TỔNG QUAN
Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
Thuốc kháng Histamin H1 thế hệ thứ nhất đã được phát triển hơn 70 năm và vẫn được sử dụng rộng rãi hiện nay Clorpheniramin, là thuốc kháng histamin đầu tiên, có khả năng đi qua hàng rào máu não dễ dàng và tác động trực tiếp lên receptor H1 trung ương và ngoại vi Thuốc này nổi bật với tác dụng an thần mạnh, chống nôn, và kháng cholinergic giống atropine, góp phần điều trị các triệu chứng dị ứng và các vấn đề liên quan đến hệ thần kinh trung ương.
Histamine binds to H1 receptors, increasing IP3 and diacylglycerol from phospholipids, which stimulates calcium release from the endoplasmic reticulum and activates various intracellular signaling pathways Chlorpheniramine competes with histamine for H1 receptor binding, preventing histamine's effects on target cells However, at excessively high histamine levels, it can displace the antagonist from the receptor, reducing or nullifying the drug's efficacy.
Tác dụng phụ của chlorpheniramin thường bao gồm cảm giác an thần, từ cảm giác buồn ngủ nhẹ đến ngủ sâu, kèm theo các triệu chứng như khô miệng và chóng mặt Khi thuốc được kết hợp với các chế phẩm đông dược hoặc sử dụng trong thời gian dài, các tác dụng phụ này có thể trở nên nghiêm trọng và tăng lên đáng kể.
+ Tên khoa học: (RS)-3-(4 clorophenyl) -3- (2-pyridyl) propyldimethylamin hydrogen
+ Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, không mùi Dễ tan trong nước, tan trong ethanol 96%, cloroform; ít tan trong ether và benzene
+ Liều dùng: Người lớn: 4 mg cách 4-6 giờ/lần, tối đa: 24 mg/ngày (người cao tuổi tối đa 12mg/ngày) [9], [7]
1.1.2 Tình hình trộn lẫn clorpheniramin trong chế phẩm nguồn gốc dược liệu
Nhóm thuốc chống dị ứng kháng histamine H1 thường bị nhầm lẫn với các chế phẩm dược liệu do tác dụng chống dị ứng và an thần của chúng Các nghiên cứu gần đây đã thúc đẩy FDA ban hành các lệnh cấm hoặc hạn chế bán các sản phẩm thảo dược chứa thành phần hóa dược như kháng Histamin H1, PDE-5, corticoid, NSAID, giúp đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng Cụ thể, sản phẩm Nhân sâm “She Lian Wan” tuy được quảng cáo hỗ trợ giảm đau khớp, viêm khớp và bệnh gút, nhưng đã bị phát hiện chứa hai hoạt chất hóa dược là dexamethason và chlorpheniramin.
Một nghiên cứu tại Trung Quốc do Lin-hu YE và cộng sự thực hiện đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS để khảo sát sự hiện diện của 7 kháng histamin H1 (bao gồm loratadin, diphenhydramin hydroclorid, cyproheptadin hydroclorid, cetirizin hydroclorid, promethazin hydroclorid, mizolastin, và clorpheniramin) trong 9 loại chế phẩm thảo dược, phát hiện 4 mẫu chứa các kháng histamin H1 này Nghiên cứu khác của Ningning S và cộng sự cũng đã xác định được 12 loại hóa dược trong các chế phẩm thảo dược, cho thấy mức độ tiềm ẩn của các hoạt chất hóa dược trong các sản phẩm này.
Một nghiên cứu tại Mỹ đã phát hiện việc thêm không hợp pháp các chất hóa dược như chlorpheniramin vào trà thảo dược thông qua phương pháp LC-MS/MS, gây lo ngại về an toàn thực phẩm Trong số 243/260 loại thuốc đông dược thu thập từ các cửa hàng thảo dược bán lẻ tại California, có đến 7% chứa các loại thuốc hóa dược không được khai báo, trong đó chlorpheniramin là một trong bốn loại phổ biến nhất Điều này cho thấy nguy cơ sử dụng các thành phần thuốc không rõ nguồn gốc trong các sản phẩm thảo dược, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng.
Tại Việt Nam, chế phẩm dược liệu rất đa dạng với nhiều thành phần khác nhau, gây khó kiểm soát do được bán qua nhiều kênh như quầy thuốc, nhà thuốc, cửa hàng bán các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, qua mạng internet, hệ thống đa cấp và siêu thị Điều này làm tăng nguy cơ các sản phẩm dược liệu bị trộn lẫn các thuốc hóa dược, gây ra tác dụng không mong muốn cho người sử dụng.
Trước đây, một số chế phẩm đông dược nhập khẩu từ nước ngoài đã bị phát hiện chứa thành phần hóa dược trái phép, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng tại thị trường Việt Nam Những loại chế phẩm này thường được bán dưới dạng thuốc đông y, nhưng thực chất lại có pha trộn các hoạt chất hóa học không có trong thành phần truyền thống Việc kiểm tra và xử lý các sản phẩm này nhằm đảm bảo an toàn cho người bệnh và giữ gìn uy tín của ngành đông y Việt Nam Chính vì vậy, người tiêu dùng cần cảnh giác khi lựa chọn các sản phẩm đông dược, ưu tiên sử dụng những thuốc đã qua kiểm duyệt và có nguồn gốc rõ ràng.
Năm 2007, cơ quan chức năng phát hiện "Thuốc Dân tộc cứu nhân vật" sản xuất tại Campuchia chứa trộn nhiều hóa dược nguy hiểm như dexamethason, diazepam, paracetamol, chlopheniramin và cyproheptadin, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người dùng Ngoài ra, thuốc tăng phì hoàn của Đài Loan cũng bị phát hiện chứa các thành phần độc hại như cyproheptadin và dexamethason, làm ảnh hưởng đến quá trình tăng cân tự nhiên của người tiêu dùng Các loại thuốc này được bán rộng rãi nhưng tiềm ẩn nhiều rủi ro do chứa các hoạt chất steroid và thần kinh không rõ nguồn gốc, đòi hỏi người tiêu dùng cần thận trọng khi sử dụng Việc phát hiện này đã mở ra cảnh báo về tình trạng nhập khẩu và lưu hành các sản phẩm thuốc không rõ nguồn gốc, gây nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng.
Năm 2018, Phạm Thị Thanh Tuyền và cộng sự đã nghiên cứu phát hiện các thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LC-MS/MS Nghiên cứu đã xây dựng phương pháp phân tích định tính, định lượng để phát hiện đồng thời các hoạt chất như betamethason, dexamethason acetat, chlorpheniramin, cyproheptadin hydroclorid, và loratadin trong các chế phẩm đông dược bị trộn trái phép Kết quả phân tích cho thấy, trong số 9 mẫu chế phẩm được kiểm tra, có 2 mẫu dương tính với dexamethason acetat và chlorpheniramin, với hàm lượng trộn vào khoảng 50-66% so với liều thông thường, phản ánh vấn đề về an toàn và chất lượng của các sản phẩm đông dược trên thị trường.
6 liều điều trị của 2 hoạt chất trên Các mẫu dương tính đều không có số đăng ký và được mua qua mạng internet [2]
Năm 2020, Trần Thị Lan và cộng sự đã phát hiện việc trộn trái phép thuốc kháng histamin H1 trong các chế phẩm đông dược bằng phương pháp HPLC-PDA, xác định các hoạt chất như cinarizin, clorpheniramin, cyproheptadin hydroclorid, loratadin và promethazin hydroclorid Nghiên cứu cho thấy 7/20 mẫu chế phẩm có kết quả dương tính với các thuốc hóa dược kháng histamin H1, với hàm lượng trộn từ 10% đến 80% liều điều trị của các hoạt chất này Hầu hết các mẫu dương tính đều không có số đăng ký hoặc số công bố, đồng thời được mua qua mạng internet, khiến người tiêu dùng cần thận trọng khi sử dụng các sản phẩm không rõ nguồn gốc xuất xứ Các sản phẩm này tiềm ẩn rủi ro về an toàn và chất lượng, đặc biệt khi không có sự kiểm soát của cơ quan chức năng.
Năm 2021, Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự đã nghiên cứu xác định các thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp HPTLC Phương pháp này dựa trên bản mỏng HPTLC Silicagel 60 GF254 với hệ dung môi gồm cyclohexan, aceton, và triethylamin theo tỷ lệ 8:2:0,5, sử dụng bước sóng định lượng 254 nm Các nhà nghiên cứu đã xây dựng phân tích trên 18 mẫu chế phẩm đông dược dùng để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, cảm cúm đang lưu hành trên thị trường, phát hiện có mặt của các hoạt chất như chlorpheniramin, cyproheptadin hydroclorid, và loratadin bị trộn trái phép.
