TỔNG QUAN
Thông tin chung về ɣ- oryzanol
1.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc ɣ-oryzanol là thành phần được tìm thấy với số lượng nhiều nhất trong dầu cám gạo, hàm lượng ɣ- oryzanol có trong dầu cám gạo khoảng từ 1 % đến 2 % hay 10-20 mg/g Ngoài ra, hoạt chất này cũng được tìm thấy trong ngô, lúa mạch, các loại dầu thực vật, lúa mạch đen và cám lúa mì ɣ-oryzanol được xác định là một hỗn hợp của phytosteryl ferulat, của acid ferulic được este hóa với sterol (campesterol, sitosterol, stigmasterol) và triterpenoid (cycloartenol và 24-methylenecycloartenol) Ít nhất 10 phytosteryl ferulat của γ- oryzanol đã được tìm thấy, chẳng hạn như campesteryl, campestanyl, cycloartenyl, 24- methylenecycloartanyl, sitostanyl, sitosteryl, stigmasteryl, Δ-campestenyl, Δ-sitostenyl và Δ-stigmastenyl ferulat Trong số này, chiếm ưu thế là campesteryl, cycloartenyl, 24- methylenecycloartanyl và sitosteryl ferulat chiếm từ 80% đến 95% γ-oryzanol tùy vào các giống lúa [10], [17], [24]
Hình 1 1 Cấu trúc hóa học của một số chất trong ɣ-oryzanol 1.1.2 Tính chất hóa lý
- Bột kết tinh không vị, màu trắng hoặc hơi vàng, không có mùi [26]
- Nhiệt độ nóng chảy từ 137,5–138,5 °C [26]
- Không tan trong nước, tan ít trong diethyl ether, ethanol và n-heptan, tan trong cloroform và aceton [26]
- Bị thủy phân trong môi trường kiềm ở 80 o C tạo muối của acid ferulic [31]
- Tạo kết tủa với ion canxi sau khi thủy phân trong môi trường kiềm và pha loãng với nước [12]
Nhiều công trình nghiên cứu đã xác định thuộc tính sinh học của ɣ-oryzanol như sau:
ɣ-oryzanol có tác dụng giảm cholesterol trong máu bằng cách ức chế sự hấp thu cholesterol từ chế độ ăn uống cũng như ngăn chặn quá trình tái hấp thu cholesterol nội sinh qua đường tiêu hóa, góp phần làm giảm nồng độ cholesterol trong máu hiệu quả [8], [11], [15], [29].
ɣ-oryzanol có nhiều lợi ích cho bệnh nhân tiểu đường, đặc biệt giúp cải thiện lượng đường huyết bằng cách nâng cao chức năng và duy trì sự tồn tại của tế bào β tụy Các bằng chứng cho thấy đặc tính hạ đường huyết của ɣ-oryzanol liên quan chặt chẽ đến hoạt tính chống oxy hóa của nó, góp phần bảo vệ và phục hồi chức năng của tuyến tụy trong quản lý bệnh tiểu đường.
γ-Oryzanol có tác dụng chống viêm hiệu quả, nhờ vào các đặc tính chống oxy hóa đã được chứng minh qua các nghiên cứu in vitro và in vivo Trong các mô hình nghiên cứu, γ-oryzanol đã ức chế đáng kể quá trình sản xuất gốc tự do do lipopolysaccharid gây ra ở đại thực bào RAW 264.7 của chuột, từ đó giảm thiểu phản ứng viêm thông qua trung gian NF-κB Điều này cho thấy γ-oryzanol có khả năng làm giảm các phản ứng viêm hiệu quả, góp phần hỗ trợ điều trị các bệnh viêm nhiễm.
γ-Oryzanol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp bảo vệ tế bào trước các phản ứng oxy hóa gây tổn thương Nghiên cứu in vitro cho thấy, γ-oryzanol hiệu quả ngăn chặn quá trình oxy hóa mô cao hơn gấp bốn lần so với vitamin E, nhấn mạnh vai trò của nó trong việc chống lại các gốc tự do có hại cho cơ thể.
ɣ-oryzanol có tác dụng làm giảm các triệu chứng tiền mãn kinh như bốc hỏa, đổ mồ hôi về đêm và mất ngủ, giúp cải thiện hệ thần kinh ở phụ nữ trong giai đoạn này Ngoài ra, sự kết hợp của ɣ-oryzanol và các sterol thực vật đã được ứng dụng trong điều trị mất trí nhớ do tuổi già, xơ cứng động mạch và các bệnh liên quan đến tiểu não, mang lại lợi ích cho sức khỏe não bộ và hệ tuần hoàn.
Thử nghiệm trên chuột cho thấy độc tính cấp tính của ɣ- oryzanol với LD50 theo các đường dùng như sau:
- Đường qua da: 100 mg/kg
- Đường tiêm tĩnh mạch: 382 mg/kg [25].
Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có ở Việt Nam và trên thế giới
1.2.1.1 Phương pháp đo quang xác định ɣ- oryzanol
Phương pháp đo quang đã được sử dụng để định lượng ɣ- oryzanol ở Việt Nam với các điều kiện phân tích như Bảng 1.1
Bảng 1 1 Phương pháp đo quang xác định ɣ- oryzanol
Mẫu Xử lý mẫu Dung môi chiết mẫu Bước sóng Tài liệu tham khảo
Hòa tan với dung môi n-heptan 315 nm
Phương pháp này có ưu điểm nổi bật là dễ vận hành, quy trình thực hiện nhanh chóng và tiết kiệm chi phí Tuy nhiên, nó cũng tồn tại nhược điểm về độ chính xác không cao và dễ gây ra các sai số trong quá trình áp dụng.
1.2.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol
Ngoài phương pháp đo quang, HPLC cũng được ứng dụng để định lượng ɣ- oryzanol với các điều kiện như Bảng 1.2
Bảng 1 2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol ở Việt Nam Đối tượng mẫu
Dung môi chiết mẫu Điều kiện sắc ký Tài liệu tham khảo
Dùng hỗ trợ của vi sóng
Phương pháp HPLC được sử dụng để xác định ɣ-oryzanol trên nền mẫu cám gạo, với các điều kiện như dung môi chiết, cách xử lý mẫu đa dạng, cột C18, pha động đẳng dòng, và bước sóng phát hiện tại 280 nm và 330 nm Nhiệt độ cột được duy trì từ 20°C đến 35°C để tối ưu hóa quá trình phân tích Tuy nhiên, theo sắc ký đồ phân tích trong tài liệu tham khảo [5], các đỉnh của ɣ-oryzanol không tách hẳn khỏi nhau như thể hiện trong Hình 1.2, cho thấy phương pháp có thể cần được điều chỉnh để nâng cao độ phân giải.
Hình 1 2 Sắc ký đồ phân tích ɣ- oryzanol bằng HPLC trong tài liệu tham khảo [5]
Hiện tại tại Việt Nam, các nghiên cứu về ɣ-oryzanol chủ yếu sử dụng hai phương pháp chính là đo quang và HPLC với điều kiện phân tích đơn giản Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu này còn rất hạn chế, chưa đáp ứng đầy đủ nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng trong lĩnh vực này.
