Tài liệu thí nghiệm CN protein - enzyme

Các bài thí nghiệm này giúp sinh viên nắm vững tính chất của protein – enzyme và hiểu rõ hơn các kiến thức lý thuyết đã học từ môn học Công nghệ Protein – Enzyme.. Thực hành Công nghệ Pr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG CĐ KINH TẾ CÔNG NGHỆ TPHCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*****************

GVGD: ThS Lê Thanh Hải

TPHCM, tháng 03 năm 2013

MỤC LỤC

LỜI NÓI ĐẦU 1

NỘI QUY THỰC TẬP 2

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN) 3

1/ Nguyên tắc 3

2/ Thực hành 3

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 3

2.2 Dụng cụ và thiết bị 3

2.3 Tiến hành 3

2.4 Kết quả 4

BÀI 2: PHẢN ỨNG BIURE 5

1/ Nguyên tắc 5

2/ Thực hành 5

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 5

2.2 Dụng cụ và thiết bị 5

2.3 Tiến hành 5

2.4 Kết quả 5

BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN CASEIN 6

1/ Nguyên tắc 6

2/ Thực hành 6

1.1 Nguyên liệu và hóa chất 6

1.2 Dụng cụ và thiết bị 6

1.3 Tiến hành 6

1.4 Kết quả 6

BÀI 4: SO SÁNH TÁC DỤNG XÚC TÁC CỦA ENZYME VỚI XÚC TÁC VÔ CƠ 7

1/ Nguyên tắc 7

2/ Thực hành 7

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 7

2.2 Dụng cụ và thiết bị 7

2.3 Tiến hành 7

2.4 Kết quả 8

BÀI 5: TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME 9

1/ Nguyên tắc 9

2/ Thực hành 9

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 9

2.2 Dụng cụ và thiết bị 9

2.3 Tiến hành 9

2.4 Kết quả 10

BÀI 6: TÁC DỤNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH VÀ CHẤT KÌM HÃM 11

1/ Nguyên tắc 11

2/ Thực hành 11

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 11

2.2 Dụng cụ và thiết bị 11

2.3 Tiến hành 11

2.4 Kết quả 12

BÀI 7: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE 13

1/ Nguyên tắc 13

2/ Thực hành 13

2.1 Nguyên liệu và hóa chất 13

2.2 Dụng cụ 13

2.3 Tiến hành 13

2.4 Tính kết quả 14

BÀI 8: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME ASCOBATOXIDASE 15

1/ Nguyên tắc 15

2/ Thực hành 15

2.1 Nguyên liệu và hoá chất 15

2.2 Dụng cụ 15

2.3 Tiến hành 15

2.4 Cách tính kết quả: 16

BÀI 9: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ DỨA (PHƯƠNG PHÁP LOWRY) 17

1/ Nguyên tắc 17

2/ Thực hành 17

2.1 Nguyên liệu và hoá chất 17

2.2 Dụng cụ và thiết bị 17

2.3 Tiến hành 17

2.4 Tính kết quả 19

BÀI 10: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME BROMELIN 20

1/ Nguyên tắc 20

2/ Thực hành 20

2.1 Dụng cụ 20

2.2 Hoá chất 20

2.3 Cách tiến hành 20

2.4 Kết quả 21

BÀI 11: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM α-AMYLASE THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH VÀ ROE 22

1/ Nguyên tắc 22

2/ Thực hành 22

2.1 Nguyên liệu và hoá chất 22

2.2 Dụng cụ và thiết bị 22

2.3 Cách tiến hành 23

2.4 Tính kết quả 25

LỜI NÓI ĐẦU

Giáo trình “Thực hành công nghệ protein – enzyme” được biên soạn nhằm phục vụ cho môn học thực hành công nghệ protein – enzyme của sinh viên chuyên ngành công nghệ thực phẩm

và sinh học ứng dụng – Khoa Công nghệ Sinh học – Trường Cao đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM Giáo trình được biên soạn dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu và sách thí nghiệm

về protein – enzyme trong và ngoài nước

Trong tài liệu này gồm 11 bài thực hành nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương tiện

và quy tắc an toàn thí nghiệm, sử dụng dụng cụ, thiết bị và thực hành thí nghiệm định tính, định lượng acid amin, protein, enzyme từ đơn giản đến phức tạp

