Phạm thanh thuỷ phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn escherichia coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại hà nội luận văn thạc sĩ dược học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THANH THUỶ PHÁT HIỆN CÁC GEN MÃ HOÁ YẾU TỐ ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Escherichia coli TRONG CÁC MẪU THỊT LỢN, THỊT GÀ VÀ THỊ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH THUỶ

PHÁT HIỆN CÁC GEN MÃ HOÁ YẾU TỐ

ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Escherichia coli

TRONG CÁC MẪU THỊT LỢN, THỊT GÀ VÀ THỊT BÒ THU MUA Ở MỘT SỐ CHỢ, SIÊU

THỊ TẠI HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THANH THUỶ

PHÁT HIỆN CÁC GEN MÃ HOÁ YẾU TỐ

ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN Escherichia coli

TRONG CÁC MẪU THỊT LỢN, THỊT GÀ VÀ THỊT BÒ THU MUA Ở MỘT SỐ CHỢ, SIÊU

THỊ TẠI HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HOÁ SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8720208

Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Tuấn Linh

PGS TS Phùng Thanh Hương

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và trân trọng cảm ơn hai người

thầy: TS Dương Tuấn Linh – Viện Dinh dưỡng và PGS TS Phùng Thanh Hương

– Trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, trực tiếp dẫn dắt, động viên, giúp đỡ trên nhiều phương diện và ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại viện

Tôi cũng xin gửi lời chân thành cảm ơn tới ThS Nguyễn Ánh Ngọc và DS Đỗ Hải An, cùng các anh chị tại Khoa Vi sinh & Sinh học Phân tử và Khoa Dinh dưỡng

& Bệnh không lây nhiễm – Viện Dinh dưỡng đã dành tâm huyết và thời gian để có thể dẫn dắt tôi đến ngày hoàn thành luận văn

Đồng thời tôi cũng chân thành cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Hóa sinh đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, động viên và cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu trong quá trình thực hiện luận văn Ngoài ra, tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Dược

Hà Nội, cũng như các phòng ban của trường đã tạo điều kiện, cơ sở vật chất để tôi có

cơ hội và môi trường học tập và rèn luyện

Cuối cùng, tôi muốn dành lời cảm ơn tới gia đình, những người bạn đã bên cạnh tôi, là nguồn động viên lớn lao với tôi trong học tập, công tác cũng như trong cuộc sống

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè để tôi có thể có được kết quả tốt hơn

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 1 tháng 4 năm 2023

Người viết

Phạm Thanh Thủy

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 6

DANH MỤC CÁC BẢNG 7

DANH MỤC CÁC HÌNH 9

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Escherichia coli 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học 3

1.1.2 Cơ chế độc lực của vi khuẩn Escherichia coli liên quan đến các gen độc lực được khảo sát 7

1.1.3 Dịch tễ và tình hình nghiên cứu về gen mã hoá độc lực vi khuẩn Escherichia coli 12

1.2 Phương pháp phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli 14

1.2.1 Phương pháp PCR 15

1.2.2 Phương pháp multiplex PCR 16

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu và phương pháp thu thập 17

2.1.2 Thiết bị, hoá chất nghiên cứu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Thiết kế cỡ mẫu 20

2.3.2 Phương pháp khảo sát một số thông số phản ứng multiplex PCR khuếch đại đồng thời các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli 21

2.3.3 Phương pháp tăng sinh vi khuẩn Escherichia coli trên mẫu thịt 26

2.3.4 Quy trình tách chiết ADN từ dung dịch tăng sinh chọn lọc cho các vi khuẩn 27 2.3.5 Phương pháp tiến hành phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn 28

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 30

3.1 Khảo sát xây dựng quy trình m-PCR, xác định được các thông số thích hợp để phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli 30

3.1.1 Kết quả phân tích cặp mồi lựa chọn bằng phương pháp tin sinh học 30

3.1.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ của phản ứng PCR đơn mồi 30

3.1.3 Kết quả khảo sát chu trình nhiệt của phản ứng PCR đa mồi trên các mẫu dung dịch E coli tách chiết ADN chứng dương 35

3.1.4 Kết quả khảo sát lại các thông số của phản ứng PCR đa mồi trên các mẫu dung dịch E coli tách chiết ADN cần phát hiện 36

3.2 Phát hiện được các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại Hà Nội 39

3.2.1 Tỷ lệ nhiễm E coli có các gen độc lực trong 3 loại thịt 39

3.2.2 Tỷ lệ lưu hành gen độc lực của E coli trên thịt lợn 41

3.2.3 Tỷ lệ lưu hành gen độc lực của E coli trên thịt bò 44

3.2.4 Tỷ lệ lưu hành gen độc lực của E coli trên thịt gà 47

PHẦN 4: BÀN LUẬN 51

4.1 Về kết quả khảo sát một số thông số của phản ứng m-PCR để phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli 51

4.2 Về kết quả phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại Hà Nội 52

4.2.1 Tỷ lệ các nhóm chủng E coli 52

4.2.2 Tỷ lệ nhiễm các gen mã hoá yếu tố độc lực cho các chủng E coli 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AE Attaching and Effacing

ADN Acid deoxyribonucleic

BHI Brain Heart Infusion

BPW Buffered Peptone Water

DAEC Diffusely adherent E coli E coli bám dính khuếch tán

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

EAEC Enteroadherent E coli E coli bám dính

EHEC Enterohaemorrhagic E coli E coli gây xuất huyết đường ruột

EIEC Enteroinvasive E coli E coli xâm nhập đường ruột

EPEC Enteropathogenic E coli E coli gây bệnh đường ruột

ETEC Enterotoxigenic E coli E coli gây độc đường ruột

HUS Hemolytic Uremic Syndrome Hội chứng tán huyết – ure huyết

LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification

LEE Locus of Enterocyte Effacement

m-PCR Multiplex Polymerase Chain

STEC Shigatoxigenic E coli E coli sinh độc tố Shiga

VTEC Verotoxigenic E coli E coli gây độc tế bào Vero

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

RTX Repeats in Toxin

UPEC Uropathogenic E coli E coli gây nhiễm trùng đường tiết

niệu

DANH MỤC CÁC BẢNG

trang Bảng 2.1 Bộ đa mồi thứ nhất: để phân nhóm A, B1, B2 và D 22

Bảng 2.2 Bộ đa mồi thứ hai: để phát hiện gen mã hóa yếu tố độc lực 23

Bảng 2.3 Bộ đa mồi thứ ba: để xác định E coli chủng kháng nguyên

Bảng 3.1 Tỷ lệ các phân nhóm E coli trên trên 3 loại thịt được tăng

sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone 39

Bảng 3.2

Tỷ lệ nhiễm các gen độc lực cần khảo sát của E coli trên 3

loại thịt được tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone

40

Bảng 3.3 Tỷ lệ các phân nhóm E coli trên các mẫu thịt lợn được

tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone 41

Bảng 3.4

Tỷ lệ nhiễm các gen độc lực của E coli trên các mẫu thịt

lợn được tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone

42

Bảng 3.5

Tỷ lệ nhiễm E coli chủng O157 và O111 trên các mẫu thịt

lợn được tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone

43

Bảng 3.6 Tỷ lệ các phân nhóm E coli trên các mẫu thịt bò được tăng

Bảng 3.7

Tỷ lệ nhiễm các gen độc lực của E coli trên các mẫu thịt

bò được tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone

45

Bảng 3.8

Tỷ lệ nhiễm E coli chủng O157 và O111 trên các mẫu thịt

bò được tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone

46

Bảng 3.9 Tỷ lệ các phân nhóm E coli trên các mẫu thịt gà được tăng 47

sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone

Bảng 3.10

Tỷ lệ nhiễm các gen độc lực của E coli trên các mẫu thịt

gà được tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone và Peptone

48

Bảng 3.11 Tỷ lệ nhiễm E coli chủng O157 và O111 trên các mẫu thịt

gà được tăng sinh vi khuẩn trong môi trường Tryptone 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

trang

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình phân loại Escherichia coli theo nhóm A,