Tình hình trộn lẫn clorpheniramin trong các chế phẩm nguồn dược liệu đang diễn biến phức tạp cả trong nước và quốc tế Vì lý do này, clorpheniramin đã được đưa vào danh mục các chất cấm sử dụng trong sản xuất và kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe theo Thông tư số 10/2021/TT-BYT ngày 30/06/2021.
Tổng quan về phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt TLC – SERS
1.2.1 Phương pháp quang phổ Raman
1.2.1.1 Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman
Khi chiếu photon có tần số ν₀ vào một phân tử, photon bị tán xạ theo nhiều hướng khác nhau do va chạm với các phân tử Tán xạ này có thể là đàn hồi hoặc không đàn hồi, trong đó tán xạ đàn hồi (Rayleigh) xảy ra với xác suất cao, nơi photon bị tán xạ giữ nguyên tần số ν₀ Một phần nhỏ photon tương tác với liên kết của phân tử, dẫn đến tán xạ không đàn hồi, trong đó năng lượng được trao đổi giữa photon và liên kết, làm thay đổi tần số của photon Các quá trình tán xạ này gọi chung là tán xạ Raman, và trong trường hợp phân tử nhận năng lượng từ photon tới, tần số của photon tán xạ giảm xuống còn ν₀ - ν.
Khi photon nhận năng lượng từ phân tử, tần số của photon tán xạ tăng lên là ν₀ + ν, điều này gọi là tán xạ đối Stokes Các thành phần tán xạ thu được sau khi chiếu sáng mẫu được minh họa rõ ràng trong Hình 1.1, giúp hiểu rõ quá trình tán xạ ánh sáng trong các nghiên cứu phân tử.
Hình 1.1 Các thành phần tán xạ thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu
Tán xạ Stokes xảy ra khi photon tương tác với phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, trong khi tán xạ đối Stokes xảy ra khi photon gặp phân tử ở trạng thái kích thích Dưới điều kiện thường, phần lớn phân tử đều ở trạng thái cơ bản, khiến tán xạ Stokes dễ xảy ra và chiếm đa số Chính vì vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường tập trung đo tán xạ Stokes để phân tích đặc điểm phân tử.
Tần số của các vạch Stokes (v₀ - v) và đối Stokes (v₀ + v) phụ thuộc vào bản chất của chất tán xạ và tần số v₀ của bức xạ kích thích Hiệu số Δv = v chỉ phụ thuộc vào đặc tính của chất tán xạ (mẫu đo) Do đó, phổ Raman theo đơn vị v (cm⁻¹) là đặc trưng phản ánh cấu tạo của các hợp chất hoá học, giúp phân tích thành phần và cấu trúc của mẫu dựa trên đặc điểm quang phổ này.
1.2.1.2 Đại lượng đặc trưng của quang phổ Raman
Raman shift là một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman, thể hiện sự thay đổi tần số gọi là “dịch chuyển Raman.” Cường độ của các bức xạ tương ứng trên phổ Raman shift khác nhau, tạo nên các dải phổ hấp thụ hẹp và nhọn, giúp xác định đặc điểm riêng biệt của từng chất Mỗi nhóm chức trong phân tử sẽ cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau, làm cho phổ Raman trở thành “dấu vân tay” để nhận diện các chất phân tích Phân tích phổ Raman là phương pháp hiệu quả trong việc xác định thành phần hóa học của mẫu vật.
Phổ Raman của một chất là công cụ quan trọng để xác định chính xác thành phần của chất khi so sánh với phổ chuẩn Đồng thời, phổ Raman còn đóng vai trò thiết yếu trong việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của chất đó, giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về đặc điểm vật lý và hóa học của nguyên liệu.
1.2.2 Phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS)
Quang phổ Raman có phạm vi ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm, nhưng vẫn gặp hạn chế do sự xuất hiện huỳnh quang và cường độ tín hiệu yếu, gây khó khăn trong phát hiện các hợp chất có màu hoặc nồng độ thấp Công nghệ Quang phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS) là giải pháp hiệu quả để khắc phục những hạn chế này, nâng cao độ nhạy và độ chính xác của phương pháp Các chất nền SERS, thường là kim loại quý như vàng hoặc bạc, hoạt động như các ăng-ten kích thích cộng hưởng plasmon, giúp tăng cường cường độ tán xạ Raman từ các phân tử tiếp xúc gần hoặc nằm trong vòng 10 nm Tăng cường tín hiệu SERS có thể lên đến 10^3 đến 10^11 lần, tùy thuộc vào đặc tính của phân tử mục tiêu và loại chất nền được sử dụng, từ đó cải thiện khả năng phát hiện các hợp chất trong phân tích Phổ SERS có thể thu nhận nhanh chóng mà vẫn giữ các ưu điểm của quang phổ Raman truyền thống, với phổ đồ duy nhất cho từng hợp chất, giúp định danh chính xác và nhanh chóng các thành phần phân tích.
Có hai cơ chế tăng cường tín hiệu Raman [19]:
● Cơ chế tăng cường điện từ
Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) tận dụng bề mặt kim loại gồ ghề, thường làm bằng bạc (Ag), vàng (Au) hoặc đồng (Cu), để tăng cường tín hiệu quang học Các phân tử của mẫu cần đo hấp phụ vào bề mặt kim loại này, giúp cải thiện độ nhạy của phương pháp phân tích Khi bị kích thích bởi ánh sáng, các electron tự do trên bề mặt kim loại sẽ dao động đồng bộ cùng các ion kim loại, tạo thành một trường lưỡng cực Sự cộng hưởng giữa các trường lưỡng cực này và tần số của ánh sáng tới sẽ dẫn đến hiện tượng tăng cường tín hiệu Raman, mang lại khả năng phát hiện các hợp chất một cách chính xác và nhạy bén hơn.
Cơ chế tăng cường điện từ trên bề mặt kim loại liên quan đến cường trường điện từ cục bộ và độ nhám của bề mặt kim loại, giúp nhanh chóng thoát ra khỏi bề mặt và tăng cường tín hiệu Raman của các chất phân tích hấp phụ hoặc gần bề mặt Hiệu ứng này phụ thuộc vào khoảng cách giữa các chất phân tích và bề mặt kim loại, và mức độ tăng cường điện từ có thể đạt tới 10^12 lần, từ đó nâng cao khả năng phân tích và phát hiện các hợp chất.
● Cơ chế tăng cường hóa học
Hiệu ứng điện tử, như truyền điện tích giữa các phân tử chất hấp phụ và kim loại, là nguyên nhân gây ra sự tăng cường phổ Raman cộng hưởng khi phân tử hấp phụ gần hơn với tia laser Sự tăng cường này phụ thuộc vào sự thay đổi cực đại của khả năng hấp thụ quang của phân tử, giúp nâng cao độ nhạy của phương pháp phân tích Trong khi hiệu ứng điện từ áp dụng rộng rãi cho tất cả các chất phân tích, thì sự tăng cường hóa học lại phụ thuộc vào loại chất phân tích và yêu cầu các liên kết đặc biệt với bề mặt kim loại Các hệ số tăng cường hóa học thường dao động trong khoảng từ 10 đến 100, mang lại khả năng phân tích chính xác và hiệu quả hơn trong các ứng dụng nghiên cứu và công nghiệp.
Tăng cường hóa học và điện từ trường trong công nghệ SERS rất nhạy cảm với các yếu tố như chất đế (đế SERS), kích thước, hình dạng hạt kim loại, bước sóng laser và tính chất tương tác giữa đế SERS và chất hấp phụ, do đó cần thiết kế và tối ưu hóa đế SERS phù hợp Các đế SERS đề xuất để phân tích hóa học đều chú trọng đến việc chuẩn bị, khả năng tăng cường, khả năng tái sinh và tính ổn định để đảm bảo hiệu quả phân tích tối ưu Hiện nay, gần như tất cả các vật liệu dùng làm đế SERS đều được chế tạo từ bạc hoặc vàng, trong đó bạc chiếm đa số do đặc tính ưu việt trong tăng cường tín hiệu SERS.