Các bài thí nghiệm này giúp sinh viên nắm vững tính chất của protein – enzyme và hiểu rõ hơn các kiến thức lý thuyết đã học từ môn học Công nghệ Protein – Enzyme

Tác giả

ThS Lê Thanh Hải

5 Khi làm thí nghiệm phải trật tự, cẩn thận, giữ sạch nơi làm thí nghiệm, tiết kiệm hóa chất, làm vỡ hay gây hư hỏng thiết bị thì phải bồi thường

6 Sau khi thí nghiệm, sinh viên phải rửa sạch dụng cụ, sắp xếp lại dụng cụ, hóa chất đúng chỗ, lau sạch bàn thí nghiệm và bàn giao cho cán bộ phụ trách phòng thí nghiệm

7 Cuối buổi sinh viên phải nộp báo cáo kết quả lại cho giáo viên hướng dẫn

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN)

o Dung dich A: 27,8 g NaH2PO4 hoà tan trong 1000ml

o Dung dịch B: 53.05g Na2HPO4 7H2O hoặc 71.1g Na2HPO4.12H2O pha trong 1000ml

o Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Xác định hàm lượng nitơ amin trong nước mắm:

Nước mắm là một dung dịch thủy phân protein có thể định lượng nitơ bằng phương pháp chuẩn độ formol Do nước mắm có màu tối cần phải pha thật loãng mới có thể so màu của chất chỉ thị

Lấy 1ml nước mắm cho vào bình định mức 100ml, dùng nước cất định mức thành 100ml, lắc đều

Lấy vào bình erlen có cùng dung tích với 2 bình màu chuẩn 20ml dịch mẫu pha loãng từ bình định mức, thêm 5 giọt bromthymol blue Nếu dung dịch có màu xanh dương thì thêm từng giọt HCl hay H2SO4 0,05N; nếu dung dịch có màu vàng thì thêm từng giọt NaOH 0,05N cho đến khi dung dịch có màu ứng với màu của bình 1 có pH 7,0

Thêm 3 giọt phenolphtalein 0,5%; 4ml formol trung tính rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05N cho đến khi hỗn hợp có màu ứng với màu của dung dịch trong bình 2 có pH 9,2

Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu bằng nước cất

2.4 Kết quả

Số gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm:

= −  × × 0,0007 × 100 × 1000

20 × Trong đó:

x: lượng gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm

a: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm

b: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn V: số ml nước mắm cho vào bình định mức

0,0007: số gram nitơ với 1ml NaOH 0,05N

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 2: PHẢN ỨNG BIURE

1/ Nguyên tắc

Đây là phản ứng thường dùng để phát hiện liên kết peptide (-CO-NH-) Phản ứng xảy ra đối với các chất chứa từ hai liên kết peptide trở lên Phản ứng này dùng để định lượng protein bằng cách lập đồ thị chuẩn với các dung dịch protein chuẩn có nồng độ xác định nhờ kỹ thuật

so màu Nồng độ protein tối thiểu để định lượng chính xác là 10mg/ml

Tùy thuộc vào gốc R mà màu phản ứng có thể là màu xanh tím, tím hoặc hồng

2 – 3 giọt CuSO4 1%, lắc đều

2.4 Kết quả

Chụp hình, ghi màu và viết phương trình phản ứng của 2 phản ứng trên

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN CASEIN

1/ Nguyên tắc

Các phân tử protein là các polymer có tính điện ly lưỡng cực Trong dung dịch, khi pH thay đổi nó phân ly tạo thành các nhóm tích điện dương và các nhóm tích điện âm khác nhau Đối với mỗi protein sẽ có một giá trị pH xác định mà tại đó tổng số điện tích âm bằng tổng số điện tích dương, khi đó phân tử protein trung hòa về điện, pH đó gọi là điểm đẳng điện của protein Tại điểm đẳng điện, dung dịch protein không bền, dễ bị kết tủa

2/ Thực hành

1.1 Nguyên liệu và hóa chất

- Dung dịch acid acetic (CH3COOH) 0,1N : 100ml

- Dung dịch natri acetate (CH3COONa) 0,1N : 100ml

- Dung dịch casein 0,4%: Cân 0,4g casein cho vào becher 100ml và thêm 20ml dung dịch CH3COONa 0,1N Đặt lên nồi cách thủy đun nóng để hòa tan hoàn toàn Chuyển sang bình định mức 100ml và định mức tới 100ml bằng dung dịch