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình thực hiện mục tiêu 1 19

Hình 2.2 Sơ đồ quá trình thực hiện mục tiêu 2 20

Hình 2.3 Kết quả khảo sát cặp mồi O157 trên chủng Escherichia

Hình 2.4 Sơ đồ chu trình nhiệt của phản ứng PCR đơn mồi khảo sát

Hình 3.1 Kết quả điện di phát hiện gen chuA (279 bp) trong dung

Hình 3.2 Kết quả điện di phát hiện gen yjaA (211 bp) trong dung

Hình 3.3 Kết quả điện di phát hiện gen TspE4.C2 (152 bp) trong

Hình 3.4 Kết quả điện di phát hiện gen stx1 (180 bp) trong dung

Hình 3.5 Kết quả điện di phát hiện gen stx2 (225 bp) trong dung

Hình 3.6 Kết quả điện di phát hiện gen eaeA (384 bp) trong dung

Hình 3.7 Kết quả điện di phát hiện gen hlyA (534 bp) trong dung 33

dịch mẫu E coli tách chiết ADN

Hình 3.8 Kết quả điện di phát hiện gen O157 (259 bp) trong dung

Hình 3.9 Kết quả điện di phát hiện gen O111 (406 bp) trong dung

Hình 3.10 Kết quả điện di 3 set phản ứng PCR phát hiện E coli

trong dung dịch mẫu E coli tách chiết ADN 35

Hình 3.11 Kết quả điện di phát hiện E coli trong dung dịch mẫu E

coli tách chiết ADN set 1 để phân nhóm A, B1, B2 và D 36

Hình 3.12 Kết quả điện di phát hiện E coli trong dung dịch tách chiết

ADN set 2 để phát hiện gen stx1, stx2, eaeA, hlyA 37

Hình 3.13 Kết quả điện di phát hiện E coli trong dung dịch tách chiết

ADN set 3 phát hiện gen chủng O157 và O111 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng trở nên cấp thiết, tuy đã có nhiều cảnh báo nhưng số ca ngộ độc thực phẩm vẫn đang gia tăng với tính chất ngày càng nghiêm trọng Theo số liệu thống kê năm 2010 của Cục vệ sinh An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có chừng 200-600 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.000 – 7.000 nạn nhân, trong đó có vài chục ca tử vong [1] Khoảng 20 – 30% là ngộ độc do hoá chất, khoảng 50% là do vi sinh vật, 14% - 20% do thức ăn có độc…[1]

Escherichia coli là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng hàng đầu trong các vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, tiêu chảy, trong đó, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) hay E coli sinh độc tố Shiga (STEC) là nguyên nhân phổ biến nhất gây ra

bệnh viêm đại tràng xuất huyết, tiêu chảy ra máu, và cũng là một trong những nguyên nhân chính gây ra dịch bệnh do thực phẩm ở người [2] Yếu tố độc lực của EHEC đã được xác định là do độc tố Shiga (Stxs), ngoài ra, hầu hết các dòng EHEC

O157 có tập hợp đầy đủ các gen độc lực eae mã hóa yếu tố bám dính và hlyA mã hóa

yếu tố gây tan máu [3], các độc tố này gây tiêu chảy nghiêm trọng, nguy cơ cao dẫn đến hội chứng tán huyết – ure huyết (HUS – Hemolytic Uremic Syndrome) và suy thận ở người bệnh [4, 5] Chúng cũng chính là tác nhân gây ra các đợt bùng phát lớn

với những ghi nhận tử vong gây ra bởi E coli tại các quốc gia phát triển như Mỹ [6],

Đức [7], … Ngoài ra, chủng EHEC O111 cũng đã được báo cáo gây ra các đợt bùng phát ở Tây Âu và Nhật Bản, với ghi nhận có ca tử vong và nhiều ca mắc hội chứng

HUS [8] Escherichia coli cũng chính là một trong ba vi khuẩn được xác định là

nguyên nhân gây ra ngộ độc tập thể tại một trường học tại Việt Nam vào tháng 11 năm

2022, khiến một học sinh tử vong, việc này càng làm rõ hơn mức độ nguy hiểm mà vi khuẩn này gây ra với sức khoẻ cộng đồng

Đứng trước sự gia tăng các ca ngộ độc thực phẩm hàng năm, việc đưa ra lời cảnh báo sớm và ngăn chặn là rất cần thiết Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và tầm quan

trọng của việc bảo vệ sức khỏe con người, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Phát hiện

các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli trong các mẫu thịt

lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại Hà Nội” với mục tiêu:

1 Khảo sát một số thông số của phản ứng multiplex PCR để phát hiện các gen

mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli

2 Phát hiện được các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli

trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại

Hà Nội

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Escherichia coli

1.1.1 Đặc điểm sinh học

1.1.1.1 Đặc điểm hình thể

Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy tiện, hình que ngắn, kích

thước khoảng 1-3m x 0,4 – 0,7m Hầu hết vi khuẩn có lông ở xung quanh thân nên

di động được, một số chủng có vỏ, không sinh bào tử Bình thường E coli sống trong

đường ruột của người, động vật máu nóng và chim

1.1.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Escherichia coli (E coli) phát triển tốt trong nhiệt độ dao động từ 21 – 49C,

tối ưu ở khoảng 37C và mức tối thiểu để đăng trưởng có thể đo được là 7,5C; Tế bào sống sót tốt trong thực phẩm ở -20C, và bị giết chết ở 64,3C

1.1.1.3 Giới hạn ô nhiễm vi khuẩn E coli trong thịt

Năm 2012, Bộ Y Tế đã ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm

vi sinh vật trong thực phẩm: QCVN số 8-3:2012/BYT, trong đó quy định giới hạn ô

nhiễm vi sinh vật: E coli trong thịt và sản phẩm chế biến từ thịt phải qua xử lý nhiệt

trước khi sử dụng, với: giới hạn dưới (m): 5x102 và giới hạn trên (M): 5x103

m: giới hạn dưới, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm tất cả các kết quả không vượt quá giá trị m là đạt

M: giới hạn trên, nếu trong n mẫu kiểm nghiệm chỉ 01 mẫu cho kết quả vượt

Trong đó, số mẫu cần lấy từ lô hàng để kiểm nghiệm là 5; mẫu kiểm nghiệm được phép có tối đa 2 mẫu cho kết quả kiểm nghiệm nằm giữa m và M

1.1.1.4 Phân loại Escherichia coli

Thông thường, E coli và vật chủ người của nó cùng tồn tại trong tình trạng sức

khoẻ tốt cùng có lợi, và là thành phần cấu thành nên hệ vi sinh vật đường ruột ở người

Chúng hiếm khi gây bệnh, thậm chí, một số chủng E coli còn có lợi cho vật chủ như

việc tạo ra khu hệ cộng sinh vi sinh vật nhằm ngăn chặn các tác nhân gây bệnh khác hay tạo ra vitamin K2 [9, 10]

Tuy nhiên, một số chủng E coli đã tiến hoá, phát triển, tăng khả năng thích

nghi trong vật chủ và cho phép chúng gây ra nhiều loại bệnh cho những người khoẻ

mạnh Ba hội chứng lâm sàng phổ biến gây bởi E coli: Bệnh đường ruột/tiêu chảy,

nhiễm trùng đường tiết niệu và nhiễm trùng huyết/viêm màng não [11]

Trong số các chủng gây bệnh đường ruột, có sáu chủng được mô tả rõ ràng:

EPEC (Entero pathogenic E coli): E coli gây bệnh đường ruột: EPEC gây

bệnh tiêu chảy nặng ở trẻ sơ sinh Nguồn lây nhiễm EPEC thường do nguồn nước bị ô nhiễm cũng như các sản phẩm thịt không đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực

phẩm Có chế bệnh sinh của EPEC liên quan tới protein intimin mã hoá bởi gen eae là

yếu tố bám dính bề mặt tế bào ruột [12] Do đó, EPEC có thể phát hiện bằng các kĩ thuật sinh học phân tử cũng như nuôi cấy tế bào Hep-2 [13]

ETEC (Enterotoxigenic E coli): E coli gây độc đường ruột: ETEC thường gây

ra ra bệnh tiêu chảy nhưng rất ít khi sốt hay sốt nhẹ Tính chất bệnh sinh của ETEC là

do vi khuẩn có khả sinh một số độc tố ruột như độc tố ruột không bền với nhiệt labile enterotoxin, độc tố này có tính chất giống với độc tố ở vi khuẩn gây bệnh tả Cholera spp.) Bên cạnh đó, ETEC cũng có thể tổng hợp một số độc tố bền với nhiệt (Heat-Stable toxin - ST, chúng chịu được 30 phút ở 100C) Có một số phương pháp phát hiện chủng ETEC như ngưng kết miễn dịch dùng hạt latex, ELISA, PCR, phương pháp lai phân tử và giải trình tự gen