1.2.2 Các phương pháp định lượng ɣ- oryzanol đã có trên thế giới
1.2.2.1 Phương pháp đo quang định lượng ɣ- oryzanol
Phương pháp đo quang đã được sử dụng để định lượng ɣ- oryzanol trên thế giới với các điều kiện phân tích như Bảng 1.3
Bảng 1 3 Phương pháp đo quang để định lượng ɣ- oryzanol trên thế giới
Mẫu Xử lý mẫu Dung môi chiết mẫu
Thời gian chiết Bước sóng
-Hòa tan bằng nước và acid ascorbic
-Sau đó chiết lặp lại bằng dung môi chiết mẫu n-hexan:
Phương pháp dễ vận hành và tiết kiệm chi phí, nhưng có nhược điểm là độ chính xác không cao và dễ gặp sai số Ngoài ra, quy trình chiết phức tạp và thời gian xử lý mẫu lâu cũng là những hạn chế cần xem xét.
1.2.2.2 Một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới để xác định ɣ-oryzanol với độ chính xác cao và chi phí nghiên cứu tiết kiệm Các phương pháp HPLC phân tích ɣ-oryzanol đã được ghi nhận trong nhiều tài liệu tham khảo, như đã trình bày trong Bảng 1.4.
Bảng 1 4 Một số phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao xác định ɣ- oryzanol có trên thế giới
Dung môi chiết mẫu Điều kiện sắc ký Tài liệu tham khảo
Pha loãng với pha động
Nhận xét: Phương pháp HPLC được sử dụng trong các tài liệu tham khảo có các đặc điểm sau:
- Dung môi và cách xử lý mẫu đa dạng
- Pha tĩnh: chủ yếu sử dụng cột C8 và C18
- Bước sóng phát hiện từ 325 đến 330 nm
- Nhiệt độ cột: từ 20 o C đến 50 o C
1.2.2.3 Một số phương pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định ɣ- oryzanol
Một số tài liệu tham khảo trình bày phương pháp xác định ɣ-oryzanol bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) với các điều kiện sắc ký khác nhau Thông qua các phương pháp này, quá trình phân tích và xác định hàm lượng ɣ-oryzanol được thực hiện chính xác và tin cậy Bảng 1.5 trình bày các điều kiện sắc ký đã được sử dụng trong các nghiên cứu này, giúp tối ưu hóa quá trình phân tích và nâng cao hiệu quả xác định hợp chất.
Bảng 1 5 Một số phương pháp sắc ký lỏng khối phổ xác định ɣ- oryzanol
Dung môi chiết mẫu Điều kiện sắc ký Tài liệu tham khảo
Nghiên cứu lúa gạo Quốc tế)
Nhận xét: Phương pháp LC- MS trong các tài liệu tham khảo sử dụng điều kiện sắc ký có đặc điểm sau:
- Dung môi và phương pháp xử lý mẫu đa dạng
- Pha tĩnh là cột C8 hoặc C18
- Pha động theo chương trình gradient hoặc đẳng dòng
- Bước sóng phát hiện từ 320 nm đến 325 nm
- Nhiệt độ cột từ 20 o C đến 30 o C
1.2.2.4 Một số phương pháp sắc ký khí khối phổ xác định ɣ- oryzanol
Ngoài phương pháp HPLC và LC-MS, các phương pháp xác định ɣ-oryzanol bằng sắc ký khí khối phổ cũng được trình bày trong tài liệu tham khảo, thể hiện đa dạng và chính xác trong phân tích hợp chất này (xem Bảng 1.6).
Bảng 1 6 Một số phương pháp xác định ɣ- oryzanol bằng sắc ký khí khối phổ
Dung môi chiết mẫu Điều kiện sắc ký
Ete dầu mỏ - n- hexan- MeOH 1:3 (w/v)
300°C, tốc độ 10°C/phút trong 10 phút
Chiết bằng dung môi ở 50°C, khuấy
310°C, tốc độ 15°C/phút, trong 5 phút
340°C, tốc độ 2,5°C/phút, trong 3 phút
Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ phòng
Phương pháp GC-MS được đánh giá cao nhờ vào quy trình xử lý mẫu đơn giản, sử dụng dung môi chiết phù hợp và cột phân tích hiệu quả Hệ thống cũng linh hoạt với chương trình nhiệt độ đa dạng giúp tối ưu hóa quá trình phân tích Ngoài ra, khí mang như Heli và H2 được sử dụng phổ biến để nâng cao hiệu suất và độ nhạy của phương pháp.
ɣ-oryzanol được xác định bằng nhiều phương pháp phân tích hiện đại như quang phổ, HPLC, LC-MS và GC-MS Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp phù hợp nhất để đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong việc phân tích thành phần này Việc sử dụng các kỹ thuật phân tích tiên tiến giúp nghiên cứu đạt được kết quả chính xác, phục vụ cho các mục đích nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.
HPLC là phương pháp xây dựng để định lượng ɣ-oryzanol với ưu điểm độ chính xác cao, thao tác đơn giản và phù hợp với thiết bị sẵn có trong phòng thí nghiệm Các nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC tại Việt Nam và trên thế giới thường sử dụng cột C8 hoặc C18 làm pha tĩnh, với pha động đẳng dòng, bước sóng phát hiện từ 280 nm đến 330 nm, nhiệt độ cột từ 20°C đến 50°C, tốc độ dòng từ 1,0-1,7 ml/phút và dung môi chiết mẫu đa dạng như methanol, diclometan:methanol (2:1), n-hexan: ethanol (tỷ lệ 4:3 và 9:1), hoặc n-hexan: ethyl acetat để tối ưu hóa quá trình phân tích.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột C18 với tốc độ dòng 1,2 ml/phút và nhiệt độ cột 40°C, cùng thể tích mẫu 10 µl, sử dụng pha động là hỗn hợp MeOH và ACN theo tài liệu tham khảo [5] Các yếu tố được khảo sát nhằm tối ưu hóa điều kiện phân tích bao gồm tỷ lệ dung môi pha động, dung môi chiết mẫu, thời gian chiết mẫu và bước sóng phát hiện Việc lựa chọn các điều kiện tối ưu giúp nâng cao độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp phân tích, đảm bảo kết quả nghiên cứu chính xác và tin cậy.
Thông tin về mẫu chứa ɣ- oryzanol
1.3.1 Một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol hiện đang có trên thị trường trong nước và ngoài nước
Hình ảnh của một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol hiện đang có trên thị trường trong nước và ngoài nước được thể hiện ở Hình 1.3
Hình 1 3 Hình ảnh một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol trên thị trường
Các sản phẩm chứa ɣ- oryzanol hiện có trên thị trường trong và ngoài nước rất đa dạng về dạng bào chế như viên nén, viên nang mềm và nang cứng, phù hợp với nhiều nhu cầu sử dụng khác nhau Hàm lượng ɣ- oryzanol trong các sản phẩm cũng đa dạng, giúp người tiêu dùng chọn lựa phù hợp với mục đích chăm sóc sức khỏe của mình Thông tin về một số sản phẩm chứa thành phần ɣ- oryzanol được trình bày rõ ràng trong Bảng 1.7, cung cấp các dữ liệu cần thiết để người tiêu dùng và các nhà phân phối có thể lựa chọn sản phẩm phù hợp.
