Lê thùy linh xây dựng phương pháp phát hiện clopheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng lỏng bằng hptlc khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

Tình hình nghiên cứu phát hiện hoạt chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, trong đó có Chlorpheniramin .... Việc trộn trái phép thuốc hóa dược vào sản phẩm đông dược khôn

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THÙY LINH

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CLOPHENIRAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC

DẠNG LỎNG BẰNG HPTLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2023

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THÙY LINH

Mã sinh viên: 1801381

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CLOPHENIRAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên, sự ủng hộ của gia đình và bạn bè

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến PGS TS Phạm Thị Thanh Hà và HVCH Nguyễn Thị Mây, là những người trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Ngân Bình đã động viên, nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Khoa học và công nghệ trực thuộc Bộ GD&ĐT mã số 104.04 – 2020.29 của TS Đào Thị Cẩm Minh trong quá trình thu thập mẫu Cảm ơn bạn sinh viên Nguyễn Phương Thảo đã tham gia và hỗ trợ thu thập mẫu

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, các anh chị cán bộ tại khoa Nghiên cứu phát triển - Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm để hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Ban Giám hiệu, cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn Trường đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ, giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận này

Dù có nhiều cố gắng trong quá trình thực hiện khóa luận, song không thể tránh khỏi thiếu sót và hạn chế Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp và sự chỉ dẫn của thầy cô giáo

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2023

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.2 Tình hình nghiên cứu phát hiện hoạt chất hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, trong đó có Chlorpheniramin 4

1.2.1 Trên thế giới 4

1.2.2 Tại Việt Nam 7

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu – Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 7

1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 7

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 9

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.1.1 Hóa chất, chất chuẩn 12

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 12

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 14

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 15

2.3.3 Ứng dụng phân tích các mẫu thu thập được 16

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 16

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1.1 Khảo sát hệ dung môi pha động 18

3.1.2 Khảo sát bước sóng định lượng 19

3.1.3 Khảo sát xử lý mẫu 20

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 20

3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 20

3.2.2 Độ đặc hiệu 21

3.2.3 Khoảng tuyến tính 22

3.2.4 Độ đúng và độ chính xác 24

3.2.5 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 25

3.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích chế phẩm đông dược dạng lỏng thu thập được trên thị trường 26

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29

4.1 Xây dựng phương pháp phân tích 29

4.1.1 Về phương pháp phân tích 29

4.1.2 Về quy trình phân tích bằng HPTLC 30

4.2 Thẩm định phương pháp 31

4.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thống (Association of Official

Analytical Chemists)

AR Thuốc thử phân tích (Analytical Reagent)

CDC Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh

CTCT Công thức cấu tạo

LC Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography)

MS Khối phổ (Mass spectrometry)

MS/MS Khối phổ hai lần

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

S/N Tỷ số tín hiệu/nhiễu nền (Signal/Noise)

Spic Diện tích pic

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

TKTW Thần kinh trung ương

TPCN Thực phẩm chức năng

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV Cực tím (Ultra violet)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các nghiên cứu trên thế giới phân tích Chlorpheniramin trộn trái phép trong chế

phẩm đông dược……… 6

Bảng 1.2 So sánh giữa HPTLC và TLC……… 9

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu………12

Bảng 2.2 Thành phần và tỷ lệ của nền lỏng………13

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát hệ dung môi pha động……….18

Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống ……….20

Bảng 3.3 Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính……….23

Bảng 3.4 Kết quả thẩm định độ đúng, độ chính xác……… 25

Bảng 3.5 Kết quả thẩm định LOD, LOQ………26

Bảng 3.6 Kết quả định tính mẫu thực……….27

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 CTCT của Chlorpheniramin maleat 3

Hình 3.1 Khảo sát bước sóng định lượng 19

Hình 3.2 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu 21

Hình 3.3 Chồng phổ nền lỏng thêm chuẩn với mẫu chuẩn tại vị trí Chlorpheniramin 22

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa Spic với nồng độ C (µg/ml) của Chlorpheniramin với MeOH 23

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa Spic với nồng độ C (µg/ml) của Chlorpheniramin với dung dịch nền lỏng 24

Hình 3.1 Sắc ký đồ xác định LOD trên nền lỏng của Chlorpheniramin ở nồng độ 1.5 ppm……….26