(heat-EIEC (Enteroinvasive E coli): E coli xâm nhập đường ruột (heat-EIEC có nhiều đặc

điểm giống với Shigella khi chúng gây nhiễm đường ruột với triệu chứng giống bệnh lị [14] Giống như Shigella, chúng ta không biết rõ đâu là ổ bệnh thiên nhiên hay vật chủ

mang EIEC Không giống các chủng E coli khác, EIEC không di động, không lên

men đường lactose, không sử dụng decarboxylate lysin và không có khả năng sống trong điều kiện kị khí Tính chất bệnh sinh của EIEC chủ yếu là do khả năng xâm nhập

và phá huỷ các mô ở ruột non Kiểu hình của EIEC được mã hoá bởi plasmid khá lớn, chúng ta có thể phát hiện EIEC bằng các kĩ thuật xét nghiệm sinh học phân tử và thí nghiệm xâm nhập tế bào HeLA hay Hep-2 [15]

EAEC (Enteroaggregative E coli): E coli bám dính EAEC được đặc trưng bởi

khả năng kết dính trong các hệ thống nuôi cấy mô dưới dạng tập hợp Ở trẻ nhỏ, những nhóm này gây nhiễm trùng tiêu chảy không ra máu EAEC gây tiêu chảy phân nước, nhầy, thường không có máu và không sốt liên quan đến nhiễm trùng [16] Đã có ghi nhận bùng phát dịch tiêu chảy gây ra bởi EAEC tại miền nam Ấn Độ, nguyên nhân do nguồn nước từ giếng cạn có chứa chủng vi khuẩn này [17]

DAEC (Diffusely adherent E coli): E coli bám dính khuếch tán DAEC gây ra

hiệu ứng dẫn truyền tín hiệu đặc trưng trong các tế bào ruột non, biểu hiện là sự phát triển của các tế bào dài giống như ngón tay, bọc xung quanh vi khuẩn [11] Theo nghiên cứu, chúng có mối liên quan đến việc gây tiêu chảy ở trẻ em phụ thuộc vào tuổi; cụ thể, ở trẻ em <12 tháng tuổi, sự hiện diện của DAEC không liên quan đáng kể đến tiêu chảy Ngược lại, DAEC có liên quan đáng kể đến tiêu chảy ở trẻ >12 tháng tuổi [18]

EHEC (Enterohaemorrhagic E coli): E coli gây xuất huyết đường ruột EHEC gây tiêu chảy ra máu do khả năng biểu hiện độc tố Shiga 1 (mã hóa bởi gen stx1) và/hoặc độc tố Shiga 2 (mã hóa bởi gen stx2) Ở chủng EHEC có biểu hiện Stx2,

chúng dẫn đến tiêu chảy ra máu và cũng có thể biểu hiện Stx1, trong khi chủng vi khuẩn không biểu hiện Stx2 không gây tiêu chảy ra máu Stxs là một nhóm các độc tố protein AB của vi khuẩn, bao gồm một tiểu đơn vị A và năm tiểu đơn vị B giống hệt nhau có khả năng ức chế tổng hợp protein thông qua khả năng nhắm mục tiêu vào các ribosome của sinh vật nhân thực (eukaryote) Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm ức chế tổng hợp protein, trong khi năm tiểu đơn vị B liên kết với glycosphingolipid Gb3 – một thụ thể trên các tế bào nội mô Sự ức chế tổng hợp protein gây chết tế bào ruột và

dẫn đến viêm đại tràng [19] Bộ gen của EHEC cũng có chứa gen eae mã hóa intimin,

là chất kết dính chính của nó, sau khi EHEC gắn vào và tạo ra tổn thương cục bộ ở ruột, độc tố Stx xâm nhập vào vật chủ và di chuyển đến các tế bào biểu mô của cơ quan đích Tế bào biểu mô cầu thận bị tổn thương tương tự như tế bào ruột, gây chết tế bào theo chương trình và tách ra hỏi màng tế bào Sự đẩy ra của tế bào làm lộ collagen, thường không có trong mạch máu kích hoạt tiểu cầu, hình thành huyết khối, kích hoạt quá trình đông máu gây giảm tiểu cầu Các tế bào nội mô bị tổn thương như vậy cũng trở thành nơi bám dính của bạch cầu, hậu quả là thận bị tổn thương thêm Tình trạng này dẫn đến hội chứng tán huyết - urê huyết (HUS) được đặc trưng bởi: thiếu máu huyết tán vi mạch, giảm tiểu cầu và suy thận [19, 20]

Phân loại E Coli theo nhóm phả hệ di truyền:

Các chủng E coli chủ yếu thuộc vào 1 trong 4 nhóm phả hệ di truyền

(phylogenetic group) là A, B1, B2, và D Trong đó các chủng thuộc nhóm B2 và D thường chứa các yếu tố độc lực liên quan tới các chủng không lưu hành ở hệ đường ruột của động vật máu nóng (extraintestinal infections - ExPEC) [21] Các chủng này thường là thủ phạm cho việc nhiễm trùng ở vị trí nào đó trên cơ thể, chúng cũng mang các gen mã hoá các yếu tố độc lực, các gen kháng kháng sinh và gây bệnh trên người

Bốn nhóm phả hệ này được phân dựa trên 3 marker gen: chuA, yjaA, TspE4.C2

Hình 1.2: Sơ đồ quá trình phân loại Escherichia coli theo nhóm A, B1, B2, D [22]

Chủng thuộc nhóm B2 và D thường được phân lập từ người viêm đường tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết Nên 2 nhóm chủng này thường gặp với tỷ lệ thất bại trong điều trị và dẫn tới tử vong cao hơn khi nhiễm nhóm chủng A và B1 Hay nói cách khác

việc nhiễm chủng A hay B1 có tiên lượng điều trị tốt hơn so với chủng B2 và D Nguyên nhân là chủng B2 có yếu tố độc lực và khả năng tạo màng sinh học (biofilm) lớn hơn so với chủng B1

1.1.2 Cơ chế độc lực của vi khuẩn Escherichia coli liên quan đến các gen độc lực

được khảo sát

1.1.2.1 Các hệ thống tiết liên quan đến gen khảo sát

Hình 1.3 Sơ lược cấu trúc hệ thống tiết loại 1, 2, 3, 4, 5, 6 [23]

Vi khuẩn có bộ máy bơm các phân tử từ trong bào tương ra bên ngoài Các chất này có vai trò quan trọng trong sự đáp ứng của vi khuẩn với môi trường xung quanh,

nó sở hữu các tính chất sinh lí như bám dính, tính chất bệnh sinh, sự đáp ứng và sống còn Chúng có thể được bài xuất trực tiếp từ bào tương ra khỏi tế bào bằng quy trình một bước hoặc hai bước Trong cơ chế một bước, các cơ chất được vận chuyển trực tiếp từ bào tương của vi khuẩn vào không gian ngoại bào hoặc vào tế bào đích, bao gồm hệ thống tiết loại 1 (T1SS), T3SS, T4SS và T6SS Đối với cơ chế bài tiết hai bước, các chất nền trước tiên được chuyển vào khoang chu chất bởi các chất vận chuyển kéo dài xuyên qua lớp màng trong của vi khuẩn (hệ thống Tat và hệ thống Sec – hình 1.2) và sau đó được chuyển đến màng ngoài hoặc được tiết vào ngoại bào [24]

Ở đây, chúng tôi đi sâu vào hệ thống tiết của chủng EHEC cụ thể typ O157 và O111

có liên quan đến các gen độc lực cần khảo sát trong bài

 Hệ thống tiết loại 1 (Type 1 secretion system)

Hệ thống tiết loại 1 (T1SS) phổ biến rộng rãi trong các vi khuẩn gram âm Một

ví dụ quan trọng là sự bài tiết độc tố tan máu HlyA từ các chủng gây bệnh đường tiết

niệu Sự bài tiết chỉ trong một bước duy nhất trực tiếp từ bào tương đến không gian ngoại bào Bộ máy vận chuyển bao gồm ba protein màng không thể thiếu: hai protein

