Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất kháng histamin h1 cấm sử dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng lc msms khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

Nhưng hiện nay đã có nhiều báo cáo phát hiện trong một số TPBVSK được cho thêm vào các hóa chất tổng hợp có dược tính nhằm ngụy biện tác dụng hoặc tăng cường mạnh tác dụng hỗ trợ điều tr

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHẤT KHÁNG HISTAMIN H1 CẤM SỬ DỤNG TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

Mã sinh viên: 1801645

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHẤT KHÁNG HISTAMIN H1 CẤM SỬ DỤNG TRONG THỰC PHẨM

1 Bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc

2 Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia

HÀ NỘI -2023

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Thanh Hà và TS Đào Thị Cẩm Minh đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Ngân Bình cũng như các thầy, cô giáo tại Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, các anh/chị tại Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đặc biệt là Th.s Mạc Thị Thanh Hoa, DS Nguyễn Quang Hùng đã đồng hành và hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện

đề tài này

Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc Trường Đại học Dược Hà Nội và Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận

Em xin được cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí thu thập mẫu thực từ đề tài Khoa học và Công nghệ trực thuộc Bộ Giáo dục và Đào tạo, mã số đề tài 104.04-2020.29 do TS Đào Thị Cẩm Minh chủ trì Em xin cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Mây và sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh đã hỗ trợ trong quá trình thu thập các mẫu thực

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người luôn bên cạnh ủng hộ

và động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Trong quá trình thực hiện, dù cố gắng hết sức nhưng vẫn không tránh khỏi nhiều thiếu sót, kính mong nhận được những chỉ bảo, đánh giá từ quý thầy cô và mọi người

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 23 tháng 5 năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Phương Thảo

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT a DANH MỤC CÁC BẢNG b DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ c

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3

1.1.1 Nhóm thuốc kháng Histamin H1 3

1.1.2 Một số dược liệu và sản phẩm TPBVSK hỗ trợ điều trị dị ứng, giải độc 5

1.1.3 Quy định hiện hành 6

1.2 THỰC TRẠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 7

1.2.1 Trên thế giới 7

1.2.2 Tại Việt Nam 8

1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS 10

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.3.2 Khối phổ (MS) 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15

2.1.3 Dung môi, hoá chất 15

2.1.4 Chất chuẩn 15

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.3.1 Xây dựng và tối ưu hoá phương pháp 16

2.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 17

2.3.3 Phát hiện trộn trái phép Cinnarizin, Chlorpheniramin, Cyproheptadin trong một số thực phẩm bảo vệ sức khoẻ 18

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VA BÀN LUẬN 20

3.1 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP 20

3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS 20

3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 22

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu 22

3.2 THẨM ĐỊNH CỦA PHƯƠNG PHÁP 24

3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 24

3.2.2 Độ phù hợp hệ thống 25

3.2.3 Độ đặc hiệu 26

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) 30

3.2.5 Đường chuẩn 31

3.2.6 Độ đúng và độ chính xác 31

3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MẪU THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE 34

3.4 BÀN LUẬN 37

3.4.1 Về nền mẫu 37

3.4.2 Về phương pháp phân tích 38

3.4.3 Về phương pháp xử lý mẫu 38

3.4.4 Về thẩm định phương pháp phân tích 39

3.4.5 Về ứng dụng trên mẫu TPBVSK 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

Kết luận 41

Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO: i

Phụ lục 1 Khối phổ của các chất ở điều kiện lựa chọn iii

Phụ lục 2 Đồ thị đường chuẩn của các chất trong nền mẫu lỏng và nền mẫu rắn iv

Phụ lục 5: Danh sách 22 mẫu TPBVSK thu thập viii Phụ lục 6: Sắc kí đồ các mẫu TPBVSK dương tính ix

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chemists

Hiệp hội các nhà hóa học phân

tích

b

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng 6

Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định các thuốc kháng Histamin H1 9

Bảng 2.1 Thành phần và tỷ lệ các dược liệu của nền mẫu 14

Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ 20

Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích 21

Bảng 3.3 Chương trình gradient chạy sắc ký 22

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nền mẫu 23

Bảng 3.5 Quy trình pha dãy chuẩn 25

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS (n=6) 25

Bảng 3.7 Tỷ lệ cường độ tín hiệu của ion định tính/định lượng các chất phân tích 27

