Đỗ hải an phát hiện các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn campylobacter jejuni và campylobacter coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua ở một số chợ, siêu thị tại hà nội luận văn thạc sĩ dược học

TỔNG QUAN

Đại cương về đặc điểm vi khuẩn học của vi khuẩn Campylobacter spp

Campylobacter spp thuộc họ Campylobacteriaceae, gồm ít nhất 20 loài và 6 phân loài đã được xác định Các loài này là nguyên nhân chính gây hơn 400-500 triệu ca nhiễm trùng hàng năm, đặc biệt là các bệnh nhiễm trùng đường tiêu hóa ở người như C jejuni, C coli, C fetus, C ureolyticus, C insulaenigrae, và nhiều loài khác Trong đó, C jejuni là tác nhân phổ biến nhất gây bệnh tiêu chảy do vi khuẩn Campylobacter spp., chiếm đến khoảng 10% tổng các trường hợp tiêu chảy, ngang bằng tỷ lệ gây bệnh của Salmonella và Shigella Ngoài ra, C coli là nguyên nhân đứng thứ hai gây nhiễm trùng đường ruột ở người Tại Việt Nam, các nghiên cứu ghi nhận rằng C jejuni đóng vai trò quan trọng trong các ca tiêu chảy, góp phần đáng kể vào gánh nặng bệnh tật của cộng đồng.

Campylobacter spp là trực khuẩn Gram âm, mảnh, hình cong (dấu phẩy, chữ S hoặc cánh chim), di động nhờ có 1 lông ở 1 đầu, không sinh nha bào [1]

Hình 1.1 Hình dạng vi khuẩn Campylobacter spp [13]

Campylobacter spp thường được nuôi cấy trên môi trường vi hiếu khí (5% O2, 10% CO2 và 85% N2) Nhiệt độ phát triển tối ưu rất thay đổi, nhưng các loài đều

4 phát triển được ở 37 o C C jejuni thích hợp với nhiệt độ 42 o C, không phát triển ở nhiệt độ dưới 25 o C [14]

Các môi trường chọn lọc phổ biến như canh thang Bolton và thạch máu tryptose được bổ sung kháng sinh Amphotericin B 5mg, Cefoperazone 10mg, Trimethoprim 10mg, và Vancomycin 10mg để phân lập vi khuẩn hiệu quả Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu thường có màu trắng hoặc xám, bóng, ướt và không tan máu, giúp nhận diện đặc trưng của vi khuẩn Thời gian mọc thành khuẩn lạc thường từ 24 đến 48 giờ, phù hợp để xác định và phân loại vi khuẩn trong quy trình bác sĩ xét nghiệm.

* Tiêu chuẩn vi sinh về vi khuẩn Campylobacter spp trong thực phẩm

Vi khuẩn Campylobacter spp cần điều kiện nhiệt độ và độ ẩm phù hợp để sinh trưởng, do đó chúng không thể phát triển hoặc sống sót trong thức ăn Mặc dù vậy, lượng nhiễm trùng của chúng thường thấp, chỉ khoảng 500-10.000 đơn vị tế bào, nhưng lại có khả năng lây bệnh cao, nghĩa là chỉ cần một lượng tế bào nhỏ cũng đủ gây bệnh cho con người [15].

Tại Việt Nam, Bộ Y tế quy định giới hạn ô nhiễm vi sinh vật trong thịt và sản phẩm chế biến từ thịt theo QCVN 8-3:2012/BYT, với tổng số vi sinh vật hiếu khí trong khoảng 5x10^5 – 5x10^6 CFU/g Tuy nhiên, hiện chưa có văn bản nào quy định rõ tiêu chuẩn về Campylobacter spp trong các sản phẩm thịt lợn, thịt bò, thịt gà Do đó, việc đặt tiêu chuẩn phát hiện Campylobacter spp trong an toàn thực phẩm là cần thiết để đảm bảo vệ sinh và sức khỏe cộng đồng.

Dịch tễ học của Campylobacter spp

Trên toàn cầu, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính có từ 44 đến 93 trường hợp nhiễm Campylobacter spp trên 10.000 dân mỗi năm, cho thấy mức độ phổ biến rất cao Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Campylobacter spp đã tăng đều đặn tại cả các quốc gia phát triển và đang phát triển kể từ năm 2007, với sự gia tăng đáng kể ở Bắc Mỹ (tăng 14%), Châu Âu (tăng 13%) và Úc (tăng 6%) Điều này cho thấy xu hướng gia tăng nhiễm trùng do Campylobacter spp trên toàn cầu, đặt ra các vấn đề về an toàn thực phẩm và sức khỏe cộng đồng.

Trong năm 2009, Anh và xứ Wales đã ghi nhận 143 vụ dịch bệnh, trong đó có 114 trường hợp liên quan đến ô nhiễm thực phẩm hoặc nước uống, cho thấy tầm quan trọng của vệ sinh an toàn thực phẩm để ngăn chặn các dịch bệnh lây truyền qua thực phẩm và nước Ngoài ra, còn có 2 trường hợp xảy ra do tiếp xúc trực tiếp với động vật, nhấn mạnh nguy cơ lây bệnh từ động vật sang người khi tiếp xúc không an toàn Việc kiểm soát vệ sinh môi trường và thực phẩm là yếu tố then chốt để giảm thiểu số vụ dịch trong cộng đồng.

Trong năm 2019, Cơ quan An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) ghi nhận khoảng 64 ca mắc bệnh liên quan đến phương thức lây truyền không xác định trên mỗi 100.000 dân ở Châu Âu, phản ánh mức độ phổ biến của vấn đề này tại khu vực Tại Hoa Kỳ, giai đoạn từ 1996 đến 2012 ghi nhận tỷ lệ mắc bệnh khoảng 14,3 ca trên 100.000 dân mỗi năm, cho thấy sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các khu vực Tuy nhiên, dữ liệu dịch tễ học về Campylobacter spp tại châu Á còn hạn chế, mặc dù các số liệu này cũng cho thấy mức độ lưu hành đáng kể của vi khuẩn trong cộng đồng.

Vi khuẩn Campylobacter spp là tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa phổ biến, đặc biệt ở trẻ nhỏ Một nghiên cứu tại ba bệnh viện ở Dương Châu, Trung Quốc, từ tháng 7/2005 đến tháng 12/2006, cho thấy 4,84% trong số 3.061 bệnh nhân tiêu chảy có kết quả PCR dương tính với C jejuni, với tỷ lệ mắc cao nhất ở trẻ dưới 7 tuổi Nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò của Campylobacter trong các bệnh đường ruột ở khu vực này.

Trong giai đoạn 2005 đến 2009, có 14,9% bệnh nhân viêm dạ dày ruột được xác định dương tính với vi khuẩn Campylobacter, trong đó gồm 127 ca nhiễm C jejuni và 15 ca nhiễm C coli [18] Tại Vellore, Nam Ấn Độ, từ tháng 1/2003 đến tháng 5/2006, tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi bị tiêu chảy dương tính với vi khuẩn này là 4,5% trong tổng số 349 trẻ, cho thấy mức độ phổ biến của Campylobacter trong các bệnh lý tiêu hóa trẻ em ở khu vực này.

Nghiên cứu dịch tễ về vi khuẩn Campylobacter spp tại Việt Nam cho thấy tỷ lệ nhiễm cao trong các trang trại chăn nuôi lợn và gia cầm, như ở Đồng bằng sông Cửu Long, ghi nhận tỷ lệ nhiễm là 31,9% ở gà, 23,9% ở vịt, và 53,7% ở lợn Ngoài ra, tại thành phố Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắk Lắk, trong 248 mẫu thịt (lợn, gà, bò) thu thập từ các chợ địa phương, tỷ lệ nhiễm cũng đáng báo động, cho thấy việc kiểm soát vi khuẩn này cần được khẩn trương thực hiện để đảm bảo an toàn thực phẩm.

