYGTG CTATTCTGVGTATGACTAG Tất cả các trình tự ADN sẽ được phân tích bằng phần mềm BioEdit Mô hình khoảng cách di truyền phù hợp nhất sẽ được lựa chọn với điểm BIC (Bayesian Information Criterion) thấp nhất Phương pháp Neighbor Joining và Maximum Likelihood sẽ được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA7

Phương pháp lặp mẫu được sử dụng là Bootstrap với số lần lặp mẫu là 1000