Bảng 3.8 Giá trị LOD và LOQ của các chất phân tích 30

Bảng 3.9 Phương trình đường chuẩn của các chất phân tích 31

Bảng 3.10 Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày (n=7) 32

Bảng 3.11 Độ đúng và độ chính xác khác ngày (n=7) 33

Bảng 3.12 Độ tái lập của các chất phân tích (n=14) 34

Bảng 3.13 Kết quả định tính các chất phân tích trên 22 mẫu TPBVSK 35

Bảng 3.14 Kết quả xác định các mẫu TPBVSK dương tính 36

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá trên mẫu TPBVSK dương tính 37

DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Chlorpheniramin 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Cinnarizin 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Cyproheptadin 5

Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 11

Hình 1.5 Sơ đồ hệ thống HPLC 11

Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực 12

Hình 3.1 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của các chất phân tích trên nền mẫu lỏng 28

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu cúa các chất phân tích trên nền mẫu rắn 29

Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu trắng nền lỏng thêm chuẩn tại điểm LOD vi

Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng nền rắn thêm chuẩn tại điểm LOD vii

a) Sắc ký đồ của mẫu HA29 cho kết quả dương tính với cả 3 chất CIN, CLO, CYP ix

b) Sắc ký đồ của mẫu VNA19 cho kết quả dương tính với CLO ix

c) Sắc ký đồ của mẫu CLA24 cho kết quả dương tính với CLO x

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu chăm sóc bảo vệ sức khỏe của con người ngày càng nâng cao Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) ngày càng được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới, Việt Nam cũng nằm trong xu hướng đó Cùng với việc phát triển của các trang thương mại điện tử, các mạng xã hội trên internet, việc mua bán TPBVSK online xuất hiện ngày càng nhiều Điều này trở thành một vấn đề lớn đến sức khỏe cộng đồng nếu như việc kiểm tra, quản lý các TPBVSK không diễn ra một cách chặt chẽ

Hầu hết các quan niệm cho rằng TPBVSK do có nguồn gốc từ thảo dược, dẫn xuất tự nhiên nên sẽ an toàn Nhưng hiện nay đã có nhiều báo cáo phát hiện trong một số TPBVSK được cho thêm vào các hóa chất tổng hợp có dược tính nhằm ngụy biện tác dụng hoặc tăng cường mạnh tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý Các thuốc hóa dược được tìm thấy điển hình là thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid….[15] Vấn đề này rất nguy hiểm cho người tiêu dùng, nhất là đối với những người có sẵn bệnh lý nền như bệnh tim mạch hoặc người cao tuổi vô tình sử dụng gây ra những tác dụng phụ trầm trọng

Tại Việt Nam, vấn đề trộn trái phép các chất nhóm kháng Histamin H1 cũng đã được quan tâm Một số phương pháp phân tích phát hiện các chất thuộc nhóm này trong các chế phẩm TPBVSK, chế phẩm đông dược đã được công bố như sử dụng phương pháp phân tích LC-MS/MS[20], phương pháp HPLC-DAD [2] , phương pháp TLC [12]… Trong đó phương pháp LC-MS/MS là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để khẳng định định tính việc trộn trái phép tân dược vào các TPBVSK

Năm 2020, Trần Thị Lan đã xây dựng phương pháp HPLC và HPTLC để phát hiện 5 chất thuộc nhóm kháng Histamin H1 bao gồm ba chất có trong Danh mục chất cấm trong Thông

tư 10/2021/TT-BYT Tuy nhiên hai phương pháp trên có độ nhạy và độ đặc hiệu chưa cao,

do đó vẫn xảy ra trường hợp âm tính giả/dương tính giả Phương pháp LC-MS/MS là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để khẳng định định tính việc trộn trái phép tân dược vào các TPBVSK Các chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng trên TPBVSK theo Thông tư số 10/2021/TT-BYT được ban hành ngày 30/06/2021 bao gồm Chlorpheniramin, Cyproheptadin và Cinnarizin

Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS kết hợp khả năng phân tách chất của sắc ký lỏng (LC)

và khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ (MS); phương pháp cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp trong phân tích trên nền mẫu phức tạp như chế phẩm TPBVSK và để mở rộng đối tượng nghiên cứu góp phần phục vụ cho công tác kiểm tra, quản lý việc trộn các chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng trên TPBVSK trên thị trường, chúng tôi tiến hành

đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất kháng Histamin H1 cấm sử dụng trong Thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC-MS/MS” Với mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời Chlorpheniramin, Cinnarizin và Cyproheptadin trộn trái phép trong TPBVSK dạng lỏng và dạng rắn bằng LC-MS/MS

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định các dược chất trên trộn trái phép trong một số TPBVSK đang lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Nhóm thuốc kháng Histamin H1