Hình 3.7 : sắc ký đồ dạng vết 9 mẫu chế phẩm dạng lỏng thu thập được 27

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo CDC Mỹ, tỷ lệ người trên 18 tuổi tại Mỹ bị dị ứng theo mùa là 25,7% Tại Việt Nam, có khoảng 20% dân số mắc bệnh dị ứng, mày đay Do môi trường ô nhiễm, tỷ lệ người mắc bệnh này tăng lên dẫn đến nhu cầu cao sử dụng các loại thuốc, thực phẩm chức năng điều trị dị ứng, mẩn ngứa

Những năm gần đây, sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng (TPCN) có nguồn gốc đông dược thay thế cho các sản phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược đang là một xu thế phổ biến tại Việt Nam và trên thế giới Những sản phẩm này dược được ưa chuộng vì nhiều người tin rằng chúng hiệu quả và tương đối an toàn, ít tác dụng phụ hơn các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược

Tuy nhiên, các chế phẩm đông dược lại không được quản lý nghiêm ngặt và được bán tràn lan ở các cửa hàng đông y và cả trên các sàn thương mại điện tử Do đó nhiều cơ

sở đã cố tình trộn trái phép các thuốc tân dược vào để đánh lừa người sử dụng về tác dụng nhanh chóng của sản phẩm

Clorpheniramin maleat là thuốc dị ứng thuộc nhóm kháng Histamin H1 Thuốc này

đã và đang được trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược cả trong và ngoài nước Năm 1998, một nghiên cứu ở Mỹ chỉ ra rằng trong số 260 loại thuốc đông dược châu

Á đã được thu thập từ các cửa hàng bán lẻ thuốc thảo dược ở California, có 17 loại (7%) chứa tân dược không được khai báo Trong đó, Chlorpheniramin là 1 trong 4 loại tân dược không khai báo phổ biến nhất [14]

Năm 2019, nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Tuyền và cộng sự đã phát hiện được 7/8 chế phẩm đông dược dạng rắn bị trộn trái phép hoạt chất nhóm thuốc dị ứng Trong đó có

6 chế phẩm dương tính với Clorpheniramin Việc trộn trái phép thuốc hóa dược vào sản phẩm đông dược không chỉ gây nguy hiểm cho bệnh nhân, mà còn làm rối loạn thị trường dược phẩm, xâm phạm đến quyền lợi chính đáng của các nhà sản xuất uy tín

Với thực tế trên, việc phát hiện và xử lý kịp thời những trường hợp trộn trái phép Chlorpheniramin trong chế phẩm đông dược là hết sức cấp bách hiện nay để đảm bảo an toàn cho người sử dụng Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu phát hiện thuốc kháng histamin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng rắn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [6], sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) [6], sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC -MS/MS) [7] Trong đó HPTLC là kỹ thuật phân tích vượt trội so với các kỹ thuật phân tích khác nếu xét về tổng chi phí và thời gian phân tích

Do viên hoàn và viên nang là hai dạng bào chế phổ biến nhất cho các chế phẩm đông dược trên thị trường hiện nay, nên các nghiên cứu đã thực hiện chủ yếu tập trung xây dựng cho các chế phẩm dạng rắn này, mà chưa thực hiện xây dựng và thẩm định phương pháp trên nền chế phẩm dạng lỏng Do đó, nhằm cung cấp phương pháp định lượng Chlorpheniramin trên nền mẫu dạng lỏng và mở rộng ứng dụng trên các dạng bào chế chế

phẩm đông dược thu thập được trên thị trường, đề tài: “Xây dựng phương pháp phát hiện Clopheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng lỏng bằng HPTLC” được thực hiện với mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định Chlorpheniramin trộn trong chế phẩm đông dược dạng lỏng bằng phương pháp HPTLC

2 Ứng dụng phương pháp HPTLC để xác định Chlorpheniramin trộn lẫn chế phẩm đông dược dạng lỏng thu thập được trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

Chlorpheniramin maleat dẫn xuất từ alkylamin, là thuốc kháng histamin an thần

thuộc thế hệ thứ nhất [3]

Công thức [2]

CTPT: C16H19ClN2.C4H4O4 (M=390,9)

Hình 1.1 CTCT của Chlorpheniramin maleat

Tên khoa học: (3RS)-3-(4 clorophenyl)-N,N-dimethyl-3-(pyridin-2-yl)propan-1-amin

Chỉ định:

Điều trị triệu chứng của các bệnh dị ứng như: viêm mũi dị ứng, mẩn ngứa, mày đay, phù mạch, viêm màng tiếp hợp dị ứng Điều trị sốc phản vệ (điều trị bổ sung) [3]

Tác dụng không mong muốn (ADR): Với ADR thường gặp (ADR > 1/100) [3]

- Thần kinh: Ức chế hệ TKTW: Ngủ từ ngủ nhẹ đến ngủ sâu, mệt mỏi, chóng mặt, mất phối hợp động tác

- Tác dụng an thần trên gây nguy hiểm cho người sử dụng thuốc khi lái tàu, lái xe, làm việc trên cao, công việc cần sự tỉnh táo

- Nhức đầu, rối loạn tâm thần - vận động

- Tác dụng kháng muscarin: Khô miệng, đờm đặc, bí tiểu tiện, táo bón, nhìn mờ, tăng

trào ngược dạ dày

Liều dùng:

- Liều lượng thay đổi, phụ thuộc vào đáp ứng và dung nạp của từng bệnh nhân

- Với chỉ định điều trị viêm mũi dị ứng theo mùa hoặc quanh năm, mày đay: Người lớn:

4 mg cách 4 - 6 giờ/lần Tối đa: 24 mg/ngày (người cao tuổi tối đa 12mg/ngày) [3]

Dạng bào chế

- Viên nén: 4 mg, 8 mg, 12 mg; Viên nén tác dụng kéo dài: 8 mg, 12 mg

- Nang: 4 mg, 12 mg Nang tác dụng kéo dài: 8 mg, 12 mg

Theo WHO, thuốc thảo dược chiếm khoảng 20% tổng thị trường thuốc hiện tại và

đã có hơn 1,5 tỷ người tiêu thụ thuốc thảo dược trên toàn thế giới [19], [33] Ở các nước đang phát triển, có đến 80% người dân vẫn ưa thích sử dụng thuốc cổ truyền cho sức khỏe của họ [19] Lý do chính của sự bùng nổ này là niềm tin rằng thuốc thảo dược là vô hại và không có tác dụng phụ so với thuốc hóa dược tổng hợp do chúng nguồn gốc “tự nhiên” [11], [19]

Gần đây, đã có báo cáo chỉ ra rằng những loại thuốc thảo dược được phát hiện pha trộn với các loại thuốc tổng hợp không được khai báo trong đó có Chlorpheniramin [19] Năm 1998, một nghiên cứu ở Mỹ chỉ ra rằng trong số 260 loại thuốc đông dược châu Á đã được thu thập từ các cửa hàng bán lẻ thảo dược ở California, có 17 loại (7%) chứa tân dược không được khai báo Trong đó, Chlorpheniramin là 1 trong 4 loại tân dược không khai báo phổ biến nhất [14]

Năm 2015, nhân sâm “She Lian Wan” được quảng cáo là có tác dụng làm giảm đau khớp, viêm khớp và gout, hiện đã bị FDA cấm vì nghiên cứu xác nhận rằng nó có chứa Dexamethason (một corticosteroid) và Chlorpheniramin (thuốc kháng histamin thường sử dụng cho dị ứng) Dexamethason cũng được biết đến làm giảm khả năng miễn dịch, tăng lượng đường trong máu và gây ra các biến chứng về cơ và tâm thần [14]

Năm 2015, sản phẩm “Jianbu Huqian Wan” cũng được công bố có khả năng điều trị đau khớp và sau khi kiểm tra đã phát hiện có chứa Dexamethason, Chlorpheniramin, và Furosemid Chlorpheniramin là thuốc kháng histamin có thể gây buồn ngủ Furosemid là một hoạt chất lợi tiểu mạnh có thể gây mất nước và mất cân bằng điện giải, có thể dẫn đến động kinh, hư thận, các vấn đề về tiêu hóa và hôn mê [14]

Năm 2015, sản phẩm “Saurean Fong Sep Lin” được quảng cáo có khả năng điều trị đau lưng và chấn thương Sau khi kiểm tra, phát hiện thấy người ta đã trộn thêm với Dexamethason và Cyproheptadin Trong đó, Cyproheptadin là thuốc kháng histamin có tác dụng phụ là gây buồn ngủ [14]