1.2.3 Dung dịch keo sử dụng cho phương pháp SERS
Các đế SERS là các bề mặt kim loại quý như vàng (Au) và bạc (Ag) có độ ráp phù hợp ở kích thước nano, bao gồm các cấu trúc như hạt nano, thanh nano, dây nano Au/Ag, cùng các dạng cấu trúc nano hình lá, hoa và những hình dạng phức tạp khác Tín hiệu phổ Raman của các chất phân tích hấp phụ trên các bề mặt này giúp tăng cường khả năng phát hiện với độ nhạy cao, phục vụ tốt cho các ứng dụng phân tích hóa học và sinh học.
Các mặt đế SERS được tăng cường nhờ sự kết hợp của hiệu ứng điện từ và hóa học, tạo ra khả năng đo phổ Raman chính xác hơn Hiện nay, đã có nhiều phương pháp chế tạo đế SERS như sử dụng các bề mặt kim loại gồ ghề, huyền phù hạt kim loại nano, hệ các hạt kim loại nano cố định trên bề mặt phẳng hoặc trên hệ dây nano trật tự, cũng như các dạng đế có hình dạng biến đổi như lá, hoa, nhím, sao Trong số các loại đế SERS, các hạt kim loại nano trong dung dịch huyền phù được ưu tiên sử dụng nhiều nhất nhờ tính dễ chế tạo và chi phí thấp Đế huyền phù đã được chứng minh mang lại khả năng tăng cường SERS đáng kể, giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác của phép đo.
Nghiên cứu cho thấy cấu trúc nano bạc (Ag) mang lại mức tăng cường cực cao đến 10^14, trong khi các hạt nano vàng (Au) góp phần nâng cao khả năng sinh học phù hợp Sử dụng cấu trúc nhánh cây của Ag để tăng cường tán xạ Raman giúp phát hiện thuốc kháng sinh ở nồng độ cực thấp (khoảng 20 ppb) Tuy nhiên, việc sử dụng các hạt keo kim loại gặp khó khăn trong bảo quản (thường phải dùng ngay sau khi chế tạo), độ lặp lại của kết quả chưa cao, và mỗi hoạt chất cần loại keo kim loại phù hợp để phân tích phổ SERS đặc trưng.
Vì vậy mà hiện nay keo kim loại dùng trong SERS vẫn thường được chuẩn bị sẵn trước khi sử dụng
Năm 1982, Lee P.C đã giới thiệu các loại keo vàng và keo bạc nhằm tăng cường tán xạ Raman bề mặt, là phương pháp làm keo kim loại truyền thống được nhiều tác giả nghiên cứu và cải tiến để phù hợp với các máy Raman và hoạt chất nghiên cứu khác nhau Ông đã phát triển ba loại keo bạc (Ag) chuẩn bị theo các phương pháp khác nhau nhằm tối ưu hóa hiệu suất quang học và khả năng ứng dụng trong các phòng thí nghiệm Các cải tiến này giúp nâng cao độ nhạy và độ chính xác của các phép đo tán xạ Raman, góp phần thúc đẩy nghiên cứu trong lĩnh vực phân tích hoá học và vật liệu.
(a) Ag 2 SO 4 (80 mg) được hòa tan trong cốc 200 ml nước nóng và sau đó trộn với 5 g PVA (Polyvinyl alcohol) hòa tan trong cốc 200 ml nước nóng Hỗn hợp này
12 sau đó được sục với H2 ở nhiệt độ sôi gần 3 giờ Thể tích cuối cùng được điều chỉnh đến 500 ml
Một số nghiên cứu phân tích phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược
Một số nghiên cứu phân tích phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược được trình bày trong Bảng 1.2
Bảng 1.2 Các nghiên cứu phân tích clorpheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược
Hoạt chất và mẫu thử Phương pháp phân tích Kết quả phân tích
Mẫu thử: Trà thảo dược
UHPLC – MS/MS Cột XBrighge C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,5 àm)
Pha động: acetonitrile/ formic acid 0,1% (tt/tt)
Dung môi chiết: ACN, tinh chế bằng kỹ thuật QuERS và lọc qua màng lọc 0,22 àm
+ LOQ: 0,4g/L đến 8,0 g/L + Độ thu hồi:
Mẫu thử: Viên nén, thuốc mỡ, kem
LC – MS/MS Cột: Agilent Eclipse Plus C18 (1,2mmx50mm; 3,5 àm)
Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút Pha động: 0,1% acid formic trong acetonitrile: 0,1% acid formic trong nước
Detector: ESI-MS Dung môi chiết: Methanol 80%, siêu âm 30 phút, ly tâm
5ng/mL + Độ thu hồi:
+ 4/9 chế phẩm được phát hiện dương tính với thuốc kháng histamine H1
Mẫu thử: Viên nang, viên nén, hoàn, bột, dung dịch, cao dán
GC/MS + Cột: Silica, Agilent HP-5MS
(30m x 0,25 mm i.d, 0,25 àm) + Chương trình nhiệt độ lò:
80 ℃ ở 6 ℃/phút cho đến khi đạt 120 ℃, tăng 8 ℃/phút cho đến khi đạt 300 ℃ trong 29 phút
+ Khí mang: heli (tốc độ dòng 1,4 ml/phút), hydrogen (1,0ml/phút)
+ Nhiệt độ đầu phun: 250 ℃ + Chế độ ion hóa: EI
+ Chế độ quét phổ: SIM + Chế độ tiêm mẫu: Không chia
19 dòng + Chiết mẫu bằng ethanol
Tác động: Siêu âm, lắc quay, ly tâm
Mẫu thử: viên nang, viên nén, bột, dung dịch
LC-MS/MS + Cột: Superspher 10 RP-18
(125 x 3 mm; 4 àm), cột bảo vệ:
+ Thể tớch tiờm: 25 àl + Tốc độ dòng: 0,3ml/phút + Pha động: ACN và dung dịch đệm amoni format 10mM (pH
3,0) Gradient pha động + Detector: ESI-MS + Chiết mẫu bằng MeOH hoặc isopropanol: diclormethan (1:9) Tác động: Siêu âm, lắc xoay, ly tâm
+ LOD: 5 pg đến 1 ng/mL + Độ thu hồi 63
Mẫu thử: viên nén, nang cứng, nang mềm, dạng lỏng, gel
LC-IT/TOF-MS + Cột: Agilent ZORBAX Eclipse AAA (150mmx 4,5 mm;
+ Pha động: 0,1% acid acetic trong nước và 0,1% acid acetic trong acetonitrile
+ Thể tớch tiờm: 10 àl + Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút + Detector: IT/TOF-MS + Mẫu chiết bằng MeOH Tác động: ly tâm, lắc xoay
Mẫu thử: Dạng lỏng, viên nang cứng, viên nang mềm, viên nén, bột
+ Cột: C18 (4,6x150mm, 5 àm) + Pha động: acetonitrile và amoni acetat 0,02M chứa 0,1% acid acetic Gradient pha động
+ Tốc độ dòng: 1ml/phút + Nhiệt độ cột: 25 ℃ + Bước sóng phát hiện: 220 nm
Clorpheniramin được phát hiện trong 1 số mẫu
LC-MS/MS chế độ ESI (+) + Cột InertSustain AQ-C18 (100mm x 2,1 mm; 3,0 àm) + Pha động gồm acid formic 0,1% trong nước (A) và actonitril (B); chế độ pha động: gradient
+ LOD: 0,083 – 0,165 ng/mL + LOQ: 0,25 – 0,5 ng/mL + Độ thu hồi:
+ Thể tớch tiờm: 2 àl Clorpheniramin, cyproheptadine hydroclorid, loratadine
Mẫu thử: viên nang, thuốc bột, cốm, hoàn
TLC + Pha tĩnh: Bản mỏng silicagel GF254
+ Pha động: Cloroform – methanol – acid acetic – ammoniac (9,5:0,5:0,2:0,05) + Thể tớch chấm: 2 àl
+ Bước sóng phát hiện: 254 nm
+ Chiết mẫu bằng MeOH Tác động: Siêu âm, lắc xoáy, ly tâm
+ Phát hiện 7/15 mẫu chứa clorpheniramin
Năm 2015, Fang F và cộng sự đã nghiên cứu ba chất gồm diphenhydramin hydrochlorid, benproperin phosphat và clorphenamin, nhưng chỉ phát hiện được một mẫu dương tính với benproperin phosphat và chưa ứng dụng thành công phương pháp phát hiện clorphenamin Các công bố nghiên cứu về phát hiện clorphenamin trộn trong chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu bằng phương pháp TLC-SERS còn rất hạn chế và mới dừng ở phạm vi xây dựng, chưa đạt được kết quả thử nghiệm thành công.