Các thuốc kháng Histamin H1 thường là lựa chọn hàng đầu để điều trị các trường hợp dị ứng và thường mang lại hiệu quả tốt Một số thuốc kháng Histamin H1 còn được sử dụng với mục đích chống say tàu xe, máy bay; chống nôn cho bệnh nhân sau phẫu thuật, phụ nữ thai nghén hoặc tăng cảm giác ngon miệng…

Thuốc kháng Histamin H1 có 2 thế hệ Thuốc kháng Histamin thế hệ 1 như Diphenhydramine, Promethazine, Chlorpheniramin, … có tác dụng ức chế thần kinh trung ương gây an thần, tuy nhiên mức độ tác dụng không giống nhau giữa các thuốc và các cá thể Các thuốc kháng Histamin H1 thế hệ 2 như Loratadin, Cetirizin, … hầu như không có tác dụng này.[8]

Tác dụng không mong muốn: Tác dụng không mong muốn hay gặp nhất của thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 là gây ngủ, an thần và kháng cholinergic Tác dụng an thần trên gây nguy hiểm cho người sử dụng thuốc khi lái tàu, xe, làm việc trên cao, công việc cần sự tỉnh táo Các kháng histamin H1 thế hệ 1 làm tăng tác dụng của rượu và các thuốc ức chế thần kinh trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi, mất sự phối hợp nhịp nhàng, ù tai, bồn chồn, tăng co giật (động kinh) ở trẻ em Ở cùng liều điều trị, các thuốc thế hệ 2 ít gây tác dụng không mong muốn hơn Các kháng histamin H1 thế hệ 1 còn có tác dụng kháng cholinergic nên gây khô miệng, họng và mũi Ngoài ra còn gây căng ngực, đau đầu Trên tiêu hóa, gây

ăn kém ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy…

1.1.1.1 Chlorpheniramin

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Chlorpheniramin

cloroform, nước và methanol; ít tan trong ether và benzene.[16]

 Chỉ định: Điều trị triệu chứng: Viêm mũi dị ứng mùa và quanh năm, mày đay Điều trị sốc phản vệ (điều trị bổ sung).[7]

+ Người lớn: Clorpheniramin maleat: Uống: 4 mg, cách 4 - 6 giờ/lần Tối đa: 24 mg/ngày (người cao tuổi tối đa 12 mg/ngày)

+ Trẻ em: Uống: 1 tháng tuổi - 2 tuổi: 1 mg, 2 lần/ngày; 2 - 6 tuổi: 1 mg cách 4 - 6 giờ/lần, tối đa 6 mg/ngày; 6 - 12 tuổi: 2 mg, cách 4 - 6 giờ/lần, tối đa: 12 mg/ngày; 12 - 18 tuổi:

4 mg cách 4 - 6 giờ/ lần, tối đa 24 mg/ngày

1.1.1.2 Cinnarizin

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Cinnarizin

trong methylen clorid, tan trong acetone khó tan trong ethanol 96 % và methanol.[6]

bệnh Ménière Rối loạn mạch não và mạch ngoại vi khác.[7]

giảm huyết áp khi dùng liều cao.[7]

+ Đối với chỉ định rối loạn mạch não: Liều 75mg, ngày 1 lần

+ Đối với chỉ định rối loạn mạch ngoại vi: Liều 75mg/lần, 2-3 lần/ngày.[7]

1.1.1.3 Cyproheptadin

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Cyproheptadin

methyl-4-(2-tricyclo[9.43,8]pentadeca-1(15),3,5,7,9,11,13-heptaenylidene)piperidine

methanol, hơi tan trong ethanol 96%.[6]

+ Viêm mũi dị ứng; dị ứng nhẹ, đơn thuần ở bệnh mày đay, phù mạch, da nổi quầng + Chủ yếu điều trị ngứa do các dị ứng: Tại chỗ do côn trùng cắn, do dị ứng vật lý, do thuốc, huyết thanh ngứa do viêm da dị ứng, ngứa thủy đậu

+ Phòng và chống chứng đau nửa đầu

+ Kích thích ăn ngon ở người gầy yếu, chán ăn, thần kinh dễ bị kích thích.[9]

Với những tác dụng và chỉ định như trên, mục đích của việc trộn các chất nhóm kháng Histamin H1 vào TPBVSK sẽ nhằm tăng cường hoặc ngụy tạo tác dụng chống dị ứng trong các trường hợp viêm mũi dị ứng, viêm da dị ứng, nổi mày đay, giải độc gan, giảm ngứa, giúp an thần, gây ngủ, tạo cảm giác ăn ngon miệng… chủ yếu vẫn là hỗ trợ ngăn chặn các phản ứng dị ứng