Bảng 1 7 Thông tin về một số sản phẩm có chứa thành phần ɣ- oryzanol có trên thị trường
TT Tên sản phẩm Dạng bào chế Nhà sản xuất Hàm lượng ɣ- oryzanol trên nhãn (mg)
Gamma Oryzanol Viên nén Threshold
Oryzanol Viên nang cứng Swanson
Viên nén Công ty Vistra
Nano Megumi Oic Viên nang mềm Công ty cổ phần công nghệ mới
Skin Vitamin E đỏ Viên nang mềm Công ty cổ phần dược phẩm
Viên nang cứng Công ty A.P
Viên nang cứng RCM ( Ấn độ)
1.3.2 Thông tin về sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân dùng trong nghiên cứu
Viên làm trắng da Kiều Xuân được lựa chọn làm mẫu thử để khảo sát các điều kiện thích hợp Dựa trên đó, phương pháp định lượng γ-oryzanol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được xây dựng và thẩm định Sản phẩm này nổi bật trên thị trường và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu phân tích thành phần mỹ phẩm Việc xác định chính xác lượng γ-oryzanol giúp nâng cao chất lượng và đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.
Thông tin về mẫu viên làm trắng da Kiều Xuân:
- Hình ảnh sản phẩm (Hình 1.4)
- Dạng bào chế: viên nén
- Nhà sản xuất: Công ty cổ phần dược phẩm Sao Kim- khu công nghiệp Quang Minh- Mê Linh- Hà Nội
- Bảng thành phần và hàm lượng các thành phần được trình bày ở Bảng 1.8
Bảng 1 8 Các thành phần của viên làm trắng da Kiều Xuân
Thành phần Hàm lượng nhãn (mg)
EstroG-100 (estrogen thảo dược) 257 ɣ-oryzanol 20
Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích phổ biến dùng để tách, định tính và định lượng các hợp chất trong hỗn hợp Trong quá trình này, các chất phân tích di chuyển qua cột chứa hạt pha tĩnh dưới tác dụng của pha động lỏng, giúp phân tách dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và tính chất của từng hợp chất Các hợp chất có cấu trúc hoặc tính chất tương đồng, như đồng phân đối quang, cần được tác động hợp lý bởi hệ pha tĩnh và pha động để đạt hiệu quả tách tối ưu HPLC là phương pháp chuẩn xác, phù hợp cho việc phân tích các hợp chất phức tạp trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có thể được thực hiện bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, phù hợp với đặc điểm cấu tạo của chất phân tích Trong thực tế, các kỹ thuật sắc ký lỏng phổ biến nhất bao gồm HPLC khả năng cao, HPLC thường, và các phương pháp phân tích dựa trên tính chất của mẫu Việc ứng dụng các kỹ thuật này giúp nâng cao độ nhạy, độ chính xác và khả năng phân tích phức tạp của các hợp chất hoá học Sử dụng HPLC phù hợp theo đặc điểm của mẫu là yếu tố quan trọng để đảm bảo kết quả phân tích chính xác, tin cậy và hiệu quả trong nghiên cứu và ứng dụng công nghiệp.
- Sắc ký trao đổi ion
- Sắc ký các đồng phân quang học
Trong đó, sắc ký phân bố là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay, có thể phân thành 2 dạng tùy thuộc vào pha tĩnh:
- Sắc ký lỏng- lỏng: Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt chất mang rắn, gọi là chất nhồi cột
- Sắc ký pha liên kết: pha tĩnh có liên kết với bề mặt chất mang rắn, gồm sắc ký pha thuận và pha đảo [3]
1.4.3 Các đại lượng đặc trưng
Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột, còn gọi là hiệu lực biểu kiến của cột, là chỉ số quan trọng phản ánh khả năng phân tách và hiệu quả của quá trình chưng cất Trong quá trình hoạt động, mỗi đĩa trên cột thể hiện sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa pha tĩnh và pha động Do đó, số đĩa lý thuyết càng cao thì khả năng phân tách các thành phần trong hỗn hợp càng hiệu quả, đảm bảo chất lượng sản phẩm đạt tiêu chuẩn mong muốn.
Trong đó: L là chiều dài của cột
H là chiều cao của đĩa lý thuyết
W là chiều rộng đo ở đáy pic tR là thời gian lưu của pic tương ứng chất phân tích (phút) [3], [4]
Thời gian lưu là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi pic đến detector
Trong đó: L là chiều dài cột,
𝑣̅ là tốc độ trung bình của chất phân tích [3], [4]
1.4.2.3 Độ phân giải (R s ): Độ phân giải là khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký
Trong đó: ∆𝑍 là khoảng cách giữa hai pic,
W * , W + lần lượt là độ rộng pic của chất A, B [1], [3]
1.4.2.4 Hệ số bất đối (AF): dùng để đánh giá tính bất đối xứng của pic
Trong đó : a là nửa chiều rộng phía trước pic, b là nửa chiều rộng phía sau pic, a và b được đo ở 1/10 chiều cao pic [1], [3]
Các ứng dụng của HPLC trong kiểm nghiệm bao gồm:
- Định tính: định tính chất thử dựa vào thời gian lưu, hình dạng pic của thử và chuẩn, hoặc chồng pic của thử và chuẩn
Định lượng các chất trong phân tích hóa học dựa trên diện tích pic và nồng độ của chất thử cũng như chất chuẩn, giúp xác định chính xác hàm lượng của các thành phần Có nhiều phương pháp định lượng bằng HPLC như phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn nội, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích, mang lại độ chính xác và tin cậy cao trong phân tích.
- Xác định tạp chất: dựa vào thời gian lưu, diện tích pic để xác định tạp chất
- Định lượng tạp chất: định lượng các chất dựa vào diện tích pic và nồng độ của chất thử, chất chuẩn tạp [3]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
- Mẫu thử: viên làm trắng da Kiều Xuân
- Nơi sản xuất: Công ty cổ phần dược phẩm Sao Kim- khu công nghiệp Quang Minh-
- Quy định hàm lượng: hàm lượng ɣ-oryzanol trong mỗi viên không nhỏ hơn 80,0 % và không lớn hơn 120,0 % so với hàm lượng ghi trên nhãn (tiêu chuẩn nhà sản xuất)
2.1.2 Thiết bị, hóa chất, dung môi
- Tủ sấy Binder (Đức), mã thiết bị: NIFC.05E53 của Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
- Tủ lạnh Sharp (Thái Lan), mã thiết bị: NIFC.05E049 của Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
- Cân phân tích Mettler toledo (Thụy Sĩ), d= 0,0001 g, mã thiết bị: NIFC.04E60 của Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
- Cân phân tích Sartorius (Đức), d=0,00001 g, mã thiết bị: NIFC.04E059 của Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
- Máy ly tâm HERMLE-Z 326 K (Đức), mã thiết bị: NIFC.05E0119 của Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
- Máy lắc ngang IKA-HS 260 basic (Đức), mã thiết bị: NIFC.05E079 của Khoa Nghiên cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters e2695 của Mỹ, mã thiết bị NIFC 05M.063, được sử dụng tại Khoa Nghiên cứu Phát triển của Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia Thiết bị này là giải pháp tối ưu cho các phân tích đòi hỏi độ chính xác cao trong lĩnh vực kiểm nghiệm an toàn thực phẩm Với công nghệ tiên tiến của hãng Waters, máy sắc ký này giúp nâng cao hiệu quả và độ nhạy trong quá trình phân tích mẫu thực phẩm Việc sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters e2695 góp phần tăng cường khả năng phát hiện và kiểm soát chất lượng thực phẩm, đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng.