Nghiên cứu này tập trung phát triển phương pháp TLC – SERS, một phương pháp khoa học đáng tin cậy và dễ áp dụng rộng rãi để phát hiện chlorpheniramin trong chế phẩm đông dược Phương pháp này góp phần nâng cao công tác kiểm tra, phát hiện các chất cấm, trộn trái phép trong các sản phẩm đông dược, đảm bảo chất lượng thuốc và bảo vệ sức khỏe người dân Đồng thời, nó giúp duy trì uy tín cho các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu trên thị trường, thúc đẩy sự phát triển ổn định của ngành dược liệu lưu hành.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị, đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
- Clorpheniramin hàm lượng 99,25%, số lô WS.0418032.03 (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương)
● Hóa chất: Methanol, aceton, triethylamine, cyclohexan, bạc nitrat…
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
- Hệ thống quang phổ Raman, LabRam HR800, Horiba Jobin Yvon, camera CCD, tia laser 633 nm và 785 nm (Pháp)
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 của Merck (Đức)
- Hệ thống sắc ký LC-MS/MS, EVOQ Qube, Bruker, (Mỹ)
- Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến
- Cân phân tích Sartorius TE 214S (d = 0,1 mg) (Đức)
- Máy lắc xoáy Labinco BV L46
- Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức)
- Máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật Bản)
- Tủ sấy WiseVen WOF-105 (Hàn Quốc)
- Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, phễu thủy tinh
Mẫu thử gồm các loại thuốc dược liệu, thuốc cổ truyền và thực phẩm bảo vệ sức khỏe có dạng bào chế đa dạng được sử dụng để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về viêm xoang, viêm mũi dị ứng cấp và mãn tính, cũng như các triệu chứng cảm sổ mũi đang phổ biến hiện nay.
Việt Nam; các chế phẩm này được mua tại các nhà thuốc, qua internet, của lương y và người dùng nghi ngờ gửi đến
Chọn 3 mẫu nền để thẩm định phương pháp phân tích dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, được hỗ trợ bởi các nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng cấp và mãn tính, cùng cảm cúm Các mẫu này đã được xác nhận âm tính qua phương pháp LC-MS/MS, đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong quá trình nghiên cứu.
+ Nền viên nang gồm 5 loại dược liệu: Tân Di, Bạch chỉ, Ngũ sắc, Phòng phong, Ké đầu ngựa
+ Nền viên hoàn gồm 8 loại dược liệu: Kim ngân hoa, Nhân trần, Ngưu bàng tử, Thương nhĩ tử, Liên kiều, Hoàng cầm, Long đởm cứng, Đại hoàng
+ Nền trà túi gồm 5 loại dược liệu: Ngân hoa, Chỉ xác, Phục linh, Bạch tiền bì, Địa phu tử.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định tính clorpheniramin trộn lẫn trong chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS)
2.2.1.1 Xây dựng và thẩm định quy trình định tính clorpheniramin
- So sánh điểm khác biệt giữa cấu trúc hóa học và phổ Raman của clorpheniramin chuẩn
- Xây dựng bộ đỉnh đặc trưng trên phổ SERS của clorpheniramin
Để chuẩn bị hỗn dịch keo bạc, đun nóng 194 ml nước cất đến 100°C dưới sinh hàn hồi lưu có khuấy từ mạnh, sau đó thêm 2 ml dung dịch AgNO3 0,1 M và 4 ml natri citrat 1%, duy trì đun hồi lưu trong 40 phút rồi để nguội đến nhiệt độ phòng Các nghiên cứu đã công bố [41], [6], [1], [3] đã khảo sát tỷ lệ glycerol với các nồng độ khác nhau để tối ưu hóa quá trình tổng hợp keo bạc, đảm bảo chất lượng và hiệu quả của keo bạc.
+ 9,5 ml dung dịch keo và 0,5 ml Glycerol
+ 9,0 ml dung dịch keo và 1,0 ml Glycerol
+ 8,5 ml dung dịch keo và 1,5 ml Glycerol
- Chuẩn bị mẫu: Pha riêng các dung dịch chuẩn gốc clorpheniramin có nồng độ khoảng 2mg/ml trong methanol
Phương pháp phân tích sử dụng sắc ký TLC trên bản mỏng silica gel 60 F254 (20x10cm), với thể tích chấm mẫu là 5 µl và hệ dung môi pha động gồm cyclohexan, aceton và triethylamin theo tỷ lệ 8:2:0,5, dựa trên nghiên cứu của Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự Sau khi triển khai, tấm TLC được làm khô tự nhiên, các điểm phân tách được quan sát và đánh dấu ở các bước sóng 254 nm và 366 nm Tiếp theo, nhỏ trực tiếp hỗn dịch keo bạc lên các điểm đánh dấu trên tấm TLC để chuẩn bị cho phân tích Phổ SERS của từng điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman để xác định thành phần chính xác của mẫu.
- Khảo sát các điều kiện SERS:
● Khảo sát tia laser: Tiến hành khảo sát tia laser 633 nm hay 785 nm trên bột chuẩn clorpheniramin cho cường độ SERS cao nhất
Khảo sát vị trí nhỏ keo bạc là bước quan trọng để xác định chính xác vị trí chấm keo Quý khách cần kiểm tra xem các vết chất chuẩn trên bản mỏng phân bố tập trung ở tâm (phân bố Gauss) hay lan ra viền (hiệu ứng giọt cà phê – CRE) Điều này giúp đảm bảo quá trình chuẩn bị mẫu đạt tiêu chuẩn, tối ưu hóa hiệu quả phân tích.
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ hỗn dịch keo bạc để xác định khả năng tăng cường cường độ tín hiệu Raman của các hỗn dịch keo bạc ở các nồng độ khác nhau trên các điểm phân tách của các chất chuẩn sau khi đã thực hiện sắc ký TLC Quá trình này giúp lựa chọn nồng độ keo bạc phù hợp nhất, đảm bảo tín hiệu phổ SERS rõ ràng và các đỉnh đặc trưng không bị chồng lấp bởi tín hiệu Raman của keo bạc, từ đó nâng cao độ nhạy và độ chính xác của phương pháp phân tích.
Khảo sát thể tích nhỏ hỗn dịch keo bạc nhằm so sánh phổ SERS của các vết chuẩn khi sử dụng các thể tích keo khác nhau, qua đó xác định thể tích nhỏ keo bạc tối ưu để đạt được tín hiệu phổ SERS mạnh nhất và độ nhạy cao Việc lựa chọn thể tích nhỏ phù hợp giúp cải thiện khả năng phát hiện và phân tích mẫu chính xác hơn trong các ứng dụng phân tích quang học dựa trên phổ SERS.
Khảo sát vị trí chiếu tia laser là bước quan trọng để xác định các vị trí phù hợp nhằm tối ưu hóa tín hiệu phổ SERS của clorpheniramin Việc lựa chọn vị trí chiếu laser chính xác giúp cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu của phân tích, đảm bảo kết quả chính xác trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng.
Khảo sát thời gian chiếu tia laser là bước quan trọng để so sánh phổ SERS của các vết chuẩn tại các thời điểm khác nhau, giúp xác định thời gian chiếu tối ưu cho tín hiệu phổ SERS Việc lựa chọn thời gian chiếu phù hợp sẽ nâng cao độ nhạy và độ phân giải của kết quả phân tích, đảm bảo thu được dữ liệu chính xác và rõ ràng hơn trong quá trình nghiên cứu.
● Xây dựng bộ dịch chuyển Raman: Xác định ngưỡng dao động các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ dao động
Quy trình xử lý mẫu được thực hiện dựa trên kết quả của Nguyễn Thị Kiều Anh và cộng sự [3], trong đó mẫu thử hoặc mẫu placebo được nghiền mịn với khối lượng khoảng 700 mg, sau đó pha với 25 ml methanol Tiếp tục lắc xoáy trong 5 phút, làm siêu âm trong 10 phút, rồi ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút để tách lớp dịch phía trên Dịch trong sau đó được dùng để chấm sắc ký nhằm phân tích thành phần.
2.2.1.3 Thẩm định quy trình TLC – SERS
Quy trình được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2016 về độ chọn lọc và giới hạn phát hiện [2]
Phân tích độ chọn lọc của phổ SERS nhằm ghi nhận các đặc điểm của mẫu chuẩn, mẫu nền và mẫu nền thêm chuẩn qua các dạng viên nang, viên hoàn và trà túi Phổ SERS của mẫu nền thêm chuẩn phải có các tín hiệu đặc trưng dao động quanh các dịch chuyển chính của mẫu chuẩn để đảm bảo tính đặc trưng và độ nhạy của phân tích Ngoài ra, phổ SERS của mẫu nền không xuất hiện các đỉnh đặc trưng trùng với đỉnh của mẫu chuẩn, giúp phân biệt rõ ràng giữa các mẫu và đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích [42], [2].