1.1.2 Một số dược liệu và sản phẩm TPBVSK hỗ trợ điều trị dị ứng, giải độc

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều TPBVSK có số đăng ký có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, giải độc gan Chúng đa dạng về thành phần các loại dược liệu cũng như dạng bào chế (viên hoàn, thuốc rắn, viên nang cứng, viên nén, dung dịch nhỏ/xịt mũi) Một số vị dược liệu và TPBVSK có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa theo “Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế ban hành” do bộ trưởng Bộ y tế ban hành ngày 31/10/2016 được trình bày trong Bảng 1.1 dưới đây:

Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng

1.1.3 Quy định hiện hành

Ngày 30/06/2021, Bộ Y tế ban hành Thông tư số 10/2021/TT-BYT về Quy định Danh mục các chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe Trong Danh mục các chất cấm sử dụng, có 3 chất thuộc nhóm kháng Histamin H1 gồm Chlorpheniramin, Cinnarizin và Cyproheptadin

1.2 THỰC TRẠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1.2.1 Trên thế giới

Trong những năm gần đây, việc tiêu thụ các TPBVSK, đặc biệt là những sản phẩm nguyên liệu từ dược liệu, đã tăng lên do quan niệm rằng chúng là sản phẩm tự nhiên không gây nguy hại cho sức khỏe con người Tại Liên minh Châu Âu và Hoa Kỳ, các TPBVSK được coi là thực phẩm/loại thực phẩm đặc biệt, do đó không có bất kỳ đánh giá an toàn bắt buộc nào trước khi thương mại hóa Trong số các vấn đề có thể ảnh hưởng đến an toàn, việc trộn lẫn trái phép các dược chất hoặc các chất tương tự có dược tính là mối quan tâm lớn vì một

số nhà sản xuất vô đạo đức có thể gian lận nhằm tạo ra hiệu quả nhanh chóng và tăng doanh

số cho các sản phẩm của họ Bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau như DAD, LC-MS/MS, GC-MS, UHPLC, NMR,… và khảo sát trên nhiều dạng bào chế như viên nang cứng, viên nang mềm, viên nén, rắn, cốm, dạng lỏng, túi trà, rắn trà…, với các điều kiện xử lý thích hợp, các dược chất được phát hiện trộn trái phép trong TPBVSK trong báo cáo thường là các chất có tác dụng giảm cân, tăng cơ/hiệu suất trong thể thao và các chất tăng cường hoạt động tình dục.[18]

HPLC-Một nghiên cứu khác đã thực nghiệm trên các các thuốc cổ truyền dược liệu tại nhiều quốc gia như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia… bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau như LC-MS/MS, HPLC, GC-MS, HPTLC,… cho ta thấy thực trạng việc trộn không khai báo các tân dược vào thuốc cổ truyền, TPBVSK đáng báo động Nhiều loại tân dược đã được phát hiện bao gồm thuốc hạ đường huyết (thuốc chống tiểu đường), thuốc ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống tăng huyết áp, glucocorticosteroid, chất kích thích, steroid…[11]

Nhóm thuốc kháng Histamin H1 cũng được cho thấy là hay bị trộn vào các TPBVSK vì tác dụng chống dị ứng trong nhiều trường hợp, tác dụng an thần và kích thích ăn ngon miệng, tùy từng loại

Trong bài báo về thực trạng việc trộn các dược chất tổng hợp vào các bài thuốc cổ truyền Trung Quốc tại Đài Loan (1997), tổng cộng có 2.609 mẫu được thu thập bởi tám bệnh viện

đa khoa lớn và được phát hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Kết quả cho thấy: trung bình 23,7% (n = 618) các mẫu được thu thập từ tám bệnh viện phát hiện việc trộn tân dược

04 mẫu có chỉ định điều trị thấp khớp hoặc chống viêm chứa sáu loại tân dược được trộn vào khác nhau Hơn một nửa (52,8%) các loại thuốc cổ truyền Trung Quốc bị pha trộn có chứa từ hai loại tân dược trở lên.[17] Các tân dược được tìm thấy thường thuộc nhóm giảm đau, chống viêm NSAIDs, nhóm glucocorticoids, các thuốc kháng Histamin H1, thuốc an thần gây ngủ… Trong những tân dược bị phát hiện trộn trái phép, Chlorpheniramin maleat xếp thứ hạng 14 trên tổng 25 dược chất tổng hợp, có mặt trong 16 mẫu thử nghiệm [17]