- Cột sắc ký XBridge Waters (Mỹ) C18 (250 x 4,6 mm, 5àm) của Khoa Nghiờn cứu phát triển- Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia
- Các dụng cụ thủy tinh cần thiết
- Nhà sản xuất: Toronto Research Chemicals Inc.-2 Brisbane Road, Toronto, Canada
- Methanol (dùng cho HPLC) sản xuất bởi Merck KGaA, Đức
- Acetonitril (dùng cho HPLC) sản xuất bởi Merck KGaA, Đức.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát các điều kiện phù hợp để xây dựng phương pháp định lượng ɣ- oryzanol
2.2.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký
- Khảo sát bước sóng phát hiện
- Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động
2.2.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu
- Khảo sát dung môi và tỷ lệ dung môi chiết mẫu
- Khảo sát thời gian chiết mẫu
2.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Tính thích hợp hệ thống sắc ký
- Độ chính xác trung gian
2.2.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol
2.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký a) Khảo sát bước sóng phát hiện: quét phổ dung dịch chuẩn với bước sóng từ 210 nm đến 400 nm để chọn bước sóng phân tích b) Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động: khảo sát pha động MeOH: ACN ở các tỷ lệ 35:65; 50:50 và 70: 30
2.3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu a) Dựa vào độ tan của ɣ-oryzanol và điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi khảo sát 6 dung môi xử lý mẫu là:
- n-hexan: isopropanol= 1:3 (v/v) b) Khảo sát thời gian chiết mẫu với thời gian là 15 phút, 30 phút và 45 phút
2.3.2 Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol
2.3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu chuẩn γ-oryzanol nhằm đảm bảo độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp định lượng Quá trình này giúp ghi lại các sắc ký đồ rõ ràng, chính xác, phản ánh đặc điểm phân tích Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên thời gian lưu tR và diện tích pic đảm bảo phương pháp phân tích ổn định và tin cậy Việc kiểm tra tính phù hợp của hệ thống giúp xác định khả năng phân tích các mẫu thử một cách chính xác, phù hợp với tiêu chuẩn định lượng γ-oryzanol Đây là bước quan trọng trong phát triển phương pháp phân tích chất lượng cao cho nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.
S, số đĩa lý thuyết N, độ phân giải Rs và hệ số bất đối AF [4]
- Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0 %
- Giá trị RSD của tổng diện tích pic ≤ 2,0 %
- Độ phân giải các pic Rs > 1,5
- Hệ số bất đối AF < 2,00
Trong quá trình phân tích, chúng tôi so sánh đáp ứng của các mẫu khác nhau bao gồm mẫu trắng (dung môi pha mẫu), mẫu placebo (chứa các thành phần tá dược như đã trình bày trong Bảng 2.1), mẫu thử và mẫu chuẩn, tất cả được phân tích trong cùng điều kiện để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Bảng 2 1 Các thành phần của mẫu placebo
Mẫu trắng và mẫu placebo không thể hiện tín hiệu pic của ɣ-oryzanol trong thời gian lưu của mẫu chuẩn, cho thấy chúng không chứa hợp chất này Đồng thời, mẫu thử và mẫu chuẩn có thời gian lưu của ɣ-oryzanol tương đồng, xác định tính chính xác trong phân tích và đảm bảo độ tin cậy của phương pháp HPLC trong xác định hàm lượng ɣ-oryzanol.
- Các pic sắc ký của ɣ-oryzanol trong mẫu thử và mẫu chuẩn đạt độ tinh khiết pic với độ tinh khiết góc (PA) < độ tinh khiết ngưỡng (TH) [33]
Dựa trên dung dịch chuẩn gốc cú có nồng độ khoảng 400 µg/ml, chúng tôi tiến hành pha loãng với dung môi phù hợp để tạo ra các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ γ-oryzanol lần lượt đạt từ 50% đến 75% Các bước pha loãng này giúp đảm bảo độ chính xác trong phân tích và kiểm tra hàm lượng γ-oryzanol trong mẫu Việc chuẩn bị dung dịch chuẩn có nồng độ phù hợp là yếu tố quan trọng để nâng cao độ chính xác của phương pháp phân tích và đáp ứng các yêu cầu về tiêu chuẩn SEO.
Trong nghiên cứu, các nồng độ 100%, 125% và 150% so với nồng độ dung dịch thử (40 μg/mL) được xử lý bằng phương pháp sắc ký dưới cùng điều kiện để đảm bảo độ chính xác Quá trình này giúp xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính, từ đó xác định hệ số tương quan R và % hệ số chắn Y nhằm đánh giá mối liên hệ giữa nồng độ và tín hiệu phát hiện Phương pháp này đảm bảo độ tin cậy trong phân tích và xác định chính xác hàm lượng mẫu thử.
Yêu cầu: Đường hồi quy có dạng đường thẳng tuyến tính với hệ số tương quan R
≥ 0,998 và % hệ số chắn (tại nồng độ 100 %) Y% ≤ 2,0 %
Tiến hành phân tích độc lập 6 dung dịch thử nồng độ 100% dựa trên đường chuẩn trong cùng điều kiện để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng cách tính RSD của các giá trị hàm lượng ɣ-oryzanol trong mẫu thử qua nhiều lần phân tích khác nhau Việc này giúp đánh giá độ chính xác và khả năng lặp lại của phương pháp phân tích trong nghiên cứu.
2.3.2.5 Độ chính xác trung gian
Hai kiểm nghiệm viên thực hiện phân tích độc lập 12 dung dịch thử có nồng độ 100% vào hai ngày khác nhau, mỗi người phân tích 6 mẫu, đảm bảo điều kiện phòng thí nghiệm đồng nhất Độ chính xác trung gian được xác định bằng cách tính RSD của các giá trị hàm lượng ɣ-oryzanol trong mẫu thử giữa các lần phân tích để đảm bảo tính nhất quán và độ chính xác của phương pháp phân tích Việc sử dụng mẫu chuẩn và thực hiện phân tích trong cùng điều kiện giúp nâng cao độ tin cậy của kết quả kiểm nghiệm.
Yêu cầu: Độ chính xác trung gian của hai kiểm nghiệm viên trong hai ngày khác nhau có RSD ≤ 2,0 %
Trong quá trình phân tích, thêm chính xác lượng chuẩn γ-oryzanol tương ứng với 60%, 100% và 140% so với nồng độ dung dịch thử (40 µg/ml) vào mẫu placebo để chuẩn bị ba mẫu độc lập ở mỗi nồng độ Sau đó, tiến hành phân tích tương tự mẫu thử, ghi lại sắc ký đồ và tính độ thu hồi của chuẩn γ-oryzanol nhằm đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp phân tích Các bước này giúp xác định chính xác hàm lượng γ-oryzanol trong mẫu cũng như đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tích sắc ký.