Campylobacter spp tồn tại cao nhất trên thịt gà, với tỷ lệ nhiễm 8,96%, trong khi trên thịt lợn và thịt bò, tỷ lệ nhiễm thấp hơn lần lượt là 5,00% và 5,56% [20] Nghiên cứu tại Hà Nội và Hải Phòng cho thấy, trong 400 mẫu thịt gà thu thập tại các chợ bán lẻ, tỷ lệ nhiễm Campylobacter spp là 22% tại Hải Phòng và cũng đáng lưu ý tại Hà Nội.

29% Trong đó, chủng C jejuni chiếm 31/44 (70,45%), tiếp theo là chủng C coli chiếm 9/44 (20,45%) và một số chủng Campylobacter spp khác là 4/44 (9,1%)

Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Campylobacter spp trên các mẫu thịt sống khá cao, tiềm ẩn nguy cơ gây bệnh tiêu hóa ở người Nghiên cứu tại Thái Bình cũng chỉ ra rằng Campylobacter spp là nguyên nhân chính gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi, chiếm tỷ lệ 9,8%, cao hơn Salmonella spp (1,2%) và Shigella spp (2,9%).

Khả năng gây bệnh của Campylobacter spp

Nhiễm khuẩn Campylobacter spp qua đường thực phẩm là một vấn đề rất được quan tâm, vi khuẩn này gây ra khoảng 8,4% các trường hợp tiêu chảy toàn cầu

[2] Campylobacteriosis là tên gọi chung của các bệnh nhiễm trùng do các loài Campylobacter spp gây bệnh gây ra và được đặc trưng bởi sốt, nôn mửa, tiêu

Nhiễm Campylobacter spp thường biểu hiện qua triệu chứng chảy nước hoặc máu, đặc biệt phổ biến ở trẻ em dưới 4 tuổi và người lớn trên 75 tuổi Hầu hết các đợt bùng phát nhiễm khuẩn này xuất phát từ việc tiêu thụ thịt gia cầm và các sản phẩm từ gia cầm Campylobacter gây ra khoảng 60-80% các trường hợp nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên toàn cầu, làm nổi bật tầm quan trọng của việc đảm bảo an toàn thực phẩm.

Các loại thịt gia cầm như thịt gà, gà tây, đà điểu và vịt là những nguồn phổ biến chứa vi khuẩn Campylobacter spp., gây nguy hiểm cho sức khỏe Ngoài thịt gia cầm, các loại thịt khác như thịt lợn, bò, cùng các sản phẩm từ sữa, đồ uống bị ô nhiễm, trái cây chưa rửa và tiếp xúc với vật nuôi bị nhiễm bệnh cũng có nguy cơ mang vi khuẩn này Vi khuẩn Campylobacter có khả năng tồn tại trong nhiều môi trường nông nghiệp khác nhau, từ không khí, bụi, đất cho đến các bề mặt phi sinh học, khiến việc kiểm soát nguồn lây nhiễm trở nên phức tạp.

Campylobacter spp là tác nhân phổ biến gây viêm ruột cấp tính ở người, lây qua đường tiêu hóa qua thực phẩm và nước uống bị ô nhiễm phân động vật như gia súc và gia cầm Thời gian ủ bệnh từ 2-10 ngày, kèm theo các triệu chứng như đau bụng, tiêu chảy dữ dội, phân nước có thể có máu và mủ; một số trường hợp còn xảy ra nhiễm trùng huyết Tiêu chảy do Campylobacter spp kéo dài 5-10 ngày, đa số không cần dùng kháng sinh để điều trị Trong trẻ nhỏ, tiêu chảy do vi khuẩn này chủ yếu là do C jejuni gây ra, đặc biệt là ở độ tuổi 12-24 tháng sau sinh Ở các nước đang phát triển, tỷ lệ tiêu chảy do Campylobacter spp chiếm từ 5-45%, trong khi ở các nước phát triển, tỷ lệ này thấp hơn như Mỹ chỉ khoảng 4,6% Tại Hà Nội, theo Bộ môn Vi sinh Trường Đại học Y Hà Nội, tỷ lệ trẻ em mắc tiêu chảy do C jejuni dao động từ 6-10%, cao hơn nhiều so với tỷ lệ mắc do Shigella spp và Salmonella spp (1-2%) Cơ chế gây bệnh gây tiêu chảy của Campylobacter hiện còn chưa hoàn toàn rõ ràng, nhưng giả thiết dựa trên tính chất phân tiêu chảy, có thể do hai yếu tố chính: một là độc tố ruột giống vi khuẩn Vibrio cholerae, gây ra phân hoàn toàn nước; hai là yếu tố xâm nhập như ở Shigella, gây ra phân có máu Sau tiêu chảy cấp, bệnh nhân nhiễm Campylobacter spp có thể phát triển các di chứng như viêm khớp phản ứng, hội chứng ruột kích thích và các bệnh lý thần kinh tự miễn nghiêm trọng như hội chứng Guillain-Barré.

Cơ chế độc lực của vi khuẩn

1.4.1 Yếu tố độc lực của vi khuẩn Độc lực (virulence) là mức độ của khả năng gây bệnh của vi sinh vật Vi khuẩn gây bệnh sử dụng nhiều phương pháp hay cơ chế khác nhau để xâm nhập vào tế bào vật chủ, phá hủy các mô và trốn thoát hệ thống miễn dịch của vật chủ Một trong những yếu tố quan trọng liên quan đến cơ chế này của vi khuẩn là sự tiết protein qua màng phospholipid Các protein được tiết ra đóng vai trò quan trọng liên quan đến độc lực của vi khuẩn, từ việc tăng cường khả năng bám dính với các tế bào nhân thực, tạo ổ sinh thái trong môi trường, đến việc gây độc trực tiếp cho các tế bào vật chủ và phá vỡ chức năng của chúng Nhiều tác nhân gây bệnh sử dụng các hệ thống tiết protein để tiết ra các yếu tố độc lực từ tế bào chất của vi khuẩn vào tế bào vật chủ hoặc ra ngoài môi trường Nói chung, các hệ thống tiết protein của vi khuẩn có thể được chia thành các nhóm khác nhau, dựa trên cấu trúc, chức năng và tính đặc hiệu của chúng Một số hệ thống được bảo tồn trong tất cả các loại vi khuẩn và tiết ra nhiều protein khác nhau, trong khi có những hệ thống chỉ được tìm thấy ở một số ít loài vi khuẩn và/hoặc chỉ đặc trưng cho một hoặc một số protein đặc hiệu Ở các vi khuẩn Gram âm, các cơ chế này có thể chia thành 2 nhóm, 1 là xuyên qua cả 2 lớp màng bên trong (inner membrane - IM) và màng ngoài (outer membrane - OM), nhóm còn lại chỉ xuyên qua màng ngoài của tế bào Cho tới nay, có 5 hệ thống tiết xuyên màng kép được ghi nhận là các hệ thống tiết T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T6SS, bên cạnh đó hệ thống tiết T5SS chỉ xuyên qua màng ngoài [23] Dưới đây là một vài mô tả sơ lược về các hệ thống tiết:

Hệ thống tiết loại I (T1SS) đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường độc lực của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như Serratia marcescens, tiết ra hemophore HasA thông qua con đường T1SS, hoặc protein hemolysin HlyA của E coli gây bệnh đường tiết niệu Hệ thống này giúp các vi khuẩn sản xuất các chất độc độc quyền, tăng khả năng xâm lấn và gây tổn thương cho kí chủ Từ đó, T1SS trở thành mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu phát triển các phương pháp điều trị chống lại các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra.