Tại Trung Quốc, nhóm nghiên cứu của YE Lin-hu sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát 7 chất thuộc nhóm kháng Histamin bao gồm loratadin, diphenhydramin hydrochlorid, cyproheptadin hydrochlorid, cetirizin hydrochlorid, promethazin hydrochlorid, mizolastin,

và chlorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm y học cổ truyền, kết quả phát hiện 4/9 mẫu

có sự trộn lẫn các chất phân tích nhóm kháng Histamin trên.[21]

Ở Hàn Quốc, Jung-Ah Do, Jung Yeon Kim và cộng sự đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời 20 chất nhóm kháng Histamin trong thực phẩm bổ sung bằng LC-MS/MS để khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm và đã phát hiện 1 mẫu chứa diphenhydramin.[14]

1.2.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam hiện nay, việc sử dụng TPBVSK ngày càng trở nên phổ biến, đặc biệt nhu cầu sử dụng TPBVSK có chứa các loại thảo dược có tác dụng chăm sóc, hỗ trợ điều trị bệnh lý ngày càng tăng Các sản phẩm TPBVSK có mặt ngày càng nhiều và được bán qua nhiều kênh khác nhau như trong hiệu thuốc, cửa hàng bán sản phẩm chăm sóc sức khỏe, siêu thị, qua mạng internet, trang thương mại điện tử… nên rất khó kiểm soát, có nguy cơ cao về việc gây ra những tác dụng không mong muốn

Năm 2022, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Trọng Linh đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS

để tầm soát các chất hóa dược tổng hợp thuộc nhóm ức chế PDE5, kháng viêm, giảm đau, giảm cân trên 80 mẫu TPBVSK Kết quả phát hiện 10 mẫu dương tính nhóm tăng cường sinh lý nam, 1 mẫu dương tính nhóm kháng viêm, và 7 mẫu dương tính với Sibutramin – nhóm giảm cân

Với nhóm thuốc kháng Histamin H1, năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã kiểm tra mẫu “Thuốc bổ Tỳ‟ của cơ sở Phước Lợi Đường tại Đà Nẵng với công dụng kích thích ngon miệng đã phát hiện có trộn dexamethason và cyproheptadin

Một số phương pháp xác định các thuốc kháng histamin trộn trong TPBVSK đã tham khảo được tổng hợp trong bảng sau:

Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định các thuốc kháng Histamin H1

Pha động: 0,1% acid formic trong nước (Kênh A) và 0,1% acid formic trong acetonitril (Kênh B) Chương trình gradient:

Kênh B được tăng tuyến tính từ 5% lên 95% trong 0,1 phút, duy trì ở mức 95% trong thêm 4 phút, và sau đó giảm xuống 5%

trong 4 phút để cân bằng lại

Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút

Chiết mẫu bằng methanol 80%, siêu

mm, Waters) Pha động: Acid formic 0,1% trong nước và acid formic 0,1% trong acetonitril

Chương trình gradient: 0 phút , 5% B; 1.0 phút, 5%

B; 7.0 phút, 100% B; 8.0 phút, 100% B; 8.1 phút, 5% B; và 10.0 phút, 5% B Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút

Mẫu được đồng nhất hóa, 1g mẫu được chiết bằng 20ml Methanol, siêu âm 10 phút, và lọc qua màng 0,22

µm

[14]

60 GF254, hệ dung môi khai triển: Cloroform – methanol – acid acetic – amoniac (9,5 : 0,5 : 0,2 : 0,05), bước sóng phát hiện:

254 nm và thể tích chấm : 2

µl

Đồng nhất mẫu, cân mẫu bằng 1/2 liều Thêm 20,00ml methanol, lắc xoáy

5 phút, siêu âm 10 phút, Ly tâm 6000 vòng/phút Cô đặc

10 lần và lọc qua màng lọc 0,45 µm

Pha động gồm acid formic 0,1% trong nước và

acetonitril Chế độ gradient 3: 0 → 7,5 phút: 15 → 75 % B; 7,5 → 8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5

→ 12 phút: 15 % B

Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút Thời gian phân tích: 12 phút

Đồng nhất mẫu, cân mẫu bằng 1/10 liều Thêm 25,00ml methanol, lắc xoáy

5 phút, siêu âm 10 phút, Ly tâm 6000 vòng/phút Pha loãng 50 lần và lọc qua màng lọc 0,22

a) Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động là chất lỏng dưới áp suất cao Pha tĩnh bản chất là chất rắn ở dạng tiểu phân hoặc chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với nhóm chức hữu cơ Pha động là chất lỏng, di chuyển thành dòng liên tục Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và cho qua cột nhờ pha động Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động Nhờ đó, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng [10]