Yêu cầu: Độ thu hồi của ɣ-oryzanol từ 97,0 %-103,0 % ở mỗi mức nồng độ
Theo tiêu chuẩn của AOAC, độ thu hồi chấp nhận được dựa trên nồng độ chất phân tích được trình bày trong Bảng 2.2 Hàm lượng ghi trên nhãn của ɣ-oryzanol là 20 mg trong mỗi viên 700 mg, do đó, phạm vi độ thu hồi chấp nhận được của ɣ-oryzanol là từ 97,0% đến 103,0%.
Bảng 2 2 Độ thu hồi chấp nhận được theo nồng độ chất phân tích Đơn vị RSD (%) Độ thu hồi (%)
2.3.3 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da Kiều Xuân Ứng dụng phương pháp đã xây dựng và thẩm định để định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da Kiều Xuân do công ty cổ phần dược phẩm Sao Kim sản xuất.
Xử lý số liệu
- Kết quả thực nghiệm được xử lý bằng thống kê trên phần mềm Microsoft Office Excel
- Một số thông số thống kê đã được sử dụng trong đề tài nghiên cứu được thể hiện trong Bảng 2.3
Bảng 2 3 Một số thông số thống kê được sử dụng trong nghiên cứu đề tài
Thông số thống kê Công thức Ghi chú
Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm được ký hiệu là 𝑥̅, phản ánh kết quả trung bình sau nhiều lần đo Số lần thử nghiệm được thể hiện bằng n, trong khi xi là giá trị đo được của từng lần thử nghiệm thứ i Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) là thước đo mức độ biến thiên của dữ liệu so với giá trị trung bình, giúp đánh giá độ chính xác của các phép đo RSD bằng 0 cho thấy dữ liệu đo lường hoàn toàn chính xác và không có sự biến thiên giữa các lần thử nghiệm, đảm bảo độ tin cậy của kết quả phân tích.
- Kết quả hàm lượng ɣ-oryzanol của mẫu thử được tính toán dựa vào công thức sau:
Trong đú: 𝑆 D@E FGử là diện tớch pic của mẫu thử (àV.s)
𝑆 D@E EGIẩA là diện tớch pic của mẫu chuẩn ɣ-oryzanol (àV.s)
𝑚 EGIẩA , 𝑚 FGử lần lượt là khối lượng cân của mẫu chuẩn, mẫu thử (g)
𝑚P là khối lượng trung bình viên (g)
HLGTN là hàm lượng ghi trên nhãn của ɣ-oryzanol (g)
HLchuẩn: là hàm lượng của chuẩn ɣ-oryzanol (%)
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thực nghiệm và kết quả
3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol
3.1.1.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử
Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử được chuẩn bị như sau:
Để chuẩn bị mẫu, cân chính xác 21,06 mg chuẩn γ-oryzanol vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm 35 ml dung môi nghiên cứu vào, lắc đều để hòa tan hoàn toàn Tiếp theo, định mức đến vạch bằng dung môi nghiên cứu để có dung dịch chứa γ-oryzanol với nồng độ 400,14 µg/ml Lấy chính xác 10,00 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml, rồi thêm dung môi vừa đủ để đạt vạch, sau đó lắc đều để đảm bảo dung dịch đồng nhất.
- Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g bột viên Kiều Xuân (lô 220621) vào ống ly tâm
Chuẩn bị mẫu gồm 50 ml, thêm 35 ml dung môi nghiên cứu, lắc đều trong 15 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 1000 v/phút để tách dịch Gạn lấy dịch lọc vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm 15 ml dung môi nghiên cứu để thực hiện chiết lần 2 Gộp dịch lọc của hai lần vào cùng bình, bổ sung dung môi đến vạch bằng dung môi chiết, lắc đều và lọc qua giấy lọc để loại bỏ tạp chất Chính xác lấy 10,00 ml dịch lọc vào bình định mức 100 ml, thêm dung môi đến vạch, lắc đều và lọc qua màng lọc 0,45 μm để loại bỏ vi khuẩn hoặc tạp chất nhỏ.
3.1.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký a) Lựa chọn bước sóng phát hiện Để lựa chọn bước sóng phát hiện, tiến hành quét phổ dung dịch chuẩn ɣ-oryzanol
40 àg/ml từ 210 nm đến 400 nm, kết quả thu được như Hỡnh 3.1
Hình 3 1 Kết quả quét phổ dung dịch chuẩn Nhận xét: từ Hình 3.1 cho thấy ɣ-oryzanol có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng
324,7 nm Vì vậy, lựa chọn bước sóng 325 nm để định lượng ɣ-oryzanol b) Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động
Trong quá trình phân tích, cột Xbridge C18 đã được sử dụng với thành phần pha động gồm methanol và acetonitril ở các tỷ lệ khác nhau (50:50, 35:65, 70:30) để đánh giá hiệu quả phân tách Các kết quả thu được thể hiện rõ qua các hình ảnh từ Hình 3.2 đến 3.4 và được tổng hợp trong Bảng 3.1, giúp xác định điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích.
Hình 3 2 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 50: 50
Hình 3 3 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 35: 65
Hình 3 4 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH: ACN = 70: 30
Bảng 3 1 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động
Thời gian lưu (t R ) (phút) Độ phân giải (Rs)
Nhận xét t R1 t R2 t R3 t R4 Rs 12 Rs 23 Rs 34
-Độ phân giải của pic số 1, 2 và 2, 3 < 1,5 35:65 11,836 12,836 14,151 15,677 1,58 2,00 2,04
- Độ phân giải của các pic đều > 1,5
-Thời gian lưu ngắn -Độ phân giải của hai pic đầu< 1,5
Hỗn hợp dung môi methanol và acetonitril ở tỷ lệ 50:50 và 70:30 cho thời gian lưu ngắn hơn trong quá trình sắc ký, nhưng độ phân giải của ba pic sắc ký đầu tiên đều thấp, dưới 1,5 Trong khi đó, các tỷ lệ 35:65 mang lại độ phân giải lớn hơn 1,5 cho tất cả các pic, cho thấy hiệu quả phân tích tốt hơn Do đó, lựa chọn dung môi methanol: acetonitril theo tỷ lệ 35:65 là phù hợp để đạt được độ phân giải tối ưu trong quá trình sắc ký.
3.1.1.3 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu a) Khảo sát dung môi chiết mẫu
Quá trình khảo sát các dung môi chiết mẫu nhằm tìm ra dung môi hòa tan tốt nhất ɣ-oryzanol đã được thực hiện theo phương pháp tính trung bình của các kết quả thí nghiệm Các thí nghiệm này dựa trên mục "2.3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu" nhằm xác định hàm lượng chất phân tích khi thay đổi dung môi chiết Các thử nghiệm được thực hiện trên 6 loại dung môi khác nhau để tìm ra dung môi tối ưu giúp nâng cao hiệu quả chiết xuất ɣ-oryzanol.
Các thông số cố định trong quá trình chiết bao gồm phương pháp chiết, thời gian chiết là 15 phút và số lần chiết là 2 lần Hàm lượng ɣ-oryzanol thu được sẽ khác nhau tùy thuộc vào loại dung môi được sử dụng, như đã được trình bày trong Bảng 3.2 Sự thay đổi dung môi ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả chiết ɣ-oryzanol, góp phần tối ưu hóa quy trình chiết trong nghiên cứu.