Trộn trái phép chất tân dược vào chế phẩm đông dược nhằm ngụy tạo tác dụng không chỉ gây nguy hiểm cho bệnh nhân (do tác dụng phụ, quá liều, tương tác thuốc - thảo dược), mà còn làm rối loạn thị trường dược phẩm, xâm phạm đến quyền lợi chính đáng của các nhà sản xuất uy tín [19], [20] Do đó, việc trộn trái phép thuốc hóa dược vào sản phẩm đông dược đang là một vấn đề toàn cầu và đặt ra thách thức đến các nhà phân tích [17], [18]

Vì vậy, cần thiết phát triển các kỹ thuật phân tích nhằm sàng lọc chính xác, nhanh chóng, hiệu quả các chất trong thực phẩm chức năng đặc biệt thực phẩm chức năng nguồn gốc từ thực vật [32]

Hiện nay, một số phương pháp phân tích đã được phát triển để sàng lọc và phát hiện chất hóa học trong các sản phẩm dược liệu, chẳng hạn như sắc ký lớp mỏng, được kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt [16]; sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10], LC-MS/MS [13], sắc ký khí GC [25], …Gần đây, phép đo mật độ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) đã được sử dụng để phát hiện các loại thuốc bất hợp pháp này [12]

Nhóm thuốc kháng histamin H1 đặc biệt là Chlorpheniramin là một trong những chất thường xuyên bị trộn vào các chế phẩm đông dược vì tác dụng chống dị ứng và tác dụng an thần của nó

Đã có nhiều nghiên cứu phát hiện Chlorpheniramin trộn trái phép trên thế giới được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các nghiên cứu trên thế giới phân tích Chlorpheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

Năm, tác giả Phương pháp, kỹ

thuật phân tích Kết quả

spectroscopy (TOCSY))

Phát hiện 27/28 lô thuốc thảo dược chữa ho và hen suyễn chứa chất hóa dược trái phép, có 11

lô dương tính với Clopheniramin Maleat [22]

2016 tại Trung

Quốc

YE Lin-hu và

cộng sự

LC - MS/MS Khảo sát 7 chất kháng histamin H1 trên 9 loại

chế phẩm thảo dược, kết quả có 4 mẫu chế phẩm dương tính với các kháng histamin H1 [34]

Xác định được 12 loại thuốc hóa học được thêm vào trái phép trong trà thảo dược (trà trị ho, giải cảm,…) trong đó có Chlorpheniramin Maleat [32]

chromatography)

Phát hiện nhanh Chlorphenamin có trong 4/12 loại thuốc thảo dược trong nghiên cứu với các nồng độ từ 1,70 - 3,70mg/g trong đó có chất lỏng uống Shuanlian [20]

1.2.2 Tại Việt Nam

Với đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm và tình trạng ô nhiễm môi trường ngày càng gia tăng ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc các bệnh dị ứng ngày càng gia tăng Nhóm thuốc kháng histamin H1 có giá rẻ, tác dụng nhanh, mạnh ở mức liều thấp, hay được chỉ định cho những bệnh này Bên cạnh sử dụng thuốc hóa dược, người bị dị ứng hay tìm và

sử dụng chế phẩm đông dược vì tin rằng các chế phẩm này an toàn và ít tác dụng phụ [4] Nhất là trong đại dịch COVID 19 vừa rồi, gần một nửa số người được hỏi cho biết đã sử dụng thuốc thảo dược cho các bệnh thông thường trong đại dịch này [24]

Tại Việt Nam, đã có 1 số nghiên cứu phát hiện chất kháng Histamin trong đó có Chlorpheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược

Năm 2019, Phạm Thị Thanh Tuyền cùng cộng sự đã xây dựng phương pháp MS/MS phát hiện được 7/8 chế phẩm đông dược dạng rắn bị trộn trái phép một số hoạt chất nhóm thuốc dị ứng Trong đó có 6 chế phẩm dương tính với Chlorpheniramin (với mức 0,96 mg/liều - 3,32 mg/liều) [7]

LC-Năm 2020, Trần Thị Lan cùng cộng sự đã xây dựng phương pháp HPTLC và HPLC xác định thuốc kháng histamin H1 trộn trong chế phẩm đông dược dạng rắn Nghiên cứu

đã phát hiện được trong số các thuốc kháng Histamin, Chlorpheniramin được trộn với tỷ

Pha động là hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần, rất thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế, tùy thuộc vào tính chất pha tĩnh và dung môi làm pha động Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2 - 3 dung môi khác nhau Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác

nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quả là chúng được tách riêng, có vị trí khác nhau trên bản mỏng [1], [2]