Các bộ phận của hệ thống HPLC được thể hiện ở Hình 1.5 dưới đây:

b) Hình 1.5 Sơ đồ hệ thống HPLC

1.3.2 Khối phổ (MS)

Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hoặc bớt điện tích như loại electron, proton hóa Từ

đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử hợp chất Sau khi được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến nguồn ion hóa Tại đây diễn ra quá trình ion hóa các chất, sau đó ion được đưa vào bộ phận phân tích khối

để tách các ion theo tỉ số m/z Sau đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được

khuếch đại và chuyển thành tín hiệu Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào hệ thống máy tính để nhận biết, xử lí và lưu trữ

Các bộ phận chính của hệ thống MS:

(1) Buồng ion hóa:

Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion mang điện tích hoặc bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao

Một số kỹ thuật ion hóa hay dùng: ion hóa bằng dòng electron (Electron ionization – EI), ion hóa hóa học (Chemical ionization – CI), ion hóa phản hấp phụ (Desorption ionization – DI), ion hóa phun mù electron (Electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric pressure chemical ionization – APCI)

Trong LC-MS, kỹ thuật ion hóa hay sử dụng là ESI Kỹ thuật ESI lý tưởng để nghiên cứu các hợp chất rất khó bay hơi đối với phương pháp đưa mẫu trực tiếp, các chất rất phân cực đến phân cực và các chất không bền với nhiệt ESI cũng phù hợp để nghiên cứu các phân

tử sinh học lớn tới 10000 Da cho đến các phân tử nhỏ với trọng lượng khoảng 100 – 1.500

Da

(2) Bộ phân tích:

Sau khi mẫu được ion hóa, chùm ion được tăng tốc bằng điện trường và sau đó đi vào bộ phân tích Trong vùng phổ kế khối lượng, các ion được phân tách theo tỉ số m/z Bộ phân tích được ứng dụng rộng rãi trong các hệ thống LC-MS là bộ tứ cực (quadrupole) Dưới đây là sơ đồ cấu tạo của bộ tứ cực:

c) Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực

(3) Detector:

Hai bộ phận phát hiện ion phổ biến là bộ phận phát hiện nhân electron (electron multipler)

sau đó được dẫn tới các diot tiếp theo, quá trình khuếch đại tiếp tục tạo ra dòng electron (105 -106) Ưu điểm của detector này là có độ nhạy cao, được ứng dụng phổ biến nhất Bộ phận phát hiện nhân quang hoạt động tương tự bộ nhân electron Tuy nhiên điểm khác là các electron thứ cấp sẽ va đập với một màn chắn phosphorus và giải phóng ra các nhân electron Số lượng các photon tỷ lệ với cường độ tín hiệu Ưu điểm của detector này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được tạp nhiễm

+ Kỹ thuật MRM (Multiple Reaction Monitoring) là cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (buồng va chạm) thu được các ion con,

cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện Trên thực tế, kỹ thuật ghi phổ MRM hay dùng hơn SRM Máy khối phổ MS/MS gồm hai

hệ máy khối phổ độc lập nhau được nối liền với nhau bởi một buồng va chạm (collision cell) MS đầu tiên để cô lập ion sơ cấp (precursor ion), tiếp theo là buồng va chạm để phân mảnh các ion này tạo ra ion thứ cấp (product ion), thường dùng khí Ar để va chạm Sau đó, các ion thứ cấp đến MS thứ hai để phân tách

Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu cao nên được sử dụng để phân tích các chỉ tiêu ở hàm lượng siêu vết (ppb/ppt) Do đó, phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực phân tích sinh học, phân tích mẫu môi trường và thuốc Tuy nhiên nhược điểm của LC-MS là thiết bị phức tạp và đắt tiền

Trên cơ sở các ưu điểm của phương pháp LC – MS/MS và các nghiên cứu đã thực hiện, kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần được sử dụng trong đề tài này để xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời Clorpheniramin, Cinnarizin và Cyproheptadin trộn trái phép trong TPBVSK

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

+ Đối tượng nghiên cứu: Chlorpheniramin; Cinnarizin và Cyproheptadin

+ Mẫu thử: 22 mẫu ghi nhãn “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe” có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm

xoang, viêm mũi dị ứng, cảm cúm, mề đay, mẩn ngứa, giải độc gan, giúp an thần, kích thích ngon miệng