Bảng 3 2 Kết quả khảo sát dung môi chiết mẫu
TT Dung môi Mẫu Khối lượng
Tổng diện tích pic (àV.s)
Kết quả khảo sát cho thấy, dung môi n-hexan-isopropanol ở tỷ lệ 1:3 (v/v) mang lại hàm lượng ɣ-oryzanol cao nhất so với các loại dung môi khác Điều này cho thấy sự lựa chọn dung môi phù hợp đóng vai trò quan trọng trong quá trình chiết xuất ɣ-oryzanol từ mẫu, góp phần nâng cao hiệu quả của quá trình phân tích.
Để đánh giá khả năng tách của các pic sắc ký khi thay đổi các dung môi chiết khác nhau, chúng ta dựa vào đại lượng độ phân giải (Rs) Kết quả thể hiện rõ qua các hình từ Hình 3.5 đến Hình 3.10 và bảng số liệu Bảng 3.3, giúp phân tích hiệu quả tách thuốc trong quá trình sắc ký.
Hình 3 5 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là isopropanol
Hình 3 6 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là n-hexan-ethanol= 5:2
Hình 3 7 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là methanol
Hình 3 8 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là ethanol
Hình 3 9 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là n-hexan
Hình 3 10 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết mẫu là n-hexan- isopropanol = 1: 3
Bảng 3 3 Thông số pic sắc ký khi khảo sát dung môi chiết
TT Dung môi Độ phân giải
1 IPA 1,44 1,77 1,781 Hai pic đầu chưa tách khỏi nhau hoàn toàn
EtOH = 5:2 1,18 1,53 1,80 Hai pic đầu tiên bị chẻ đầu
3 MeOH 1,71 2,07 1,84 Các pic tách khỏi nhau
4 EtOH 1,70 2,11 1,98 Các pic tách khỏi nhau
5 n-hexan Các pic không tách khỏi nhau
= 1:3 1,55 1,78 1,87 Các pic tách khỏi nhau
Kết quả phân tích cho thấy, việc sử dụng dung môi hỗn hợp n-hexan và ethanol theo tỷ lệ 5:2 v/v giúp nâng cao hiệu quả chiết xuất Tuy nhiên, quá trình phân tích bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) cho thấy, dung môi n-hexan phù hợp khiến quá trình sắc ký chẻ đôi, còn việc sử dụng IPA làm dung môi ban đầu chưa phản ứng hoàn toàn trong quá trình phân tích.
Ba dung môi còn lại (MeOH, EtOH và n-hexan- IPA = 1:3 v/v) đều cho độ phân giải các pic > 1,5
Dựa trên hàm lượng % ɣ-oryzanol thu được khi thay đổi dung môi chiết và độ phân giải pic, chúng tôi chọn hỗn hợp n-hexan: isopropanol (1:3) làm dung môi phù hợp để tối ưu hóa quá trình chiết mẫu Ngoài ra, việc khảo sát thời gian chiết mẫu giúp xác định thời gian tối ưu để thu được hàm lượng ɣ-oryzanol cao nhất, đảm bảo hiệu quả và tiết kiệm trong quá trình chiết xuất.
Tiến hành chiết mẫu theo quy trình đã định, cố định các thông số gồm phương pháp chiết và dung môi chiết là hỗn hợp n-hexan-isopropanol theo tỷ lệ 1:3 (v/v) Thời gian chiết được thay đổi lần lượt là 15 phút, 30 phút và 45 phút, mỗi mức thời gian thực hiện lặp lại 3 mẫu thử để tính trung bình Kết quả hàm lượng ɣ-oryzanol thu được được trình bày trong Bảng 3.4, giúp đánh giá tác động của thời gian chiết đến hiệu quả chiết xuất.
Bảng 3 4 Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu
Tổng diện tích pic (àV.s)
Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi thời gian chiết suất tăng từ 15 phút lên 45 phút, hàm lượng ɣ-oryzanol không có sự thay đổi đáng kể, do đó thời gian chiết mẫu phù hợp nhất là 15 phút Qua đó, quá trình khảo sát đã xác định các điều kiện tối ưu để xây dựng phương pháp định lượng ɣ-oryzanol chính xác và hiệu quả.
- Dung môi chiết mẫu là n-hexan: isopropanol (tỷ lệ 1:3 v/v)
- Thời gian chiết mẫu là 15 phút
+ Pha tĩnh: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)
+ Tốc độ dòng 1,2 ml/phút
+ Detector PDA, bước sóng phát hiện 325 nm
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 21 mg γ-oryzanol vào bình định mức 50 ml, sau đó thêm 35 ml dung môi n-hexan: isopropanol (tỷ lệ 1:3 v/v) và lắc đều để hòa tan hoàn toàn Tiếp theo, định mức dung dịch đến vạch bằng dung môi trên và hút chính xác 10,00 ml dung dịch lọc vào bình định mức 100 ml, rồi thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều để đảm bảo độ hòa tan và chính xác của dung dịch chuẩn.
Dung dịch thử được chuẩn bị bằng cách cân chính xác khoảng 20 mg bột viên chứa ɣ-orezanol vào ống ly tâm 50 ml, sau đó thêm 35 ml dung môi n-hexan:isopropanol (tỷ lệ 1:3 v/v) Tiến hành lắc ngang ống trong 15 phút và ly tâm với tốc độ 1000 v/p Lọc dịch qua bộ lọc vào bình định mức 50 ml, phần còn lại được chiết lần hai với 15 ml dung môi chiết, rồi gộp tất cả dịch chiết để chuẩn bị phân tích.
Để chuẩn bị mẫu, lọc hai lần qua bình định mức 50 ml với dung môi chiết đến vạch, lắc đều và lọc qua giấy lọc nhằm loại bỏ các tạp chất Tiếp theo, hút chính xác 10,00 ml dịch lọc vào bình định mức 100 ml và thêm dung môi phù hợp đến vạch, sau đó lắc đều để hòa trộn Cuối cùng, lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm để đảm bảo loại bỏ các hạt vi nhỏ, giúp mẫu chuẩn bị phù hợp cho phân tích.
- Cách tính kết quả để định lượng ɣ-oryzanol: Diện tích pic của ɣ-oryzanol được xác định bằng tổng diện tích của 4 pic thành phần của ɣ-oryzanol
3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol
3.1.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Bàn luận
3.2.1 Về phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng HPLC
Dựa trên các tài liệu tham khảo và phương pháp HPLC, phương pháp phân tích ɣ-oryzanol đã được xây dựng để định lượng trong viên làm trắng da Các điều kiện sắc ký phù hợp đã được tối ưu hóa dựa trên trang thiết bị có sẵn tại phòng thí nghiệm, đảm bảo độ chính xác và độ nhạy của phương pháp phân tích.
Phương pháp HPLC được xây dựng để định lượng ɣ-oryzanol dựa trên tài liệu tham khảo [5] đã được công bố tại Việt Nam, mang lại những điểm khác biệt đáng chú ý so với phương pháp gốc.