Hệ thống tiết loại II (T2SS) có khả năng đặc hiệu rộng và tiết ra nhiều loại protein khác nhau, góp phần vào độc lực của vi khuẩn Một số vi khuẩn sử dụng T2SS để tiết ra các yếu tố độc lực như độc tố dịch tả của Vibrio cholerae gây tiêu chảy hoặc ngoại độc tố A của Pseudomonas aeruginosa ngăn chặn tổng hợp protein trong tế bào chủ, dẫn đến nhiễm trùng nguy hiểm Trong khi đó, một số loài vi khuẩn chỉ dùng T2SS để vận chuyển một loại protein duy nhất hoặc các enzyme giúp thích nghi với môi trường.

8 như: Legionella pneumophila, E coli sinh độc tố ruột và xuất huyết ruột (ETEC và EHEC), Klebsiella pneumoniae, Aeromonas hydrophila,…[25]

Hệ thống tiết loại III (T3SS) là cơ chế vi bộ phận phức tạp được tạo thành từ các màng kép, đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của nhiều loại vi khuẩn Gram âm gây bệnh T3SS giúp vi khuẩn tiêm trực tiếp các protein độc hại vào tế bào chủ, góp phần tăng khả năng gây bệnh và thích nghi với môi trường Hệ thống này được phát hiện tồn tại ở nhiều loài vi khuẩn gây bệnh phổ biến, như Salmonella, Shigella và Escherichia coli Sự hiểu biết về T3SS giúp phát triển các phương pháp điều trị mới nhằm kiểm soát các bệnh do vi khuẩn gây ra.

Các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như Salmonella, Shigella, Yersinia, Pseudomonas, Burkholderia và E coli sử dụng cơ chế vận chuyển protein để đưa các protein tác động (effector proteins) vào trong tế bào chất của tế bào chủ Các protein này sẽ kích hoạt hoặc đảo ngược các chức năng đặc biệt của tế bào, từ đó thúc đẩy quá trình xâm nhập và cư trú của vi khuẩn bên trong tế bào vật chủ.

Hệ thống tiết loại IV (T4SS) là một tập hợp các hệ thống tiết đa dạng tồn tại ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương T4SS đóng vai trò quan trọng trong khả năng độc lực của nhiều loại mầm bệnh như Helicobacter pylori, Bordetella pertussis và Legionella pneumophila, bằng cách trực tiếp tiết ra các protein độc, tác nhân hoặc phức hợp ADN-protein giúp vi khuẩn ký sinh nội bào T4SS hoạt động như một phương pháp vận chuyển protein hoặc phức hợp ADN-protein phụ thuộc vào tiếp xúc qua màng tế bào vi khuẩn, tương tự như hệ thống T3SS, sử dụng thiết bị giống như kim để vận chuyển trực tiếp các phân tử tác động từ vi khuẩn gây bệnh vào tế bào chủ của sinh vật nhân chuẩn.

Hệ thống tiết loại V (T5SS) là hệ thống tiết xuyên màng đơn, còn gọi là hệ thống tự vận chuyển (autotransporter system), gồm một polypeptide chứa cả cơ chất và lỗ tiết trên màng hợp thành Polypeptide này có khả năng đi qua hệ thống tiết và ra ngoài màng, do đó được gọi là hệ thống tự vận chuyển Các yếu tố độc lực của T5SS chủ yếu tham gia vào quá trình bám dính tế bào và hình thành màng sinh học (biofilm) Các protein độc lực như immunoglobulin A protease của Neisseria gonorrhoeae, giúp tách kháng thể của chủ thể, và protein IcsA của Shigella flexneri, thúc đẩy vận động nội bào dựa trên actin, đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học.

Hệ thống tiết loại VI (T6SS) là bộ máy nằm trên vỏ tế bào vi khuẩn, có khả năng vận chuyển protein hiệu ứng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác dựa trên cơ chế tiếp xúc T6SS đóng vai trò quan trọng trong giao tiếp và tương tác của vi khuẩn trong môi trường, giúp chúng thích nghi và cạnh tranh Đồng thời, hệ thống này được cho là góp phần tạo nên độc lực của một số loại vi khuẩn bằng cách cung cấp chất nền protein cho tế bào chủ, từ đó thúc đẩy quá trình xâm nhập và gây bệnh.

9 bằng cách tiết chất nền vào vi khuẩn lân cận có thể cạnh tranh để khai thác một vật chủ cụ thể [29]

Các hệ thống tiết protein đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây độc của vi khuẩn, bao gồm các yếu tố như sự bám vào tế bào chủ, quá trình xâm nhập và sinh sản của vi khuẩn, cũng như sản xuất độc tố và enzyme ngoại bào Ngoài ra, chúng còn liên quan đến các kháng nguyên bề mặt giúp vi khuẩn chống thực bào và né tránh phản ứng miễn dịch của ký chủ, góp phần tăng cường khả năng gây bệnh của vi khuẩn.

Sự bám vào tế bào chủ là điều kiện thiết yếu đầu tiên để vi khuẩn xâm nhập vào mô và gây nhiễm trùng, đóng vai trò như một yếu tố tạo nên khả năng gây bệnh và yếu tố độc lực của vi khuẩn Tuy nhiên, không phải tất cả các vi khuẩn có khả năng bám đều có độc lực, và một số vi khuẩn có độc lực nhưng không cần bám vào tế bào chủ để gây bệnh Độc lực của vi khuẩn là kết hợp của nhiều yếu tố, trong đó yếu tố bám là điều kiện tiên quyết nhưng không hoàn toàn quyết định khả năng gây bệnh.

Sự xâm nhập và sinh sản của vi khuẩn là các yếu tố quyết định quan trọng gây nhiễm trùng; không có sự xâm nhập và sinh sản thì không thể phát sinh bệnh Virus và các vi khuẩn ký sinh nội bào bắt buộc phải sinh sản bên trong tế bào chủ mới gây bệnh Nhiều loại vi khuẩn, dù không ký sinh nội bào bắt buộc, vẫn cần xâm nhập vào mô để gây nhiễm trùng Trong khi đó, các vi khuẩn gây bệnh bằng ngoại độc tố như Vibrio cholerae, Bordetella pertussis hay ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli) thường gây bệnh thông qua hoạt động của các độc tố tố, thay vì xâm nhập vào tế bào.

E.coli) đã không xâm nhập vào tế bào Chúng làm tổn hại màng tế bào, sinh sản trên màng nhầy niêm mạc, sản xuất và tiết ra ngoại độc tố, các ngoại độc tố này thấm vào các tế bào và gây ra những tác dụng đặc hiệu nghiêm trọng cho cơ thể Ngoài ra khả năng sinh sản trong tế bào góp phần tạo nên độc lực cho vi khuẩn Khả năng sinh sản này được xác định bởi nhu cầu dinh dưỡng và sự thích ứng với môi trường của vi khuẩn để phục vụ cho dinh dưỡng [30] Độc tố: là những chất độc của vi khuẩn để gây bệnh Nó gồm 2 loại là nội và ngoại độc tố Nội độc tố là những chất độc gắn ở vách vi khuẩn Gram âm, bản chất hóa học là lipopolysaccharide (LPS), thường có ở các vi khuẩn Gram âm như

Ngoại độc tố là các chất độc do vi khuẩn tiết ra môi trường có độc lực rất cao, vượt xa nội độc tố Các loại ngoại độc tố này có thể do cả vi khuẩn Gram dương như Corynebacterium diphtheriae và Clostridium tetani gây bệnh bạch hầu, uốn ván, hoại thư, cũng như vi khuẩn Gram âm như Bordetella pertussis, Vibrio cholerae và ETEC của E coli sản xuất.

Vi khuẩn có hai loại enzyme ngoại bào chính: một loại giúp phân cắt các phân tử có trọng lượng lớn, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn hấp thu dưỡng chất hiệu quả; loại còn lại có vai trò trong độc lực, góp phần vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn.