Nơi thu thập mẫu: các trang thương mại điện tử (Shopee, Lazada), các trang web trên internet, mạng xã hội (facebook), chợ đông y

Dạng bào chế: viên hoàn, viên nang cứng, viên nén, cao lỏng

+ Mẫu trắng: 2 nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được

chuẩn bị từ 18 loại dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng và dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học

về dược liệu đã công bố như bài thuốc “Ngân kiều tán”, “Liên kiều giải độc tán”, “Tiêu phong tán gia giảm” Các dược liệu này được nấu với dung môi nước thành cao lỏng (nền mẫu lỏng), sau đó sấy khô và nghiền thành cao khô (nền mẫu rắn)

Bảng 2.1 Thành phần và tỷ lệ các dược liệu của nền mẫu

STT Thành phần Khối lượng (g) STT Thành phần Khối lượng (g)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng thuộc sở hữu của Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

2.1.3 Dung môi, hoá chất

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

2.1.4 Chất chuẩn

nghiệm thuốc Trung ương

Chí Minh

thuốc Trung ương

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng và tối ưu hoá phương pháp

2.3.1.1 Khảo sát các điều kiện phân tích

Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa, ion mẹ, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định tính và định lượng

- Khảo sát điều kiện sắc ký: Lựa chọn pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu

và tốc độ dòng để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất phân tích ở nồng độ ng/mL, các pic nhỏ gọn, cân xứng và có tín hiệu cao nhất, thời gian phân tích không quá dài

2.3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Quy trình xử lý mẫu được tham khảo trên một số tài liệu có nền mẫu tương tự và tùy theo điều kiện phòng thí nghiệm: lựa chọn dung môi chiết mẫu, phương pháp chiết, làm sạch mẫu

2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu

Đánh giá tương quan giữa đường chuẩn dựng trên nền mẫu với đường chuẩn dựng trên dung môi Nền mẫu là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến tín hiệu phân tích bằng phương pháp LC-MS/MS, đặc biệt trên đối tượng là mẫu thực phẩm vì sự có mặt của một lượng lớn tạp chất gây nhiễu Vấn đề này sẽ được giải quyết đáng kể nếu áp dụng một quy trình

xử lý mẫu tốt, tuy nhiên vẫn không thể triệt để Do đó cần khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu lên tín hiệu phân tích trong nghiên cứu này

Quy trình khảo sát được tiến hành song song với 2 đường chuẩn, một đường chuẩn trong dung môi (methanol) và một đường chuẩn trong nền mẫu trắng thêm chuẩn được xử lý qua quy trình xử lý mẫu đã tối ưu Khoảng hàm lượng được khảo sát được tính toán tương ứng với nồng độ trong dịch phân tích cuối cùng là 1,00 – 50,0 ng/mL đối với cả 3 chất Ảnh hưởng nền được đánh giá qua tương quan giữa hệ số góc của 2 đường chuẩn bằng công thức:

Trong đó:

Theo quy định của AOAC, giới hạn cho phép của ME là ≤ ± 20%

2.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 [4] và ICH 2005 [13] trên 2 nền mẫu tự tạo chứa các chất phân tích với các chỉ tiêu:

- Độ phù hợp của hệ thống: Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm 3 chất

chlorpheniramin maleat (CLO), cyproheptadin hydroclorid (CYP) và Cinnarizin (CIN) có nồng độ 50 ng/mL vào hệ thống LC-MS/MS Đánh giá độ biến thiên (RSD) của diện tích pic và thời gian lưu

Công thức tính RSD như sau:

Trong đó:

𝑥̅: giá trị trung bình của N lần thử nghiệm

n: số lần thử nghiệm

SD: độ lệch chuẩn

RSD: độ lệch chuẩn tương đối

- Độ đặc hiệu: Tính chọn lọc của phương pháp được đánh giá thông qua việc so sánh phổ

của các chất phân tích trên 3 loại mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn Phương pháp có tính chọn lọc cao đối với chất phân tích khi không phát hiện tín hiệu của chất phân tích trên mẫu trắng, thời gian lưu của chất phân tích trên mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn không lệch quá 5% Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng (IP) và tỷ lệ các ion theo tiêu chuẩn EC 657/2002 của Châu Âu

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng ( LOQ): Xác định giới hạn phát hiện

(LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách phân tích các mẫu trắng

thêm chuẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau Tiến hành phân tích, nồng độ tại đó cho tỷ số S/N (tín hiệu/ nhiễu) = 3 là LOD và S/N = 10 là LOQ