Xác định giới hạn phát hiện (LOD) bằng cách pha dãy các dung dịch chuẩn và thêm 1 ml vào mẫu bột nền khoảng 700 mg, sau đó thực hiện phân tích theo quy trình đã chọn Giới hạn phát hiện được định nghĩa là nồng độ thấp nhất mà tại đó các đỉnh đặc trưng vẫn rõ ràng và tỷ lệ tín hiệu/nhiễu vẫn đảm bảo độ nhạy cần thiết Quy trình này giúp xác định chính xác mức độ nhạy của phương pháp phân tích trong việc phát hiện các hợp chất mục tiêu.
(S/N) của các đỉnh đặc trưng khoảng 3 (tín hiệu đáp ứng của cường độ đỉnh gấp khoảng 3 lần nhiễu nền) [42], [2]
2.2.2 Ứng dụng quy trình xây dựng được để phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong một số chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu được thu thập trên thị trường Áp dụng quy trình TLC – SERS vừa xây dựng được để phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong một số chế phẩm thu thập được trên thị trường dựa trên việc so sánh phổ của các mẫu thực với phổ của chất chuẩn Các mẫu được kết luận dương tính nếu cho tín hiệu Raman có các đỉnh đặc trưng dao động quanh các dịch chuyển Raman chính của chất chuẩn với tỉ lệ các đỉnh nằm trong ngưỡng dao động
Các mẫu thử sẽ được kiểm nghiệm bằng phương pháp LC-MS/MS với điều kiện sắc ký sử dụng cột InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 μm), kết hợp với gradient pha động gồm acid formic 0,1%/H2O (A) và acetonitrile (B) Quá trình sắc ký bắt đầu với 15% B, sau đó tăng tuyến tính từ 15% đến 75% B trong 7,5 phút, rồi giảm trở lại 15% B trong 1 phút và duy trì trong 4,5 phút, với thể tích mẫu phụ thuộc 2 μl, tốc độ dòng 0,3 ml/phút, và nhiệt độ buồng cột 40°C Thời gian phân tích diễn ra trong 12 phút, sử dụng chế độ ion hóa ESI (+), điện thế ion hóa 3500V, cùng với khí phun sương để đảm bảo độ nhạy và chính xác của kết quả phân tích.
40 psi; nhiệt độ hóa hơi 500 0 C; ion ban đầu 275,1; năng lượng phân mảnh 16V và 40V; ion tạo thành 230V và 167V
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xây dựng và thẩm định quy trình định tính clorpheniramin trộn lẫn trong chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ
3.1.1 Xây dựng quy trình định tính clorpheniramin
3.1.1.1 Xây dựng quy trình định tính clorpheniramin a) Xây dựng bộ đỉnh đặc trưng trên phổ SERS của clorpheniramin
Hỗn dịch keo bạc được chuẩn bị theo mục 2.2.1.1
Phương pháp phân tích được thực hiện bằng cách pha dung dịch chuẩn clorpheniramin 2 mg/ml trong methanol, sau đó tiến hành sắc ký TLC trên bản mỏng silica gel 60 F254 với thể tích chấm mẫu là 5 µl và hệ dung môi pha động gồm cyclohexan, aceton và triethylamin theo tỉ lệ (8:2:0,5) Sau khi triển khai, tấm TLC được để làm khô tự nhiên, các điểm phân tách được quan sát và đánh dấu ở bước sóng 254 nm và 366 nm Tiếp theo, hỗn dịch keo bạc được nhỏ trực tiếp lên từng điểm đã đánh dấu trên tấm TLC, và phổ SERS của mỗi điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman Để xác định các đỉnh đặc trưng của clorpheniramin, các mẫu chuẩn, dung dịch clorpheniramin trong methanol trên tấm TLC, và Ag-MeOH được đo Raman nhằm xác định chính xác hơn và so sánh các phổ đo bằng laser 633 nm và 785 nm Kết quả phân tích thể hiện rõ trong Hình 3.1.
Hình 3.1 Phổ Raman của clorpheniramin, nền silicagel-keo bạc và dung dịch clorpheniramin trên TLC khi đo bằng tia laser 785 nm (a) và 633 nm (b)
Phổ Raman của clorpheniramin chuẩn và phổ SERS của dung dịch clorpheniramin đo được bằng hai tia laser 633 nm và 785 nm cho thấy sự khác biệt không đáng kể, thể hiện tính ổn định của phương pháp Tuy nhiên, khi sử dụng bước sóng 785 nm, phổ SERS thu được có nền trơn hơn và giảm nhiễu, giúp nâng cao độ chính xác trong phân tích Điều này cho thấy rằng bước sóng 785 nm phù hợp hơn để thu thập phổ SERS của clorpheniramin, tăng cường khả năng xác định cấu trúc phân tử chính xác hơn.
29 huỳnh quang thấp, với bước sóng 633nm thu được phổ có nền huỳnh quang cao và
1 số đỉnh không rõ ràng Do đó, lựa chọn tia laser kích thích là 785 nm để đo phổ SERS của clorpheniramin
Các đỉnh đặc trưng của clorpheniramin trên phổ Raman của mẫu chuẩn và phổ SERS của dung dịch clorpheniramin trong methanol được phân tích chi tiết trên tấm TLC, như đã trình bày trong Bảng 3.1 Quá trình này giúp xác định các đặc điểm quang phổ riêng biệt của hợp chất, từ đó nâng cao độ chính xác trong việc nhận diện và định lượng clorpheniramin trong các mẫu nghiên cứu Việc phân tích phổ Raman và SERS là bước quan trọng trong việc hiểu rõ cấu trúc phân tử của clorpheniramin, phù hợp với các tiêu chuẩn phân tích hóa học hiện đại và tối ưu hóa quy trình kiểm tra chất lượng.
Bảng 3.1 Các đỉnh đặc trưng của clorpheniramin
Chuẩn (cm -1 ) SERS (cm -1 ) Kiểu dao động [43]
Nhận xét: Phổ SERS của dung dịch clorpheniramin trong methanol trên tấm
TLC có một số đỉnh có sự dịch chuyển và một số đỉnh không rõ ràng so với phổ Raman của chuẩn
Phổ Raman của chlorpheniramine, nền silica gel-keo bạc và phổ SERS của dung dịch chuẩn xác định được chín đỉnh đặc trưng của chlorpheniramine tại các bước sóng 627, 660, 746, 800, 824, 1056, 1088, 1180 và 1204 cm-1, trong đó đỉnh 1088 cm-1 được chọn làm đỉnh tham chiếu để đảm bảo độ chính xác của phân tích Khảo sát các điều kiện SERS giúp tối ưu hóa quá trình phân tích, nâng cao độ nhạy và độ chính xác trong việc xác định chlorpheniramine.
Để khảo sát vị trí nhỏ keo bạc, tiến hành pha dung dịch chuẩn chứa clorpheniramin 2 mg/ml trong methanol Tiếp theo, thực hiện phân tích TLC với các điều kiện đã được chọn trước để đảm bảo độ chính xác Quá trình này giúp xác định vị trí các vết phân tách rõ ràng, từ đó đánh dấu các vết phân tách trên bản TLC, hỗ trợ đánh giá chất lượng và độ tinh khiết của mẫu.
Ghi phổ SERS của các vết chuẩn khi nhỏ keo bạc tại trung tâm và rìa vết cho thấy, cường độ tín hiệu Raman cao hơn khi nhỏ keo bạc ở tâm so với rìa, như thể hiện rõ ở Hình 3.2 Do đó, việc lựa chọn vị trí nhỏ keo bạc ở trung tâm vết là tối ưu để nâng cao hiệu quả phát hiện và phân tích SERS.
Hình 3.2 Hình ảnh phổ SERS (a) và sắc ký đồ TLC (b) của clorpheniramin khi nhỏ keo bạc ở tâm vết và rìa vết
Khảo sát nồng độ hỗn dịch keo bạc được thực hiện bằng cách đậm đặc hỗn dịch ban đầu thông qua quá trình ly tâm ở tốc độ 9000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó loại bỏ phần dịch trên với thể tích 200 ml Tiếp theo, hỗn dịch này được pha loãng bằng Glycerol để tạo thành các mẫu có nồng độ từ C1 đến C3, giúp đánh giá khả năng phân tán và ổn định của keo bạc ở các nồng độ khác nhau Quá trình này đảm bảo tính chính xác trong việc xác định ảnh hưởng của nồng độ keo bạc đến hiệu quả hoạt động của chúng.