Các loại enzyme trong chất gây bệnh có vai trò khác nhau, trong đó hyaluronidase được xác định rõ ràng là có khả năng gây bệnh Tuy nhiên, bản thân các enzyme này hầu như ít độc tính, và vai trò gây bệnh của các loại khác vẫn chưa được chứng minh đầy đủ, đòi hỏi thêm các nghiên cứu để hiểu rõ hơn về tác dụng của chúng.

Các phương pháp sử dụng để xác định chủng vi khuẩn và các gen mã hóa yếu tố độc lực

Trong những năm gần đây, các phương pháp sinh học phân tử như PCR, multiplex PCR, real-time PCR, microarray ADN và giải trình tự toàn bộ hệ gen đã được phát triển để phát hiện và phân tích các gen độc lực của Campylobacter spp Những kỹ thuật này giúp nâng cao độ chính xác và hiệu quả trong việc xác định đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn, góp phần vào công tác kiểm soát và phòng chống bệnh tật.

Kỹ thuật PCR là phương pháp cơ bản trong sinh học phân tử, giúp nhân bản nhiều bản sao của một trình tự DNA ban đầu để phục vụ các nghiên cứu phân tích Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện và xác định vi khuẩn, đặc biệt trong các mẫu bệnh phẩm Ví dụ, Gonzalez và cộng sự đã sử dụng PCR để xác định tác nhân gây bệnh đường ruột là C jejuni và C coli dựa trên gen độc lực ceuE Ngoài ra, Talukder Kaisar cùng các cộng sự đã nghiên cứu về tỷ lệ các gen độc lực của C jejuni trên các bệnh nhân tiêu chảy tại Bangladesh bằng kỹ thuật PCR.

Kỹ thuật multiplex PCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều gen hoặc loài sinh vật trong cùng một mẫu nhờ sử dụng nhiều cặp mồi trong một phản ứng, giúp giảm thời gian và chi phí so với phương pháp PCR đơn lẻ Ưu điểm này giúp multiplex PCR được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm Ví dụ, nghiên cứu của Datta Suvamoy và cộng sự sử dụng kỹ thuật mPCR để xác định 11 gen độc lực của vi khuẩn C jejuni từ các mẫu lâm sàng của người, thịt gia cầm, phân gà và phân bò.

Kỹ thuật real-time PCR là phương pháp gần giống với PCR truyền thống nhưng có thêm thiết bị ghi nhận tín hiệu ngay trong quá trình phản ứng tổng hợp DNA, giúp định lượng chính xác lượng ADN Phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát hiện và xác định lượng gen vi khuẩn, điển hình như trong nghiên cứu của Andrew D Sail và cộng sự, đã sử dụng real-time PCR để phát hiện và định lượng Campylobacter jejuni trong thực phẩm sau quá trình nuôi cấy tăng sinh.

Kỹ thuật microarray DNA cho phép xác định nhanh chóng và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh do vi khuẩn Dmitriy Volokhov và cộng sự đã ứng dụng thành công phương pháp này để phát hiện bốn loài vi khuẩn Campylobacter gồm C jejuni, C coli, C lari và C upsaliensis, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và kiểm soát bệnh truyền nhiễm.

Kỹ thuật giải trình tự toàn bộ hệ gen (WGS) là công cụ cung cấp thông tin di truyền toàn diện về vi khuẩn, ngày càng được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu nguồn gây bệnh từ thực phẩm Sandeep Ghatak và cộng sự đã ứng dụng kỹ thuật này để giải trình tự hệ gen và phân tích C coli YH502 từ thịt gà bán lẻ, qua đó phát hiện hệ thống tiết loại VI do plasmid sinh ra, góp phần nâng cao hiểu biết về các yếu tố gây bệnh trong lĩnh vực an toàn thực phẩm.

Trong số các phương pháp xác định tác nhân gây bệnh, kỹ thuật real-time PCR, microarray DNA và giải trình tự toàn bộ hệ gen là những phương pháp hiệu quả để phát hiện nhiều tác nhân cùng lúc với độ chính xác cao Tuy nhiên, các kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, nhân lực chuyên môn cao và chi phí lớn PCR và multiplex PCR là các kỹ thuật cơ bản, phổ biến hiện nay, phù hợp với nhiều nghiên cứu nhờ tính đơn giản và tiết kiệm thời gian Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn hai phương pháp PCR và multiplex PCR để phát hiện vi khuẩn Campylobacter cùng các gen độc lực của chúng trong các mẫu thịt lợn, thịt bò và thịt gà, dựa trên mục đích, phạm vi và điều kiện cụ thể của nghiên cứu.

PCR là kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử dùng để nhân rộng nhiều bản sao của đoạn ADN trong ống nghiệm, mô phỏng quá trình sinh tổng hợp ADN của tế bào sống Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học, phục vụ nhiều mục đích nghiên cứu và ứng dụng khác nhau.

* Ứng dụng phản ứng PCR:

PCR được ứng dụng rộng rãi trong y học để hỗ trợ chẩn đoán và tầm soát bệnh ung thư như phát hiện HPV trong ung thư cổ tử cung, gen BRCA1/BRCA2 trong tầm soát ung thư vú, gen APC trong ung thư đại tràng, bên cạnh đó còn phát hiện bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm thông qua đột biến điểm tại vị trí CvnI và nghiên cứu hệ kháng nguyên bạch cầu người Ngoài ra, kỹ thuật PCR còn được sử dụng để nghiên cứu tính kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh, bằng cách khảo sát gen kháng thuốc như gen pbp1a và pbp2a của Streptococcus pneumoniae, đột biến kháng Rifamicin ở gen rpoB, hay phát hiện khả năng kháng INH do thiếu gen catalase của vi khuẩn Lao Các ứng dụng này còn giúp xác định chính xác chủng vi khuẩn và gen độc lực của các loại vi khuẩn gây bệnh, góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và kiểm soát dịch bệnh.

Kỹ thuật PCR giúp nhân bản và khuếch đại DNA vi khuẩn, tạo ra số lượng bản sao đủ lớn để xác định chính xác chủng và loài vi khuẩn Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện vi khuẩn trong các mẫu thực phẩm và môi trường, như xác định vi khuẩn E.coli gây tiêu chảy trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, cũng như phát hiện vi khuẩn Salmonella gây bệnh thương hàn trong các mẫu thịt.

Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định yếu tố độc lực của vi khuẩn, giúp phát hiện các gen độc lực quan trọng Ví dụ, PCR giúp xác định các gen độc lực của các chủng vi khuẩn E.coli, từ đó đánh giá mức độ nguy hiểm và khả năng gây bệnh của vi khuẩn Công nghệ này đóng vai trò thiết yếu trong nghiên cứu và chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn gây ra.

O157:H7/H- chứa các gen quan trọng như stx1, stx2, eae và EHEC-hlyA được phân lập từ bò, xác nhận vai trò của chúng trong nhiễm EHEC Ngoài ra, quá trình khuếch đại gen mã hóa cholera toxin (độc tố ruột của vi khuẩn) đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các yếu tố gây bệnh liên quan đến vi khuẩn EHEC.

Vibrio cholerae) giúp phân biệt một cách chắc chắn vi khuẩn Vibrio cholerae gây

Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định sự hiện diện của các nhóm huyết thanh không gây bệnh tả của vi khuẩn Vibrio cholerae, giúp phân biệt các loại vi khuẩn không gây bệnh tả Ngoài ra, PCR còn giúp đánh giá các gen độc lực của Salmonella được phân lập từ thịt lợn, thịt gà và thịt bò, đặc biệt là gen invA liên quan đến quá trình xâm nhập vào tế bào chủ, gen stn gây tiêu chảy bằng cách kích hoạt hệ thống tín hiệu cAMP và cGMP, và gen spvC trên plasmid độc lực có khả năng phân hủy phospho threonin, làm bất hoạt enzyme MAPK của tế bào chủ.