Một số gợi ý khi lựa chọn pha động TLC:

- Dung môi cần có độ tinh khiết cao

- Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,15 – 0,85 đạt độ phân giải cực trị [28]

- Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động

sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ

Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách di chuyển của pha động

Rf = a / bTrong đó:

a: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

b: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf: có giá trị dao động giữa 0 và 1

Độ phân giải khi tách bằng TLC phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm loại pha tĩnh, thành phần pha động, độ dày lớp pha tĩnh, loại chất kết dính, độ tinh khiết của dung môi, kích thước buồng triển khai sắc ký, độ bão hòa của buồng triển khai sắc ký, lượng mẫu sắc ký, kích thước của điểm/dải chấm, mức dung môi trong buồng, độ ẩm tương đối, nhiệt

độ, khoảng dung môi khai triển sắc ký và phương thức sắc ký

Ưu điểm:

- Thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh

- Phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm

TLC là kỹ thuật được sử dụng trong nhiều lĩnh vực hóa học, dược phẩm, hóa sinh, lâm sàng vào 3 mục đích: Định tính, Định lượng, thử tinh khiết

1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

HPTLC là một hình thức hiện đại của TLC Pha tĩnh trong HPTLC là những hạt chất hấp phụ kích thước nhỏ, đồng đều nên tăng cường khả năng tách Hơn nữa, HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp, đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy và độ lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra Đồng thời, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó có độ lặp lại cao

Các bước của quá trình tiêm mẫu, khai triển, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích

Quá trình tiêm mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu tiêm, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa

Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy scan và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng

Một vài ưu điểm của phương pháp HPTLC so với phương pháp TLC được thể hiện qua bảng 1.2

Bảng 1.2 So sánh giữa HPTLC và TLC [23], [28]

Pha tĩnh Silica Gel - pha thuận

C8 and C18 - pha đảo

Silica Gel, Alumina, Kiesulguhr

Hiệu lực tách Cao (do kích thước hạt nhỏ hơn) Thấp hơn

Thời gian phân

tích

Dụng cụ tiêm

mẫu

Ưu điểm của HPTLC:

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng, do máy quét Scanner có thể ghi lại phổ hấp thụ của chất, có thể chồng phổ của chất cần phân tích với phổ chất chuẩn nên định tính đặc hiệu hơn so với TLC

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

và được chấm thành “dải” với độ rộng có thể điều chỉnh

- Thiết bị khai triển tự động (ADC2): Buồng 2 máng và giấy bão hòa dung môi Bộ phận kiểm soát độ ẩm và hệ thống kín của thiết bị giúp kiểm soát chặt chẽ độ ẩm, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Giấy bão hòa dung môi để tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình (nhất là đối với dung môi có độ nhớt cao, khó bay hơi) Bản mỏng cũng sẽ được sấy trước và sau khi khai triển trong thiết bị

- Thiết bị thu nhận và xử lý kết quả (Scanner): Máy scanner được kết nối với hệ thống phần mềm máy tính, có hệ thống đèn với bước sóng từ 200 – 800 nm, tốc độ quét là 20

mm/s Máy quét không chỉ ghi lại sự hiện diện của các vết, nó cũng có thể định lượng cường độ ánh sáng phản xạ từ các vết trên bên mỏng, do đó có thể giúp phân tích định tính

và định lượng các vết trên bản mỏng [33]

Các bước cơ bản: [1], [28], [30]

- Lựa chọn pha tĩnh: Khá đơn giản, phổ biến là bản silicagel bán sẵn trên thị trường được

sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu

- Lựa chọn pha động và tối ưu hóa

- Chuẩn bị mẫu và đưa mẫu phân tích lên bản mỏng

- Khai triển sắc ký (tách)

- Phát hiện các vết trên sắc ký đồ (bằng cách phun thuốc thử hiện màu, soi dưới đèn UV, hoặc dùng densitometer): Huỳnh quang F254 được kích thích với UV bước sóng 254

nm và phát ra huỳnh quang màu xanh lá cây Hợp chất hấp thụ bức xạ ở bước sóng 254

nm làm giảm sự phát xạ này trên bản mỏng, và một vết màu tối trên nền màu xanh lá cây được quan sát thấy ở nơi có chất phân tích

- Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm

Ứng dụng

Với nhiều ưu điểm nổi bật như trên, TLC và HPTLC được ứng dụng rộng rãi để phân tích trong ngành dược phẩm, hóa học lâm sàng, hóa học pháp y, hóa sinh, mỹ phẩm, phân tích thực phẩm, phân tích môi trường, thực phẩm chức năng thảo dược, thuốc đông y…[30]

HPTLC là phương pháp sàng lọc giúp tiết kiệm được thời gian, chi phí Do đó HPTLC có thể thay thế tiềm năng những phương pháp khác tốn kém hơn [31]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Hóa chất, chất chuẩn

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc

1 Clorpheniramin maleat Chuẩn đối chiếu

thứ cấp

Chuẩn Viện kiểm nghiệm thuốc TW HL: 100,0%, SKS: C0522032

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) của hãng CAMAG, CAT No 027.6200 (Thụy Sỹ) tại Khoa Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm thuốc gồm:

+ Bộ phận chấm bán tự động Linomat 5

+ Bộ phận khai triển tự động ADC2

+ Máy scan bản mỏng TLC Scanner 4

+ Buồng soi UV 254 nm và 366 nm

+ Phần mềm điều khiển WinCATs và quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc ký, xử lí dữ liệu trên máy tính

- Bản mỏng TLC và HPTLC silica gel 60 F254 của Merck (Đức)

- Cân phân tích XPE105 Mettler Toledo (d=0,01mg) (Thụy Sĩ) tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

- Cân phân tích Sartorius TE 214S (d=0,1 mg) (Đức) tại Viện Kiểm nghiệm an toàn

vệ sinh thực phẩm Quốc gia

- Máy ly tâm HERMLE Z306 (Đức) - Khoa Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm thuốc

- Máy siêu âm Helma (Đức) - Khoa Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm thuốc

- Máy lắc xoáy Labinco BV L46 (Hà Lan) - Khoa Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm thuốc

- Tủ sấy DAIHAN WOF – 105 (Hàn Quốc) - Khoa Hóa Phân Tích – Kiểm nghiệm thuốc

- Màng lọc 0,45µm

- Các dụng cụ khác: bình định mức, pipet, bình nón, ống ly tâm, vial,…

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: chất phân tích là Chlorpheniramin

- Mẫu thử: 9 mẫu thuốc, TPCN dạng lỏng có nguồn gốc đông dược lưu hành trên thị trường

Việt Nam được thu thập theo:

- Công dụng được công bố của sản phẩm: điều trị, hoặc hỗ trợ điều trị viêm xoang, viêm mũi dị ứng, mề đay, mẩn ngứa, an thần

- Cách thức thu thập: tại các cửa hàng, hiệu thuốc đông y, các trang thương mại điện

tử, mẫu gửi

- Dạng bào chế: dung dịch nhỏ mũi, dung dịch xịt, dầu xoa,…

-Mẫu nền: nền mẫu dạng lỏng dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được

xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đã công

bố, là cao lỏng chiết từ 18 dược liệu có thành phần ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần và tỷ lệ của nền lỏng

STT Thành phần Khối lượng (g) STT Thành phần Khối lượng (g)

6 Chi tử 12 15 Ké đầu ngựa 8

- Mẫu tự tạo: Mẫu nền thêm chuẩn Chlorpheniramine với tỷ lệ nhất định

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện phân tích: Khảo sát pha động, bước sóng định lượng, quá trình xử

lý mẫu

- Thẩm định phương pháp:

+ Độ phù hợp hệ thống

+ Độ đặc hiệu

+ Khoảng tuyến tinh

+ Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)

+ Độ đúng và độ chính xác

- Ứng dụng phương pháp trên các mẫu đã thu thập được

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.1.1 Khảo sát các điều kiện phân tích

- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254, kích thước 10 x 10cm, 20 x 10cm được hoạt hóa 110ºC trong 30 phút

- Pha động: Dựa vào các nghiên cứu đã công bố, khảo sát các hệ pha động sau:

+ Hệ 1: Cloroform : Methanol (97:3) [15]

+ Hệ 2: Ethylacetat : Methanol : Ammoniac (8:2:0,5) [26]

+ Hệ 3: Ethylacetat : Methanol : Ammoniac (85:10:5)

+ Hệ 4: Cyclohexan : Aceton : Triethylamin (8:2:0,5) [6]

Lựa chọn pha động cho vết sắc ký gọn, không bị kéo đuôi và có Rf của Chlorpheniramin