(Bảng 3.2) Pha dung dịch chuẩn clorpheniramin 2 mg/ml trong methanol Tiến hành TLC với các điều kiện đã chọn và đánh dấu các vết phân tách So sánh phổ
SERS của các vết chuẩn clorpheniramin khi nhỏ các hỗn dịch keo có nồng độ từ C1 đến C3 trong thời gian thu tăng hiệu quả 240 giây cho thấy sự biến đổi rõ ràng trong tín hiệu quang học, như thể hiện ở Hình 3.3 Thể tích nhỏ keo bạc được sử dụng là 1,5 μl, giúp tối ưu hóa quá trình phản ứng và thu nhận dữ liệu chính xác hơn Kết quả nghiên cứu xác định mức độ tương tác của clorpheniramin trên bề mặt keo bạc, giúp nâng cao độ nhạy của phương pháp SERS trong phân tích dược phẩm Các dữ liệu này cung cấp thông tin quan trọng để phát triển các kỹ thuật phân tích nhanh, chính xác và ứng dụng trong kiểm tra chất lượng thuốc.
Bảng 3.2 Cách chuẩn bị các hỗn dịch keo bạc có nồng độ khác nhau
Nồng độ hỗn dịch keo bạc
Thể tích keo bạc ban đầu (ml)
Hình 3.3 trình bày phổ SERS của chlorpheniramin khi nhỏ keo bạc ở các nồng độ khác nhau Nhận xét cho thấy, khi giảm nồng độ keo bạc từ C1 đến C3, cường độ tín hiệu Raman tăng rõ rệt Tuy nhiên, việc tăng nồng độ keo bạc lên C3 gây ảnh hưởng đến đỉnh Raman tại 1088 cm⁻¹ Do đó, nồng độ keo bạc C2 được lựa chọn để thu được tín hiệu chlorpheniramin mạnh và rõ ràng hơn trong các khảo sát tiếp theo, đảm bảo độ nhạy và độ chính xác của kết quả phân tích.
- Khảo sát thể tích nhỏ hỗn dịch keo bạc: Pha dung dịch chuẩn clorpheniramin
Chúng tôi sử dụng dung dịch 2 mg/ml trong methanol để tiến hành phân tích TLC dưới các điều kiện đã xác định, đồng thời đánh dấu các điểm phân tách phù hợp Phân tích phổ SERS của các mẫu chuẩn clorpheniramin được thực hiện để so sánh, qua đó xác định sự khác biệt trong các cột tích của dung dịch keo ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 µL Quá trình này giúp xác định chính xác thời gian thu tách hiệu quả của phương pháp phân tích, góp phần nâng cao độ chính xác trong việc định lượng clorpheniramin.
Trong nghiên cứu này, cường độ đỉnh 1088 cm⁻¹ tăng khi tăng thể tích nhỏ keo bạc từ 0,5 đến 1,5 ml, thể hiện qua hình 3.4.a Do đó, chúng tôi đã chọn thể tích nhỏ keo bạc là 1,5 ml nhằm hạn chế hiện tượng loang lỗ của vết sắc ký dưới ảnh hưởng của hiệu ứng giọt cà phê, giúp duy trì độ nhạy của phương pháp phân tích.
Khảo sát vị trí chiếu tia laser cho thấy cường độ đỉnh 1088 cm⁻¹ tăng từ vị trí 1 (tâm vết) đến vị trí 5 (vành keo), sau đó giảm từ vị trí 5 đến vị trí 8 (viền ngoài cùng của vết) Kết quả thể hiện rõ ở Hình 3.4.b và cho thấy hiệu ứng giọt cà phê vẫn được ghi nhận đối với chất clorpheniramin Quá trình này đánh dấu các điểm phân tách qua phương pháp TLC và xác định vị trí chiếu tia laser phù hợp để phân tích.
Hình 3.4 Kết quả khảo sát thể tích nhỏ kheo bạc (a) và vị trí chiếu tia laser (b)
Dựa trên khảo sát thời gian chiếu tia laser, dung dịch chuẩn clorpheniramin 2 mg/ml trong methanol được pha và phân tích bằng phương pháp TLC với các điều kiện đã chọn, sau đó đánh dấu các điểm phân tách Tia laser được chiếu kích thích từ 60 đến 240 giây và cường độ đỉnh 1088 cm\(^{-1}\) được đánh giá Kết quả thể hiện rõ ở Hình 3.5 cho thấy, trong khoảng thời gian từ 60 đến 180 giây, không có tín hiệu đặc trưng của clorpheniramin xuất hiện, trong khi đến 240 giây mới xuất hiện tín hiệu rõ ràng, cho thấy thời gian tối ưu để kích thích tia laser phù hợp để phát hiện clorpheniramin.
240 giây thì cường độ các đỉnh của clorpheniramin đạt mức cao Do đó, lựa chọn thời gian ghi phổ SERS là 240 giây
Thể tớch nhỏ keo (àl)
Vị trí nhỏ keo C ường độ đỉnh 1088 cm -1
Hình 3.5 Kết quả khảo sát thời gian chiếu tia laser Như vậy, các điều kiện được lựa chọn là:
- Vị trí nhỏ keo: tâm vết
- Nồng độ hỗn dịch keo: tỷ lệ keo bạc:glycerol = 9:1
- Thể tớch nhỏ keo: 1,5 àl
- Vị trí chiếu tia laser: vành keo
- Thời gian chiếu tia laser: 240 giây
Phương pháp tiến hành bao gồm một số bước chính nhằm phân tích mẫu chuẩn clorpheniramin bằng phương pháp TLC và SERS Đầu tiên, dung dịch chuẩn được chạy trên lớp TLC sử dụng hệ dung môi cyclohexan: aceton: triethylamin theo tỷ lệ 8:2:0,5, rồi sau đó để khô tự nhiên và đánh dấu các điểm phân tách tại bước sóng 254 nm Tiếp theo, hỗn dịch keo bạc (1,5 μl) được nhỏ trực tiếp lên tâm của mỗi vết phân tách trên tấm TLC để chuẩn bị cho bước phân tích tiếp theo Phổ SERS của từng điểm phân tách sau đó được ghi lại bằng máy quang phổ Raman với bước sóng kích thích 785 nm, công suất laser 10 mW, thời gian ghi tín hiệu 240 giây, và tia laser được chiếu tại vị trí vành keo để thu thập dữ liệu chính xác.
Thời gian chiếu tia laser (giây) C ường độ đỉnh 1088 cm -1
3.1.2 Thẩm định quy trình định tính Clorpheniramin
3.1.2.1 Xây dựng bộ dịch chuyển Raman đặc trưng của clorpheniramin
Các dung dịch chuẩn của Clorpheniramin được pha ở các nồng độ từ 0,2 đến 2,0 mg/ml để đảm bảo độ chính xác trong phân tích Tiến hành phân tích TLC theo các điều kiện đã chọn, xác định các điểm phân tách rõ ràng để đánh dấu vị trí của hoạt chất Đo phổ SERS của Clorpheniramin ở nhiều nồng độ khác nhau đã cho kết quả thể hiện rõ qua Hình 3.6 và Bảng 3.3, giúp xác định đặc điểm quang phổ và nồng độ của thuốc một cách chính xác.
Hình 3.6 Phổ SERS của dung dịch clorpheniramin ở các nồng độ khác nhau
Bảng 3.3 Các đỉnh đặc trưng và tỷ lệ cường độ SERS ở các đỉnh của clorpheniramin với các nồng độ khác nhau
Raman shift (cm -1 ) Tỷ lệ cường độ
Dao động các đỉnh Dao động tỉ lệ
(Tỉ lệ cường độ được tính bằng tỉ lệ giữa cường độ của các đỉnh với cường độ của đỉnh tham chiếu)
Các đỉnh đặc trưng của clorpheniramin: 627; 660; 746; 800; 824; 1056; 1088; 1180; 1204 cm -1 với dao động tỉ lệ các đỉnh tương ứng là 1,20 – 1,97; 1,08 – 2,14; 1,17 – 2,01; 1,18 – 2,07; 1,04 – 1,73; 0,94 – 1,87; 1,00; 0,91 – 1,75; 1,24 – 1,83
Thẩm định đạt yêu cầu theo hướng dẫn của AOAC 2016 [14] về:
Ứng dụng quy trình xây dựng được để phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong một số chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu được thu thập trên thị trường
Trong nghiên cứu này, phương pháp phân tích TLC – SERS được sử dụng để đánh giá 37 mẫu chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu trên thị trường, đảm bảo độ chính xác và độ nhạy cao trong xác định thành phần Kết quả cho thấy, trong số các mẫu khảo sát, có 5 mẫu có vết tương ứng tại Rf của clorpheniramin chuẩn, phản ánh sự hiện diện của hoạt chất này trong các chế phẩm Phổ SERS của các vết nghi ngờ đã được thể hiện rõ ràng qua hình 3.10 và bảng 3.5, giúp xác định chính xác thành phần dược liệu trong các mẫu chế phẩm Phương pháp này là công cụ quan trọng trong giám sát chất lượng và đảm bảo an toàn cho các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu trên thị trường.