1.5.2 Phương pháp multiplex PCR (mPCR)

Kỹ thuật multiplex PCR giúp phát hiện đồng thời nhiều gen hoặc nhiều loài sinh vật trong cùng một mẫu, tiết kiệm thời gian, công sức và chi phí so với phản ứng PCR đơn gen truyền thống Đây là phương pháp sinh học phân tử phổ biến, cho phép khuếch đại nhiều trình tự ADN cùng lúc bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi đặc hiệu, mỗi cặp mồi tìm kiếm chính xác vùng gen đích của nó Multiplex PCR là sự cải tiến của phản ứng PCR thông thường, giúp rút ngắn thời gian và giảm chi phí mà vẫn đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của kết quả phân tích.

Phản ứng mPCR có nhiều ứng dụng rộng rãi trong việc xác định đồng thời nhiều tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâm nhiễm khác Ngoài ra, phản ứng này còn dùng để xác định các thành phần trong hỗn hợp mẫu hoặc kiểm tra sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ gen Các mục đích sử dụng của mPCR bao gồm xác định tác nhân gây bệnh, phát hiện đột biến gen, định lượng mẫu và nghiên cứu pháp y Đặc biệt, phản ứng mPCR được ứng dụng trong xác định gen độc lực của vi khuẩn, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán và nghiên cứu y sinh.

Tình hình nghiên cứu về các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn C jejuni và C coli trên thế giới và tại Việt Nam

và C coli trên thế giới và tại Việt Nam

Nhiễm vi khuẩn Campylobacter từ các nguồn thực phẩm chưa qua chế biến tại chợ, siêu thị hoặc từ chính vật nuôi tại các trang trại là vấn đề toàn cầu đáng lưu tâm Khả năng gây bệnh của vi khuẩn này phụ thuộc vào các yếu tố độc lực mang tính đa dạng và phức tạp Hiểu rõ về cơ chế gây bệnh, đặc biệt là các gen mã hóa yếu tố độc lực của C jejuni và C coli, là lĩnh vực nghiên cứu hàng đầu của các nhà khoa học trong và ngoài nước nhằm giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh.

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nghiên cứu về các gen độc lực của vi khuẩn Campylobacter spp đã được tiến hành từ rất sớm trên thế giới Năm 1997, Linton và cộng sự đã phát hiện hai loài C jejuni và C coli trong mẫu bệnh phẩm phân và xác định sự có mặt của gen flaA, một gen độc lực liên quan đến khả năng di chuyển của vi khuẩn này.

Năm 1997, nghiên cứu của Gonzalez và cộng sự sử dụng kỹ thuật PCR để xác định chính xác các tác nhân gây bệnh đường ruột, bao gồm C jejuni và C coli, dựa trên gen độc lực ceuE Đến năm 1999, Michael và cộng sự đã xác định được một gen độc lực khác liên quan đến khả năng bám dính của vi khuẩn, góp phần nâng cao hiểu biết về các yếu tố gây bệnh của các vi khuẩn này.

Campylobacter spp là một loại vi khuẩn phổ biến trong thịt gà, với tỉ lệ xuất hiện lên tới 96,3% trong tổng số các chủng phân lập, bao gồm C jejuni và C coli [48] Gần đây, vào năm 2015, có một nghiên cứu tập trung vào gen độc lực hcp, liên quan đến khả năng bám dính và xâm nhập vào tế bào vật chủ của các chủng vi khuẩn này, cho thấy mức độ nguy hiểm và khả năng lây nhiễm cao của chúng.

C jejuni và C coli được phân lập từ thịt gà bằng kỹ thuật mPCR, Nicolae

Corcionivoschi và cộng sự đã xác định được tỷ lệ lưu hành gen này ở C coli là

Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm của Vi khuẩn Campylobacter spp là 56,1%, trong đó C jejuni chiếm 28,8% [33] Những nghiên cứu này chỉ là một phần trong các nghiên cứu về các gen độc lực đơn lẻ của vi khuẩn Campylobacter spp., đồng thời còn có nhiều nghiên cứu khác đề cập đến các gen độc lực như flhA, iamA, ciaB, nhằm hiểu rõ hơn về khả năng gây bệnh của vi khuẩn này.

Bên cạnh các nghiên cứu về từng gen độc lực đơn lẻ của vi khuẩn

Nghiên cứu về Campylobacter spp sử dụng kỹ thuật PCR và mPCR đã phát hiện nhiều gen độc lực của vi khuẩn này, đặc biệt là các gen liên quan đến khả năng gây bệnh như wlaN, cgtB, cdtA, cdtB và cdtC Ví dụ, năm 2020, Pedro Guirado và cộng sự đã xác định sự hiện diện của các gen wlaN và cgtB liên quan đến hội chứng Guillain-Barré trong các mẫu vi khuẩn từ người, gà và chim hoang dã Bên cạnh đó, nghiên cứu của Irati Martinez và cộng sự năm 2006 đã phân lập thành công các gen cdtA, cdtB, cdtC liên quan đến khả năng sản xuất độc tố CDT từ các nguồn khác nhau Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cùng một lúc đã xác định các gen mã hóa các yếu tố độc lực như khả năng di chuyển, bám dính, xâm nhập, sản xuất độc tố và sinh lipooligosaccharide, cung cấp cái nhìn tổng thể về các yếu tố độc lực hiện diện trong các chủng vi khuẩn Campylobacter.

Campylobacter spp Một vài nghiên cứu điển hình như nghiên cứu của Datta

Năm 2003, Suvamoy và cộng sự đã nghiên cứu tỷ lệ xuất hiện của 11 gen độc lực trong 111 chủng vi khuẩn C jejuni được phân lập từ các mẫu lâm sàng của người, thịt gia cầm, phân gà và phân bò Trong đó, 5 gen độc lực (flaA, cadF, cdtA, cdtB, cdtC) được phát hiện trong tất cả các chủng, nhưng tỷ lệ phát hiện của các gen khác như racR, wlaN, virB11, dnaJ, ciaB và pldA khác nhau tùy theo nguồn Chỉ có 2 chủng từ mẫu lâm sàng của người mang đủ 11 gen độc lực, trong khi 2 chủng từ phân bò chỉ có 6 gen, còn lại có từ 8 đến 10 gen độc lực, chưa cho thấy sự khác biệt đáng kể về sự hiện diện của các gen này giữa các nguồn phân lập Cùng năm đó, Dang Duong Bang và cộng sự đã phân tích tỷ lệ xuất hiện của 7 gen độc lực trong vi khuẩn C jejuni và C coli được phân lập từ lợn và gia súc tại Đan Mạch, xác định tỷ lệ các gen này lần lượt là cadF.

Trong tổng số các chủng vi khuẩn phân lập được, các gen độc lực như flaA, ceuE đều đạt tỷ lệ 100%, trong khi đó cdtB cũng xuất hiện ở mức 100%, còn cdtA và cdtC lần lượt chiếm tỷ lệ 95% và 90%, cùng với virB11 chỉ ở mức 7,5% Nghiên cứu của Muller và cộng sự năm 2006 đã xác định sự xuất hiện của 20 gen độc lực giả định, liên quan đến khả năng xâm nhập vào tế bào Caco-2 của ruột gà ở 11 chủng C jejuni phân lập, cho thấy mức độ đa dạng gen độc lực trong các chủng vi khuẩn này.