ở màng trong lần lượt thuộc họ protein vận chuyển ABC (ATP-binding cassette transporter) và protein dung hợp màng (MFP); protein thứ ba ở màng ngoài giống như một kênh porin Sự kết hợp của ba protein được kích hoạt bằng cách tích tụ chất nền

vận chuyển (HlyA) trong bào tương, để tạo thành một kênh liên tục từ màng trong, bắc

cầu qua chu chất và cuối cùng là ra màng ngoài của vi khuẩn.[25]

 Hệ thống tiết loại 2 (Type 2 secretion system)

Hệ thống tiết loại 2 (T2SS) được sử dụng bởi Escherichia coli và các vi khuẩn

gram âm khác để vận chuyển nhiều protein, bao gồm cả độc tố và protease, từ chu chất qua màng ngoài của tế bào và vào không gian ngoại bào [26] T2SS cấu thành từ 4 phần: phức hợp màng ngoài, lông giả xuyên màng (a periplasmic pseudopilus), các protein màng trong và ATPase trong bào tương Bộ máy này hỗ trợ bài tiết nhiều yếu

tố độc lực, do đó sự bài tiết thông qua con đường này đối với nhiều vi sinh vật được coi là một cơ chế độc lực chính Trong chủng EHEC O157:H7, T2SS đã được chứng minh là thúc đẩy sự bám dính của vi khuẩn và xâm chiếm đường ruột, mặt khác đã có nghiên cứu chứng minh các thể đột biến không biểu hiện T2SS làm giảm khả năng xâm chiếm của vi khuẩn trên thỏ sơ sinh, thấp hơn 5 lần so với bình thường [27]

 Hệ thống tiết loại 3 (Type 3 secretion system)

T3SS là một hệ thống tiết protein phức tạp, hình thành từ hơn 20 thành phần

Hệ thống này được sử dụng như tập hợp các mũi kim chứa nhiều mầm bệnh của vi khuẩn gram âm, chúng tiêm các tác nhân protein vào tế bào chủ và tạo ra những thay đổi liên quan đến bệnh tật

Gen eae mã hóa một chất kết dính gọi là intimin chịu trách nhiệm cho sự gắn

kết mật thiết của vi khuẩn với tế bào biểu mô, cho phép vi khuẩn gắn chặt vào biểu

mô, hình thành các tổn thương đặc trưng: bám dính và phá hủy (AE – attaching and effacing) Các gen liên quan đến sự hình thành tổn thương AE được mã hóa trên một

đảo gây bệnh có tên là Locus of Enterocyte Effacement (LEE), vùng này chứa các gen

mã hóa hệ bài tiết loại III Nhờ vào những tổn thưởng đặc trưng của AE, cũng như những thay đổi ở tế bào chủ gây ra bởi các protein được tiêm vào qua T3SS, chúng

góp phần tạo thuận lợi cho độc tố Shiga (Stx) của E coli vượt qua hàng rào biểu mô,

tiếp cận mục tiêu nội bào đích và gây ra các phản ứng tiếp theo [28]

 Hệ thống tiết loại 5 (Type 5 secretion system)

Hệ thống tiết loại 5 (T5SS) là hệ thống tiết xuyên màng đơn, hay còn được biết đến là hệ thống tự vận chuyển (autotransporter system) T5SS với cơ chất và lỗ tiết trên màng hợp thành 1 polypeptide đơn Polypeptide này có thể đi qua hệ thống tiết của nó và ra màng ngoài, nên người ta gọi nó hệ thống tự vận chuyển, do đó, các thành viên của hệ thống này được gọi là các chất vận chuyển tự động (AT) T5SS tiết chủ yếu các yếu tố độc lực tham gia vào việc bám dính giữa các tế bào và hình thành màng sinh học (biofilm)

Intimin là một AT được mã hóa bởi gen eaeA, được tìm thấy trong các mầm

bệnh tiêu chảy khác nhau, bao gồm EHEC Chúng làm trung gian cho sự bám dính của

vi khuẩn vào biểu mô, gây ra sự hình thành các bệ actin và sự phá vỡ các vi nhung mao trên bề mặt ruột - những tổn thương AE đặc trưng [24]

1.1.2.2 Cơ chế gây bệnh của các gen khảo sát

Các yếu tố độc lực chủ yếu là các protein được mã hóa bởi các gen cụ thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc các yếu tố di truyền di động (gen nhảy hoặc plasmid) trong vi khuẩn gây bệnh Các gen liên quan đến khả năng gây bệnh có thể mã hóa các hoạt động như bám dính, xâm lấn, gắn kết, thu nhận sắt, vận động, hoạt động độc tố, có

thể chia thành bốn kiểu độc lực chính của E coli: sự xâm nhập, thích nghi, độc tố và

tác nhân gây bệnh (effectors)

 Độc tố Shiga

Độc tố shiga là độc tố A-B5 gồm: tiểu đơn vị A được phân cắt thành hai mảnh A1 và A2 liên kết với nhau bằng cầu nối disulfua; và B pentamer Hoạt tính enzym của độc tố nằm trong A1, bằng cách khử một liên kết disulfua, stx giải phóng mảnh A1 vào tế bào chất

Hình 1.4 Cấu trúc độc tố Stx [19]

Stx gây độc bằng cách làm chết enzyme vị trí 4324 của 28s rRNA của 60s ribosome, dẫn đến ức chế tổng hợp protein và chết tế bào Ngoài ra, để gây ra stress ribotoxic, A1 kích thích sản xuất cytokine và kích hoạt các con đường tế bào apoptosis Sau khi liên kết với thụ thể và hình thành phức hợp Gb3-Stx, các độc tố được gắn kết tạo thành một cụm, xâm lấn màng tế bào và hình thành hố nội tiết tại màng sinh chất của tế bào Những phần xâm lấn này tách khỏi màng sinh chất để tạo thành chất mang độc tố nội bào Việc vận chuyển được thực hiện bằng cách di chuyển

từ thể nội bào ban đầu sang thể Golgi và vào lưới nội chất Sau đó tiểu đơn vị A1 tách

ra khỏi phức hợp Gb3-Stx và gây độc tế bào A1 loại bỏ một adenine khỏi vòng sarcin trong tiểu đơn vị 28S của ribosome Ribosome bị thương không còn liên kết với yếu tố kéo dài 1 và quá trình tổng hợp protein bị dừng lại [19]

alpha- Yếu tố bám dính

Intimin là một protein màng ngoài được mã hóa bởi gen eaeA trong LEE, cần thiết cho sự kết dính chặt chẽ vi khuẩn E coli với các tế bào biểu mô vật chủ

Hình 1.5 Mô hình sự bám dính của Escherichia coli với bề mặt tế bào vật chủ [29]

Dấu hiệu đặc trưng của sự kết dính của E coli với các tế bào chủ là sự gắn kết

mật thiết dẫn đến sự hình thành các tổn thương 'gắn và xóa' (AE) Hoạt động liên kết tế bào của chúng được định vị ở đầu C 280 acid amin, chịu trách nhiệm liên kết thụ thể Tir tương ứng, hậu quả đầu tiên từ sự gắn kết này là việc đưa thụ thể intimin (Tir) và các tác nhân khác (effector) vào tế bào vật chủ thông qua T3SS Sau khi Tir được đưa vào trong màng, nó sẽ bám vào và đóng vai trò như thụ thể cho intimin [30]

 Yếu tố tán huyết Alpha-Hemolysin

Hemolysin (HlyA) là một cytolysin mạnh và phổ biến, thành viên điển hình của

họ độc tố lặp lại (RTX) HlyA có phổ hoạt động diệt tế bào rộng, tấn công hồng cầu, bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, tế bào nội mô và tế bào biểu mô thận của động vật máu nóng [31] bằng cách phá vỡ tính toàn vẹn của tế bào chủ thông qua các hoạt động hình thành lỗ và phân giải tế bào, loại độc tố này cho phép mầm bệnh can thiệp vào các quá trình bình thường của tế bào chủ, thúc đẩy cơ chế sinh bệnh Các tế bào chủ phản ứng với những sự tấn công này bằng cách điều chỉnh lại các hệ thống sửa chữa màng, tuy nhiên HlyA cũng có thể điều khiển chức năng của tế bào vật chủ bằng cách điều khiển các con đường truyền tín hiệu cụ thể và phân giải protein vật chủ Các dòng