Lấy dung dịch CH3COOH 0,1N và nước vào 5 ống nghiệm theo thứ tự như bảng sau:

Lắc đều, sau đó thêm vào mỗi ống 1ml dung dịch casein và theo dõi sự biến đổi của chúng trong mỗi ống nghiệm

Bảng 1 Bố trí thí nghiệm xác định điểm đẳng điện của protein casein

Ở ống nghiệm có nhiều kết tủa nhất là điểm đẳng điện của casein

Chụp hình và ghi lại kết quả xác định pH đẳng điện của casein

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 4: SO SÁNH TÁC DỤNG XÚC TÁC CỦA ENZYME VỚI XÚC TÁC

VÔ CƠ

1/ Nguyên tắc

Chất xúc tác là chất làm cho phản ứng xảy ra nhanh hơn nhưng không bị tiêu hao trong quá trình phản ứng Enzyme là các chất xúc tác của các hệ thống sinh học Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước ở điều kiện nhiệt độ và pH ôn hòa

- Ống thứ hai: 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ ba: 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ tư: 1ml dung dịch HCl 1%

Sau đó đặt các ống nghiệp thứ nhất và thứ hai ở nhiệt độ phòng, ống thứ ba vào tủ ấm 60oC Đặt ống thứ tư vào nồi cách thủy đang sôi Sau 10 phút lấy các ống nghiệm ra, cho vào mỗi ống 5ml thuốc thử Lugol Đặt cả 4 ống vào nồi cách thủy trong 2 phút Lấy ra làm nguội và quan sát hiện tượng trong các ống nghiệm

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

2.4 Kết quả

Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:

Bảng 2 Bảng kết quả thí nghiệm so sánh tác dụng xúc tác của enzyme với xúc tác vô cơ

Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác Nhiệt độ

( o C)

Phản ứng Lugol

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 5: TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME

1/ Nguyên tắc

Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất định Enzyme có tính đặc hiệu rất cao Tính chất đặc hiệu của enzyme cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa enzyme với các chất xúc tác khác

Mỗi loại enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay nhiều chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Tính chất đặc hiệu của enzyme biểu hiện ở một số kiểu đặc hiệu sau:

Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển hóa nhất

định trong các kiểu phản ứng như phản ứng oxy hóa khử, phản ứng chuyển bị, phản ứng thủy phân…

Đặc hiệu kiểu cơ chất: có 3 kiểu đặc hiệu cơ chất

- Đặc hiệu tuyệt đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một cơ chất nhất định

- Đặc hiệu tương đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một kiểu liên kết hóa học nhất định

- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một dạng đồng phân quang học của cơ chất (cis hoặc trans)

Lấy 4 ống nghiệm đã ghi số, sau đó thêm vào:

- Ống thứ nhất: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ hai: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme bromelin

- Ống thứ ba: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ tư: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme bromelin

Lắc đều và để vào tủ ấm ở 37oC trong 15 phút Lấy ra, cho vào ống nghiệm thứ nhất và thứ hai mỗi ống 02 giọt thuốc thử Lugol và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút thì lấy các ống nghiệm ra, làm nguội tới nhiệt độ phòng

Cho ống thứ ba và thứ tư mỗi ống 02 giọt thuốc thử Folin

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

2.4 Kết quả

Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:

Bảng 3 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của enzyme

Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác Phản ứng thử Kết quả

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 6: TÁC DỤNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH VÀ CHẤT KÌM HÃM

1/ Nguyên tắc

Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa enzyme Các chất hoạt hóa có thể là những anion, các ion kim loại (từ ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn), các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp Các chất hoạt hóa thường làm nhiệm

vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzyme

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme những không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cả protein

- Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất Chúng thường là chất kiềm hãm thuận nghịch Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme và chiếm lấy vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động

- Chất kìm hãm không cạnh tranh: những chất này không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà liên kết với vị trí ngoài trung tâm hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác

- Ống thứ hai: 1ml dung dịch NaBr 0,5%

- Ống thứ ba: 1ml dung dịch CuSO4 0,5%

Sau đó cho vào cả ba ống mỗi ống 1ml dung dịch enzyme amylase Lắc đều và để vào tủ ấm ở

37oC trong 15 phút Lấy ra, cho vào mỗi ống 2 giọt thuốc thử Lugol, lắc đều

Tiếp tục cho vào mỗi ống 5ml dung dịch Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

2.4 Kết quả

Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:

Bảng 4 Bảng kết quả thí nghiệm xác định tác dụng của chất hoạt hóa và kiềm hãm hoạt tính của enzyme amylase

Ống nghiệm Cơ chất Xúc tác Phản ứng thử Kết quả

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 7: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE

Chuẩn bị chế phẩm lipase từ tuỵ tạng động vật: Cân 1g tụy tạng động vật, cho vào cối

nghiền 5ml hỗn hợp nước – glycerin (tỷ lệ 3:1), nghiền kỹ từ 3 – 5 phút Sau đó, lại cho thêm 5ml hỗn hợp nước – glycerin và nghiền tiếp 1 -2 phút Lọc vắt hỗn hợp qua vải màn, sau đó lọc lại qua giấy lọc, thu dịch lipase để làm thí nghiệm

Xác định hoạt tính của enzyme lipase:

Lấy 02 erlen 100ml, cho vào mỗi bình 10ml sữa tươi

- Erlen 1 (erlen thí nghiệm): cho vào 2 ml lipase, lắc đều, đặt vào bể điều nhiệt ở 370C –

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

Tiến hành thí nghiệm 2 lần Lấy kết quả là giá trị trung bình của 2 lần thí nghiệm

Cách xác định hệ số hiệu chỉnh k:

- Chuẩn độ 10ml dung dịch KOH 0,1N bằng dung dịch H2SO4 0,1N chuẩn, thuốc thử màu

là phenolphtalein cho đến khi dung dịch vừa mất màu hồng thì dừng lại

CKOHt : Nồng độ dung dịch KOH thực tế

VKOHt : Thể tích dung dịch KOH thực tế

CKOHp : Nồng độ dung dịch KOH pha

VKOHp : Thể tích dung dịch KOH pha

Hoạt độ lipase: được biểu thị bằng số ml KOH đã dùng để chuẩn độ acid béo tạo thành từ sự

thủy phân lipid có trong 1 lít sữa và được tính theo công thức sau:

 = 1− 2  ×  × 100

Trong đó:

X : Hoạt độ của enzyme lipase (UI)

V1 : Số ml KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ erlen thí nghiệm (erlen 1)

V2 : Số ml KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ erlen đối chứng (erlen 2)

k : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch KOH

Thực hành Công nghệ Protein - Enzyme

BÀI 8: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYME ASCOBATOXIDASE

1/ Nguyên tắc

Ascobatoxidase là enzym thuộc lớp oxi hoá khử (oxireductase) có nhiều trong các loại rau quả tươi và nhiều nhất ở lớp vỏ quả Enzym này oxi hoá acid ascorbic thành acid dehydroascorbic Trong thành phần của enzym này có sự hiện diện của ion Cu2+

- Cách pha dung dịch đệm phosphate pH 7:

o Dung dich A: 27,8 g NaH2PO4 hoà tan trong 1000ml

o Dung dịch B: 53.05g Na2HPO4 7H2O hoặc 71.1g Na2HPO4.12H2O pha trong 1000ml

o Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ

Chiết tách enzym ascobatoxidase: Cân 30g dưa chuột (bỏ hạt) cho vào cối sứ, nghiền với 10

– 15ml dung dịch đệm phosphat 0,15M pH 7 Dịch chiết được cho vào bình định mức 50ml

và thêm dung dịch đệm đến vạch định mức Lắc đều nhiều lần và để yên trong 1 giờ Lọc thu

dịch lọc Dịch lọc là chế phẩm enzym ascobatoxidase

Khảo sát hoạt tính enzym ascobatoxidase

- Hút 10 ml dung dịch enzym cho vào becher 100ml Sau đó cho thêm 10ml dung dịch acid ascorbic Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút Tiếp theo đun sôi trực tiếp trên bếp để ngừng phản ứng, rồi cho vào bình định mức 50 ml và làm đầy bằng nước cất