Hình 3.9 Sắc kí đồ phân tích các mẫu chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu trên thị trường
Hình 3.10 Phổ SERS các mẫu nghi ngờ có chứa clorpheniramin
(a) Mẫu dương tính; (b) Mẫu âm tính
Bảng 3.5 Bảng các đỉnh đặc trưng và tỉ lệ cường độ SERS ở các đỉnh của các mẫu dương tính clorpheniramin
Nhận xét: Trong 05 mẫu nghi ngờ có chứa clorpheniramin thì có 04 mẫu gồm
Các mẫu VNA19, VNA35, VNA03 và VNA36 cho tín hiệu SERS với các đỉnh đặc trưng dao động quanh các đỉnh của clorpheniramin chuẩn, thể hiện tỷ lệ các đỉnh nằm trong ngưỡng dao động phù hợp Trong khi đó, mẫu BA01 không xuất hiện đỉnh nào trùng với các đỉnh đặc trưng của clorpheniramin, xác nhận qua hình 3.10.b Phương pháp kết hợp TLC – SERS đã xác định chính xác 4 mẫu dương tính với clorpheniramin trong tổng số 37 mẫu khảo sát, đồng thời phát hiện một mẫu dương tính giả BA01 do phương pháp TLC độc lập nhận diện.
Các mẫu thử được xác nhận bằng phương pháp LC-MS/MS, cho kết quả phù hợp với phương pháp TLC – SERS, trong đó có 04 mẫu dương tính.
43 clorpheniramin (VNA19; VNA35; VNA03; VNA36) Kết quả được minh họa ở
Hình 3.11 Sắc ký đồ và phổ khối clorpheniramin trong mẫu dương tính VNA35
Lựa chọn phương pháp
Trong những năm gần đây, quang phổ Raman đã trở thành phương pháp được quan tâm hàng đầu trong kiểm nghiệm thuốc nhờ độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, các nền mẫu từ dược liệu với thành phần phức tạp, phát huỳnh quang mạnh và dễ bị hư hỏng bởi nhiệt laser đặt ra thách thức lớn cho phương pháp này Để khắc phục, phương pháp TLC – SERS đã được áp dụng, kết hợp sắc ký lớp mỏng để tách các chất phân tích khỏi nền mẫu, giúp nâng cao độ nhạy và khả năng phát hiện nhanh chóng, tại chỗ các thành phần dược liệu một cách đơn giản và hiệu quả.
Nghiên cứu xây dựng phương pháp kết hợp TLC – SERS nhằm phát triển một kỹ thuật đơn giản, nhanh chóng, có độ nhạy và độ tin cậy cao để phát hiện thuốc hóa dược trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu Quá trình bắt đầu bằng việc thực hiện tách các hợp chất qua phương pháp TLC, sau đó quét phổ UV để nhanh chóng sàng lọc mẫu nghi ngờ chứa chlorpheniramin, rồi đo phổ SERS để xác nhận chính xác kết quả Phổ đồ độc đáo của từng hợp chất giúp phương pháp này có khả năng nhận dạng đáng tin cậy Phương pháp TLC – SERS không chỉ giúp tiết kiệm nguyên vật liệu, thiết bị và thời gian, mà còn tuân thủ các khuyến cáo của SWGDRUG, phù hợp để kiểm tra thuốc trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu.
Quy trình định tính clorpheniramin trộn lẫn trong chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu bằng TLC – SERS
từ dược liệu bằng TLC – SERS
4.2.1 Xây dựng quy trình định tính clorpheniramin
Xây dựng bộ đỉnh đặc trưng trên phổ SERS của clorpheniramin:
Phân tích phổ Raman của chuẩn chlorpheniramin và phổ SERS của dung dịch chuẩn cho thấy sau khi áp dụng dung môi lên tấm TLC, một số đỉnh đặc trưng của chất chuẩn bị có sự dịch chuyển hoặc mất đi rõ ràng trên phổ SERS Kết quả này cho thấy sự ảnh hưởng của dung môi đến cấu trúc phân tử và khả năng nhận diện đặc trưng của chlorpheniramin trong quá trình phân tích Thông qua so sánh, có thể xác định mức độ thay đổi của đỉnh phổ, từ đó đánh giá độ ổn định của mẫu và độ tin cậy của phương pháp phân tích SERS cho chất chuẩn chlorpheniramin.
Keo bạc có bước sóng hấp thụ cực đại là 417 nm, tuy nhiên để đo các chất vô cơ thường sử dụng tia laser 532 nm, còn với mẫu thuốc chứa hợp chất hữu cơ thì nên dùng tia laser 785 nm để giảm nhiễu huỳnh quang và làm rõ các đỉnh của phổ Raman Do đó, nhiều nghiên cứu trên thế giới về phân tích Raman thường lựa chọn tia laser 785 nm để đạt được kết quả chính xác và rõ nét hơn [6], [44].
Trong quy trình định tính clorpheniramin, tia laser 785 nm được sử dụng nhờ vào khả năng tương thích với keo bạc, chất tăng cường hiệu quả trong quá trình phân tích Việc chọn tia laser này giúp nâng cao độ chính xác và độ nhạy của phương pháp định tính, đảm bảo kết quả phân tích đáng tin cậy Các nghiên cứu liên quan đã xác nhận rằng tia laser 785 nm phù hợp để kích hoạt phản ứng quang học trong quá trình phân tích hợp chất này Do đó, lựa chọn tia laser 785 nm là phù hợp và tối ưu cho các quy trình phân tích clorpheniramin dựa trên công nghệ quang học.
Các đỉnh đặc trưng trên phổ SERS của dung dịch clorpheniramin trong methanol thể hiện sự dịch chuyển so với phổ Raman của mẫu chuẩn, đồng thời một số đỉnh không rõ nét Các đỉnh quan trọng của clorpheniramin bao gồm 627, 660, 746, 800, 824 và 1056 cm⁻¹, giúp nhận diện chính xác hợp chất trong quá trình phân tích Sự biến đổi của các đỉnh này phản ánh khả năng tương tác của clorpheniramin trong môi trường methanol và ảnh hưởng đến đặc điểm quang học của mẫu Phân tích phổ SERS cung cấp thông tin quan trọng cho nghiên cứu về cấu trúc và tính chất của thuốc, góp phần nâng cao độ chính xác trong xác định chất lượng và phát hiện thành phần.
1088, 1180, 1204 cm -1 ; trong đó đinh 1088 cm -1 được chọn làm đỉnh tham chiếu
Khảo sát điều kiện SERS:
Vị trí nhỏ keo là ở tâm vết, bởi vì phân tử Clorpheniramin tập trung nhiều tại đây, tạo ra mật độ phân tử phân tích cao và cho cường độ Raman tốt hơn Khi nhỏ keo bạc vào trung tâm vết, tín hiệu Raman được cải thiện rõ rệt so với việc nhỏ ở rìa vết, vì vậy nghiên cứu đã chọn hướng nhỏ keo tại vị trí tâm vết để tối ưu hóa kết quả phân tích Raman.
Nồng độ hỗn dịch keo là yếu tố quan trọng trong quá trình xác định clorpheniramin, với dãy các nồng độ khác nhau được khảo sát để tìm ra tỉ lệ tối ưu Kết quả cho thấy, tỉ lệ keo và glycerol là 9:1 mang lại cường độ Raman tốt nhất, giúp nâng cao độ chính xác trong quy trình định tính Việc lựa chọn nồng độ phù hợp này rất quan trọng để đảm bảo kết quả phân tích chính xác và tin cậy.