- Đối tượng mẫu được sử dụng trong nghiên cứu là viên nén làm trắng da Kiều Xuân, khác với trong tài liệu là mẫu cám gạo (Nàng Hương)
Dung môi chiết mẫu được sử dụng là n-hexan-isopropanol theo tỷ lệ 1:3 v/v, khác hoàn toàn với các tài liệu tham khảo trước đó Nghiên cứu đã khảo sát hiệu quả của nhiều loại dung môi như methanol, isopropanol, ethanol, n-hexan, và các hỗn hợp như n-hexan-ethanol (5:2) và n-hexan-isopropanol (1:3), cho thấy hỗn hợp n-hexan-isopropanol đạt hàm lượng γ-oryzanol cao hơn hẳn các dung môi khác Ngoài ra, các pic sắc ký của γ-oryzanol tách rõ ràng, với độ phân giải RS12 = 1,55; RS23 = 1,78 và RS34 = 1,87, đảm bảo phân tích chính xác và hiệu quả cao.
Trong quá trình phân tích, bước sóng phát hiện được lựa chọn là 325 nm, đây là bước sóng cực đại của ɣ-oryzanol được xác định thông qua quét phổ UV của dung dịch chuẩn ɣ-oryzanol Sự chọn lựa này đảm bảo độ nhạy và độ chính xác cao trong quá trình phân tích, khác với bước sóng 280 nm được đề cập trong tài liệu [5].
Trong nghiên cứu này, thành phần pha động gồm MeOH và ACN theo tỷ lệ 35:65 không có sự khác biệt đáng kể giữa hai phương pháp, tuy nhiên các điểm sắc ký thu được của ɣ-oryzanol hoàn toàn tách biệt nhau So với các tài liệu tham khảo quốc tế, phương pháp HPLC được áp dụng trong nghiên cứu mang lại những điểm mới, góp phần nâng cao độ chính xác và khả năng phân tích của quá trình xác định ɣ-oryzanol.
Trong nghiên cứu này, đối tượng mẫu được sử dụng là viên nén làm trắng da Kiều Xuân, khác với các tài liệu trước đây tập trung vào mẫu cám gạo, gạo và dầu gạo Việc chọn viên nén làm trắng da Kiều Xuân làm mẫu nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quả và đặc điểm của sản phẩm trong việc cải thiện làn da Nghiên cứu này góp phần mở rộng kiến thức về các dạng sản phẩm làm trắng da từ thành phần tự nhiên như cám gạo và dầu gạo.
- Dung môi chiết mẫu: dung môi chiết mẫu là n-hexan- isopropanol (tỷ lệ 1:3 v/v) với ưu điểm hòa tan tốt ɣ-oryzanol và quá trình chiết mẫu đơn giản
Trong quá trình nghiên cứu, bước sóng phát hiện được sử dụng trong các tài liệu tham khảo là từ 320 nm đến 330 nm Tuy nhiên, sau quá trình quét phổ để xác định bước sóng tối ưu, đề tài đã chọn bước sóng 325 nm làm bước sóng phát hiện chính Việc lựa chọn đúng bước sóng phù hợp giúp nâng cao độ nhạy và chính xác của phương pháp phân tích.
Trong phương pháp HPLC của chúng tôi, thành phần và tỷ lệ pha động khác với các tài liệu tham khảo quốc tế, bao gồm methanol và acetonitril dựa trên phương pháp đã được phát triển tại Việt Nam [5] Quá trình khảo sát tỷ lệ dung môi pha động nhằm tối ưu hóa hiệu quả phân tích đã được trình bày chi tiết trong phần “b) Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động”.
Trong phương pháp phân tích, hệ pha động gồm MeOH và ACN được sử dụng với các tỷ lệ 35:65, 50:50, 70:30 Sau quá trình thử nghiệm, tỷ lệ 35:65 đã được chọn làm hệ pha động tối ưu Với hệ pha này, các điểm sắc ký của ɣ-oryzanol được tách biệt rõ ràng, có hệ số phân giải giữa các điểm liền kề lớn hơn 1,5, cho thấy hiệu quả phân tách của cột sắc ký rất tốt.
3.2.2 Về thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng HPLC
Phương pháp HPLC được xây dựng để định lượng ɣ-oryzanol đã được thẩm định theo các hướng dẫn chính thống của ASEAN và ICH, đảm bảo tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ đúng Phương pháp này thể hiện độ đặc hiệu cao qua việc so sánh thời gian lưu của các đỉnh ɣ-oryzanol trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn, cũng như độ tinh khiết của các đỉnh này trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn Đồng thời, phương pháp HPLC thể hiện mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích đỉnh trong khoảng nồng độ khảo sát, cùng với độ lặp lại và độ đúng cao, từ đó khẳng định tính đáng tin cậy của phương pháp trong phân tích ɣ-oryzanol.
3.2.3 Về ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da Kiều xuân
Phương pháp HPLC định lượng ɣ-oryzanol đã được xây dựng với nhiều ưu điểm, đảm bảo độ chính xác và hiệu quả trong việc kiểm tra hàm lượng ɣ-oryzanol trong các sản phẩm Trong phạm vi nghiên cứu, do hạn chế về thời gian, phương pháp được ứng dụng để xác định hàm lượng ɣ-oryzanol trong một mẫu viên làm trắng da Kiều Xuân, cho kết quả là 96,3% so với ghi trên nhãn, phù hợp với tiêu chuẩn của nhà sản xuất Việc sử dụng phương pháp HPLC đã được thẩm định giúp định lượng chính xác ɣ-oryzanol trong các chế phẩm, hỗ trợ công tác kiểm tra chất lượng các sản phẩm chứa ɣ-oryzanol trên thị trường, đảm bảo sản phẩm đến tay người tiêu dùng đạt tiêu chuẩn cao.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Qua thời gian thực hiện nghiên cứu, đề tài đã đạt được nhưng mục tiêu đề ra như sau:
1 Đã xây dựng được phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao:
- Đã lựa chọn được dung môi chiết mẫu là n-hexan: isopropanol (tỷ lệ 1:3 v/v)
- Đã lựa chọn được thời gian chiết mẫu là 15 phút
- Đã lựa chọn được điều kiện sắc ký:
+ Pha tĩnh: Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 àm)
+ Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
+ Thể tớch tiờm mẫu: 10 àl
+ Detector PDA, bước sóng phát hiện 325 nm
2 Đã thẩm định phương pháp định lượng ɣ-oryzanol trong viên làm trắng da bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao:
- Tính thích hợp hệ thống sắc ký:
+ Giá trị RSD của thời gian lưu của từng pic theo thứ tự lần lượt bằng 0,2 %; 0,2 %; 0,3 %; 0,3 %
+ Giá trị RSD của tổng diện tích pic bằng 0,7 %
+ Độ phân giải các pic đều lớn hơn 1,5
+ Số đĩa lý thuyết đều lớn hơn 2000
+ Hệ số bất đối dao động từ 0,90 đến 1,87
+ Mẫu trắng và mẫu placebo không xuất hiện pic tại thời gian lưu của ɣ-oryzanol trong mẫu chuẩn
+ Mẫu thử, mẫu chuẩn có thời gian lưu của ɣ-oryzanol tương tự nhau lần lượt là: tR1= 11, 073 (phút); tR2= 11, 984 (phút); tR3= 13,161 (phút); tR4= 14,645 (phút)
+ Các pic sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn đều đạt độ tinh khiết
- Độ lặp lại: giá trị RSD = 1,2 %
- Độ chính xác trung gian: giá trị RSD = 1,3 %
- Độ đúng: phần trăm tìm lại nằm trong khoảng từ 98,5 % đến 100,1 %