- Đường chuẩn: Từ dung dịch chuẩn hỗn hợp pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn

hỗn hợp (tối thiểu 5 điểm chuẩn) Xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic của từng chất chuẩn với nồng độ các chất phân tích Đường chuẩn xây dựng có hệ số r>0,995 và độ chệch tính lại từ đường chuẩn nằm trong khoảng ±15% (đối với điểm chuẩn tại mức nồng độ LOQ có thể chấp nhận trong khoảng ±20%)

Công thức tính độ chệch tính lại từ đường chuẩn:

Trong đó:

- Độ đúng và độ chính xác, độ thu hồi: Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng theo quy trình xử lý

mẫu đã xây dựng, thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) phù hợp Phân tích lặp lại 7 lần ở mỗi mức nồng độ để xác định độ đúng và độ chính xác trong ngày Độ đúng

và độ chính xác khác ngày được tiến hành tương tự nhưng vào ngày phân tích khác Lượng chất tìm lại được tính theo đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích Đánh giá kết quả dựa trên số liệu của 2 ngày phân tích RSD và độ thu hồi nằm trong khoảng chấp nhận ứng với mỗi mức nồng độ theo AOAC

Công thức tính độ thu hồi:

Trong đó:

R (%): Độ thu hồi

C: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

2.3.3 Phát hiện trộn trái phép Cinnarizin, Chlorpheniramin, Cyproheptadin trong một số thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

- Áp dụng phương pháp LC-MS/MS phát hiện các chất phân tích trong một số TPBVSK có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm xoang, dị ứng, giải độc gan, an thần, ăn ngon thu thập trên thị trường Dựa vào thời gian lưu, mảnh mẹ, hai mảnh con, tỷ lệ cường độ hai mảnh con của

- Xác định nồng độ các chất phân tích trên (nếu có) trong các mẫu thử thu thập được dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng cùng ngày, tương ứng của 3 chất phân tích (định lượng)

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Các kết quả thu được trong quá trình tiến hành nghiên cứu được xử lý bằng phần mềm MassLynx MS có sẵn trong thiết bị LC-MS/MS

- Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích nhờ các hàm toán học, thống kê

có sẵn trong phần mềm tin học Microsoft Excel (2016) để tính toán kết quả

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VA BÀN LUẬN 3.1 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP

3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS

3.1.1.1 Điều kiện khối phổ

Phương pháp LC-MS/MS phân tích các chất dựa trên cơ sở xác định ion phân tử (ion mẹ)

và ion sản phẩm (ion con) đối với từng hoạt chất Với kỹ thuật ion hóa ESI ở chế độ ion dương, các ion mẹ thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+ hay thêm hai proton [M-2H]++ Từ ion mẹ đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng cho định tính và định lượng

Tiêm không qua cột vào hệ thống MS các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ 5 µg/ml để xác định ion mẹ và các ion con Các điều kiện phân mảnh ion, năng lượng bắn phá phân mảnh (CE) được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ Lựa chọn 2 ion con có tín hiệu lớn, ổn định để định tính và định lượng, trong đó ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính Điều kiện khối phổ lựa chọn được trình bày trong các bảng sau:

Chế độ ion hoá: ESI (+)

Chế độ thu nhận tín hiệu: MRM

Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ

Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích

Tên chất Ion mẹ

(m/z)

Ion con (m/z) CE (eV)

Tỷ lệ ion định tính/định lượng (%) Chlorpheniramin

Nhận xét: Từ 2 bảng trên xác định được điều kiện MS/MS để phân tích các chất phân tích

Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của 3 chất phân tích đều ở dạng [M-H]+ có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z=M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Từ đó, mỗi chất phân tích được xác định bằng một ion mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định tính Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định của Châu Âu (2002/657/EC) với số điểm nhận dạng (IP) là 4 (1 ion mẹ – 1 điểm và 2 ion con – mỗi ion 1,5 điểm)

Acetonitril (kênh B)

Nhận xét: cả hai hệ đều có thời gian phân tích tương tự nhau, các pic của các chất phân tích đều gọn, cho tín hiệu cao Hệ pha động 2 có hai kênh đều là dung môi acid giúp cân bằng

pH trong quá trình phân tích Do đó, lựa chọn hệ pha động 2 để tiến hành phân tích

Với các mẫu TPBVSK có nền mẫu nhiều thành phần phức tạp, dịch xử lý mẫu đưa vào phân tích vẫn đôi khi còn chứa nhiều tạp chất khác nhau Các tạp chất này có thể gây tổn hại đến các thiết bị và quan trọng nhất là ảnh hưởng đến kết quả phân tích mẫu Do đó, việc