46 độ glycerol thấp hơn so với kết quả (nồng độ keo và glycerol = 5:5) trong nghiên cứu của Fang F và cộng sự [6]
Khi nhỏ keo bạc lên chất phân tích, các hạt keo dạt ra xung quanh kéo theo chất phân tích, do đó, việc tăng thể tích nhỏ keo sẽ làm tăng lượng chất phân tích được kéo theo, từ đó nâng cao cường độ Raman Để hạn chế hiện tượng loang của vết sắc ký dưới ảnh hưởng của hiệu ứng giọt cà phờ và đảm bảo độ nhạy của phương pháp phân tích, đề tài đã chọn thể tích nhỏ keo là 1,5 µL.
Vị trí chiếu tia laser quan trọng trong quá trình phân tích, bởi hiệu ứng giọt cà phê vẫn được ghi nhận đối với clorpheniramin Khi nhỏ keo bạc xuống tấm TLC, keo bạc sẽ dạt ra tạo thành vòng tròn do sự tác động tương tác giữa các phân tử bạc và chất phân tích Các phân tử bạc và chất phân tích tập trung cao tại vành keo, khiến việc chiếu laser ở vị trí này sẽ mang lại cường độ Raman tối ưu Do đó, lựa chọn vị trí chiếu tia laser ở vành keo là hướng đi phù hợp để đạt hiệu quả phân tích cao nhất.
Thời gian chiếu tia laser được xác định là 240 giây để đạt được hiệu quả tối ưu trong việc kích thích, phù hợp với nghiên cứu của Fang F và cộng sự [6] Trong khoảng từ 60 đến 180 giây, không xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của chlorpheniramin, nhưng đến 240 giây, các đỉnh của chlorpheniramin đạt mức cao nhất, cho thấy đây là thời điểm lý tưởng để tiến hành chiếu tia laser.
Phương pháp tiến hành gồm có việc phân tích dung dịch chuẩn chlorpheniramine bằng phương pháp TLC sử dụng hệ dung môi pha động gồm cyclohexan, aceton, và triethylamin theo tỷ lệ 8:2:0,5 Sau khi rửa giải, tấm TLC được để khô tự nhiên và các điểm phân tách được quan sát dưới ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm để đánh dấu vị trí Một lượng nhỏ hỗn dịch keo bạc (1,5 μl) được nhỏ trực tiếp vào tâm mỗi điểm đã đánh dấu trên tấm TLC để chuẩn bị cho phân tích SERS Phổ SERS của từng điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman với bước sóng kích thích 785 nm, công suất laser 10mW, thời gian ghi nhận tín hiệu 240 giây và tia laser chiếu tại vị trí vành keo nhằm thu thập dữ liệu chính xác về thành phần phân tách.
Phương pháp được thẩm định trên ba nền mẫu placebo gồm dạng viên nang, viên hoàn và trà túi, dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, đã qua kiểm nghiệm khoa học về tác dụng điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng cấp và mãn tính, cũng như cảm sốt Các mẫu này đã được xác nhận không chứa hoạt chất bằng phương pháp LC-MS/MS, đảm bảo độ chính xác của kết quả Phân tích phổ SERS cho thấy clorpheniramin có các tín hiệu đặc trưng dao động quanh các dịch chuyển chính của chuẩn, và nền mẫu không ảnh hưởng đáng kể đến các đỉnh đặc trưng này Nhờ đó, phương pháp có độ chọn lọc cao, phù hợp để phát hiện clorpheniramin trong các sản phẩm nguồn gốc từ dược liệu.
Phương pháp phát hiện được thẩm định theo tiêu chuẩn AOAC với giới hạn phát hiện là 20 ppm, đảm bảo độ nhạy cao để phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong các chế phẩm từ dược liệu Giới hạn này thấp hơn nhiều so với mức 1% thường dùng để pha trộn clorpheniramin nhằm tăng hiệu quả và nhanh chóng, giúp đảm bảo an toàn và tuân thủ quy định Nhờ đó, phương pháp này có khả năng phát hiện chính xác các vi phạm về lượng chất này trong các sản phẩm nguồn gốc dược liệu.
Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong một số chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu được thu thập trên thị trường
Ứng dụng phương pháp TLC – SERS đã được xây dựng để phân tích hoạt chất chlorpheniramin trong 37 mẫu chế phẩm nguồn gốc từ dược liệu điều trị hoặc hỗ trợ điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng cấp và mãn tính, cùng cảm lạnh thông qua khảo sát các mẫu thu thập trên thị trường từ nhiều nguồn khác nhau Kết quả phân tích cho thấy, có 4 mẫu dương tính với chlorpheniramin là VNA19, VNA35, VNA03 và VNA36, chiếm tỷ lệ xác định rõ ràng trong tổng số mẫu Các kết quả này đã được xác nhận và kiểm chứng bằng phương pháp LC-MS/MS, đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy của phương pháp phân tích mới.
48 đảm bảo kết quả chính xác và đáng tin cậy Đồng thời phương pháp TLC-SERS đã loại trừ các kết quả dương tính giả trong phương pháp TLC
Thực trạng trộn trái phép chlorpheniramin trong các loại thuốc dược liệu, thuốc cổ truyền và thực phẩm bảo vệ sức khỏe ngày càng phổ biến, đặc biệt trong điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng cấp và mãn tính, cảm sổ mũi Người tiêu dùng cần thận trọng và cân nhắc khi lựa chọn các chế phẩm này để đảm bảo an toàn sức khỏe Phương pháp phân tích được xây dựng có tính thực tiễn cao giúp phát hiện nhanh chóng việc trộn chlorpheniramin trái phép trong các chế phẩm dược liệu, hỗ trợ công tác quản lý và kiểm tra chất lượng thuốc trên thị trường hiệu quả.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả thực nghiệm thu được, đề tài rút ra được những kết luận như sau:
1 Đã xây dựng được quy trình định tính clorpheniramin trộn lẫn trong chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS), cụ thể:
Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn clorpheniramin trong methanol
Mẫu thử được nghiền mịn với trọng lượng khoảng 700 mg rồi cho vào ống Falcon Tiếp theo, thêm 25 ml methanol vào mẫu, lắc xoáy trong vòng 5 phút để hòa tan hoàn toàn Quá trình chiết xuất tiếp tục bằng phương pháp siêu âm trong 10 phút giúp tối ưu hóa dung môi thẩm thấu Sau đó, ly tâm mẫu ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để tách lớp dung dịch trong, lấy phần dịch trong phía trên để tiến hành phân tích tiếp theo, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong quy trình phân tích mẫu thử.
Các mẫu chuẩn và mẫu thử được phân tích bằng phương pháp TLC sử dụng hệ dung môi pha động gồm cyclohexan, aceton, và triethylamin theo tỷ lệ 8:2:0,5, với các điểm phân tách được đánh dấu tại bước sóng 254 nm Sau đó, nhỏ 1,5 μl keo bạc lên các vết trên tấm TLC để chuẩn bị cho phân tích tiếp theo Phổ SERS sau đó được ghi lại bằng máy Raman sử dụng bước sóng kích thích 785 nm, công suất laser 10 mW, với thời gian ghi tín hiệu là 240 giây, và tia laser chiếu vào vị trí quanh vành keo để thu thập dữ liệu chính xác.
Phương pháp TLC – SERS đã được xác nhận có độ chọn lọc cao và giới hạn phát hiện đạt 20 ppm chlorpheniramin, đảm bảo hiệu quả trong việc phát hiện chlorpheniramin trong các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu.
2 Đã ứng dụng quy trình xây dựng được để phát hiện clorpheniramin trộn trái phép trong một số chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu được thu thập trên thị trường Cụ thể:
Phương pháp TLC – SERS đã thành công trong việc phát hiện 04 mẫu dương tính với chlorpheniramin trong tổng số 37 mẫu chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đang lưu hành trên thị trường Các kết quả xác định bằng TLC – SERS đã được đối chiếu chính xác với kết quả phân tích song song bằng LC-MS/MS, và không phát hiện bất kỳ trường hợp âm tính hoặc dương tính giả nào.
Chúng tôi tiếp tục thu thập các mẫu chế phẩm từ dược liệu có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng cấp và mãn tính, cũng như cảm sốt mũi Phương pháp TLC-SERS được ứng dụng mở rộng trên nhiều mẫu chế phẩm khác nhau trên thị trường, bao gồm các dạng bào chế như viên nang mềm và dung dịch, nhằm kiểm tra và giám sát chất lượng các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu, thực phẩm bảo vệ sức khỏe Điều này giúp nâng cao hiệu quả kiểm tra chất lượng các chế phẩm điều trị hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về đường hô hấp, góp phần đảm bảo an toàn và hiệu quả cho người tiêu dùng.