Các gen liên quan đến khả năng di chuyển của vi khuẩn, như flaA, flaB, flhA, flhB, flgB, flgE2, đóng vai trò quan trọng trong sự vận chuyển của các chủng vi khuẩn Gen cadF là liên quan đến khả năng bám dính của vi khuẩn vào tế bào chủ, trong khi các gen như ciaB, iamA, docA, docB liên quan đến quá trình xâm nhập vào tế bào chủ Nhiều gen sản xuất độc tố, gồm cdtA, cdtB, cdtC, được phát hiện ở hầu hết các chủng, còn gen virB11 thì không được phát hiện trong bất kỳ chủng nào, cho thấy sự khác biệt về gen trong các chủng phân lập Các gen cgtB và wlaN liên quan đến sinh tổng hợp lipooligosaccharide, thể hiện đặc điểm phân lập đặc trưng Nghiên cứu của Talukder Kaisar và cộng sự năm 2008 tại Bangladesh về tỷ lệ gen độc lực của C jejuni, qua kỹ thuật PCR trên 300 mẫu phân, đã xác định được 40 chủng C jejuni và 5 chủng C coli, trong đó các gen độc lực như flaA có tỷ lệ xuất hiện cao nhất, phản ánh vai trò quan trọng của các gen này trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn.

(100%), cadF (100%), racR (100%), dnaJ (100%), pldA (100%), ciaB (95%), virB11 (0%), ceuE (82,5%), cdtA (97,5%), cdtB (97,5%), cdtC (97,5%) và wlaN (7,5%) [36]

Nghiên cứu về gen mã hóa các yếu tố độc lực của vi khuẩn Campylobacter spp là một vấn đề được quan tâm toàn cầu, nhằm hiểu rõ cơ chế gây bệnh và sự phân bố của các gen này Các gen độc lực của vi khuẩn có độ đa dạng cao, thay đổi theo nguồn gốc, vị trí địa lý và tỷ lệ xuất hiện trong các chủng vi khuẩn khác nhau Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phân tích các mẫu bệnh phẩm, vật nuôi và thực phẩm để xác định sự xuất hiện của các gen độc lực, góp phần trong công tác kiểm soát và phòng chống nhiễm trùng do Campylobacter spp.

Tại Việt Nam, những nghiên cứu về các gen độc lực của vi khuẩn

Hiện tại, nghiên cứu về Campylobacter spp còn hạn chế, chủ yếu tập trung vào việc xác định số lượng và tỷ lệ nhiễm trong vật nuôi và các mẫu thịt tại các trang trại, lò mổ, chợ, siêu thị ở địa phương khác nhau Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu quan tâm đến các yếu tố quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn này, ảnh hưởng đến hiệu quả phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh.

Năm 2019, Nguyễn Ngọc Minh Tuấn và cộng sự đã nghiên cứu xác định các gen gây bệnh của vi khuẩn chịu nhiệt Campylobacter spp phân lập từ thịt lợn và thịt gà tại Việt Nam Các phát hiện của nghiên cứu bao gồm việc xác định 9 chủng vi khuẩn Campylobacter spp., góp phần nâng cao nhận thức về nguy cơ lây nhiễm và phòng chống bệnh từ thực phẩm.

Nghiên cứu xác định gen gây bệnh của 8 chủng C jejuni và 1 chủng C coli trong tổng số 20 chủng Campylobacter spp được phân lập từ 150 mẫu thịt gà và thịt lợn tại Việt Nam Các gen gây bệnh được phân thành 6 nhóm chính: nhóm gen điều khiển hoạt động của lông roi gồm flaA, flaB, flhA, fimM, fimY; nhóm gen đảm nhận chức năng bám dính gồm ciaB, iamA, virB11; nhóm gen thực hiện chức năng xâm nhập tế bào gồm cadF, docA, docB, docC; nhóm gen sinh ra độc tố gồm cdtA, cdtB, cdtC; nhóm gen bài tiết độc tố secD, secF; và nhóm gen liên quan đến sinh tổng hợp các thành phần độc hại của vi khuẩn.

18 lipooligosaccharide: pglB, Cje1278, Cje1280, Cj1434c, Cj1138,Cj1438c, Cj1440c, cgtB, Cj1136 [9]

Dựa trên các nghiên cứu toàn cầu và trong nước, mặc dù đã có những nghiên cứu về gen độc lực của vi khuẩn Campylobacter spp., nhưng đặc điểm sinh học phân tử của các chủng vi khuẩn phân lập tại Việt Nam, đặc biệt ở Hà Nội, vẫn chưa được xác định đầy đủ Việc xác định các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn tại Việt Nam, đặc biệt là nguồn lây nhiễm từ thực phẩm như thịt lợn, thịt gà và thịt bò, là rất cần thiết do chúng là thực phẩm thường xuyên tiêu thụ hàng ngày Trong khi đó, nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Minh Tuấn đã xác định gen gây bệnh của vi khuẩn Campylobacter spp tại Việt Nam bằng phương pháp mPCR, thì nghiên cứu của chúng tôi có điểm khác biệt lớn về phạm vi và đối tượng nghiên cứu Cụ thể, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên ba loại thịt là lợn, gà và bò, so với nghiên cứu của Minh Tuấn chỉ tập trung vào hai loại là lợn và gà, đồng thời mẫu được thu từ các cơ sở khác nhau, mở rộng phạm vi khảo sát nhằm nâng cao hiểu biết về khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn tại môi trường Việt Nam.

Nghiên cứu của chúng tôi đã thu thập mẫu tại các chợ, siêu thị ở Hà Nội, nơi cung cấp trực tiếp sản phẩm cho người tiêu dùng, đảm bảo tính đại diện cho khu vực Với tổng số 236 mẫu thịt gà và lợn từ ba loại khác nhau, chúng tôi đánh giá khả năng gây bệnh của vi khuẩn Campylobacter hơn so với nghiên cứu của Minh Tuấn chỉ có 150 mẫu, chưa đủ để đại diện toàn diện tại Việt Nam Ngoài ra, trong khi Minh Tuấn phân tích 26 gen độc lực liên quan đến chức năng của chúng, nghiên cứu của chúng tôi sử dụng các gen 16S, ceuE, asp, mapA, hipO để xác định sự có mặt của C jejuni và C coli trong mẫu thịt, đồng thời xác định các gen độc lực liên quan đến cơ chế gây bệnh, như virB11, ciaB và hcp, liên quan đến hệ thống tiết của vi khuẩn.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Các mẫu thịt lợn, thịt gà, thịt bò được thu mua tại một số chợ, siêu thị tại Hà Nội, từ tháng 1/2022 đến tháng 5/2022 Danh sách chi tiết các chợ và siêu thị thu thập mẫu được nêu trong Phụ lục

2.1.2 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị

Các dụng cụ, thiết bị, hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm thuộc Trung tâm Dinh dưỡng & Bệnh không lây nhiễm và Khoa Vi sinh & Sinh học Phân tử, Viện Dinh dưỡng, Bộ Y tế, đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo quá trình xét nghiệm và nghiên cứu dinh dưỡng, bệnh lý.