Ca2+ và K+, được kích hoạt do quá trình thẩm thấu tế bào chủ bằng các chất độc hình

thành lỗ (pore-forming toxin), khi mất Kali, con đường MAPK được kích hoạt có thể dẫn đến nhiều phản ứng khác nhau, bao gồm cả quá trình chết theo chương trình [32]

1.1.3 Dịch tễ và tình hình nghiên cứu về gen mã hoá độc lực vi khuẩn

Escherichia coli

1.1.3.1 Trên thế giới

Vào năm 1884, bác sĩ nhi khoa – nhà sinh vật học người Đức – Theodor Escherich bắt đầu một nghiên cứu về vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh, cũng như vai trò của chúng trong đường tiêu hoá và khả năng gây bệnh Trong quá trình nghiên cứu này, ông đã phát hiện ra một loại vi khuẩn phát triển nhanh, ký sinh ở ruột già và đặt

tên nó là vi khuẩn coli, sau này được đổi tên thành Escherichia coli

Nhờ vào đặc tính dễ nuôi cấy, E coli được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu ở

nhiều lĩnh vực, thu được nhiều thành tựu nổi bật từ khắp mọi nơi trên thế giới Đặc

biệt trong lĩnh vực nghiên cứu về ADN, bộ gen của Escherichia coli cũng là bộ gen

đầu tiên được giải trình tự hoàn toàn vào năm 1997 [33]

Bên cạnh những giá trị to lớn trong nghiên cứu khoa học, E coli là nguyên

nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm, các bệnh tiêu chảy, viêm ruột với khả năng tiến triển nặng như nhiễm khuẩn huyết, và nguy cơ tử vong

Năm 1982, trong nhiều tháng, Mỹ đã ghi nhận số lượng lớn bất thường những bệnh nhân phải nhập viện với những biểu hiện chung ban đầu là đau bụng dữ dội, tiêu chảy và tiến triển thành tiêu chảy ra máu [34] Các cuộc điều tra được tiến hành, và người ta tìm ra mối liên quan đến thực phẩm, cụ thể là loại bánh mì kẹp thịt bò tại các chi nhánh của một chuỗi cửa hàng đồ ăn nhanh [6, 34] Bất chấp những nỗ lực quản lý

an toàn thực phẩm, Hoa Kỳ tiếp tục đợt bùng phát E coli O157 lớn nhất do bị ô nhiễm

nguồn nước vào năm 1999 [35]; cho tới năm 2002, ước tính có khoảng hơn 70.000 ca

nhiễm E coli O157, với hơn 2.000 ca nhập viện và khoảng 60 ca tử vong mỗi năm [6]

Đứng trước sự bùng phát lớn, từ năm 2000, nhiều tiểu bang tại Mỹ đã yêu cầu thực hiện báo cáo bắt buộc, các cuộc điều tra, nghiên cứu được thực hiện và phát hiện ra

nhiều con đường lây nhiễm khác nhau của E coli: không chỉ trong thực phẩm và nước, nguồn lây nhiễm của E coli có thể xảy ra giữa người với người, động vật với người,

, và ngay cả từ trong phòng thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn [6]

Tại Vương quốc Anh, E coli lần đầu tiên được phân lập ra vào năm 1983,

nhưng đến năm 1985 mới có đợt bùng phát cộng đồng đầu tiên Từ năm 1985 – 1996, liên tục có những đợt bùng phát được báo cáo ở xứ Wales và Scotland, với tính chất ngày càng nghiêm trọng khi số lượng ca nhiễm tăng, xuất hiện biến chứng nặng và có ghi nhận tử vong Đáng chú ý, hầu hết các ca nhiễm đều ở trẻ em và người trẻ tuổi Chi phí y tế và kiểm soát dịch bệnh ước tính trong năm đầu tiên lên tới 3,2 triệu bảng Anh

[36] E coli O157 cũng đã bùng phát tại Đức vào năm 2011, tổng cộng 3816 trường

hợp lây nhiễm được báo cáo, trong đó 54 trường hợp tử vong với nhiều ca xuất hiện hội chứng tán huyết – urê huyết xảy ra ở người lớn, đặc biệt ở phụ nữ [7]

Đề tài này tập trung vào chủng O157 và O111, nguyên nhân chính gây ra các đợt bùng phát kể trên, với các gen độc lực chính như:

- stx (Shiga toxins) mã hoá yếu tố sinh độc tố ruột,

- eae (Escherichia coli attaching and effacing) mã hoá yếu tố bám dính,

- hly (haemolysin) mã hoá yếu tố gây tan máu;

Các độc tố này gây tiêu chảy nghiêm trọng và có thể dẫn đến hội chứng tán huyết – ure huyết (HUS – Hemolytic Uremic Syndrome) và suy thận ở người bệnh [4] Việc phát hiện các gen này bằng kỹ thuật PCR đa mồi cũng đã được Adrienne và James Paton tiến hành từ năm 1998 [37], mang lại kết quả quan trọng về mặt vi sinh và lâm sàng

1.1.3.2 Tại Việt Nam

Lây nhiễm vi khuẩn Escherichia coli là một vấn đề đáng lo ngại của Việt Nam, nhiều nghiên cứu về sự nhiễm khuẩn E coli đã được thực hiện và công bố [38-40] Cũng như các nước khác trên thế giới, E coli thường được tìm thấy trong các mẫu

trứng sống, thịt lợn, thịt gà, thịt bò, ngoài ra, chúng còn có thể lây nhiễm từ người sang người, đặc biệt trên bàn tay người chế biến thức ăn đường phố Từ tháng 08/2013 đến tháng 06/2014, một nhóm tác giả đã lấy mẫu vi khuẩn trên tay người chế biến thực phẩm từ 98 cơ sở bán thực phẩm chế biến sẵn tại thành phố Pleiku – Gia Lai Kết quả

có 24,5% bàn tay người chế biến bị nhiễm vi khuẩn Escherichia coli, trong đó 6,1% là chủng E coli có gen mã hoá độc lực gây bệnh đường ruột đã được phân lập - một tỷ lệ

đáng báo động trong vệ sinh an toàn thực phẩm [41]

Năm 2018, Nguyễn Đắc Trung cùng cộng sự đã phát hiện gen độc lực của vi

khuẩn Escherichia coli gây tiêu chảy ở người, bằng kỹ thuật PCR đa mồi, với các gen quan tâm cũng là eae, stx và ngoài ra còn có ipaH một gen mã hoá cho các kháng

nguyên xâm nhập (thuộc chủng EIEC) [42] Gần đây, vào năm 2020, Nguyễn Khánh Thuận và Lý Thị Liên Khai thuộc Trường Đại học Cần Thơ cũng đã tiến hành phát

hiện gen độc lực của E coli O157:H7/H- trong các mẫu thịt bò [40]; với các gen khảo sát là stx1, stx2, eae và hlyA

Với cùng mục tiêu khảo sát được tỷ lệ nhiễm các gen mã hóa yếu tố độc lực của

vi khuẩn E coli (stx1, stx2, eaeA và hlyA), chúng tôi mở rộng thêm về việc khảo sát tỷ

lệ nhiễm E coli có kháng nguyên thuộc chủng O157 và O111 – hai chủng đã gây ra các cuộc bùng phát lớn với ghi nhận tử vong ở người; trên các mẫu thịt lợn, thịt bò và thịt gà được thu mua tại một số chợ và siêu thị tại Hà Nội được tăng sinh chọn lọc trên

cả hai môi trường Tryptone và Peptone Điều này không chỉ mang ý nghĩa về mặt vi sinh, lâm sàng, mà còn có ý nghĩa trong cảnh báo cũng như phòng tránh ngộ độc thực phẩm, bảo vệ sức khoẻ của người dân

1.2 Phương pháp phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn

Escherichia coli

Một số kỹ thuật phân tử có thể được áp dụng để phát hiện gen mã hóa yếu tố

độc lực của vi khuẩn Escherichia coli chủ yếu là phản ứng PCR đơn mồi hoặc đa mồi

như: PCR, multiplex Real-time PCR, PCR-ELISA, LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification), microarray ADN, giải trình tự gen

Phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất có thể kể đến PCR đa mồi [43-45] Kỹ thuật này dựa trên PCR cơ bản, nhưng được bổ sung thêm các cặp mồi để có thể khuếch đại nhiều trình tự ADN chỉ trong một phản ứng PCRrút ngắn thời gian mà không ảnh hưởng tới kết quả thí nghiệm

Kỹ thuật Real-time PCR cho kết quả nhanh hơn và thuận tiện hơn kỹ thuật PCR thường Kỹ thuật này đã được Claire Jenkins cùng cộng sự áp dụng để tiến hành thí

nghiệm phát hiện gen sinh độc tố verotoxin (gen vtx) [46]

PCR-ELISA là là một phương pháp miễn dịch có thể định lượng sản phẩm PCR trực tiếp và nhạy hơn nhiều so với phương pháp PCR thông thường, với thời gian phân

tích ngắn hơn và giới hạn phát hiện thấp hơn PCR-ELISA đã được Jafar Amani và các

cộng sự tiến hành thí nghiệm xác định gen stx1 và stx2 mã hoá cho khả năng sinh độc

tố Shiga của Escherichia coli [47]

Phương pháp Microarray ADN có khả năng phát hiện đồng thời một số lượng lớn các gen khác nhau trong một thời gian ngắn Nadia Jahandeh và cộng sự đã lựa chọn kỹ thuật này để thực hiện thí nghiệm phát hiện các gen mã hoá độc lực của vi

khuẩn UPEC (Uropathogenic Escherichia coli) gây nhiễm trùng đường tiết niệu [48]

Kỹ thuật giải trình tự gen được sử dụng để giải trình tự các gen kháng kháng sinh cũng như phân tích các plasmid mang gen kháng kháng sinh Đây là một phương pháp chính xác nhất để xác định các đặc tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Tuy nhiên,

kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị, nhân lực, thời gian và kinh phí cao, do đó không phù hợp với phòng xét nghiệm lâm sàng

1.2.1 Phương pháp PCR

PCR là một quy trình đơn giản và được sử dụng rộng rãi trong đó một lượng nhỏ DNA có thể được khuếch đại thành nhiều bản sao một cách nhanh chóng Kỹ thuật này được phát minh từ năm 1985, tuy nhiên cho đến nay, nó vẫn rất phổ biến trong nghiên cứu với tính ứng dụng cao Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN… Trong

Vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh trong các trường hợp tác nhân không thể hoặc rất khó để nuôi cấy thường quy

PCR cũng được ứng dụng rất rộng rãi trong y học: trong chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạch cầu trẻ em, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin, gen Rb-105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh…), nghiên cứu về hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)… và gần đây nhất, kỹ thuật Realtime PCR cũng được sử dụng để chẩn đoán và sàng lọc bệnh nhân mắc COVID-19

PCR còn được dùng để nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn Từ trước đến nay, tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh được xác định bằng các kỹ thuật dựa

trên nuôi cấy như kháng sinh đồ theo Kirby Bauer (khuếch tán trên thạch) và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimal Inhibitory Concentration) Các kỹ thuật này chiếm nhiều thời gian nên khó cho phép có định hướng điều trị kịp thời trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp Ngoài ra, các kỹ thuật nuôi cấy có hiệu quả phục vụ điều trị không cao đối với một số vi sinh vật, như Mycobacterium tuberculosis, có thời gian tăng trưởng rất dài (nhiều tuần lễ) Với kỹ thuật PCR, người ta có thể phát hiện nhanh tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh qua khảo sát gen kháng thuốc Ví dụ,

khảo sát gen pbp1a và 2a của Streptococcus pneumoniae bằng kỹ thuật PCR-SSCP, kỹ

thuật PCR phát hiện đột biến kháng Rifamicin ở gen rpoB, phát hiện kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat G) của vi khuẩn Lao

1.2.2 Phương pháp multiplex PCR

Trong các phòng thí nghiệm, việc sử dụng PCR bị giới hạn bởi chi phí và đôi khi không đủ lượng mẫu/thành phần phản ứng để tiến hảnh thí nghiệm Để khắc phục những thiếu sót này và cũng để khai thác hết khả năng khuếch đại của PCR, kỹ thuật multiplex PCR đã được xây dựng Phản ứng multiplex PCR có thể khuếch đại nhiều trình tự ADN đích trong cùng một phản ứng, bằng cách sử dụng nhiều hơn một cặp mồi (primer), và vẫn thu được kết quả chính xác, giúp tiết kiệm đáng kể thời gian và công sức trong phòng thí nghiệm, cũng như kinh phí

Kể từ khi được xây dựng, multiplex PCR đã được áp dụng thành công trong nhiều lĩnh vực chẩn đoán acid nucleic, bao gồm phân tích xóa gen, phân tích đột biến

và đa hình, phân tích định tính, định lượng và phát hiện RNA Trong lĩnh vực bệnh truyền nhiễm, kỹ thuật này đã được chứng minh là một phương pháp có giá trị để xác định virus, vi khuẩn, nấm và/hoặc ký sinh trùng Dựa trên hướng nghiên cứu phát hiện gen (định tính) với số lượng gen đích cần khảo sát tương đối nhiều (9 gen), chúng tôi

đánh giá PCR đa mồi (Multiplex PCR) là sự lựa chọn phù hợp nhất Tuy nhiên, trong

PCR đa mồi, các cặp mồi sử dụng phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và các cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau hay bắt cặp chéo lẫn nhau

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu và phương pháp thu thập

Đối tượng nghiên cứu: 316 mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua tại một số chợ, siêu thị tại Hà Nội

Phương pháp thu thập: Mẫu được thu mua tại các chợ vào lúc 7 giờ sáng Mỗi chợ thu mua trung bình 2 mẫu thịt lợn, 1 mẫu thịt bò và 1 mẫu thịt gà; mỗi mẫu thu mua khoảng 100g, bao gói trong các túi vô trùng, đánh dấu ký hiệu bên ngoài túi gồm ngày thu mua_tên chợ_loại thịt; bảo quản ở hộp đựng mẫu chuyên dụng (10C), đưa ngay về phòng thí nghiệm để phân tích

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 4/2022 đến tháng 3/2023

2.1.2 Thiết bị, hoá chất nghiên cứu

2.1.2.1 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy luân nhiệt PCR (model MasterCycler Eppendorf Đức

- Đầu côn các loại: được khử trùng và không có ADNase

- Túi dập mẫu vô trùng

- Các loại ống đong, cốc đong thủy tinh được rửa sạch và hấp sấy tiệt trùng

- Găng tay nitrile không bột, áo blouse, khẩu trang

- Giá, phiến 96 giếng để ống PCR

- Ống eppendorf 1,5 ml: được khử trùng và không có ADNase

- Ống PCR 0,2 ml Biotech

- Bình xịt cồn, giấy ăn sạch để lau khử trùng bề mặt

- Thùng rác đựng đầu côn và hoá chất

- Túi rác các loại

2.1.2.3 Hoá chất, sinh phẩm

 Kit tách chiết ADN AmpliSens® RIBO-prep, gồm

o Dung dịch điện ly giải (1) (Solution for Lysis)

o Dung dịch tủa (2) (Solution for precipitation)

o Dung dịch rửa 3 (Washing buffer 3)

o Dung dịch rửa 4 (Washing buffer 4)

 Nước khử ion đã hấp tiệt trùng (diH O)

 i-Taq® PCR Mix (M7123, Promega)

 TBE 0,5x

 Dung dịch nhuộm RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution (20.000x)

 Thang: CSL-MDNA-100BP DNA Ladder RTU

 Agarose gel

2.1.2.4 Môi trường nuôi cấy

- Eosin Methylene Blue Agar (Levine) Oxoid CM0069

2.2 Nội dung nghiên cứu

Xuất phát từ 2 mục tiêu chính, đề tài được triển khai với các nội dung như sau:

 Mục tiêu 1: Khảo sát các thông số của phản ứng m-PCR để phát hiện

các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli

Hình 2.1: Sơ đồ quá trình mục tiêu 1

 Mục tiêu 2: Phát hiện các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn

Escherichia coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ,

siêu thị tại Hà Nội

Từ tháng 4/2022 đến tháng 3/2023, chúng tôi đã tiến hành lấy ngẫu nhiên các mẫu thịt lợn, thịt gà, thịt bò thu mua tại một số chợ, siêu thị tại Hà Nội

Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ dưới đây:

Mục tiêu 1: Khảo sát các thông số

của phản ứng m-PCR để phát hiện

các gen mã hoá yếu tố độc lực của

vi khuẩn Escherichia coli

Khảo sát bằng phần mềm tin sinh học

Khảo sát nhiệt độ gắn mồi bằng phản

ứng PCR đơn mồi

Khảo sát nhiệt độ gắn mồi của phản

ứng PCR đa mồi

Hình 2.2: Sơ đồ quá trình tiến hành mục tiêu 2

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế cỡ mẫu

Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp dịch tễ học mô tả, cắt ngang Do

đó để ước tính cỡ mẫu nghiên cứu phù hợp dựa trên giả định trước đó về tỉ lệ đã biết trước, từ đó dẫn tới quyết định lựa chọn tham số thích hợp cho việc xác định tỷ lệ lưu hành dựa theo công thức sau:

= ( ∝ ) (1 − )Trong đó:

n là cỡ mẫu cần thu thập

P là tỷ lệ lưu hành kỳ vọng (được tham khảo từ các nghiên cứu trước đó)

d là độ chính xác liên quan tới cỡ mẫu thu thập

( ∝ )là giá trị tuân theo phân phối chuẩn = 1,96, với =0,05, khoảng tin cậy

(confidence interval) là 95%

Áp dụng công thức trên và các nghiên cứu trước đó, chúng tôi ước tính mẫu cho

việc phát hiện E coli trong mẫu thịt lợn, thịt bò và thịt gà là 302 [49] Trong thực tế

chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu thí điểm (pilot study) với khoảng 100 mẫu thịt (50

Mục tiêu 2: Phát hiện các gen mã

hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn

Escherichia coli trong các mẫu

thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu

mua ở một số chợ, siêu thị tại

Hà Nội

Thu thập các mẫu thịt tại một số chợ và

siêu thị tại Hà Nội

Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn Escherichia

coli trong các mẫu thịt.

Tách chiết ADN E coli từ dung dịch tăng

thịt lợn, 15 thịt bò, 25 thịt gà) để xác định sơ bộ tỷ lệ nhiễm của vi khuẩn này, khảo sát lại quá trình trình xét nghiệm, tìm được các mẫu dương tính để làm đối chứng cho các xét nghiệm sinh học phân tử Sau khi xác định sơ bộ tỷ lệ nhiễm và các thông số ổn định cho thí nghiệm, chúng tôi thực hiện nghiên cứu với tổng số mẫu thịt là 316 mẫu bao gồm 80 mẫu thịt bò, 155 mẫu thịt lợn, và 81 mẫu thịt gà

2.3.2 Phương pháp khảo sát một số thông số phản ứng multiplex PCR khuếch

đại đồng thời các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn Escherichia coli

Dựa trên các trình tự mồi được mô tả trong các nghiên cứu trước cho việc phát

hiện gen mã hóa độc lực vi khuẩn Escherichia coli [37, 50], chúng tôi tham khảo thêm

các tài liệu khác tiến hành tương tự hoặc có khác các thông số được sử dụng trong nghiên cứu Tuy nhiên, do nguồn hoá chất và sinh phẩm khác nhau, việc tiến hành khảo sát lại thành phần tham gia phản ứng, lựa chọn lại nồng độ, thể tích từng thành phần và nhiệt độ của từng set phản ứng là cần thiết để đảm bảo quá trình thí nghiệm diễn ra thuận lợi và kết quả số liệu thu được tốt nhất

2.3.2.1 Phương pháp lựa chọn cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Ngoài cặp mồi được mô tả trong nghiên cứu của Paton [37] và Bingen [50], chúng tôi tiến hành tham khảo và lựa chọn thêm một số cặp mồi từ những nghiên cứu khác [43, 51] để khảo sát trên các phần mềm tin sinh học Công cụ Primer-BLAST cho phép kiểm tra tính đặc hiệu của các đoạn mồi đã có từ trước bằng cách kết hợp các thuật toán để sắp xếp, so sánh và căn chỉnh cục bộ hoặc toàn bộ chuỗi Ngoài ra, khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc (hairpin), khả năng tự liên kết hoặc liên kết chéo giữa cặp mồi hay nhiệt độ nóng chảy cũng được kiểm tra bằng phần mềm OligoAnalyzer Chúng tôi đánh giá dựa trên khuyến nghị lựa chọn mồi của phần mềm tin sinh học được sử dụng (Integrated DNA Technologies – OligoAnalyzer), bao gồm:

 Sự khác biệt giữa nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi phải nhỏ hơn 5°C Tm là điểm nhiệt mà 50% sợi đôi ADN phân tách và tạo sợi đơn, dựa vào Tm người ta

sẽ xác định nhiệt độ gắn mồi (Ta) phù hợp Nếu Tm của hai cặp mồi chênh lệch nhau quá cao có thể dẫn đến việc gắn mồi không chính xác

 Hàm lượng GC phải nằm trong khoảng 35−80% Mật độ GC ảnh hưởng đến

Tm của mồi, ngoài ra, mật độ GC càng nhiều ở đầu 3’, lực liên kết càng lớn, tạo

điều kiện cho việc bắt cặp mồi Tuy nhiên cặp mồi cũng cần có mặt độ GC vừa phải để tránh bắt cặp không đặc hiệu do lực liên kết quá lớn

 Khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc (hairpin), khả năng tự bắt cặp (self-dimer) và bắt cặp chéo (hetero-dimer) phải có giá trị delta G lớn hơn −9,0 kcal/mol Ở đây, giá trị delta G thể hiện năng lượng tự do, năng lượng này càng nhỏ thì càng dễ xảy ra phản ứng tạo cấu trúc dimer

Bảng 2.1: Bộ đa mồi thứ nhất: để phân nhóm A, B1, B2 và D (trong đó nhóm B2

và D gây bệnh)

Cặp mồi Trình tự cặp mồi (5’ – 3’)

Kích thước (bp)

Nguồn tham khảo

E_coli_ChuA

F GACGAACCAACGGTCAGGAT

E_coli_YjaA

F TGAAGTGTCAGGAGACGCTG

E_coli_TspE4C2

F GAGTAATGTCGGGGCATTCA

152 [50]

Tm = 0,1C < 5C Mồi xuôi và mồi ngược có giá trị delta G trong khả năng tạo cấu trúc hairpin, self-dimer, hetero-dimer lớn hơn −9,0 kcal/mol

Bảng 2.2: Bộ đa mồi thứ hai: để phát hiện gen mã hóa yếu tố độc lực

Cặp mồi Trình tự cặp mồi (5’ – 3’)

Kích thước (bp)

Nguồn tham khảo

Nguồn tham khảo

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm NCBI – BLAST:

VD: Kiểm tra độ đặc hiệuu của cặp mồi O157

Hình 2.3: Kết quả khảo sát cặp mồi O157 trên chủng Escherichia coli bằng phần

mềm NCBI – BLAST

- Identities: 20/20 (100%) và 21/21 (100%) nghĩa là mồi xuôi dài 20 nucleotide, mồi ngược dài 21 nucleotide; cặp mồi khớp hoàn toàn với trình tự mẫu trong GenBanktrình tự mồi sẽ bám được trên trình tự ADN mạch đôi này trong phản ứng PCR

- Gaps: 0/20 (0%) và 0/21 (100%) nghĩa là khi bám vào DNA mẫu này, mồi xuôi và mồi ngược sẽ duỗi thẳng hoàn toàn, không nhấp nhô do các điểm không bắt cặp bên trong lòng mồi

Các thông số điều kiện cho phản ứng PCR trong khảo sát In-Silico được để mặc

định theo phần mềm, tuy nhiên điều kiện thực tế của thí nghiệm như: nồng độ thành phần trong Master Mix, hóa chất, máy luân nhiệt PCR, mà kết quả có thể có sự chênh lệch với kết quả của phần mềm tin sinh học đưa ra Do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành khảo sát phản ứng PCR đơn mồi với dải nhiệt độ bắt cặp mồi từ 53C đến