3 Đã ứng dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân: Áp dụng phương pháp đã xây dựng vào định lượng ɣ-oryzanol trong sản phẩm viên làm trắng da Kiều Xuân (Công ty cổ phần dược phẩm Sao Kim sản xuất- lô 150622) thu được kết quả hàm lượng ɣ-oryzanol 96,3 %, đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn NSX
1 Áp dụng phương pháp trong kiểm nghiệm các sản phẩm với số lượng mẫu và số lô được mở rộng
2 Tham khảo phương pháp để xây dựng phương pháp phân tích ɣ-oryzanol trong các dạng bào chế khác
3 Tham khảo phương pháp để nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng từng thành phần của ɣ-oryzanol
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Nguyễn Thị Kiều Anh (2022), Một số phương pháp sắc ký dùng trong phân tích thuốc, NXB Y Học, tr.27
2 Lê Phạm Vân Anh, Lê Nguyễn Đoan Duy, Nguyễn Công Hà (2019), “Nghiên cứu trích ly và bảo quản ɣ-oryzanol, acid ferulic từ cám gạo”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 55, tr.292-300
3 Bộ môn Hóa phân tích (2005), Hóa phân tích II, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.123-181
4 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, NXB Y học, PL-138-141
5 Phạm Cảnh Em, Nguyễn Thị Kim Mơ, Lê Thị Tường Vi, Nguyễn Trọng Tuân
Nghiên cứu này tập trung vào tối ưu hóa quy trình chiết xuất các thành phần tocopherol và γ-oryzanol từ cám gạo, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng nhằm nâng cao hiệu quả chiết xuất Phương pháp này giúp tăng năng suất và độ tinh khiết của các hợp chất hoạt tính, ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm và dược phẩm Kết quả cho thấy, với các điều kiện tối ưu, quá trình chiết xuất đạt hiệu quả cao, góp phần đưa sản phẩm từ cám gạo trở thành nguồn nguyên liệu giá trị cao Thông qua nghiên cứu này, các nhà khoa học có thể phát triển các quy trình sản xuất hiệu quả hơn, đồng thời thúc đẩy ngành công nghiệp chế biến cám gạo phát triển bền vững.
6 Nguyễn Văn Khanh, Nguyễn Thanh Hải, Nguyễn Thị Huyền và cộng sự (2021),
“Nghiên cứu chiết xuất dầu cám gạo bằng dung môi CO2 siêu tới hạn”, VNU Journal of
Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, 37(2), tr.10-17
7 Aladedunye F., Przybylski R., Rudzinska M., et al (2013), “γ-Oryzanols of North American Wild Rice (Zizania palustris)”, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 90(8), pp.1101–1109
8 Berger A Rein D Schafer, et al (2004), “Similar cholesterol-lowering properties of rice bran oil, with varied ɣ-oryzanol, in mildly hypercholesterolemic men”, European Journal of Nutrition, 44(3), pp.163–173
9 Cho J.Y., Lee H.J., Kim G.A., et al (2012), “Quantitative analyses of individual γ- Oryzanol (Steryl Ferulates) in conventional and organic brown rice (Oryza sativa L.)”,
Journal of Cereal Science, 55(3), pp.337–343
10 Cho Y.H., Lim S.Y., Rehman A., et al (2019), “Characterization and quantification of γ-oryzanol in Korean rice landraces”, Journal of Cereal Science, 88, pp.150-156
11 Claudia Juliano, Massimo Cossu, Maria Cristina Alamanni, Luisella Piu (2005),
“Antioxidant activity of gamma-oryzanol: Mechanism of action and its effect on oxidative stability of pharmaceutical oils”, International Journal of Pharmaceutics, 299, pp.146–154
12 Das P.K., Chaudhuri A., Kaimal T.N.B., et al (1998), “Isolation of γ-Oryzanol through Calcium Ion Induced Precipitation of Anionic Micellar Aggregates”, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 46(8), pp.3073–3080
13 Fang, N., Yu, et al (2003), “Characterization of Triterpene Alcohol and Sterol Ferulates in Rice Bran Using LC-MS/MS”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(11), pp.3260–3267
14 Kim H.W., Kim J.B., Cho S.M., et al (2015), “Characterization and quantification of γ-oryzanol in grains of 16 Korean rice varieties”, International Journal of Food Science Nutrition, 66(2), pp.166-174
15 Kim Y.J., Ko J.H., Kim E.H., et al (2012), “Quantification of γ-Oryzanol Components and Comparison Its Biological Activity in Brown Rice”, Korean J Food
16 Kozuka C., Yabiku K., Takayama C., et al (2013), “Natural food science based novel approach toward prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes: Recent studies on brown rice and γ-oryzanol”, Obesity Research & Clinical Practice, 7(3), pp.165-172
17 Kumar P., Yadav D., Panesar P S., et al (2016), “Comparative study on conventional, ultrasonication and microwave assisted extraction of γ-oryzanol from rice bran”, Journal of Food Science and Technology, 53(4), pp.2047–2053
18 Massarolo K.C., Ribeiro A.C., Furlong E.B., et al (2017), “Effect of particle size of rice bran on gamma-oryzanol content and compounds”, Journal of Cereal Science, 75, pp.54–60
19 Mas’ud F., Bangngalino H., Yusuf M., Suhardi, et al (2022), “Rice bran oil extraction by ethanol: optimization of γ-oryzanol and polyphenol”,Food Research, 7
20 Miller A., Frenzel T., Schmarr H.-G., et al (2003), “Coupled liquid chromatography–gas chromatography for the rapid analysis of γ-oryzanol in rice lipids”,
21 Pongpian W., Panpraneecharoen S (2019), “Analysis of Chemical Properties and Gamma - Oryzanol Content in Luem Pua Rice Bran Oil (Oryza sativa L.)”, Science & Technology Asia, 24, pp.1-5
22 Renata Heidtmann-Bemvenuti, Náthali Saião Nora, et al (2012), “Extraction of γ - oryzanol from rice bran”,Ciênc agrotec Lavras, 36(6), pp.665-673
23 Rogers E J., Rice S M., Nicolosi R J, et al (1993), “Identification and quantitation of γ-oryzanol components and simultaneous assessment of tocols in rice bran oil”,
Journal of the American Oil Chemists’ Society, 70(3), pp.301–307
24 Saenjum C., Chaiyasut C., Chansakaow S., et al (2011), “Antioxidant and anti- inflammatory activities of gamma-oryzanol rich extracts from Thai purple rice bran”,
Journal of Medicinal Plants Research, 6, pp.1070-1077
25 Sigma-Aldrich Co LLC (2020), Gamma- Oryzanol USP Reference Standard,
26 Srikaeo K (2014), “Organic Rice Bran Oils in Health”, Wheat and Rice in Disease
27 Tuncel N B., Yılmaz N (2011), “Gamma-oryzanol content, phenolic acid profiles and antioxidant activity of rice milling fractions”, European Food Research and Technology, 233, pp.577–585
28 Tsuzuki W., Komba S., Kotake-Nara E (2019), “Diversity in γ-oryzanol profiles of Japanese black-purple rice varieties”, Journal of Food Science and Technology, 56, pp.2778-2786