- Kit tách chiết ADN (hãng AmpliSense, Cat#: K2-9-Et-100);

- Các cặp mồi (hãng Phù Sa);

- PCR master mix 2X loại i-Taq TM (hãng iNtRON Biotechnology, Cat#: 25028)

- Glycerol 85% (w/v) (hãng Sigma-aldrich, Cat#: 15524-1l-R)

- Agarose (hãng Biobasic, Cat#: AB0013)

- Thang chuẩn (hãng Cleaver Scientific, Cat#: CSL-MDNA-100BP)

- Đệm điện di TBE (hãng SERVA, Cat#: 24073);

- Dung dịch nhuộm Redsafe (hãng iNtRON Biotechnology, Cat#: 42557.01)

- Nước khử ion UltraPureTM Distilled Water

- Môi trường Bolton Broth (hãng Oxoid, Cat#: CM0983)

- Laked Horse Blood (hãng Thermo Scientific, Cat#: SR0048C)

- Bolton Broth Selective Supplement (hãng Oxoid , Cat#: SR0183E)

- Găng tay, áo choàng, khẩu trang

- Giấy/thuyền/cốc cân, thìa cân

- Ống đong thuỷ tinh dung tích 50 ml, 250 ml, 1000 ml và cốc đong thuỷ tinh dung tích 1L được rửa sạch, hấp sấy tiệt trùng

- Ống falcon đáy hình nón dung tích 15ml và 50ml vô trùng

- Ống eppendorf 1,5ml được hấp sấy tiệt trùng và không chứa ADN, ARN, DNase, RNase

- Đầu tip cỏc chủng loại 10 àl, 200 àl, 1000 àl khụng chứa ADN, ARN, DNase, RNase, được hấp sấy tiệt trùng

- Túi dập mẫu Stomacher vô trùng

- Bình đựng môi trường với các dung tích phù hợp

- Bình kín với túi AnaeroGen TM tạo môi trường vi hiếu khí

- Bút không phai ghi mẫu không tẩy được bằng Ethanol, bút thường

- Giấy chỉ thị cho quá trình hấp vô trùng

- Đĩa Petri vô trùng đường kính 12 cm

- Đèn cồn, bình xịt cồn dạng sương mù, giấy ăn sạch để lau khử trùng bề mặt

Để đảm bảo chất lượng và tính vô trùng, các dụng cụ trong phòng thí nghiệm của Khoa Dinh dưỡng & Bệnh không lây nhiễm, Viện Dinh dưỡng - Bộ Y tế, được chuẩn bị theo các SOP phù hợp cho từng loại dụng cụ và mục đích sử dụng Việc chuẩn bị đúng quy trình giúp ngăn chặn hiện tượng nhiễm chéo và đảm bảo an toàn cho các bước tiến hành nghiên cứu và khám chữa bệnh.

Danh sách các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1 dưới đây

Bảng 2.1 Danh sách thiết bị

Tên thiết bị - Model Hãng sản xuất Xuất xứ

Cân phân tích (model M1203i) BEL Engineering Trung Quốc Nồi hấp khử trùng ướt (model HV-110) Hirayama Nhật Bản

Tủ sấy khử trùng khô (model UF260) Memmert Đức

Tủ ấm CO2 (model ICO-105Met) Memmert Đức

Tủ hút khí độc (model EFH-4A8) Esco Singapore

Tủ mát (model EFH-4A8) Panasonic Nhật Bản

Tủ lạnh sâu (model MDF-U4512) Panasonic Nhật Bản

Tủ sạch pha dung dịch phản ứng (model PCR-4A1) Esco Singapore

Tủ an toàn sinh học cấp độ 2 (model AC2-4E8) Esco Singapore

Máy dập mẫu (model ZJLW-10) Zenth Trung Quốc

Máy điện di (model Mupid-2plus) Mupid Nhật Bản

Máy ly tâm lạnh, tốc độ cao (model 5430R) Eppendorf Đức

Máy ly tâm nhỏ (model 5452) Eppendorf Đức

Máy vortex (model E-centrifuge) Wealtec Mỹ

Máy gia nhiệt (model AccuBlock D1302) LabNet Mỹ

Máy luân nhiệt PCR (model MasterCycler X50S) Eppendorf Đức

Máy chụp ảnh gel agarose (model 1708195EDU) Bio-Rad Mỹ

Nội dung nghiên cứu

Xuất phát từ 2 mục tiêu, đề tài triển khai các nội dung nghiên cứu sau:

Với mục tiêu 1: Khảo sát được các điều kiện của phản ứng PCR và mPCR bao gồm

- Phân tích in silico các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện của phản ứng PCR đối với từng gen

- Khảo sát các điều kiện của phản ứng mPCR đối với từng set phản ứng

Mục tiêu của nghiên cứu là xác định tỷ lệ nhiễm của các vi khuẩn Campylobacter spp., gồm C jejuni và C coli, trên các mẫu thịt lợn, thịt gà và thịt bò thu mua tại các chợ và siêu thị ở Hà Nội Đồng thời, nghiên cứu cũng nhằm phân tích tỷ lệ mang các gen mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn này trong các mẫu thực phẩm Kết quả sẽ cung cấp dữ liệu quan trọng về mức độ nhiễm and sự tồn tại của các yếu tố gây độc của Campylobacter trong thực phẩm tươi sống tại khu vực này.

- Xác định tỷ lệ nhiễm Campylobacter spp., C jejuni và C coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà, thịt bò

- Xác định tỷ lệ mang các gen mã hóa yếu tố độc lực của C jejuni và C coli trong các mẫu thịt lợn, thịt gà, thịt bò

* Các gen sử dụng trong nghiên cứu:

- Phát hiện Campylobacter spp.: gen 16S đặc trưng cho chi Campylobacter

- Phát hiện loài C jejuni và C coli: gen 16S của 2 loài C jejuni, C coli; 2 gen ceuE và asp của loài C coli; 2 gen mapA và hipO của loài C jejuni

- Phát hiện gen độc lực: gen virB11 (hệ thống tiết loại IV), gen ciaB (hệ thống tiết loại III), gen hcp (hệ thống tiết loại VI)

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp dịch tễ học mô tả cắt ngang Các nội dung nghiên cứu được mô tả trong sơ đồ hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.3.1.2 Cỡ mẫu nghiên cứu Để ước tính cỡ mẫu nghiên cứu phù hợp dựa trên giả định trước đó về tỷ lệ đã biết trước, từ đó dẫn tới quyết định lựa chọn tham số thích hợp cho việc xác định tỷ lệ nhiễm dựa theo công thức sau:

Trong đó: n: cỡ mẫu cần thu thập

P: tỷ lệ nhiễm kỳ vọng (có thể tham khảo từ các nghiên cứu trước đó hay nghiên cứu thử ban đầu) α: mức ý nghĩa thống kê (chọn α = 0,05)

Dưới mức ý nghĩa α = 0,05, hệ số tỷ lệ tin cậy là 1,96, tương ứng với độ tin cậy 95% Độ chính xác của nghiên cứu được xác định dựa trên cỡ mẫu thu thập, trong đó chúng tôi chọn d = 0,1 để đảm bảo độ chính xác Áp dụng công thức tính toán dựa trên các nghiên cứu trước đó, chúng tôi ước tính rằng cỡ mẫu phù hợp để phát hiện sự hiện diện của Campylobacter spp trong các mẫu thịt là 87 mẫu.

Để ước tính số mẫu cần thu thập và thiết lập các điều kiện thí nghiệm phù hợp, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ở quy mô thử nghiệm ban đầu (pilot study), nhằm xác định các yếu tố chính ảnh hưởng và tối ưu hóa quy trình nghiên cứu.

Nghiên cứu đã phân tích tổng cộng 100 mẫu thịt gồm 50 mẫu thịt lợn, 25 mẫu thịt bò, và 25 mẫu thịt gà để xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Kết quả thử nghiệm sơ bộ cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn trên các loại thịt khác nhau, giúp chúng tôi đánh giá nguy cơ an toàn thực phẩm Ngoài ra, các mẫu dương tính trong phân tích này sẽ được sử dụng làm chứng dương PCR cho các giai đoạn tiếp theo của nghiên cứu, góp phần vào việc xác định chính xác mức độ nhiễm vi khuẩn trong thịt.

Sau khi khảo sát thử nghiệm, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu trên tổng số 236 mẫu thịt, gồm 60 mẫu thịt bò, 115 mẫu thịt lợn và 61 mẫu thịt gà để đảm bảo tính đa dạng và chính xác của dữ liệu nghiên cứu.

2.3.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phát hiện vi khuẩn Campylobacter và gen độc lực

Hình 2.2 trình bày sơ đồ mô tả quy trình thí nghiệm nhằm phát hiện sự hiện diện của Campylobacter spp trong mẫu thịt và xác định gen độc lực của vi khuẩn này Quá trình nghiên cứu sử dụng các phương pháp cụ thể để đảm bảo độ chính xác trong việc xác định và phân tích các đặc điểm sinh học của Campylobacter spp trong các mẫu thực phẩm, góp phần nâng cao công tác kiểm soát an toàn thực phẩm.