2.3.2.2 Phương pháp lựa chọn nhiệt độ bắt cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

Khảo sát lại nhiệt độ gắn mồi bằng cách chạy gradient nhiệt độ từ 53 - 57C cho phản ứng PCR đơn mồi Thời gian gắn mồi áp dụng 30 giây, số chu kỳ phản ứng áp dụng 40 Lựa chọn nhiệt độ cho băng diện di sáng rõ và không có sản phẩm phụ dựa trên kết quả PCR đơn mồi, sau đó chạy thử phản ứng PCR đa mồi trên mẫu chứng dương Nhiệt độ lựa chọn đạt yêu cầu khi ảnh điện di cho ra đúng kết quả đã biết của mẫu, các vạch rõ và không có sản phẩm phụ gây nhiễu

2.3.3 Phương pháp tăng sinh vi khuẩn Escherichia coli trên mẫu thịt

2.3.3.1 Lựa chọn môi trường tăng sinh vi khuẩn

Nhóm 1: Tryptone là sản phẩm từ quá trình tiêu hóa casein của sữa bởi enzyme được tiết từ tuyến tụy gọi là trypsine; một hỗn hợp dung dịch gồm các peptide và

lactose Ngoài các đặc tính dinh dưỡng của nó, tryptone còn giúp vi khuẩn E coli

chống lại stress oxy hóa (tác nhân gây ảnh hưởng đến quá trình tăng sinh của vi khuẩn)[52]; bởi vậy tryptone là một môi trường nuôi cấy vi khuẩn phù hợp đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu

Nhóm 2: Khác với các chủng E coli khác, chủng STEC O157 hay EIEC lên

men chậm hoặc không lên men lactose [16]; bởi vậy, môi trường peptone được lựa chọn để tăng tính nhạy cảm và tăng sinh chọn lọc cho các chủng vi khuẩn này Peptone

là một hỗn hợp hòa tan trong nước của polypeptide và acid amin được hình thành bởi quá trình thủy phân một phần acid hoặc enzyme của protein Các protein này có thể được thu từ máu gia súc [53] bởi vậy, peptone có thể coi là môi trường máu phù hợp, được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu về tán huyết [54-56]

2.3.3.2 Lựa chọn nhiệt độ ủ tăng sinh vi khuẩn

Phần lớn các chủng E coli gây bệnh qua đường phân-miệng, chúng được gọi là

E coli phân (fecal E coli) – có điều kiện nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn khác biệt đáng

kể so với E coli không gây bệnh Khác với các chủng E coli thông thường có nhiệt độ

phát triển ở khoảng 10 – 40C [57], các chủng gây bệnh thường vẫn cho thấy sự tăng trưởng chậm ở 44 – 45,5°C, những nghiên cứu theo hướng này đã được thực hiện bởi Eijkman ngay từ năm 1904, người đã tận dụng khả năng tồn tại của coliform phân ở

46°C nghĩ ra các xét nghiệm nhiệt độ cao như một phương pháp để phân biệt giữa E coli phân và các chủng không phải từ phân Dựa trên hướng nghiên cứu đó, năm 1969, Netty và cộng sự đã tiến hành phân biệt E coli phân và các chủng không phải từ phân

[58] Kết quả so sánh cho thấy ở nhiệt độ 37C, cả hai chủng đều phát triển bình thường và có ghi nhận được phát hiện, tuy nhiên ở 44,5C chỉ ghi nhận phát hiện được

chủng E coli phân, không có dấu hiệu của chủng không phải từ phân

2.3.3.3 Tiến hành tăng sinh vi khuẩn E coli trong các mẫu thịt

Tham khảo từ các nghiên cứu trước và dựa trên quy trình BAM của Mỹ [59],

chúng tôi tiến hành tăng sinh chọn lọc vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh – hay E

coli phân

Cân hai lần 25 g thịt xay cho vào hai túi đồng nhất mẫu chứa 225 ml dung dịch BHI, tách vi khuẩn khỏi bề mặt thì bằng máy đồng nhất mẫu với tốc độ 100 lần/phút trong 30 giây ở nhiệt độ phòng, ủ dung dịch chứa mẫu thịt ở 35C trong 3 giờ để phục

hồi vi khuẩn, sau đó mỗi túi đồng nhất mẫu này được dùng để phân lập các chủng E coli khác nhau Nhóm 1, túi đồng nhất mẫu được thêm vào 225 ml dung dịch môi

trường Tryptone Phosphate 2x, ủ ở 44,5 – 45C trong 20 giờ Nhóm 2, túi đồng nhất mẫu được thêm vào 225 ml dung dịch BPW 2x và ủ ở 44,5 – 45C trong 20 giờ Sau

20 giờ, thu 1 ml mẫu từ mỗi nhóm chuyển vào 0,330 ml Glycerol 85% vô trùng để lưu giữ chủng

2.3.4 Quy trình tách chiết ADN từ dung dịch tăng sinh chọn lọc cho các vi khuẩn

Quy trình này được thực hiện tuân theo hướng dẫn của hãng sản xuất kit AmpliSense Chia 130 µl dung dịch đệm li giải (lysis buffer) (1) vào mỗi ống eppendorf 1,5 ml, sau đó thêm 50 µl dung dịch tăng sinh chọn lọc vi khuẩn vào mỗi ống, đảo trộn hỗn hợp trong 10 giây và ly tâm nhẹ để loại bỏ dịch trên nắp ống; hỗn hợp này được ủ ở 65C trong 5 phút, sau đó bổ sung 100 µl dung dịch tủa (2) vào mỗi ống, ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó loại bỏ dịch nổi; cặn còn lại trong mỗi ống được bổ sung 160 µl dung dịch rửa 3 (Washing buffer 3), sau đó đảo trộn hỗn hợp từ 5 đến 7 lần và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 2 phút; sau khi ly tâm, loại bỏ dịch nổi và rửa cặn với 65 µl dung dịch rửa 4 (Washing buffer 4), đảo trộn hỗn hợp từ 5 đến 7 lần và ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong

2 phút; Sau khi rửa cặn, dịch nổi được loại bỏ và tủa được làm khô ở 65C trong 5 phút; sau đó, thêm 50 µl nước khử ion, đảo trộn hỗn hợp nhẹ nhàng và ủ ống eppendorf 1,5 ml ở 65C trong 5 phút để hòa tan tủa; sau 5 phút, ly tâm ống eppendorf 1,5 ml với tốc độ 13000 vòng/phút trong 1 phút và chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 1,5 ml mới Sau đó, dung dịch tách chiết ADN này được bảo quản ở -20C

để sử dụng cho các phản ứng PCR phát hiện gen mã hóa yếu tố độc lực

2.3.5 Phương pháp tiến hành phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn

Sau khi tham khảo các tài liệu nghiên cứu trước đó cùng với kiểm tra lại bằng

phần mềm In-Silico, chúng tôi lựa chọn được các cặp mồi phù hợp (bảng 2.1 – 2.3) để

tiến hành khảo sát nhiệt độ gắn mồi Mẫu được tiến hành khảo sát là 9 mẫu được sử dụng tại nghiên cứu pilot và có ghi nhận phát hiện gen đích cần khảo sát Các mẫu sẽ được tiến hành phản ứng 4 lần, kết quả thu được phải tương đồng nhau về vị trí băng sản phẩm chính để đảm bảo độ tin cậy cho mẫu chứng dương

Một phản ứng PCR bao gồm: 2,5l mastermix i-Taq, 2l thể tích ADN khuôn (lấy từ dung dịch tách chiết ADN của vi khuẩn), 0,2l cho mỗi đoạn mồi (xuôi/ngược)

và nước khử ion đã hấp tiệt trùng vừa đủ 6,5l Phản ứng được tiến hành bằng máy luân nhiệt PCR MasterCycler X50S với số chu kỳ là 40 vòng Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% có chứa RedSafe

2.3.5.1 Tiến hành khảo sát nhiệt độ gắn mồi bằng phương pháp PCR đơn mồi

Chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ gắn mồi của từng gen bằng phương pháp PCR đơn mồi, với dải nhiệt độ X: 53 – 57C từ đó lựa chọn được nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho từng set phản ứng (bảng 2.1 – 2.3) Yêu cầu sản phẩm thu được rõ nét, đúng

vị trí gen cần khảo sát, cặp mồi không tự bắt cặp với nhau tạo sản phẩm phụ