Nuôi cấy tăng sinh chọn lọc trong canh thang Bolton

(42 o C/24 - 48h, điều kiện vi hiếu khí 10% CO 2 , 5% O 2 , 85% N 2 )

Tách chiết ADN vi khuẩn bằng kit AmpliSense

PCR phát hiện vi khuẩn Campylobacterspp. Âm tính -> Kết thúc thí nghiệm Dương tính mPCR phát hiện loài C jejuni, C coli và phát hiện gen độc lực

Trong quá trình thu thập mẫu, tổng cộng 236 mẫu thịt đã được lấy, gồm 115 mẫu thịt lợn, 61 mẫu thịt gà và 60 mẫu thịt bò tại chợ và siêu thị vào khoảng 7 giờ sáng, mỗi địa điểm lấy 2 mẫu thịt lợn, 1 mẫu thịt gà, 1 mẫu thịt bò, mỗi mẫu khoảng 30g Các mẫu thịt được ghi mã số bằng bút không phai, đóng gói trong túi vô trùng và bảo quản trong hộp chứa đá khô để tránh tiếp xúc trực tiếp, sau đó chuyển ngay đến phòng thí nghiệm Vi sinh của Viện Dinh dưỡng để phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Campylobacter Quá trình chọn lọc mẫu và tăng sinh nuôi cấy diễn ra ngay khi mẫu về đến phòng thí nghiệm, sau đó các gen mã hoá yếu tố độc lực của vi khuẩn này sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, đảm bảo kết quả chính xác và nhanh chóng.

2.3.2.2 Phương pháp tăng sinh chọn lọc vi khuẩn Campylobacter spp từ các mẫu thịt lợn, thịt gà, thịt bò

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Hướng dẫn Phân tích Vi khuẩn (Bacteriological Analytical Manual - BAM) của FDA xuất bản năm 2021 để tăng sinh chọn lọc các vi khuẩn, đảm bảo độ chính xác và đáng tin cậy trong phân tích Các môi trường tăng sinh chọn lọc cho vi khuẩn được chuẩn bị dựa theo hướng dẫn của nhà sản xuất cùng với các SOP nội bộ tại Khoa Dinh dưỡng Bệnh không lây nhiễm (Viện Dinh dưỡng) Quy trình xử lý mẫu ban đầu và các điều kiện tăng sinh chọn lọc Campylobacter spp được mô tả ngắn gọn nhằm đảm bảo quy trình chuẩn và tối ưu kết quả nghiên cứu.

Dựa trên các đặc điểm sinh học của Campylobacter spp., đặc biệt là khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng phù hợp đóng vai trò quan trọng trong việc diễn biến quá trình tăng sinh và chọn lọc vi khuẩn.

Campylobacter spp có thể bị tổn thương trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, khiến chúng nhạy cảm với các tác nhân chọn lọc trong môi trường nuôi cấy Để tránh kết quả âm tính giả, sử dụng môi trường phục hồi như Bolton Selective Enrichment Broth giúp hồi sinh các tế bào bị tổn thương và tạo điều kiện cho vi sinh vật nhân lên Thêm Natri metabisulphite và Natri pyruvate vào Bolton Broth hỗ trợ loại bỏ các hợp chất độc hại, đảm bảo vi sinh vật phát triển tối ưu và nâng cao độ chính xác trong xét nghiệm phát hiện Campylobacter spp.

Ngoài ra, các chất kháng sinh có trong Bolton broth Selective supplement giúp tối ưu hóa tính chọn lọc đối với Campylobacter spp.: Vancomycin, Cefoperazone

Trimethoprim có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, trong khi Cycloheximide hoạt động chống nấm men, giúp loại bỏ sự phát triển của các tác nhân không mong muốn Việc tăng sinh chọn lọc này giúp tăng số lượng vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Campylobacter spp., trong mẫu xét nghiệm, từ đó dễ dàng phát hiện và chọn lọc Điều này còn giúp giảm thiểu hiện tượng âm tính giả khi thực hiện phản ứng PCR, tăng độ chính xác của kết quả xét nghiệm.

* Môi trường tăng sinh chọn lọc Campylobacter spp

Chuẩn bị môi trường canh thang Bolton để nuôi cấy tăng sinh chọn lọc

Để chuẩn bị môi trường nuôi Campylobacter spp theo hướng dẫn của hãng Oxid, bạn cần trộn 27,6 gram môi trường Bolton Broth (gồm peptone thịt, Lactalbumin thủy phân, chiết xuất nấm men, natri clorua, acid alpha ketoglutaric, natri pyruvate, natri metabisulfit, natri carbonat, và haemin) với 1L nước cất trong bình thủy tinh sạch, khuấy đều rồi tiệt trùng bằng nồi hấp ở 121°C trong 15 phút Sau khi để nguội đến 50°C, thêm 50 ml huyết ngựa đã khử fibrin và vô trùng cùng một lọ Bolton broth bổ sung chọn lọc chứa các kháng sinh như Cefoperazon, Vancomycin, Trimethoprim, và Cycloheximide Khuấy đều lần nữa và bảo quản ở nhiệt độ từ 2 đến 8°C để sử dụng.

Đầu tiên, lấy 25g thịt thái nhỏ, cho vào túi stomacher chứa 100 ml dung dịch Bolton, môi trường tăng sinh vi khuẩn có chứa Lake Horse Blood và kháng sinh, sau đó sử dụng máy đồng nhất mẫu với tốc độ 100 lần/phút trong 30 giây ở nhiệt độ phòng để tách vi khuẩn khỏi bề mặt thịt Tiếp theo, gạn dung dịch sang phía còn lại của túi stomacher Trong giai đoạn trước khi tăng sinh, ủ dung dịch này ở 37°C trong 4 giờ tại điều kiện vi hiếu khí trong tủ ấm CO2 (10% CO2, 5% O2, 85% N2) Khi bước tăng sinh bắt đầu, ủ dung dịch ở 42°C trong vòng 48 giờ trong tủ ấm CO2 với điều kiện vi hiếu khí để thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn.

N2 Sau 48 giờ, lấy 1ml dung dịch tăng sinh chọn lọc cho vào 0,33ml glycerol 85% (w/v) vô trùng và lưu mẫu ở -20 o C để giữ chủng

2.3.2.3 Phương pháp tách chiết ADN từ dung dịch tăng sinh chọn lọc vi khuẩn

Quy trình tách chiết ADN được thực hiện theo hướng dẫn của hãng sản xuất Kit AmpliSense (Nga) Dưới đây là phần tóm tắt quy trình tách chiết ADN:

Chia 300 µl dung dịch đệm ly giải (lysis buffer) vào mỗi ống Eppendorf 1,5 ml, sau đó thêm 50 µl dung dịch tăng sinh chọn lọc vi khuẩn vào mỗi ống Tiếp theo, đảo trộn hỗn hợp trong 10 giây và ly tâm nhẹ để loại bỏ dịch trên nắp ống Hỗn hợp này sau đó được ủ theo quy trình phù hợp để đảm bảo hiệu quả trong quá trình xử lý.

Chúng tôi thực hiện nấu mẫu ở nhiệt độ 65°C trong vòng 5 phút để đảm bảo quá trình phản ứng diễn ra hiệu quả Sau đó, bổ sung 400 μL dung dịch tủa vào mỗi ống nghiệm để tách chất cần phân tích Tiếp theo, ly tâm hỗn hợp với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút để tách phần cặn và loại bỏ dịch nổi Phần cặn còn lại sau quá trình ly tâm đảm bảo chứa thành phần quan trọng của mẫu để phân tích chính xác.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

BÀN LUẬN